CN113481286A - 基于链交换扩增的miRNA-208a扩增引物对及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于链交换扩增的miRNA‑208a扩增引物对及其检测试剂盒，所述扩增引物对包含正向引物和反向引物，正向引物由5’端侧平衡序列和3’端侧扩增序列组成，扩增序列与miRNA‑208a‑3p的5’端侧序列同源；反向引物由5’端侧扩增序列和3’端侧平衡序列组成，扩增序列与miRNA‑208a‑3p的3’端侧序列互补。本发明的miRNA‑208a等温扩增反应完成后加入运行缓冲液，混匀滴加到试纸条加样窗口，2分钟后检测荧光信号。本发明的检测方法可在1小时内完成。本发明miRNA‑208a检测方法操作简便，快速、安全，可为急性心肌梗死提供一种早期分子诊断检测方法。

Description

基于链交换扩增的miRNA-208a扩增引物对及其检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基于链交换扩增的miRNA-208a扩增引物及其检测试剂盒，属于分子生物学检测技术、侧流层析技术等技术领域。

背景技术

心血管疾病的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，极大地威胁着人民群众的生命与健康。我国现有心血管疾病患者人数约为3.3亿，心血管疾病居城乡居民总死亡原因之首，防治心血管疾病迫在眉睫。冠心病是心血管疾病中的一种，而急性心肌梗死(Acutemyocardial infarction，AMI)是冠心病发作时最主要的临床表现。心肌细胞受到损伤时，会释放蛋白类、外泌体等进入到外周血中，在不同的时间范围内达到峰值并持续一段时间。临床上一般认为这段时间为最佳检测时机，相关物质的测定结果将作为检测报告的重要依据，这些物质因此也被称为心肌标志物。心肌标志物在临床早期诊断、术前术中的实施方案以及预后治疗等各环节具有十分重要的意义。

目前，临床上诊断AMI常用的心肌标志物为心肌肌钙蛋白(cTn)，血清中cTn异常升高即可诊断为心肌损伤，但cTn水平也可能在冠状动脉疾病和非心脏疾病中上调，因此缺乏特异性，且具有时间滞后性。近年来，非编码RNA分子中的microRNA(miRNA) 已经被证实可以调节如高血压、瓣膜病、AMI等病理性的复杂过程。miRNA被证实在 AMI患者的血液中可以被检测出，同时其在血液循环中具有稳定性。其中，miR-208a 在AMI患者的血浆中1小时内可显著升高至检测水平，而在健康人群的血浆中不存在，被认为具有作为AMI生物标志物的重要潜在价值。

当前，可用于检测和定量分析miRNA的方法包括miRNA克隆、RNA印迹法、微阵列杂交、荧光定量PCR(RT-qPCR)等，但这些方法仍然有其局限性。克隆法具有识别新的miRNA的优势，但并不是一种准确的miRNA定量方法。常规RNA印迹法敏感性较差，且耗时、费力，需要大量的RNA样本和放射性探针。微阵列杂交法涉及到探针的修饰、芯片的制作及miRNA的标记等，成本较高，且设计复杂。常用的RT-qPCR 法灵敏度高、特异性强，但仪器和试剂成本均较高，且需要训练有素的操作人员，难以在基层医疗单位和现场检测中广泛使用。

因此，本领域亟需开发一种能够准确检测miRNA-208a，检测时间短、灵敏度高、不需要昂贵的设备和试剂且适于现场快速检测的方法。这对于及时诊断并救治AMI患者具有极其重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了等温扩增引物对。

本发明还要解决的技术问题是提供了等温扩增引物在制备检测miRNA-208a试剂盒中的应用。

本发明最后所要解决的技术问题是针对现有技术在检测miRNA-208a中的局限性，提供一种快速检测miRNA-208a的荧光定量试剂盒及检测方法，具有操作简便、灵敏度高、特异性强、重复性好、适用性广、可数字化判读的特点。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了等温扩增引物对，所述等温扩增引物对包含一条正向引物和一条反向引物，所述正向引物由正向的5’端侧平衡序列和正向的3’端侧扩增序列组成，所述正向的3’端侧扩增序列与miRNA-208a-3p的5’端侧序列同源；所述反向引物由反向的5’端侧平衡序列和反向的3’端侧扩增序列组成，所述反向的3’端侧扩增序列与miRNA-208a-3p的3’端侧序列互补；所述正向引物序列如SEQ ID NO：1所示；所述反向引物序列如SEQ ID NO：2所示。

