CN115725792B - 一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒 - Google Patents
一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115725792B CN115725792B CN202211148284.XA CN202211148284A CN115725792B CN 115725792 B CN115725792 B CN 115725792B CN 202211148284 A CN202211148284 A CN 202211148284A CN 115725792 B CN115725792 B CN 115725792B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- detection
- avian leukosis
- leukosis virus
- nucleic acid
- universal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 81
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 title claims abstract description 50
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 claims abstract description 20
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 claims abstract description 20
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 15
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims abstract description 14
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims abstract description 14
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 11
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 2
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 claims 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 13
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 16
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 4
- 241000886677 Duck adenovirus 1 Species 0.000 description 4
- 241000701063 Gallid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 4
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 4
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 241001664176 Alpharetrovirus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000004668 avian leukosis Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000005571 horizontal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000005570 vertical transmission Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种通用型禽白血病病毒新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述试剂盒包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、石墨化碳纳米管、聚乙二醇甲醚、SYBR Green I、检测引物，所述检测引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。与传统检测试剂盒和检测方法相比，本发明方法具有简便快捷、特异性强、灵敏度高、重复性好的优点，在检测时间与检测成本方面具有显著优势，适合于批量检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
背景技术
禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)属于反转录病毒科α反转录病毒属成员，感染禽类能够引起多种肿瘤性疾病。根据病毒囊膜蛋白抗原性差异、病毒干扰实验及宿主范围，目前ALV可分为A～K 11个亚群(ALV-A～K)。仅A～E、J、K亚群从鸡分离到，其余亚群见于其他鸟类，其中A亚群对蛋鸡危害较大，J亚群对肉鸡危害严重。由于该病具有水平传播与垂直传播的能力，因而给养禽业造成了严重的危害，属于“国家中长期动物疫病防治规划”中必须净化的疫病。
我国对于禽白血病的通用检测标准是基于P27抗原的酶联免疫吸附试验(NY-T680-2018禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法)，该方法在检测成本、灵敏度、特异性方面存在诸多缺陷。随着科技的发展，以PCR、LAMP等分子生物学方法在禽白血病病毒的快速检测中得到逐步应用，但上述方法仍存在诸多缺陷。例如，PCR方法灵敏度相对偏低，检测时间也相对偏长；LAMP方法较PCR方法灵敏度大幅提高，检测时间也缩短，但极易发生气溶胶污染，且因引物较多易造成引物二聚体，无法通过琼脂糖凝胶电泳辨别假阳性结果。
