JPH03103199A - 核酸の検出方法 - Google Patents

核酸の検出方法

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JPH03103199A
JPH03103199A JP1303182A JP30318289A JPH03103199A JP H03103199 A JPH03103199 A JP H03103199A JP 1303182 A JP1303182 A JP 1303182A JP 30318289 A JP30318289 A JP 30318289A JP H03103199 A JPH03103199 A JP H03103199A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、相補性を有する２種の核酸によるハイブリッ
ド形成反応を利用した核酸の検出方法、該方法に用いる
固定化プローブ及び該方法を利用した遺伝子病に特有な
遺伝子の検出方法に関する。
〔従来の技術］ 本鎖のＤＮＡやＲＮＡが互いに相補性を有している場合
、相補性を有する部分が結合して二木鎖となりハイブッ
リドを形成する。このハイブリダイゼーション反応を利
用した核酸の検出や定量のための方法としてサザン法等
の種々の方法があり、遺伝子のクローニング、遺伝子組
換え、所望の遺伝子のスクリーニング、あるいは検体遺
伝子を用いた疾病の診断等の各種遺伝子工学的手法にお
ける基本的技術の一つとなっている。
核酸のパイプリダイセーションを利用した分析力法とし
ては、ＤＮＡやＲＮＡからなるプローブにハイブリッド
の検出のための標識を施し、これを試料核酸とハイブリ
ダイズさせ、形成されるハイブリッドをプローブに付与
した標識を利用して検出する方法が一般的である。
このプローブの標識化の方法としては、放射性同位元素
をプローブに導入する方法、あるいは発光反応、発色反
応、蛍光反応等に必要な化合物等をプローブに導入ある
いは結合させる方法等が用いられている。
プローブとしては、例えば動物、植物、微生物等から直
接分離した核酸断片、所定の基準に従ってクローニング
したクローン化核酸断片、合成機器によって合成したオ
リゴヌクレオチド等か、分析の目的等に応じて利用され
ている。
［発明が解決しようとする課題コ 遺伝子工学の発展にともない、ハイブリダイゼーション
を利用した核酸の分析法の利用頻度や応用範囲も拡大し
つつあり、より簡便な操作で感度良い分析が行なえる方
法に対する要請が高まっている。
例えば、放射性同位元素を用いた標識化は、ハイブリッ
ドの検出感度が良い等の利点を有する反面、放射性物質
を扱うので、そのための高価な試薬、特別な機器、装置
等が必要であり、また操作に危険性を伴なう。
これに対して、ビオチンーアジピンー抗アジビン抗体一
蛍光色素複合体の蛍光反応を利用する酵素による標識化
に代表される非放射性標識は、安全かつ簡便な操作によ
り標識化及び検出が行なえ、用いる試薬も安価であると
いう利点を有するが、プローブの標識に用いた場合に検
出感度が低くなり易いという欠点かある。
また、各種分析においては、標識化されるプローブとし
て１００塩基以上のヌクレオチド釦長を有する核酸断片
か用いられる場合が多い。このような比較的長い核酸断
片は、その標識化が比較的容易であるという利点を存す
るが、合成機による合成が困難であり、その調達に生体
からの分離操作やクローニング等の煩雑な作業が必要と
なるという欠点がある。
これに対し、１００塩基未満の長さの核酸断片は、合成
機器によって容易に合成できるという利点がある。しか
しながら、標識化、特に゜ニックトランスレーションや
酵素による標識化が容易でないという短所がある。
更に、複数棹のプローブを用いて複数種の核酸を同時に
分析したい場合に：形成されたハイブリッドにどのプロ
ーブが含まれているのかを判別するためには、各核酸に
対応するプローブのそれぞれに異なる標識を施す必要が
ある。しかしながら、このような操作は極めて煩雑であ
る。
方、疾病と関連する遺伝子の検出方法へのハイブリダイ
ゼーションを利用した核酸の分析法の応用が注目されて
いる。
遺伝子レベルでの変異等によって誘発される疾病として
、例えばフェニルケトン尿症、サラセミアなとの遺伝性
ヘモグロビン異常症、ＯＴＣ（ｏｒｎｉｔｉｎｅ　ｔｒ
ａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ）欠損症、Ｄｕｃｈｅｎ
ｎｅ型ｈ名ジストロフィ一等種々の遺伝子病が知られて
いる。
また、ある種の癌の発生に遺伝子変異による蛋白質の変
異が関与しているとの報告がある。
あるいは、ＡＩＤＳ，ＡＴＬ等の重篤な疾患がレトロウ
ィルスによって引き起されている可能性が高まっている
。
遺伝子病の診断は、一・般的には、遺伝子病に特徴的な
酵素の活性やタンパク質の量を測定し、その結果からこ
れらの欠損や異常があるかどうかを判断することによっ
て行なわれているが、場合によっては疾患の指標となる
酵素の存在がサンプリングの困難な臓器等の部分に極在
し、検体の人手が困難であったり、また測定すべき指標
酵素を特定できないこともあり、これらの診断方法は必
ずしも満足できるものではない。
また、ウイルス感染症の診断は、もっぱらＥＬＩＳＡ法
やＰＡ法により行なわれてきたが、これらの方法は必ず
しも正確なものではない。
遺伝子病、癌、ウイルス感染を、検体の採取が比較的容
易であり、正確な検査が期待できる遺伝子レベルでの診
断によって正確に甲期発見できれば、適切な治療を早期
に行なうことができる。そこで、遺伝子レベルでの診断
方法に対する要望が高まっている。
その有力な方法のー・・つとして、例えばＲＦＬＰ（ｒ
ｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔ
ｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）がある。
この方法は、ヒトの全遺伝子を制限酵素によって切断し
て得たＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で展開し、
これを放射性同位元素等により標識化したプローブＤＮ
Ａとパイプリダイズさせ、標識を利用して検出されるハ
イブリッドの電気沫動パターンを、ＩＥ常遺伝子で同様
にして得た電気泳動パターンと比較することによって疾
病と関連する遺伝子の存在を検出する方法である。
ＲＦＬＰ等を利用した遺伝子の解析による遺伝子病の診
断法は、より確実な診断を行なう−Ｅで極めて有用な方
法として注目されている。
しかしながら、これらの方法の実施に際しては、試験者
に対して分子生物学的知識や熟練した技術が要求され、
しかも操作が極めて煩雑であるため、医師、検査技術者
等の医療に携わっている者が容易に実施できる方法では
ない。
また、これらの方法は、ＤＮＡの切断、サザンブロッテ
ィング、パイプリダイゼーシ字ンの各工程にそれぞれ１
日程度の時間を要し、最終的な結果を得るまでに長時間
を要し、一・回の検査に取り扱える検体数に限りがある
ので、多くの患者のＤＮＡを多項目にわたって検査する
のは極めて困難な作業となる。
また、核酸のハイブリダイゼーションを利用した検出方
法の細菌等の微生物の分類法、特に病原菌の検定への応
用が注目されている。
微生物の分類学的な同定は、その微生物の生態学的性状