其中，所述正向引物和反向引物工作摩尔比为1:1～1:3。

本发明内容还包括所述的等温扩增引物在制备检测miRNA-208a的试剂盒中的应用。

本发明内容还包括一种快速检测miRNA-208a的试剂盒，所述试剂盒包括所述的等温扩增引物对。

其中，所述等温扩增引物对上标记有特定标记物，可选自生物素、地高辛、FAM、异硫氰酸荧光素、Cy3或Cy5荧光染料中的一种或几种，使扩增后的DNA产物两端分别含有不同的标记物。

其中，所述试剂盒还包括等温扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、聚乙二醇、甜菜碱、无酶水、阳性对照和阴性对照。

其中，所述阳性对照：miRNA-208a标准品；阴性对照：灭菌双蒸水。

其中，所述试剂盒还包括荧光免疫层析检测试纸条。

其中，所述荧光免疫层析检测试纸条包括底板、吸水纸、硝酸纤维膜、结合垫、样品垫，所述硝酸纤维膜上设有一条包被有二抗的质控线C线，还设有一条与所述质控线C线平行的包被有抗B抗体的检测线T线，所述结合垫包被有荧光微球抗A抗体偶联物，所述抗A抗体和抗B抗体，可选自链霉亲和素、生物素、抗地高辛抗体或抗荧光染料抗体，所述抗荧光染料抗体可选自抗FAM抗体、抗FITC抗体、抗Cy3抗体、抗 Cy5抗体等，所述抗B抗体应选用与抗A抗体不同的抗体。

其中，等温扩增引物对中的引物适用工作温度范围为55～70℃，所述引物对优选反应温度为61～63℃。

本发明的引物设计包括如下特征：

(1)miRNA-208a等温扩增引物由一条正向引物和一条反向引物构成；

(2)所述正向引物(F)和反向引物(R)的序列长度范围均为15～30个核苷酸。其中反向引物作为扩增起始阶段的逆转录引物，同时与正向引物组成扩增引物对；

(3)所述正向引物由5’端侧平衡序列和3’端侧扩增序列组成，扩增序列与 miRNA-208a-3p的5’端侧序列同源。其中，扩增序列长度大于等于3个核苷酸，优选长度为大于等于6个核苷酸。平衡序列为随机碱基排布，使得正向引物GC含量为40％～60％，且平衡序列与人源基因组序列同源性低于80％。

(4)所述反向引物由5’端侧平衡序列和3’端侧扩增序列组成，扩增序列与 miRNA-208a-3p的3’端侧序列互补。其中，扩增序列长度大于等于3个核苷酸，优选长度为大于等于6个核苷酸。平衡序列为随机碱基排布，使得反向引物GC含量为 40％～60％，且平衡序列与人源基因组序列同源性低于80％。

(5)所述正向引物和反向引物中的平衡序列可以但不限于设计限制性内切酶识别位点、标签序列等功能性序列。

(6)采用生物信息学方法设计引物及进行引物筛选得到如上所述的引物对。

本发明内容还包括一种快速检测miRNA-208a的方法，当扩增产物荧光值高于141时判定为阳性，否则判定为阴性。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：

1)反应体系简单高效：无需设计茎环引物，仅使用一对常规引物即可实现对miRNA-208a-3p的高效扩增，稳定性好、特异性高。

2)一步法高效扩增：等温扩增所使用的聚合酶同时具有聚合酶活性和反转录活性，可以实现对RNA靶标一步法扩增，无需额外的反转录步骤。

3)检测用时短：等温反应只需30分钟，即可扩增出满足荧光定量检测要求的产物数量。本发明从核酸扩增到结果判定可在35分钟内完成。

4)仪器简单：扩增反应只需要一台普通水浴锅就能完成，扩增反应条件温和，安全、不易污染。

5)广泛的适用性：等温扩增引物设计策略和荧光定量检测试剂盒具有广泛的适用性，可灵活应用于其他miRNA家族的扩增，应用前景广阔。

6)适于现场检测：本发明荧光定量分析仪可手持式使用，试纸条判读简单快捷，参考比较基准即可判定结果。

综上，本发明的荧光定量试剂盒及其检测方法具有用时短、仪器简单、灵敏度高、适用范围广、适于现场检测等优点，无需复杂仪器，为临床上快速诊断AMI提供了新的技术支持，具有广阔的市场前景和显著的社会、经济效益。