基于上述原因，本发明提供一种新型的禽白血病病毒核酸检测方法，可有效解决普通PCR和LAMP检测中的缺陷仅使用一对引物，就可以达到简便快捷、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。
发明内容
本发明针对传统核酸检测技术在禽白血病病毒检测中存在的不足，特别是如何提高检测效率、灵敏度与特异性，提供了一种特异性检测禽白血病病毒的新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
本发明技术方案如下：
本发明提供了一种特异性检测禽白血病病毒的新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述禽白血病病毒的核酸检测试剂盒包括10×反应缓冲液、8000U/μl BstDNA聚合酶、10mM dNTPs、检测引物、甜菜碱、石墨化碳纳米管、聚乙二醇甲醚、阳性对照和阴性对照；所述检测引物为SEQ ID NO.1的引物和SEQ ID NO.2的引物的组合。
本发明通过使用特别设计的一对检测引物，就可以实现特异性强、灵敏度高的优点。特别需要说明的是，本发明的试剂盒加入石墨化碳纳米管后的扩增条带，有单一的目的特异性条带(如图1所示)。本发明设计是在链交换扩增(使用一对引物进行等温扩增)的基础上改进的(仍使用一对引物，分两步进行扩增)。研究发现，在不加入石墨化碳纳米管的情况下，会出现类似链交换扩增的非特异性扩增现象(如图1所示，出现引物二聚体而特异性条带不清晰等)，所以通过加入石墨化碳纳米管等新型纳米材料可以最大限度的提高反应特异性。石墨化碳纳米管对基因扩增的机制不明，据推测由于表面电荷性质，可与单链DNA形成相对稳定的结构，而双链DNA由于双链间氢健作用力更稳定，所以不会石墨化碳纳米管结合。因此，石墨化碳纳米管可以吸附多余未参加反应的引物单链，以防止引物二聚体的产生，有效提高反应特异性。
本发明的试剂盒中加入甜菜碱可帮助DNA聚合酶顺利通过DNA某些复杂二级结构，防止DNA聚合酶从模板DNA中解离。DNA局部区域因含有多个复杂碱基(Py-G-C)，会促使DNA聚合酶的停滞，最终导致DNA聚合酶停止有效延伸。而甜菜碱可提高DNA小沟中富含鸟嘌呤和胞嘧啶区域的鸟嘌呤和胞嘧啶的水合作用，影响DNA分子结构，改变DNA灵活性，帮助DNA聚合酶沿着DNA模板延伸。其次，甜菜碱可消除变性温度对碱基的依赖性。浓度依赖性降低高GC含量序列的Tm，并使不同引物的Tm相接近，最终降低DNATm值。此外，甜菜碱溶液可稳定DNA-蛋白复合物。
进一步的，所述阳性对照为禽白血病病毒JS11C1阳性模板，所述阴性对照为无菌生理盐水
进一步的，所述试剂盒检测体系的组分为：每20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μL dNTPs(1～10mM)、0.5μL聚乙二醇甲醚、1μL甜菜碱(8mM)、引物ALV-F和ALV-R(10μM)各2μL、0.8μLBst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨化碳纳米管溶液(10ng/μL)、0.2μLSYBR Green I(100×)、3μL模板和5μL无菌生理盐水。
进一步的，所述禽白血病病毒检测方法的反应流程为：74℃1秒，61℃1秒，循环总数45。
进一步的，所述10×反应缓冲液含有200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mMKCl，20mM MgSO4，1％曲拉通，pH 8.0～8.8。
进一步的，所述禽白血病病毒检测方法的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM。
更进一步的，一种使用通用型禽白血病病毒检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：
S1：试剂盒提取样品中的DNA，得到检测模板。
S2：将缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、SYBR Green I、甜菜碱、聚乙二醇甲醚、石墨化碳纳米管溶液、检测引物以及DNA模板加入灭菌反应管中，添加灭菌生理盐水至总体积20μl，同时设置阳性、阴性对照，使用荧光定量PCR仪进行扩增反应；
S3：当反应结束后，荧光曲线起峰(荧光值大于0.001)判定为阳性；当荧光曲线未起峰(荧光值小于等于0.001)时判定为阴性。或采用3％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明根据美国生物技术信息中心基因序列数据库GenBank中已公开的已知不同亚型禽白血病病毒全基因序列，通过多种比较基因组学技术比较分析，成功筛选获得禽白血病病毒的特异基因序列，进一步设计引物，优化反应条件，成功建立通用型禽白血病病毒核酸检测方法，具有灵敏度高，特异性强的优点。同时，本发明只需通过一次反应，即可对禽白血病病毒进行快速检测，相比传统的核酸检测方法，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适合于批量检测。
附图说明
图1为实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中：M为Takara 20bp DNA Ladder(Dye Plus)，泳道1为含石墨化碳纳米管体系检测禽白血病病毒JS11C1，泳道2为不含石墨化碳纳米管检测禽白血病病毒JS11C1，泳道3为阴性对照；
图2为实施例3中抗干扰评价实验的检测结果。图中：1为禽白血病病毒的阳性模板；2为禽白血病病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和鸡减蛋综合征病毒的混合阳性模板；3为阴性对照；
图3为实施例4中敏感性评价的检测结果。图中：1为2.4×103copies/μl，2为2.4×102copies/μl，3为2.4×101copies/μl，4为2.4×100copies/μl，5为2.4×10-1copies/μl，6为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1通用型禽白血病病毒核酸检测方法的建立
引物的设计：根据GenBank数据库中已知的禽白血病病毒DNA序列及其它物种DNA序列，通过分析比对后，筛选出禽白血病病毒通用核苷酸序列，在此基础上设计、优选得到用于特异性检测禽白血病病毒的引物，如下表所示。