や生化学的性状を、標準微生物と比較検討することによ
って行なわれてきた。
ところが、このような方法では、検査法の違いによって
性状の判定が異なったり、どの性状に重点をおくかによ
って同定結果が異ったりする場合がある。
検体が感染症を引き起した患者から得た細菌等の場合、
その同定結果に誤りがあると、適切な対応処置ができな
いことになるので、より確実な同定法が特に必要とされ
る。
そこで、近年、より確実な同定法を提供する目的で、細
菌感染症における原因細菌の検出、同定にＤＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリダイゼ゜−ション法を用いる試みがなされて
きている。
この方法は、細薗のＤＮＡのなかで該細菌に特徴的な塩
基配列に青目してそれを基準配列とし、該払準配列と相
同性の高い塩基配列が検体細菌から抽出したＤＮＡ中に
存在するかどうかを、該基窄配列を検出できるプローブ
を用いたハイブリダイゼーション法によって調べること
によって、検体細菌の分類学的な同定を行なう方法であ
る。
この方法におけるプローブとしては、細菌の染色体から
クローン化したＤＮＡ断片、細菌の保持しているプラス
ミドそのもの、合成オリゴヌクレオチド等が用いられる
。
具体的には、プローブとして １）クローン化したランタムフラグメントを用いる方法
、 ２）リボゾームＲＮＡを用いる方法及び３）リボゾーム
ＲＮＡの塩基品列から選択した種や属に特徴的な塩基配
列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いる方法がある
。
上記１）の方法として、細菌から抽出したＤＮＡを適当
な制限酵素で切断して得たランダムフラグメントをクロ
ーン化し、そのなかから目的の分類群とのみ特異的に反
応するクローンを選択してプローブとして用いる方法が
、例えば、Ｃｒｉａｌｅ，　Ｍ．　Ｓ．，　Ｆｌｏｗｅ
ｒｓ．　Ｒ．Ｓ．　ｅＬ　ａｔ．；　ＤＮＡｐｒｏｂｅ
ｓ，　１４：ｌ−１４８．　１９８６等により知られて
いる。
上記２）の方法としては、Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ．　！’
．　Ｉｆ．；Ｊ．Ｈｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　
２３：４８１−４８４．　１９８６に開示された方法が
知られている。この方法は、細菌のりボゾームＲＮＡが
同一分類群内で比較的類似していることに着目した方法
であり、細菌の染色体中に多数の遺伝子コピーが存在す
るので、リポゾームＲＮＡを用いれば検出感度が高くな
るという利点がある。
Ｅ記３）の方法としては、ｌ’ｒｏＬｅｕｓ属のりボゾ
ームＲＮＡの塩基配列から選択した、Ｉｌｒｏｔｅｕｓ
属に属する細菌の属、挿または他種等に特異的な塩基配
列をプローブに利用した例が（ｌｌａｕｎ，Ｇ．　＆Ｇ
ｏｂｅｌ，Ｕ．；　　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
ＬｅＬｔ、，４３：　　＋８７−＋９４；　１９８７に
報告されている。
しかながらこれらの方法においても、先に述べたハイブ
リダイゼーションを利用した核酸の各種分析方怯におけ
る問題点を共通して有している。
本発明は、以Ｌ述べたようなハイブリダイセーション法
を利用する従来の各種検出方法におｉｆる問題点に鑑み
なされたものであり、その目的は、簡便かつ正確に実施
できるパイプリダイセーション法を利用した核酸の検出
方法を提供することにある。
［課題を解決するための手段］ 本発明の核酸の検出方法は、試料核酸とプローブ核酸と
を反応させ、得られた反応混合物中への被検出核酸・プ
ロープ核酸ハイブリッドの形成のイｆ胤を分析する過程
を含む核酸の検出方法において、 ａ）試料核酸とプローブ核酸とを反応させる過程と、 ｂ）過程ａで得られた反応混合物中に形成されたハイブ
リッドのみに標識を施す過程と、Ｃ）過程ｂにおいて標
識化されたハイブリッドを該標識を利用して検出する過
程と を含むことを特徴とする。
本発明は、ヒト、動物、植物、細菌等の微生物、真菌、
原生動物等の生体に由来するＤＮＡやＲＮＡ、クローン
化ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、合成ＤＮＡ等の各種核酸の検
出、定量に利川でき、検出対象となる核酸（被検出核酸
）の種類は限定されない。
プローブ核酸としては、被検出核酸と効果的にハイブリ
ダイズできる塩基配列を有する核酸であればどのような
ものでも利用できるが、合成機で手軽に合成できる比較
的短いヌクレ才チド鎖長のオリゴヌクレオチドが利用し
易い。
プローブ核酸のヌクレオチド鎖長は、被検出核酸のヌク
レオチド鎖長の１７１０以下とするのが好ましい。
なお、本発明においては、プローブ核酸と被検出核酸か
らなるハイブリッドに標識が施されるので、プローブ核
酸自体には標識化に必要な要件は要求されない。
例えば、ニックトランスレーション法や標識酵素の結合
法を用いる標識では、標識される核酸がある程度以七の
ヌクレオチド鎖長を有する必要があるが、本発明で利用
するプローブ核酸にはこのような要件は要求されない。
従って、人手（調製）し易く、かつ上述のように高感度
な検出を実現し得る短いヌクレオチド釦長のものがプロ
ーブ核酸として利用できるようになる。
しかしながら、本発明においては形成されたハイブリッ
ドに標識か施されるので、プローブ核酸の構成やヌクレ
オチド長を、形威されたハイブリッドの標識化が容易で
あるように選択することが望ましい。
例えば、後述するような、ハイブリッドの二木鎖部分の
一方のヌクレオチド鎖をブライマーとして利用し、その
末端からヌクレオチド錯を伸展させ、その伸展部分に標
識物質を取り込ませる方法による標識化方法で、プロー
ブ核酸をブライマーとして利用する場合、形成されるハ
イブリッドが、プローブ核酸とパイプリダイズした被検
出核酸のヌクレオチト１ｎがブライマ一端部の伸展の際
の鋳型として機能できるような構成、すなわちプローブ
核酸の末端伸展方向に被検出核酸のヌクレオチトコｎが
一木釦の状態で存在する構成を有している必要がある。
従って、このようなプローブ核酸をブライマーとして利
用するこの標識化方法の場合には、プローブ核酸の構成
やヌクレオチド長を、形成されるハイブリッドの構造を
考慮して決定するのが望ましい。
なお、場合によっては試料核酸をブライマーとして利用
するものであっても良い。
試料核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションは
、常法に従って行なうことができる。
なお、ハイブリッド形成反応の条件は、用いられるプロ
ーブ核酸の有するヌクレオチド釦長や塩基配列などによ
って異なるので、パイプリダイゼーションにおける操作
条件は所望とする目的に応じて最適条件を適宜選択する
と良い。
このハイブリッド形成反応は、一般的には、ホルムアミ
ド、適当な塩及びＤｅｎｈａｒｄＬ溶液を含むハイブリ
ダイゼーション溶液中で、温度をコントロールして行う
ことができる。
このハイブリッド形成反応には、試料核酸とプローブ核
酸とをハイブリダイゼーション溶液中で反応させる方法
、担体に固定化されたプローブ核酸にパイプリダイゼー
ション溶液中で試料核酸を反応させる方法、担休に固定
化された試料核酸にハイブリダイゼーション溶液中でプ