附图说明

图1为本发明链交换等温扩增原理与荧光定量检测试剂盒检测结果判断示意图。

图2为本发明miRNA-208a荧光定量检测方法不同反应温度、反应时间测试结果图。

图3为本发明miRNA-208a等温扩增方法酶切鉴定结果图。图为使用限制性内切酶AluI反应结果。

图4为本发明基于miRNA-208a的标准物质样品和阴性质控检测结果对比图。其中，图a和c为阳性质控和阴性质控的测试线荧光信号值；图b和d为阳性质控和阴性质控对应的试纸条荧光成像结果。

图5为本发明miRNA-208a荧光定量检测方法的灵敏度结果图。其中，图a为不同浓度的miRNA-208a检测结果，图b为基于扩增产物荧光值建立的线性关系。

图6为本发明miRNA-208a荧光定量检测方法的特异性结果图。

图7为本发明基于血清样本的miRNA-208a荧光定量信号值。

图8为本发明基于血清样本的cTnI值。

图9为本发明基于血清样本的miRNA-208a和cTnI的相关性分析。

图10为本发明miRNA-208a荧光定量检测方法的ROC曲线及临界值(cutoff)的确定。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出，以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。

实施例1：荧光免疫层析定量检测试纸条的制备

荧光免疫层析定量检测试纸条，其组成包括底板、吸水纸、硝酸纤维膜、结合垫、样品垫，底板上用硝酸纤维膜粘贴，硝酸纤维膜的一端连接吸水纸、另一端连接结合垫；结合垫上搭接样品垫，硝酸纤维膜上设有一条包被有一种生物素化牛血清白蛋白的质控线(C)，同时还设有一条与所述质控线平行的包被有抗地高辛抗体的检测线(T)；结合垫为固定有标记链霉亲和素的荧光微球的玻璃纤维膜；试纸条还包含一个卡壳，卡壳上设置有加样窗口和信号读取窗口，其中加样窗口与样品垫对应，信号读取窗口与检测线、质控线对应。

具体制备过程如下：

(1)选用亲水的玻璃纤维为样品垫和结合垫，将样品垫、结合垫浸泡在100mL缓冲液与效应物的混合溶液中，2分钟后取出，然后在70℃烘箱中干燥待用。将标记链霉亲和素的荧光微球探针(南京东纳生物科技有限公司，货号：FPM-SAF-200)以5μL/cm 的量，喷洒在结合垫上并干燥，制得固定有探针的结合垫以及经过处理的样品垫。其中，缓冲液基础成分为pH 9.0、0.02M的磷酸缓冲液，效应物主要成分为1wt％的分子量为 4000-20000的PEG、1wt％的防腐剂P300(Sigma-Aldrich，货号：48912-U)、0.05wt％的酪蛋白、0.05wt％的胎牛血清蛋白、0.01wt％的海藻糖。

(2)选用跑水速度为90秒的硝酸纤维膜，将硝酸纤维膜放置在湿度为25～65％的密闭箱中平衡1小时。将抗地高辛抗体用浓度为0.02M的磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释至2mg/mL，将生物素化牛血清白蛋白用浓度为0.02M的磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释至20μg/mL，将上述两种溶液在硝酸纤维膜上划线，划线量为0.8μL/cm，划线结束后，干燥备用。

(3)在带有粘性的PVC底板中部粘贴硝酸纤维膜。所述硝酸纤维膜一端粘贴吸水纸，二者重叠宽度为2mm；所述硝酸纤维膜另一端接结合垫，二者相互交错，重叠宽度为4mm。样品垫覆盖在结合垫上，将底板固定，最后裁切成免疫层析试纸条。