表1通用型禽白血病病毒核酸检测引物序列
模板制备：将禽白血病病毒JS11C1接种DF1细胞后进行病毒分离，使用商品化的试剂盒提取病毒基因组DNA，作为待检模板。
检测试剂的配制：10×反应缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％曲拉通，pH 8.0～8.8)、dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM)、Bst DNA聚合酶(8000U/μl)、10μM检测引物、0.5μL聚乙二醇甲醚、甜菜碱、石墨化碳纳米管溶液、10×SYBR Green I。此外，设置石墨化碳纳米管缺省对照组。
检测体系及扩增程序：检测体系为20μL，具体包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μLdNTPs(1～10mM)、0.5μL聚乙二醇甲醚、1μL甜菜碱(8mM)、引物ALV-F和ALV-R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨化碳纳米管溶液(10ng/μL)、0.2μL SYBR GreenI(100×)、3μL模板和5μL无菌生理盐水。扩增程序的步骤包括74℃1秒，61℃1秒，循环总数45。
检测结果的判定：当反应结束后，荧光曲线起峰(荧光值大于0.0001)判定为阳性；当荧光曲线未起峰(荧光值小于等于0.0001)时判定为阴性。或取5μl扩增产物，加1μl 6×Loading buffer混匀，点样于3％琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像仪下拍照判定，可见约50bp大小的条带，而缺省石墨化碳纳米管对照组几乎未见特异性条带，而出现了引物二聚体(如图1)。
实施例2特异性评价实验
用实施例1的方法进行本发明检测方法的特异性评价，将6种鸡源常见病毒(禽白血病病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和鸡减蛋综合征病毒)的阳性模板按照实施例1所述方法进行检测，结果如表2所示，只有禽白血病病毒的检测结果为阳性，其它种属细菌均为阴性。
表2本发明特异性评价试验结果
实施例3抗干扰评价实验
用实施例1的方法进行本发明检测方法的敏感性评价。提取禽白血病病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和鸡减蛋综合征病毒的阳性模板。将提取的模板分为2份，1号样品仅含禽白血病病毒阳性模板，2号样品为禽白血病病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和鸡减蛋综合征病毒阳性模板的等比例混合物，3号样品为阴性对照。按照实施例1所述方法进行检测，结果如图2所示，1号样品和2号样品均显示出明显的荧光曲线，3号样品无荧光曲线出现，表明本发明方法具有较好的抗干扰能力。
实施例4灵敏度评价实验
用实施例1的方法进行本发明检测方法的敏感性评价。将禽白血病病毒JS11C1基因组DNA测定原始浓度后10倍梯度稀释，对不同稀释梯度阳性模板进行扩增。由图3可知本发明方法检测禽白血病病毒的最低下限可达2.4拷贝(2.4×100copies/μl)，表明该方法具有较高的灵敏度和应用价值。
实施例5稳定性评价实验
用实施例1的方法进行本发明检测方法的重复性评价。以禽白血病病毒JS11C1阳性模板分别进行10次扩增测试。结果见表3，由表可见，荧光信号时间阈值(Tt)相对稳定(变异系数约为4.9％)，阴性对照无荧光信号时间阈值，表明该方法具有较好的稳定性。
表3稳定性测试结果
实施例6检测试剂盒的组装
根据实施例1表中的序列合成禽白血病病毒特异性检测引物，用灭菌生理盐水稀释为10μM浓度，等体积混合后得到检测引物；阳性对照；禽白血病病毒JS11C1阳性模板；核酸扩增试剂：10×反应缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％曲拉通，pH 8.6～8.8)、dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM)、Bst DNA聚合酶(8000U/μl)、甜菜碱(8mM)、聚乙二醇甲醚、石墨化碳纳米管溶液(10ng/μL)检测引物、阳性对照以及阴性对照(无菌生理盐水)。
将以上所涉试剂和产品共同包装，再配以产品使用说明书(包括产品保存条件、反应程序和结果判定方法等)，组装成本发明所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒。
实施例7临床病料检测
临床收集的53份具有疑似禽白血病病毒病变的病料，经病毒分离和DNA提取后备用。分别采用实施例1的方法和禽白血病病毒检测标准(DB22T2921-2018)中的方法进行禽白血病病毒检测。结果如表4所示，53份临床病料中，本发明检测方法的阳性检出率为35.8％(19/53)，高于禽白血病病毒检测标准的检出率30.2％(16/53)。而禽白血病病毒检测标准检出的阳性病料(无论是A、B或J亚群)使用本发明方法也均为阳性结果，而对3例检测标准结果为阴性的样品进行测序分型表明均为K亚群禽白血病病毒。表明本发明试剂盒所建立的检测方法具有较好准确率。此外禽白血病病毒检测标准(DB22T2921-2018)检测周期约需要4个小时时间，而采用本发明试剂盒检测仅需约半小时。
表4临床样本检测结果
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种链交换扩增的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：1)反应缓冲液；2)检测引物：正向引物ALV-F和反向引物ALV-R，所述的ALV-F和ALV-R引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；3)Bst DNA聚合酶；4)dNTPs；5)SYBR GreenI；6)甜菜碱；7)聚乙二醇甲醚；8)石墨化碳纳米管。
2.根据权利要求1所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：9)阳性对照：禽白血病病毒JS11C1阳性模板；10)阴性对照：无菌生理盐水。