ローブ核酸を反応させる方法等か利川できる。
試料核酸やプローブ核酸の固定化には、核酸をニトロセ
ルロース、ナイロン膜、各種ゲル等の担体に、物理的あ
るいは化学的に結合させる方法が利川できる。
本発明の方法においては、試料核酸とプローブ核酸を反
応させ、その結果形成させれたハイブリッドに選択的に
標識が施される。
この標識化の方法としては、例えばハイブリッドの二木
鎖部分を構成する鎖の一方をブライマーとして利用し、
その末端を伸展させて１本鎖部分を２本鎖化する際に、
その新たに合成される伸展部分に標識物質を取り込ませ
る方法等が利用できる。
この方法によれば、ハイブリッドを形成していない核酸
には、新たな二木鎖部分形成のためのブライマーとして
機能する部分及び伸展部分形成用の鋳型となる部分が存
在しないので、上記の標識物質を取り込む二本釦化反応
が生じない。
従って、ハイブリッドを形成していない核酸とハイブリ
ッドとの混合物状態で、この標識化反応を行なっても、
ハイブリッドのみに選択的に標識を施すことができる。
この標識化には、ブライマーを利用して新たな２本鎖部
分を合成するための種々の方法が利用できる。
例えば、ブライマ一端部の伸展に必要な、ｄＡＴＰ．　
ｄＣＴＰ，　ｄＧＴＰ，　ｄＴＴＰなどのヌクレオチド
と標識化すべきハイブリッドとをヌクレオチド鎖形成用
の酵素の存左下で反応させ、その際に用いるヌクレオチ
ドの１または２以上に標識化ヌクレオチトを用いて、新
たに形成されるヌクレオチド釦に標識を取り込ませる方
法等を利用できる。
この標識化ヌクレオチドとしては、一般にプローブの標
識に利用されている、例えば放射性同位元素（Ｒｌ）に
より標識化されたもの、例えばビオチン、ジニトロフエ
ニルヌクレオチドＫＭ　導体等の蛍光、発光または発色
を誘発するのに必夢な酵素や化合物などの非放射性標識
物質（ｎｏｎＲｌ）で標識化されたものなどが利用でき
る。
ヌクレオチド釦形成用の酵素としては、大腸菌ＤＮＡポ
リメラーセエ、ＤＮＡポリメラーゼエのクレノー断片、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ等の各種ＤＮＡのポリメラーゼ
や逆転写酵素などが利用できる。
本発明における標識化は、ハイブリッドが適当な担体に
固定化した状態で、あるいはハイブリッドを適当な溶媒
中に溶解あるいは分散した状態で行なうことができる。
なお、標識化の反応終了後に、標識化されたハイブリッ
ドと、ハイブリッドに取り込まれなかった標識物との分
離は、例えば以゛Ｆのような方法により行なうことがで
きる。
（１）固定化プローブ核酸を用いた場合；適当な担体に
固定化した固定化プローブ核酸に試料核酸を反応させる
。この反応でハイブリッドがＩＦｅ成された場合には、
ハイブリッドも担体に固定化されている状態となる。そ
の状態で、更に標識化処理を行なった後、適当な条件下
、例えば塩濃度や温度を変えて担休を洗浄し、ハイブリ
ッドに取り込まれなかった標識物を洗い出して除去する
。
（２）固定化試料核酸を用いた場合； 適当な担体に固定化した試料核酸にプローブ核酸を反応
させる。この反応でハイブリッドか形成された場合には
、ハイブリッドも担体に固定化されている状態となる。
以下、上記（１）の方法と同様にして担体を洗浄し、ハ
イブリッドに取り込まれなかった標識物を洗い出して除
去する。
（３）試料核酸とプローブ核酸を固定化しないで反応さ
せた場合； 適当な媒体中でプローブ核酸と試料核酸を反応させる。
得られた反応液に、更に標識化処理を行なった後、ハイ
ブリッドとハイブリッドに取り込まれなかった標識物と
を適当な分離方法によって分離する。
この分離方法としては、エタノール沈殿法、ゲルろ過カ
ラムによる分離等が利用できる。
なお、プローブ核酸を上述の反応のブライマーとして利
用する場合には、プローブ核酸としてハイブリッド形成
後にプライマーとして利用し得る構成やヌクレオチド３
ｎ長を有するものを用いるのが望ましい。また、場合に
よっては、試料核酸をブライマーとして利用しても良い
。
なお、通常、同程度の標識量を用いた場合に、一般にＲ
ｌ標識に比べてｎｏｎＲＩ標識は低感度であるが、本発
明の方法ではｎｏｎＲＩ標識な用いた場合でも高感度な
検出が可能となる。
従来の方法では、短いヌクレオチド鎖長のプローブ核酸
を標識化して用いる場合が多いが、このような場合には
標識取り込み部の量が制限され、標識の取り込み量に限
界がある。
これに対して、本発明の方法では、上述の標識化の操作
においてプライマーとなる核酸の末端の伸展により新に
今威される２本鎖部分の長さが十分に長いものとなるよ
うに、プローブ核酸と試料核酸の組合せを考慮して用い
ることにより、標識化における標識の取り込み量を多く
させることができ、ｎｏｎＲＩ標識を用いた場合でもそ
の低感度性を多量の取り込み量で補填することができ、
高感度な検出が可能となる。
ハイブリッドの標識化が終了したところで、該標識を利
用してハイブリッドの検出を行なう。
なお、形成されたハイブッリドの有する標識量を定量的
に分析することによって、被−検出核酸の定量を行なう
ことができる。
以上の操作において、プローブ核酸として、複数種の核
酸を用いることにより、試料核酸中に複数の被検出核酸
が含まれている場合にそれらを同時に検出することがで
きる。
複数種のプローブを用いる方法の代表例を以下に示す。
ａ）固定化プローブを用いる方法； まず、複数種の被検出核酸のそれぞれに対応した複数種
のプローブ核酸を、どの位置にどのプローブ核酸が配置
されているかがわかるように所定の配列で固定化し、そ
れを試料核酸と反応させる。
反応終了後、形成されたハイブリッドに標識を施すため
の処理を行ない，該標識を利用してハイブリッド形成位
置を検出する。陽性を示す位置から対応するプローブ核
酸の種類を特定し、その結果から試料核酸中に含まれて
いた被検出核酸の種類を判定する。
この方法では、プローブ核酸が予め設定された位置で固
定されているので、どのプローブ核酸に試料核酸がパイ
プリダイズしたかが，このプローブ核酸の予め設定され
た固定位置から容易に判定できる。
従って、標識化したプローブを、固定化した試料核酸と
反応させる従来の方法におけるように、複数種のプロー
ブ核酸のそむぞれを選別できるように、各プローブ核酸
で異なる標識を用いる必要がない。
なお、同一操作で複数種のプローブ核酸でのハイブリッ
ド形成反応を同時に効率良く行なわせるには、各プロー
ブ核酸のヌクレオチド鎖長を、複数種のプローブ核酸に
おける個々のハイブリッド形成反応が同一条件化で進行
するために必要な長さに調節しておくことが好ましい。
具体的には、例えば個々のハイブリッド形成反応におい
て形成されるハイブリッドの解離温度（Ｔｍ：−本鎖化
する温度）をそろえておくと良い。
すなわち、Ｔ．値の算出には、用いるパイプリダイゼー
ション溶液の種類によって種々の数式が用いられている
。例えば、０．９Ｍ　Ｎａｉｌ中では２０ｍａｒ以下の
オリゴヌクレオチドのＴ．ａは、Ｔ．＝２Ｘ　（Ａ＋Ｔ
）＋４Ｘ　（Ｇ＋Ｃ）（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃはそれぞれアデ
ニン、チミン、グアニン、シトシンの数を表す。） で示される（続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ，
Ｐ２３６参照）。
そこで、これに従い、それぞれのプローブ核酸の塩基配