(4)将裁切好的免疫层析试纸条加上卡壳，上盖设置有加样窗口和信号读取窗口，其中加样窗口与样品垫对应，信号读取窗口与质控线、检测线对应。

实施例2：基于miRNA-208a扩增引物的设计与筛选

根据美国生物技术信息中心基因序列数据库GenBank中已公开的miRNA-208参考序列(NC000014.9)，使用BLASTn、MAFFT、DNASTAR等分子生物学工具进行基因组序列比对分析，获得miRNA-208a序列特异性的保守区域(miRNA-208a-3p)。根据保守靶序列，利用Primer Premier 5.0和在线工具NUPACK(http://www.nupack.org/)进行等温扩增引物的设计。所设计引物进一步通过BLASTn和Primer-BLAST检索验证；所设计引物序列如下：

表1靶基因和等温扩增引物信息

等温扩增反应体系及程序为：以miRNA-208a标准物质(根据miRNA-208a-3p序列，委托宝日医生物技术(北京)有限公司合成HPLC纯化级别的RNA制品，规格：1M/ 管)(10mM)为模板，20μL反应体系包括：上下游引物Primer-F(10mM)和Primer-R (10mM)各1.5μL，10×等温扩增缓冲液2μL，Bst 2.0WarmStart^TM DNA聚合酶(8000 U/mL)0.8μL，液态聚乙二醇(分子量200-600)2μL，dNTPs(1～10mM)2.5μL， MgSO₄(100mM)1.2μL，模板2μL以及无酶水6.5μL。将反应体系配制于PCR反应管(200μL)中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将平行样品置于恒温环境反应60分钟。等温扩增反应结束后使用荧光定量分析仪进行分析。

通过等温扩增方法所得miRNA-208a扩增片段序列(加粗所标示部分为限制性内切酶AluI(AG^CT/TC^GA)的酶切位点)如下：

5’-ACTGGTGGCTGACAGATAAGACGAGCAAAAAGCTTGTGTCGTTCAGTCG G-3’

实施例3：基于等温扩增的miRNA-208a序列荧光定量检测方法的建立

采用HPLC级别合成的miRNA-208a标准物质(miRNA-208a-3p)(10mM)(委托宝日医生物技术(北京)有限公司合成)和阴性对照(生理盐水)进行等温扩增方法测试，以优化反应温度和反应时间，具体步骤如下：

1、反应温度的确定

以miRNA-208a合成标准物质(1×10¹⁰pmol/L)为模板，在实施例2获得的miRNA-208a特异性引物的作用下进行等温扩增，其中，20μL反应体系包括：上下游引物Primer-F(10mM)和Primer-R(10mM)各1.5μL，10×等温扩增缓冲液2μL，Bst 2.0WarmStart^TM DNA聚合酶(8000U/mL)0.8μL，液态聚乙二醇(分子量200-600) 2μL，dNTPs(1～10mM)2.5μL，MgSO₄(100mM)1.2μL，模板2μL以及6.5μL无酶水。将反应体系配制于PCR反应管(200μL)中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将平行样品分别置于恒温环境61℃、62℃、63℃、64℃和 65℃反应55～60分钟。

待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2分钟，通过荧光定量分析仪读取数值。

从图2a可以看出，反应温度在61℃、62℃、63℃、64℃和65℃时，均能获得较高的荧光值，其中63℃时荧光信号值达到最高，因此选择63℃作为优选的反应温度。

2、反应时间的确定

以miRNA-208a合成标准物质(10mM)为模板，在实施例2获得的miRNA-208a 特异性引物的作用下进行等温扩增，其中，20μL反应体系包括：上下游引物Primer-F (10mM)和Primer-R(10mM)各1.5μL，10×等温扩增缓冲液2μL，Bst 2.0WarmStart^TM DNA聚合酶(8000U/mL)0.8μL，液态聚乙二醇(分子量200-600)2μL，dNTPs(1～10 mM)2.5μL，MgSO₄(100mM)1.2μL，模板2μL以及6.5μL无酶水。将反应体系配制于PCR反应管(200μL)中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将平行样品置于恒温环境63℃反应60分钟，期间每10分钟测试一次样品的荧光值。