3.根据权利要求1所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的反应缓冲液含有Tris-HCl、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁和曲拉通。
4.根据权利要求1所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：正向引物ALV-F和反向引物ALV-R的浓度均为10pmol/μL。
5.根据权利要求1所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的检测反应体系为：每20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、8mM dNTPs 2μL、0.5μL聚乙二醇甲醚、1～10mM甜菜碱1μL、10μM引物ALV-F和ALV-R各2μL、8000U/mLBst DNA聚合酶0.8μL、10ng/μL石墨化碳纳米管溶液1μL、0.2μL 100×SYBR Green I、3μL模板和5μL无菌生理盐水。
6.权利要求1-5任意一项所述的一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒在制备检测禽白血病病毒的试剂中的应用。
7.一种使用权利要求1-5任意一项所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒进行非诊断检测的方法，包括以下步骤：
S1：试剂盒提取样品中的DNA，得到检测模板；
S2：将缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、SYBR Green I、甜菜碱、聚乙二醇甲醚、石墨化碳纳米管溶液、检测引物以及DNA模板加入灭菌反应管中，添加灭菌生理盐水至总体积20μl，同时设置阳性、阴性对照，使用荧光定量PCR仪进行链交换扩增反应；
S3：当反应结束后，荧光曲线起峰，即荧光值大于0.001判定为阳性；当荧光曲线未起峰，即荧光值小于等于0.001时，判定为阴性；或采用3％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211148284.XA CN115725792B (zh) | 2022-09-20 | 2022-09-20 | 一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211148284.XA CN115725792B (zh) | 2022-09-20 | 2022-09-20 | 一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115725792A CN115725792A (zh) | 2023-03-03 |
| CN115725792B true CN115725792B (zh) | 2024-01-30 |
Family
ID=85293231
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211148284.XA Active CN115725792B (zh) | 2022-09-20 | 2022-09-20 | 一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115725792B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103627818A (zh) * | 2013-10-10 | 2014-03-12 | 广西大学 | 检测主要亚型禽白血病病毒的lamp试剂盒 |
| US9797020B1 (en) * | 2014-05-28 | 2017-10-24 | Eric S. Johnson | Assay for the detection of avian leukosis/sarcoma viruses (ALSV)-induced cancer or infection in DNA from human and animal biological specimens |
| CN110261607A (zh) * | 2019-05-28 | 2019-09-20 | 北京市动物疫病预防控制中心 | 用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法 |
| CN110438204A (zh) * | 2019-08-20 | 2019-11-12 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 一种利用碳纳米管优化环介导等温扩增反应的方法 |
| CN113481286A (zh) * | 2021-08-17 | 2021-10-08 | 东南大学 | 基于链交换扩增的miRNA-208a扩增引物对及其检测试剂盒 |
| WO2021205042A1 (en) * | 2020-04-10 | 2021-10-14 | RNAssist Limited | Composition and method for inactivating a virus |
-
2022
- 2022-09-20 CN CN202211148284.XA patent/CN115725792B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103627818A (zh) * | 2013-10-10 | 2014-03-12 | 广西大学 | 检测主要亚型禽白血病病毒的lamp试剂盒 |
| US9797020B1 (en) * | 2014-05-28 | 2017-10-24 | Eric S. Johnson | Assay for the detection of avian leukosis/sarcoma viruses (ALSV)-induced cancer or infection in DNA from human and animal biological specimens |
| CN110261607A (zh) * | 2019-05-28 | 2019-09-20 | 北京市动物疫病预防控制中心 | 用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法 |