列をその式に代入して各プローブ核酸でのＴイ値がそろ
うようにそれらの長さを選択すると良い。
複数種のプローブ核酸のヌクレオチド鎖長は、被検出核
酸のヌクレオチド鎖長の平均のｌ／】０以下とするのが
好ましい。
ｂ）マイクロプレート等の独立した反応領域を有する担
体を用いる方法； まず、マイクロプレート等の独立した反応領域をイｆす
る担体の各反応領域に試料核酸を含むパイプリダイゼー
ション用の溶液を調製する。
次に、複数種のプローブ核酸のそれぞれを単独で反応領
域に加え、ハイブリダイゼーションを行なう。その際、
どの反応領域にとのプローブ核酸が加えられたかがわか
るようにしておく。
反応終了後、各反応領域内で形成されたハイブリッドの
標識化に必要な反応を行なわせてから、該標識を利用し
てハイブリッド形成を検出し、陽性を示す反応領域から
対応するプローブ核酸の種類を特定し、その結果から試
料核酸中に含まれていた被検出核酸の秤類を判定する。
なお、同一操作で複数種のプローブ核酸でのハイブリッ
ド形成反応を同時に効率良く行なわせるには、各プロー
ブ核酸のヌクレオチド鎖長を、複数種のプローブ核酸に
おける個々のハイブリッド形成反応が同一条件化で進行
するために必要な長さに調節しておくことが好ましい。
例えば、上述したようにＴ．がそろうように各ヌクレオ
チド鎖長を選択すると良い。
複数種のプローブ核酸のヌクレオチド鎖長は、被検出核
酸のヌクレオチド鎖長の平均のｌ／１０以下とするのが
好ましい。
以上の方法ａ．ｂを含む複数種のプローブ核酸を利用す
る場合の本発明の方法においては、標識化したプローブ
を固定化した試料核酸と反応させる従来の方法における
ように、複数種のプローブ核酸の選別のための各プロー
ブ核酸への異なる標識による標識化を行なう必要がない
。
一方、複数種の試料核酸に対して１種のプローブ核酸を
用いた複数種の試料核酸の同時検査を行なうこともでき
る。
例えば、複数種の試料核酸を、どの試料核酸がどの位置
にあるかわかるように適当な担体に固定し、１種のプロ
ーブ核酸と反応させ、形成されたハイブリッドの標識化
及び標識の検出のための処理を行なうことにより、陽性
を示す位置に対応する試料に被検出核酸の存在を確認で
きる。
更に、この方法は、マイクロプレート等の独立した反応
領域を形成できる担体で、核酸を固定せずに行なうこと
もできる。
以上説明した本発明の核酸の検出方法は、遺伝子病、癌
、ウィルス感染症に特有な遺伝子の検出に１ｆ用である
。
遺伝子病等に特有な遺伝子を検出する方法としては、例
えば以下の過程を含む方法等を挙げることができる。
■、検査項目である疾病の指標となる遺伝子と関連する
プローブ核酸を適当な担休に固定化する過程。
■、過程■で得た固定化プローブと検体染色体ＤＮＡ　
（試料核酸）を反応させる過程。
■、過程■を経た担体に、形成されたハイブッリドの標
識化に必要な処理を行なう過程。
■、過程■で形成されたハイブッリドを過程■で行なっ
た標識を利用して検出する過程。
１二記過程０で使用される核酸プローブとしては、遺伝
子病等の遺伝子に特有な塩基配列の認識に必要な塩基配
列を有するものが適宜選択されてい用いられ、そのヌク
レオチド鎖長は特に限定されない。
例えば，一塩基対の置換による点突然変異に基づく疾患
を検出する場合には、一塩基の違いを効果的に、かつ感
度良く判定する上で、核酸プローブとしては、１００塩
基以下、好ましくは２９塩基以下、より好ましくは１７
〜２０塩甚からなるオリゴヌクレオチドが用いられる。
また、点突然変異に対応する置換部位は、プローブ核酸
としてのオリゴヌクレオチドの中央Ｃ位置するように配
置するのが、より正確な判定を行なう上で好ましい。
過程０において、同一・担体上に予め決められた配列で
複数検査項目に対応した複数種のプローブ核酸を固定し
ておけば、複数項目にわたった検査を同時に行なうこと
ができる。なお、この方法には、先に述べた複数のプロ
ーブ核酸を用いる方法のａの方法における操作が適用で
きる。
過程■で用いる検体ＤＮＡとしては、染色体ＤＮＡその
もの、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素によって適当な長
さに切断したもの等が利用できる。
なお、多項目の検査を同時に行なう場合，には、制限酵
素で適当な長さに切断した断片を利用するのが効率が良
い。
またハイブリッド形成反応は、先に述べたような方法に
よって行なうことができる。
この方法で、点突然変異を検出する場合、一つのヌクレ
オチドの違いだけでは、プローブと核酸とのミスマッチ
が発生して、点突然変異に有無の差別化ができない場合
がある。
しかしながら、ハイブリッドのＴ．は、ミスマッチハイ
ブリッドにおける相補的でない塩基対数、プローブ核酸
のＧ（グアニン）及びＣ（シトシン）の含量、プローブ
核酸のヌクレオチド鎖長，点突然変異の位置、ミスマッ
チの種類等によって影響されるので、所望の点突然変異
の検出を阻害するミスマッチハイブリッドの発生のない
温度条件等を、用いるプローブ核酸の構成等に応じて選
択することが重要である。
例えば、ミスマッチハイブリッドに含まれる相補的でな
い塩基対１つあたりＴ１は５〜ＩＯ”Ｃ降下する。
従って、ハイプダイゼーションの温度は、所望とするハ
イブリッドのＴｆｆｌと形成し得るくスマッチハイブリ
ッドのＴ１を考慮して選択する必要がある。
また、同一担体Ｅに複数種のプローブ核酸を固定化して
用いる場合には、上述のミスマッチに係る要件に加えて
、各プローブ核酸により形成されるハイブリッドのＴ，
が揃うように、これらのヌクレオチド鎖長等を調節して
おくと良い。
過程０における標識化には先に挙げた方法等が利用でき
る。
過程■は、用いた標識に応じた方法によって行なわれる
。
なお、Ｅ述の方法ではプローブ核酸を固定化して用いた
が、ブロープ核酸の代りに検体核酸を固定化しても良い
。
すなわち、複数検体のそれぞれを固定位置がわかるよう
に固定し、これに１種のプローブ核酸を反応させるよう
にすれば、１つの検査項目について、複数個の検体を同
時に検査することができる。
更に、検体核酸とプローブ核酸のいずれも固定化せずに
反応させても良い。
そのような方法の−・例として以下の過程を含む方法等
が挙げられる。
■、検体核酸とプローブ核酸を適当な媒体中でハイブリ
ダイズさせる過程。
■、過程■で得た反応液に形成されたハイブリッドの標
識化に必要な処理を行なう過程。
■、過程ので形成されたハイブリッドを過程■で行なっ
た標識を利用して検出する過程。
なお、これらの方法におけるハイブリダイゼーション、
ハイブリッドの標識化、標識によるハイブリッドの検出
等の操作は先に説明した操作によって行なうことができ
る。
また、先に複数種のプローブ核酸を用いる方法のｂの項
で説明した操作に従って複数種のプローブ核酸を個々に
用い■〜■の過程を、複数種のプローブ核酸について同
時に行なうことで、複数の検査項目の同時検査が可能で
ある。
一方、マイクロプレート等の独立した反応領域を形成で
きる担体の反応領域に、複数の検体核酸を，どの反応領
域に、検体か入っているかがわかるように別々゛に投入
した後、各ウェルに同種のブロープ核酸を加えて、パイ
プソダイゼーション、ハイブリッドの標識化、標識の検
出のための処理を行なうことにより、陽性を示すウェル
に対応する試料核酸が検査項目に対して陽性がどうかを
判定できる。
以上の遺伝子病等に特有な遺伝子の検出方法において、
細菌やウィルス等の微生物に特有の塩基配列を有する核
酸をプローブとして用い、試料として微生物から分離し
た核酸を用いることによって、微生物の分類字的な同定
を行なうことができる。
その際のプローブ核酸としては、細菌の分類の場合には
、２０ｍｅｒ程度のヌクレオチド鎖長を有するもの、ウ
ィルスの分類の場合には２０ｍｅｒ程度のヌクレオチド
鎖長を存するものが奸適である。
［実施例］ 実施例Ｉ ＤＮＡ合成機（ＡＢ１社、３８１Ａ型）によりプラスミ
トｐｕｃ　＋９の−・部を構成する以下のＤＮＡ塩基配
列を有する４　１ＩＩｌｅｒオリゴヌクレオチドを合成
した。
５′３′ ＧＡＴ（：ＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧＣ
ＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧ八八ＴＧ合成物の一部を用
い、７Ｍ尿素を含むｌ５９６ボリアクリルアミドゲル電
気泳動によりその純度を調べたところ、９０＊以上の純
度を有していると判定さられたので、この合成物は精製
せずに以下の操作に直接用いた。
この合成物の５０μｇを含む溶液５０μ１を、混合試薬
液［　０．６４Ｍカコジル酸カリウム、３．３＋ｎＭＣ
ａＣｌ，　，　０．３３ｍＭジチオスレイトールを含む
０．１２Ｍトリス−ＯＮ　（ｐＨ６．９）　］の１００
　μｌ　、４．０ｍＭビオチン化ＵＴＰ（ＢＲＬ社製）
　４０μ＋　，　１．０ｍＭ　ｄＴＴＰ１μ１，水１０
０μ１及びＴｄＴ　（Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｄｅｏｘｙ−
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）１
５μ１　　（約９０単位）と混合し、１０分間、３０℃
で反応させた。なお、反応は、０．２Ｍ　ＥＤＴＡ　４
μ１の添加によって停止させた。
反応を惇止させた後、フェノール処理、エタノール沈殿
を行ない、得られた沈殿物を乾燥後、水１００μ１に溶
解させた。
アガロース（ゲル）を臭化シアンで活性化し、それにア
ビジンを結合させて固定相（担体）を形成した。
得られた固定相を、先に得た４　１ｍｅｒオリゴヌクレ
オチドを処理して得た沈殿物の水溶液に加え、２０分間
ゆっくり攪拌しながらこれらを混合した後、かるい条件
で遠心処理し、上清を除去し、固定化プローブ核酸を得
た。
一方、試料核酸として、プラスミドｐｌ）Ｒ　３２２（
試料Ａ）、プラスミドｐｕｃ　１９　（試料Ｂ〉及びブ
ラスミドｐＢＲ　３２２とプラスミドｐｕｃ　１９の混
合物（試料Ｃ、混合重量比１：１）を用意し、これらの
試料を常法によって［ｃｏＲＩ　（ＴＯＹＯＩＩＯ製）
で消化してから、得られた消化物を加熱処理して、二本
鎖ＤＮＡを１本鎖化し、各試料から得られた３種の一本
鎖ＤＮＡを含む反応生成物を個クに用いて以下の操作を
行なった。
一本鎖ＤＮＡを含む反応生成物２０μｇと、先に調製し
た固定化プローブ核酸を試験管に入れ、これに１０×ア
ニリーング溶液［１ｘアニリーング溶液：　６０ｍＭ　
ＭｇＣＩｚ、６　０ｍＭ　　β−メルカブトエタノール
及び５００ｍＭ　ＮａＣＩを含む１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐｏａ．ｏ）］の１０１．ＬＩを加え、更に
全体が１００μｌとなるように蒸留水を加えた。
得られた混合溶液を６５℃に１０分間にわたって加温し
てから、その温度を室温まで約１時間かけて徐々に下げ
た。
次に、得られた反応液に、１０×アニリーング溶液１０
μ！　，　ＩｍＭ　ｄＡＴＰ　１０　μ！　，　１ｍＭ
　ｄＣＴＰ　１０　μ１及びＩｍＭ　ｄＧＴＰ　１０　
μｌを加えた後、ｐ　”−ＴＴＰＩＯＯＣｉを添加し、
全量を蒸留水によって２００μ１として標識化用の溶液
を調製した。
この標識化用溶液に、クレノー断片（ＴＯＹＯＢＯ社製
）の５単位を加え、水冷下で１時間反応させた。
反応終了後、反応液中から固体相を分離し、これをＴＥ
ｉ衝液で２度洗浄し、シンチレーションカウンターによ
ってその放射線の計量を行なった。
その結果、試料Ｂを用いた操作及び試料Ｃを用いた操作
で最終的に得られた固体相において＋０８ｃｐｍ程度（
試料Ａを用いた場合の約１０’倍）の放射線が計数され
、これら試料Ｂ及びＣ中にＰＩ（；　１９が存在するこ
とが確認された。
実施例２ ＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社、３８１Ａ型）によりブラスミ
ドｐｕｃ　＋９の一部を構成する以下のＤＮＡ塩基配列
を有する４　１ｍａｒオリゴヌクレオチド（プローブＡ
）と、プラスミドｐＢｎ　３２２の一部を構成する以下
のＤＮＡ塩基配列を有する４　１ｍａｒオリゴヌクレオ
チド（プローブＢ）を合成した。
プローブＡ ５′　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　３′６八ＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣ
八ＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣ（：ＴＧ八ＡＴＧＧＣＧ八ＡＴ
ＧプローブＢ ５′３′ ＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣ（ｄ；ＣＴ
ＴＡＴＣＣＧＧＴＡ八ＣＴＡＴＣＧＴこれらの合成物の
純度を、実施例１と同様の操作で調べたところ、いずれ
も９５ｔ以上の純度を有していた。これらの合成物は精
製せずに以下の操作に直接用いた。
これらの合成物のそれぞれの２００ｎｇ／μｌ濃度のス
ポット用溶液を調製し、その２μｌずつをニトロセルロ
ースフィルター（シュライヒャー＆シャネル）にプロー
ブＡとＢのスポットか第１図に示１−ように配列される
ようにスポットし、乾燥させた後、８０℃、２時間の焼
付けを行なった。
一方、試料核酸として以下のものを用意した。
試料Ｄ： ブラスミドｐｕｃ　＋９と大腸菌ＪＭ１０９株から常法
により調製した染色体プラスミドの混合物（混合重量比
、１：１） 試料Ｅ； プラスミドｐＢＲ　３２２と大腸菌Ｈ旧旧株から常法に
より調製した染色体プラスミドの混合物（混合重量比、
１：ｌ） 試料Ｆ： 大腸菌１１ＢＩＯＩ株から常法により調製した染色体ブ
ラスミド 試料ＤＮＦを個々に用いて以下の操作を行なった。
試料１μｇを含む溶液２μＩに、ｌＯｘｌ’Ａ緩衝液２
、θμ１及び水１６．０μ１を混合し、得られた混合液
にｌＯ単位のｌｌｉｎｄＩＩＩ　（ＴＯＹＯＢＯ製）を
加え、３７℃で２時間放置して、反応させた。
反応終Ｔ　ｆ＆、反応液を、９５℃、５分間加熱して、
二本鎖ＤＮＡを一本鎖化した後、１００零本ルムアミド
９ｍｌ、２０ｘ　ＳＳＣ　５　ｍｌ、５０Ｘ　Ｄｎｈａ
ｒｄｔ溶液０．４＋ｎｌ，　ＩＭリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ６．５）　０．４ｍｌ及び５０．０ｍｇ／ｍｌ濃度の
変性サケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ　（　Ｓｉｇｍｅｒ社製）　０
．ｌｍｌ　と混合し、パイプリダイゼーション用の溶液
とした。
以上の操作によって、各試料がらの３種のパイプリダイ
ゼーション用溶液が得られた。
次に、各ハイプリダイゼーション用溶液に先に容易した
プローブ核酸を固定したフィルターをそれぞれ浸漬し、
ハイブリダイゼーションを行なった。
具体的には、フィルターを、最終濃度が３×ＳＳＣ／及
びｌｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔとなる溶液の２００ｍｌに４
２℃で３０分間浸漬してブレハイブリダイゼーションを
行なった後、ポリエチレン製の袋内にフィルターがハイ
ブリダイゼーション用溶液に浸漬されるようにこれらを
入れて密封し、これらを４２℃で１２時間反応させた。
反応終Ｙ後、ポリエチレン製袋から取り出したフィルタ
ーを２ｘ　ＳＳＣ／０．１９６ＳＯＳ　５００ｍｌに浸
たし、室温で２５分間洗浄し、続いて０．２Ｘ　ＳＳＣ
／Ｏ．ｌ９６ＳＤＳ５００ｍｌで同様に室温で３５分間
洗浄した。
次に、洗浄後の各フィルターを以下の組成の標識化用の
溶液に浸漬した状態で、ポリエチレン製袋内に密封し、
３７℃、２時間放置して反応させた。
標識化用溶液組成； １ｍＭ　ｄＡＴＰ　　　　　　　　　　　２０μｌｍＭ
　ｄＧＴＰ　　　　　　　　　　　２０μＩｍＭ　ｄＣ
ＴＰ　　　　　　　　　　　２０　ｐ０．４ｍＭビオチ
ン化ＵＴＰ　　　　　　５０　μ１０Ｘアニーリング溶
液　　　　１００μクレノー断片　　　　　　　　　Ｉ
Ｏμ計２ｍｌ 反応終了後、取り出した各フィルターをＴＥ緩衝液で洗
浄してから、常法（　Ｂｉｏｉｎｄｕｓｔｒｙ，　Ｖｏ
ｌ．　３，Ｎｏ．　６．　１９８９．　ｐ４７９−５０
４等参照）に従って、呈色反応を行なった。
その結果、試料Ａからのハイブリダイゼーション溶液と
反応させたフィルターではプローブＡのスポット部分が
発色し、また試料Ｂからのハイブリダイゼーション溶液
と反応させたフィルターではプローブＢのスポット部分
が発色した。これに対し、試料Ｃからのハイブリダイゼ
ーション溶液と反応させたフィルターではスポット部分
における発色は認められなかった。
実施例３ フエニルアラニン尿症患者の白血球ＤＮＡに見られるＰ
ＡＨ遺伝子の変異のなかで頻度の高い変異（木部）とし
て以下のものが知られている。
ハブロタイブ３ 正常：　”’ｒＣＣＡ丁ＴＡＡＧＡＧＴＡ八ＧＴＡＡＴ
ＴＴ”　（プローブｌ）異常：　”ＴＣＣＡＴＴ八Ａ（
：ＡＡＴＡＡＧＴＡＡＴＴＴ”　（ブロープ２）＊ ハブ口タイプ２ 正常：　５′ｃＡｃＡＡｒＡｃｃＴｃｃＧｃｃｃｒｒｃ
ｒｃ３′（プローブ３）異常：　５′ＣＡＣＡＡＴＡＣ
ＣＴＴＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣ”　（プローブ４）＊ そこで、これら４種のオリゴヌクレオチドをプローブ核
酸として利用するためにＤＮＡ合成機（ＡＢ１社、３８
１　Ａ型）で合成した。
なお、得られた合成物の純度を実施例１と同様の操作で
調べたところ、いずれも９５ｔ以上の純度を有していた
。
これらの合成物を直接用い、実施例２と同様の操作によ
り、ニトロセルロースフィルターに各プローブのスポッ
トを第２図に示す配置で形成した。
次に、仔意に選択した検体提供者からの培養羊水細胞か
ら、常法に従って、２本鎖ＤＮＡを抽出し、Ｐｖｕ　Ｉ
Ｉで消化した後、１００℃、ｌＯ分間の加熱処理により
２本鎖ＤＮＡを１本鎖化した。
容器内に、各プローブのスポットを形成したフィルター
と、１０×ア二一リング溶液０．５ｍｌを入れ、更に蒸
留水を加えて全体の容量を５ｍｌとし、溶液にフィルタ
ーが浸漬されるようにした。
これに、先に得た検体としての１本３５　Ｄ　Ｎ　Ａ断
片混合物を加え、６５℃、１０分間放置した．所定時間
経過後、約１時間かけて反応液を徐々に室温まで放冷し
た。
なお、この反応によってハイブリッドが形成された場合
、第３図に示すようなプローブと検体ＤＮＡとの部分的
二本鎖が形成されていると考えられる。
次に、室温まで放冷された反応液に、ｌｍＭｄＡＴＰ　
０．２ｍｌ，　ＩｍＭ　ｄＧＴＰ　０．２ｍｌ、ＩｍＭ
　ｄＣＴＰ　０．２ｍｌ、０．４ｍＭビオチン化υＴＰ
　Ｏ．５ｍｌ　，　ＩＯｘアニーリング？液　０．５ｍ
ｌ及び蒸留水：ｌ．４ｍｌを加えた後、更にクレノー断
片１６単位を加え、３７℃で１時間反応させた。
この反応で、第３図に示すような二本鎖部分を有するハ
イブリッドが形威されている場合には、その二本釦部分
のプライマーとして機能する片方の釦の３゜末端からＤ
ＮＡが合成され、末端が３゜末端下流へ向けで（矢印方
向に）進展する。
その際に、新しく形成される片側のヌクレオチド鎖内に
標識が取り込まれることになる。
次に、未反応のビオチン化ＵＴＰを除去するために、フ
ィルターを２ｘＳＳＣで洗浄した。
洗浄後のフィルターを常法に従った発色反応にかけたと
ころ、プローブ２のスポットが発色したので、この検体
提供者はフエニルアラニン尿症の疑いがあると判定され
た。
実施例４ 任意に選択した数人の検体提供者からの培養羊水細胞を
個々に用い、常法に従って、２木■ｎＤＮＡを抽出し、
Ｐｖｕ　１１で消化した後、１００℃、１０分間の加熱
処理により２本ｉｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａを１本鎖化し、各検
体提供者からの一本鎖ＤＮＡ混合物を得た。
次に、実施例２と同様にして、各ＤＮＡ混合物（各２μ
ｇ）をニトロセルロースフィルターに、どのスポットが
どの検体提供者からのものであるかがわかるようにスポ
ットした。
更に、容器内に、各検体ＤＮＡ混合物のスポットを形成
したフィルターと、ＩＱＸアニーリング溶液０．５ｍｌ
を入れ、史に蒸留水を加えて全体の容量を５ｍｌとし、
溶液にフィルターが浸漬されるようにした。
これに、実施例３で得たプローブ１の１μｇを添加し５
６５℃で、１０分間放置した．所定時間経過後、約１時
間かけて反応液を徐々に室温まで放冷してから、実施例
３と同様の標識化、洗浄、呈色のための処理を行なった
。
東に以上の操作をプローブ２〜４のそれぞれについて行
なった。
その結果、プローブ２を用いた場合にフィルター上の５
番目のスポットが呈色し、このスポットの検体の提供者
はフエニルアラニン尿症の疑いがあると判定された。
実施例５ 実施例３で合成したプロープ１〜４（各約１μｇずつ〉
をどのウエルにどのプローブが含まれるかがわかるよう
にマイクロプレートに適した。
次に、任意に選択した検体提供者からの培養羊水細胞か
ら、常法に従って、２本鎖ＤＮＡを抽出し、Ｐｖｕ　Ｉ
Ｉ　（　ＴＯＹＯＢＯ社製）で消化した後、１００℃、
ｌＯ分間の加熱処理により２本鎖ＤＮＡを１本ｇＱ化し
て、検体１本鎖Ｄ　Ｎ　Ａを含む混合物を得た。
このＤＮＡ混合物を、各ウエルに５０ｎｇずつ投入した
。
更に、各ウエルに、ＩＯＸアニーリング溶液７μ１を加
えてから、各ウエル内の溶液量が７０μＩとなるように
蒸留水を加えた。
この状態のマイクロプレートを６５℃で１０分間放置し
てから、約１時間かけて徐々に室温まで放冷した。
次に、各ウエルに、ＩｍＭ　ｄＡＴＰ　５μＩ　，　１
ｍＭ　ｄＧＴＰ５μｌ　，　ｌｍＭ　ｄＧＴＰ　５μＩ
　，　０．４ｍＭビオチン化ＵＴＰ８μＩ　．　ＩＯｘ
アニーリング溶液７μ１及び蒸留水４０μ１を加えて混
合した後、更にクレノー断片】ＯＩ１１位を加え、３７
℃で１時間反応させ、標識化を行なった。
反応終了後、エタノール３５０μｌを各ウエルに加え、
−７０℃で１時間冷却した後、各ウエル内から上清を吸
引廃棄し、］二清とともに未反応のビオチン化ＵＴＰを
除去した。
次に、マイクロプレートを乾燥させた後、ウシ血清アル
ブミン（Ｓｉｇｍｅｒ社製）によって常法によりブロッ
キングを行なってから、ストレブトアビジンーアルカリ
ホススファターゼ溶液（ＢＲＬ社製）を各ウエルに加え
、３７℃で反応させた．３０分間経過したところで、液
体を各ウエルから吸引廃棄し、更にＯ．ＩＭ　Ｔｒｉｓ
−Ｈ（１　（Ｐｔｌ９．５）−０．１ＭＮａＣＪ２　−
　５０ｍＭ　ＭｇＣｎ　２溶液（緩衝ｉ＆Ａ）で洗浄し
た後、ＢＣＩＰ溶液（ＢＲＬ社製）３０μＩ，ＮＢＴ溶
液（ＢＲＬ社製）４４μｌ及び緩衝液ＡＩＯｍ！：Ｌの
混合溶液を各ウエルに２００μｌ加え、室温で３０分間
の反応を行なわせてから、プレートリーダーによって発
色を判定した。
その結果、プローブ２のウエルに強い発色が認められ、
この検体提供者はフエニルアラニン尿症の疑いがあると
判定された。
実施例６ ＤＮＡ合成機（ＡＢ１社、３８１Ａ型）によりプラスミ
ドｐｌＪＧＩ９の−・部を構成する以下のＤＮＡ塩基配
列を有する４　１ｍｅｒオリゴヌクレオチドを合成した
。
合成物の一部を用い、７Ｍ尿素を含むｌ５＊ボリアクリ
ルアミドケル電気泳動によりその純度を調べたところ、
９０本以上の純度を有していると判定さら゛れたので、
この合成物は精製せずに以下の操作のプローブ核酸とし
て用いた。
一方、試料核酸として、ブラスミドｐａｎ　３２２（試
料Ａ）、゛ブラスミドｐＵｃＩ９（試料Ｂ）及びブラス
ミドｐｃｒｔ　３２２とブラスミドｐｕｃ　１９の混合
物（試料Ｃ、混合＠着比１：１）を用意し、これらの拭
料を常法によってＥｃｏＲＩ　（ＴＯＹＯＢＯ製）で７
１１化してから、得られた消化物を加熱処理して、二本
ｉＪ’ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａを１本鎖化し、各試料から得られ
た３種の一本ｉｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａを含む反応生成物を個
々に用いて以Ｆの操作を行なった。
−・本ｇＱ　Ｄ　Ｎ　Ａを含む反応生成物２０μｇと、
先に調製したプローブ核酸２０μｌを反応チューブに入
れ、これにＩＯＸアニリーング溶液［１ｘアニリーング
溶液：　６０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、６　０ｍＭ　　β−メ
ルカプトエタノール及び５００ｍＭ　Ｎａ（：ｌを含む
ｌｏＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ（ｐ１１８．０）］の
１０μ１を加え、更に全体が１００μ１となるように蒸
留水を加えた。
得られた混合溶液を６５℃にｌＯ分間にわたって加温し
てから、その温度を室温まで約１時間かけて徐々に下げ
た。
次に、得られた反応液に、１０×アニリーング溶液１０
μ１　，　］＋ｎＭ　ｄＡＴＰ　１０　μ１　，　ｌｍ
Ｍ　ｄｃＴＰ　１０　μ１及びｌｍＭ　ｄＧＴＰ　１０
μｌを加えた後、ｐ　３２−ＴＴＰＩＯＯＣｉを添加し
、全量を蒸留水によって２００μｌとして標識化用の溶
液を調製した。
この標識化用溶液に、クレノー断片（ＴＯＹＯＢＯ社製
〉の５単位を加え、水冷下で１時間反応させた。
反応終了後、ＧＥＮＥ（；ＬＥＡＮＴ’　（ＢＩＯ　１
０１社）を用い、反応液中の未反応のＰ　”−ＴＴＰと
形成されたハイブリッドを以ト゛のようにして分離した
。
ＧＥＮＥＣＬＥＡＮのシリカマトリックス（５μＩ）を
反応液２００μｌに加え、よく攪拌し、水中にｌＯ分間
保持した後、５秒間遠心し、上清を除去して，シリカマ
トリックス／ハイブリッド結合物のベレットを得た。
その際、未反応のｐ　′ｊ２−ＴＴＩ’は、上滑と共に
シリカマトリックスに結合しているハイブリッドから分
離された。
ＧＥＮＥＣＬＥＡＮの分離液で得られたベレットを３回
洗浄し、これに３μＩの純水を加え、５０’Ｃ、２分間
のインキュベートを行ない、ベレットからハイブリッド
を溶離させ、ハイブリッドを含む上清を遠心により回収
した。
回収した上清をシンチレーションカウンターにかけ、そ
の放射線の計量を行なった。
その結果、試料Ｂを用いた操作及び試料Ｃを用いた操作
で最終的に得られた溶液では１０’　ｃｐｍ程度（試料
Ａを用いた場合の約１０３倍）の放射線が計数され、こ
れら試料Ｂ及びＣ中にｐｕｃ　１９が存在することが確
認された。
実施例７ 以下のｐｕｃ　１９の一部を構成するオリゴヌクレオチ
ドを合成し、そのままプローブとして用いた。
５′　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　３′ＡＴＣＧＣ（ＩＩＩ；ＴＴ（：Ｃｌ
；八ＡＣＡＧＴＴＧＧＧ（；ＡＧＣ（：ＴＧＡＡＴＧＧ
ＧＧＡ八Ｔこのプローブ（以下プローブＡという）を工
群．　ＮＯ．１−ＮＯ．ＩＯの計１０個、並びにＩＩ群
；ＮＯ．１〜ＮＯ．ＩＯの計１０個のマイクロプレート
ウエルにそれぞれ１μｇづつ導入した。
次に試料ｐｏｃ　１９を一本鎖に解離したものを下記表
１の割合で工群；Ｎ０．１〜Ｎ０．１０のマイクロプレ
ートウエルにそれぞれ投入し、またコントロールとして
ｐＢＲ　３２２を一木鎖に解離したものを下記表１の割
合でＩＩ群：Ｎ０．１〜ＮＯ．ＩＯのマイクロプレート
ウエルにそれぞれ投入した（第４図（Ａ）参照）。
更に、各ウエルに、１０×アニーリング溶液７μ１を加
えてから、各ウエル内の溶液量が７０μ１となるように
蒸溜水を加えた。
この状態のマイクロプレートを６５℃でＩＯ分間放置し
てから、約１時間かけて徐々に室温まで放冷した。
次に、各ウェルに、１ｍＭ　ｄＡＴＰ　５μＩ　，　ｌ
ｍＭ　ｄＧＴＰ５μｌ　，　ＩｍＭ　ｄｃＴＰ　５μｌ
　，　０．５ｍＭビオチン化ＵＴＰ８μｌ　，　ＩＯＸ
アニリーング溶液７μＩ及び蒸留水４０μｌを加えて混
合した後、更にクレノー断片ＩＯ単位を加え、３７℃で
１時間反応させ、標識化を行なった。
反応終了後、エタノール３５０μｌを各ウエルに加え、
−７０℃で一時間冷却した後、各ウエル内から上清を吸
引廃棄し、上清とともに未反応のビオチン化１１ＴＰを
除去した。
次に、マイクロプレートを乾燥させた後、ウシ血清アル
ブミン（Ｓｉｇｍｅｒ社製）によって常法によりプロッ
キングを行なってから、ストレブトアビジンーアルカリ
ホススファターゼ溶液（ＢＲＬ社製）を各ウエルに加え
、３７℃で反応させた。
３０分間経過したところで、液体を各ウエルから吸引廃
棄し、更に０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｉｔ（ｐｌ１９．
５）−０．１ＭＮａＣｆｌ　−　５０ｍＭ　ＭｇＣＩｌ
　２溶液（緩衛液Ａ）で洗浄した後、ＢＣＩＰ溶液（Ｂ
ＲＬ社製）３０μｌ，ＮＢＴ溶液（ＢＲＬ社製）４４μ
１及び緩衛液Ａ１０ｍＩｔの混合溶液を各ウエルに２０
０μｌ加え、室温で３０分間の反応を行なわせてから、
プレートリーダーによって発色を判定した。
その結果、工の群ではＮＯ．７の０．１ｎｇまで発色し
た。Ｈの群のコントロールは発色をみなかった。
比較例１ 以下に示すｐＵＣｌ９の一部を構成する２本鎖ＤＮＡを
合成し、その５゛末端のリン酸を除去し、そのかわりに
ビオチン化ｄＵＴＰをＴ４ファージ由来ポリメクレオキ
ナーゼで導入し、標識化したものを一本鎖に解離しプロ
ーブとして用いて従来法による検出を行なった。
このプローブ（以下プローブＢという）を■群：　Ｎ０
．１〜Ｎ０．１０の計１０個、並びに■群；ＮＯ．Ｉ−
Ｎ０．１０の計１０個のマイクロプレートウエルにそれ
ぞれ１μｇづつ導入した。
次に試料ｐｕｃ　＋９を一本鎖に解離したものを上記実
施例７の表１と同様の割合でｍ群；ＮＯ．ｌ〜ＮＯ．Ｉ
Ｏのマイクロプレートウエルにそれぞれ投入し、またコ
ントロールとして試料ｐＢＲ　３２２を一木鎖に解離し
たものを上記実施例７の表１と同様の割合で■群；ＮＯ
．Ｉ〜ＮＯ．ｌＯのマイクロプレートウエルにそれぞれ
投入した（第４図（Ｂ）参照）。
更に、各ウエルに、ＩＯＸアニーリング溶液７μ１を加
えてから、各ウエル内の溶液量が７０μ１となるように
蒸溜水を加えた。
この状態のマイクロプレートを６５℃でＩＯ分間放置し
てから、約１時間かけて徐々に室温まで放冷した。
反応終了後、エタノール３５０μｌを各ウエルに加え、
−７０℃で一時間冷却した後、各ウエル内から．Ｌ清を
吸引廃棄し、上清とともに未反応のプローブを除去した
。
次に、マイクロプレートを乾燥させた後、ウシ血清アル
ブミン（Ｓｉｇｍｅｒ社製）によって常法によりブロッ
キングを行なってから、ストレブトアビジンーアルカリ
ホススファターゼ溶液（ＢＲＬ社製）を各ウエルに加え
、３７℃で反応させた。
３０分間経過したところで、液体を各ウエルから吸引廃
棄し、更に０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（［　（ｐＨ９．５
）−０．ＩＭＮａＣＩＬ　−　５０ｍＭ　ＭｇＣＩｌ　
２溶液（緩衛液Ａ）で洗浄した後、ＢＣＩＰ溶液（ＢＲ
Ｌ社製）３０μｌ，ＮＢＴ溶液（ＢＲＬ社製）４４μｌ
及び緩衛液Ａ１０ｍｕの混合溶液を各ウエルに２００μ
１加え、室温で３０分間の反応を行なわせてから、プレ
ートリーダーによって発色を判定した。
その結果、■の群では５ｎｇまで発色した。■の群のコ
ントロールは発色をみなかった。
実施例７及び比較例１より本発明の方法によれば従来例
より５０倍程度検出感度がよくなることが確認できた。
これはアニール後の伸展反応でビオチン化ｄＵＴＰを５
０倍程度多くとりこむためと考えられる。
［発明の効果コ 本発明においては、標識化したプローブ核酸を用いない
ので、プロープ核酸に標識化のための要件が要求されな
い。その結果、入手が容易であり、かつ高感度な検出が
期待できるヌクレオチド鎖長の短いものをプローブ核酸
として利用でき、簡便な操作で感度の良い検出が行なえ
る。
また、本発明においては、形成されたハイブリッドに標
識が施されるので、非放射性標識を用いた場合でも効率
良い標識化が可能となり、標識化及び検出操作がより安
全で簡便なものとなる。
しかも、プローブ核酸に標識化を施する従来の方法では
、全ての、すなわちハイブリッドの形成に関与しないプ
ローブ核酸にも標識が施されているのに対して、本発明
の方法では、形成されたハイブリッドだけが標識化され
るので、標識物質の節約ができる。
更に、複数種のプローブ核酸を用いて同時に複数の核酸
の検出を行なう場合、プローブ核酸を核酸を標識化する
従来の方法では、複数のプローブ核酸の差別化を複数の
異なる標識を用いることで行なうという煩雑な操作が必
要とされたが、本発明によれば形成されたハイブリッド
の標識化を１種の標識で行なえば良く、標識化操作が簡
易化され、複数の核酸の検出を極めて簡便に効率良く行
なうことができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例２におけるプローブ核酸のスポットの配
列を示す図、第２図は実施例３におけるプローブ核酸の
スポットの配列を示す図、第３図は被検出核酸・プロー
ブ核酸ハイブリッドの構成を模式的に示した図、第４図
は（八）　．　　（Ｂ）は実施例７及び比較例１を説明
するための図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）試料核酸とプローブ核酸とを反応させ、得られた反
    応混合物中への被検出核酸・プローブ核酸ハイブリッド
    の形成の有無を分析する過程を含む核酸の検出方法にお
    いて、 ａ）試料核酸とプローブ核酸とを反応させる過程と、 ｂ）過程ａで得られた反応混合物中に形成されたハイブ
    リッドのみに標識を施す過程と、 ｃ）過程ｂにおいて標識化されたハイブリッドを該標識
    を利用して検出する過程と を含むことを特徴とする核酸の検出方法。 ２）プローブ核酸または試料核酸が担体に固定化されて
    いる請求項１に記載の核酸の検出方法。 ３）プローブ核酸のヌクレオチド鎖長が、被検出核酸の
    ヌクレオチド鎖長の１／１０以下である請求項１または
    ３のいずれかに記載の核酸の検出方法。 ４）複数種のプローブ核酸が所定の配置で担体に固定化
    されている請求項２に記載の核酸の検出方法。 ５）複数種の試料核酸が所定の配置で担体に固定化され
    、過程ａにおいて１種のプローブ核酸と反応される請求
    項２に記載の核酸の検出方法。 ６）各プローブ核酸におけるハイブリッド形成反応が同
    一条件化で進行するのに必要なヌクレオチド鎖長を各プ
    ローブ核酸が有する請求項４に記載の核酸の検出方法。 ７）プローブ核酸のヌクレオチド長が、被検出核酸のヌ
    クレオチド鎖長の平均の１／１０以下である請求項４〜
    ６のいずれかに記載の核酸の検出方法。 ８）被検出核酸が遺伝子病に特有な塩基配列を有する請
    求項１〜７のいずれかに記載の核酸の検出方法。 ９）プローブ核酸のヌクレオチド鎖長が、１００塩基以
    下である請求項８記載の核酸の検出方法。 １０）プローブ核酸が、遺伝子病の点突然変異を検出し
    得るヌクレオチド鎖長が２５塩基以下のオリゴヌクレオ
    チドである請求項８に記載の核酸の検出方法。 １１）被検出核酸とハイブリダイズするプローブ核酸を
    担体に固定した請求項２に記載の核酸の検出方法に用い
    る核酸検出用固定化プローブ。 １２）複数種のプローブ核酸が所定の配置で担体に固定
    化されている請求項１１に記載の核酸検出用固定化プロ
    ーブ。 １３）プローブ核酸のヌクレオチド長が、標識化被検出
    核酸のヌクレオチド鎖長の１／１０以下である請求項１
    ２に記載の核酸検出用固定化プローブ。 １４）複数種のプローブ核酸を所定の配列で担体に固定
    した請求項１２に記載の核酸検出用固定化プローブ。 １５）各プローブ核酸におけるハイブリッド形成反応が
    同一条件化で進行するのに必要なヌクレオチド鎖長を各
    プローブ核酸が有する請求項１４に記載の核酸検出用固
    定化プローブ。 １６）複数種のプローブ核酸のヌクレオチド鎖長が、標
    識化被検出核酸のヌクレオチド鎖長の平均の１／１０以
    下である請求項１４または１５に記載の核酸検出用固定
    化プローブ。 １７）標識化被検出核酸が遺伝子病に特有な塩基配列を
    有する請求項１２〜１７のいずれかに記載の核酸検出用
    固定化プローブ。 １８）複数種のプローブ核酸のヌクレオチド鎖長が、１
    ００塩基以下である請求項１４に記載の核酸検出用固定
    化プローブ。 １９）複数種のプローブ核酸が、遺伝子病の点突然変異
    を検出し得るヌクレオチド鎖長が２５塩基以下のオリゴ
    ヌクレオチドである請求項１４に記載の核酸検出用固定
    化プローブ。
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