待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2分钟，通过荧光定量分析仪读取数值。

从图2b可以看出，随着反应时间的延长，扩增产物的荧光值逐渐增高。从10分钟到30分钟，扩增产物的荧光值迅速增高，30～60分钟时荧光值升高速率逐渐降低，在反应时间大于40分钟后，荧光值曲线斜率已趋于平缓。因此，选择30分钟作为优选的反应时间。

3、等温扩增产物酶切验证

本发明等温扩增产物中含有限制性内切酶AluI(AG^CT/TC^GA)的识别位点，可对miRNA-208a扩增产物进行酶切鉴定。

第一步，以miRNA-208a合成标准物质(10mM)为模板，在实施例2获得的引物的作用下进行等温扩增，其中，20μL反应体系包括：上下游引物Primer-F(10mM) 和Primer-R(10mM)各1.5μL，10×等温扩增缓冲液2μL，Bst 2.0WarmStart^TM DNA 聚合酶(8000U/mL)0.8μL，液态聚乙二醇(分子量200-600)2μL，dNTPs(1～10mM) 2.5μL，MgSO₄(100mM)1.2μL，模板2μL以及6.5μL无酶水。将反应体系配制于 PCR反应管(200μL)中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，置于恒温环境63℃反应30分钟。

第二步，取5μL等温扩增产物，加入1.5μL AluI、2μL CutSmart缓冲液及11.5μLddH₂O，混匀后瞬时离心，在37℃条件下反应1小时，取5μL产物使用3.0％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

从图3中可以看出，经荧光定量分析仪读取结果，等温扩增产物显示特异性扩增峰，而经酶切反应后扩增峰消失。同时，等温扩增产物经3％浓度的琼脂糖凝胶电泳显示出典型的梯状条带，无弥散现象。经过酶切反应后，产物可被充分消化，可见扩增产物序列正确。结果表明，本发明等温扩增方法结果准确。

4、基于等温扩增技术的荧光定量试纸条检测方法的建立

以miRNA-208a合成标准物质(10mM)为模板，在实施例2获得的引物的引导下进行等温扩增，其中，20μL反应体系包括：上下游引物Primer-F(10mM)和Primer-R (10mM)各1.5μL，10×等温扩增缓冲液2μL，Bst 2.0WarmStart^TM DNA聚合酶(8000 U/mL)0.8μL，液态聚乙二醇(分子量200-600)2μL，dNTPs(1～10mM)2.5μL， MgSO₄(100mM)1.2μL，模板2μL以及6.5μL无酶水。将反应体系配制于PCR反应管(200μL)中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，置于恒温环境63℃反应30分钟。

待等温扩增反应结束后，向反应管中直接加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01 ～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2分钟，通过荧光定量分析仪读取数值。

结果如图4和表1所示，基于等温扩增技术的荧光定量检测方法结果稳定，有利于实际应用。

表1基于miRNA-208a检测阳性质控和阴性质控测试结果对比

注：CV表示变异系数。

实施例4：快速检测miRNA-208a荧光定量检测试剂盒的灵敏度测试

本实施例测试本发明荧光定量检测试剂盒检测miRNA-208a的灵敏度。将 miRNA-208a标准物质从1×10¹⁰pmol/L进行10倍梯度稀释至1pM。反应体系和程序如下所示：

20μL反应体系包括：上下游引物Primer-F(10mM)和Primer-R(10mM)各1.5μL， 10×等温扩增缓冲液2μL，Bst 2.0WarmStart^TM DNA聚合酶(8000U/mL)0.8μL，液态聚乙二醇(分子量200-600)2μL，dNTPs(1～10mM)2.5μL，MgSO₄(100mM)1.2μL，模板2μL以及6.5μL无酶水。将反应体系配制于PCR反应管(200μL)中，同时设置阴性对照(生理盐水)。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将样品置于恒温环境63℃反应30分钟。待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0， 0.01～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2分钟，通过荧光定量分析仪读取数值。

检测结果如图5所示，图中：特异性扩增曲线对应的miRNA-208a标准物质模板浓度分别为1×10¹⁰pmol/L、1×10⁹pmol/L、1×10⁸pmol/L、1×10⁷pmol/L、1×10⁶pmol/L、 1×10⁵pmol/L、1×10⁴pmol/L、1×10³pmol/L、1×10²pmol/L、1×10¹pmol/L，而1×10⁰ pmol/L和阴性对照则看不到明显的曲线(图5a)。判定本试剂盒的检测灵敏度为1×10¹ pmol/L，具有较高的灵敏度和应用价值。图5b为梯度稀释的miRNA-208a标准物质样品对应荧光值所建立的线性关系。

结果表明，本试剂盒的荧光定量检测方法的检测灵敏度为1×10¹pmol/L，具有较高的灵敏度和检测价值。

实施例5：快速检测miRNA-208a荧光定量检测试剂盒的特异性测试

用实施例3确定的优化反应体系及反应条件进行等温扩增及荧光定量检测。取miRNA-208a标准物质样品、正常人总RNA(使用RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Blood)提取正常人全血样本总RNA，正常人全血由东南大学附属中大医院提供)、非互补序列(GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAC AAGCTT)和无酶水，按照实施例3确定的优化反应体系和反应条件进行等温扩增，63℃反应30分钟。结果如图6和表2所示，仅miRNA-208a标准物质显示出特异性扩增峰，荧光值大于30000，而其他样品均无特异性扩增峰，荧光值均小于12。

结果表明，本发明荧光定量检测方法的检测特异性好，具有较高的检测应用价值。

表2基于miRNA-208a的检测方法特异性评价试验测试结果

实施例6：临床样本验证测试

1、基于血清样本的miRNA-208a荧光定量检测

用实施例3确定的优化反应体系及反应条件进行等温扩增及荧光定量检测。为了评估本发明方法在检测临床样品中miRNA-208a的应用性能，使用31例AMI患者的血清作为AMI组，该组患者均符合AMI的诊断标准且入院/住院验血时发病时间＜6小时，并且排除恶性肿瘤、肝肾功能不全以及既往有心肌梗死、脑卒中等CVDs病史的患者，在符合医院伦理要求情况下留取新鲜血液样本于EDTA抗凝管中，经4℃离心后置于－ 80℃冰箱保存备用。使用RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Blood)提取样品中的RNA。同时，随机选取近邻时间进行健康体检人群23例(身体无异常且未服用任何药物)作为对照组。

20μL反应体系包括：上下游引物Primer-F(10mM)和Primer-R(10mM)各1.5μL， 10×等温扩增缓冲液2μL，Bst 2.0WarmStart^TM DNA聚合酶(8000U/mL)0.8μL，液态聚乙二醇(分子量200-600)2μL，dNTPs(1～10mM)2.5μL，MgSO₄(100mM)1.2μL，模板2μL以及6.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将样品置于恒温环境63℃反应30分钟。待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2分钟，通过荧光定量分析仪读取数值。

结果如图7所示，31例AMI组(实心圆)荧光信号值表现为高值，而23例对照组 (空心圆)中的20例均未检测到明显的荧光信号值。AMI组和对照组的荧光信号值呈现极显著差异(P<0.0001)。此外，对照组中出现了3例假阳性样本，推测主要原因是 miRNA-208a与cTnI在发病后血清中出现的时间窗不同，这需要后续进一步的实验研究来验证。

2、miRNA-208a荧光值与cTnI相关性分析

用实施例3确定的优化反应体系及反应条件进行等温扩增及荧光定量检测。为了评估本发明方法中miRNA-208a对AMI的临床诊断价值，使用31例AMI组和23例对照组的临床cTnI值(由东南大学附属中大医院医学检验科提供)与其对应的miRNA-208a 的荧光定量信号值进行相关性分析。本发明中应用SPSS 23.0统计学软件对所得数据进行统计学分析，运用Pearson分析法对数据进行关联性分析。

20μL反应体系包括：上下游引物Primer-F(10mM)和Primer-R(10mM)各1.5μL， 10×等温扩增缓冲液2μL，Bst 2.0WarmStart^TM DNA聚合酶(8000U/mL)0.8μL，液态聚乙二醇(分子量200-600)2μL，dNTPs(1～10mM)2.5μL，MgSO₄(100mM)1.2μL，模板2μL以及6.5μL无酶水。将反应体系配制于PCR反应管(200μL)中。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将样品置于恒温环境63℃反应30分钟。待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2分钟，通过荧光定量分析仪读取数值。

结果如图8所示，AMI组的cTnI浓度为2.28±2.18ng/mL，而对照组的cTnI浓度为0.003±0.002ng/mL，两组结果差异极显著(P＜0.0001)。将miRNA-208a的荧光定量信号值与其对应的cTnI浓度进行相关性分析，结果如图9所示，miRNA-208a与cTnI 存在显著正相关(R²＝0.617)。

3、临界值(cutoff)的确定

基于本实验部分的miRNA-208a荧光值与cTnI相关性分析结果，制作ROC曲线对结果进行分析，同时剔除3个异常值之后，确定本发明方法的临界值(cutoff)(阴性样本的荧光值的平均值加3倍标准偏差)。结果表明，本发明基于miRNA-208a扩增引物的检测试剂盒和检测方法具有较高的灵敏度和特异性，cutoff值为141。

临床样本验证测试结果表明，本发明基于链交换等温扩增靶向miRNA-208a的定量检测方法对AMI的临床诊断具有较高的应用价值。

序列表

<110> 东南大学 徐州淮海生命科学产业研究院有限公司

<120> 基于链交换扩增的miRNA-208a扩增引物及其检测试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Primer-F(Artificial Sequence)

<400> 1

actggtggct gacagataag acgag 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Primer-R(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgactgaac gacacaagct ttttg 25

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> miRNA-208a-3p(Artificial Sequence)

<400> 3

auaagacgag caaaaagcuu gu 22

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> miRNA-208a-3p扩增片段(Artificial Sequence)

<400> 4

actggtggct gacagataag acgagcaaaa agcttgtgtc gttcagtcgg 50

Claims (9)

1.miRNA-208a等温扩增引物对，其特征在于，所述等温扩增引物对包含一条正向引物和一条反向引物，所述正向引物由正向的5’端侧平衡序列和正向的3’端侧扩增序列组成，所述正向的3’端侧扩增序列与miRNA-208a-3p的5’端侧序列同源；所述反向引物由反向的5’端侧平衡序列和反向的3’端侧扩增序列组成，所述反向的3’端侧扩增序列与miRNA-208a-3p的3’端侧序列互补；所述正向引物序列如SEQ ID NO：1所示；所述反向引物序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述等温的扩增引物对，其特征在于，所述正向引物和反向引物的工作摩尔比为1:1~ 1:3。

3.权利要求1或2所述的等温扩增引物对在制备miRNA-208a检测试剂盒中应用。

4.一种miRNA-208快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的等温扩增引物对。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述等温扩增引物对上标记有特定标记物，可选自生物素、地高辛、FAM、异硫氰酸荧光素、Cy3或Cy5荧光染料中的一种或几种。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括等温扩增缓冲液、BstDNA聚合酶、dNTPs、聚乙二醇、甜菜碱、无酶水、阳性对照和阴性对照。

7.根据权利要求4或5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光免疫层析试纸条。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光免疫层析试纸条包括底板、吸水纸、硝酸纤维膜、结合垫、样品垫，所述硝酸纤维膜上设有一条包被有二抗的质控线C线，还设有一条与所述质控线C线平行的包被有抗B抗体的检测线T线，所述结合垫包被有荧光微球抗A抗体偶联物，所述抗A抗体和抗B抗体可选自链霉亲和素、生物素、抗地高辛抗体或抗荧光染料抗体，所述抗荧光染料抗体可选自抗FAM抗体、抗FITC抗体、抗Cy3抗体、抗Cy5抗体，所述抗B抗体应选用与抗A抗体不同的抗体。

9.根据权利要求4~8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述等温扩增引物对中的引物适用工作温度范围为55~70℃，所述等温扩增引物对优选反应温度为61~63℃。

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