| CN110438204A (zh) * | 2019-08-20 | 2019-11-12 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 一种利用碳纳米管优化环介导等温扩增反应的方法 |
| WO2021205042A1 (en) * | 2020-04-10 | 2021-10-14 | RNAssist Limited | Composition and method for inactivating a virus |
| CN113481286A (zh) * | 2021-08-17 | 2021-10-08 | 东南大学 | 基于链交换扩增的miRNA-208a扩增引物对及其检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Accurate, rapid and highly sensitive detection of African swine fever virus via graphene oxide-based accelerated strand exchange amplification;Linlin Zhuang等;Analytical Methods;第14卷;第2-3小节 * |
| 荧光定量RT-PCR检测禽白血病病毒方法的建立及应用;李佳桃等;中国动物检疫;第25卷(第9期);25-28 * |
| 陈皓.环境现代仪器分析实验.同济大学出版社,2020,137-138. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115725792A (zh) | 2023-03-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110551853B (zh) | 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒 | |
| CN112094948B (zh) | 一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒 | |
| CN113502352B (zh) | 检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用 | |
| Weiss et al. | Polyadenylate sequences on Newcastle disease virus mRNA synthesized in vivo and in vitro | |
| CN111321252B (zh) | 一种具有抗突变性能的新型冠状病毒核酸检测引物对、试剂盒及其应用 | |
| WO2022257663A1 (zh) | 一种检测筛查新冠病毒n501y突变的方法及试剂盒 | |
| CN110724769A (zh) | 检测非洲猪瘟病毒mgf360-505r基因的pcr引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN115232888A (zh) | 快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物、试剂盒及方法 | |
| CN113943831A (zh) | 可同时诊断猪腹泻病三种高发病原的多重荧光定量引物和探针组合及其应用 | |
| CN107326098B (zh) | 一种快速区分兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂 | |
| TW201321520A (zh) | 用於病毒檢測的方法和系統 | |
| CN115725792B (zh) | 一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒 | |
| CN116287357A (zh) | 一种基于靶向扩增子测序的呼吸道病原菌检测试剂盒 | |
| CN114634996A (zh) | 用于检测牛呼吸道疾病的引物探针组合、试剂盒及其应用 | |
| CN110592269A (zh) | 草鱼出血病2型病毒（gcrv-2）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN114672596A (zh) | 一种检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对、检测试剂盒及应用 | |
| Wang et al. | A multiplex PCR for Massachusetts and Arkansas serotypes of infectious bronchitis virus | |
| CN110616278B (zh) | 检测fav-8和fav-11的特异性引物及试剂盒 | |
| CN116334254B (zh) | 一种多杀性巴氏杆菌新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法 | |
| CN110804677A (zh) | 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的巢式二重pcr检测引物及试剂盒 | |
| CN116334255B (zh) | 一种沙门氏菌新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法 | |
| CN116334253B (zh) | 一种用于鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒 | |
| CN110894551A (zh) | 草鱼出血病i型病毒（gcrv-i）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN112575122B (zh) | 一种用于快速检测鸭2型腺病毒和鸭圆环病毒的双重pcr引物组及其检测方法与应用 | |
| CN114107569B (zh) | 一种快速鉴别牛痘病毒的引物、探针及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |