JPH04502862A - 核酸配列上の一個の塩基を迅速に検出および／または同定する方法とその応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸配列上の一個の塩基を迅速に検出および／または同定する方法とその応用 本発明は、核酸配列上の一個の塩基を検出および／または同定する方法に関し、 また、該方法の遺伝病の診断もしくはハイブリダイゼーションのコントロール等 における応用に関する。

核酸のハイブリダイゼーシヨンは、核酸の同定やその存在を確認する研究におい て使用されてきた。ハイブリダイゼーションは相補性塩基の対合に基づく。互い に相補性の一本鎖核酸を混合してインキュベートすると、それらの一本鎖核酸は 対を成して二本鎖ハイブリッド分子を形成する。一本ｌＤＮＡもしくはＲＮＡが 相補性の核酸配列との間で構造体を形成する性質を分析法ないし診断法に応用す ることができる。高い比放射能を育する放射性ヌクレオシド三燐酸を利用するこ とと、Ｔ４キナーゼ等のポリメラーゼ作用を有する酵素の存在下でＤＮＡを３１ Ｐで標識することとによって、生物学的意義を存する種々の核酸配列の同定、分 離、特徴付けを行なうことができる。

ハイブリダイゼーションは、例えば、 −遺伝子型の遺伝上の変異が（所定配列の挿入、欠失もしくは点突然変異の結果 として）病的な結果を示す場合のヒトないし動物の遺伝病、−ゲノムＤＮＡの再 配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｓｅｎｔｓ）による場合の癌疾患、−細菌性微生物（ 細菌、カビ、ウィルス等）のゲノム等の外来性のゲノムの存在が確認される場合 の感染症、 一法医学（父性、子孫確定等）や農業−食品部門（植物、衛生管理等）等におけ る、一般に個体の識別、 など、所定の核酸配列の存在の検出において重要な判断手段となる。

しかしながら、診断手段としてのハイブリダイゼーションは、その実施の困難性 （難しい技術）により、あるいは、該ハイブリダイゼーションの特異性の欠如（ 操作法）により、制限を受ける。

実際、ハイブリダイゼーションの化学的研究により、使用される核酸鎖の各々の 濃度、それらの長さおよび塩基組成、温度、１）Ｈ，イオン強度、媒体の粘性等 による影響が証明されている。

特に温度は重要であって、融点（Ｔ、：配列の５０％が二本鎖の状態にあるとき の温度）よりも低い温度でなければならない。溶液中において、最も好ましい温 度は、１５０個のヌクレオチドのプローブの場合でＴ、よりも２５℃低い温度で あり、これより短かいプローブではさらに僅かに低い温度が好ましい。

−個の塩基が関係する突然変異を検出するときには、一般に、場合により２つの タイプのプローブを使用することができる。すなわち、普通１５０個以上のヌク レオチドからなる所謂長核酸プローブと、普通１７〜２４個のヌクレオチドから なる所謂短核酸プローブとである。突然変異が、所謂制限酵素によって特異的に 認識される位置でおこる場合には、ササン法を用いることができる。この手法に は、ＤＮＡの分離、制限酵素による分解、ゲル電気泳動、膜への移動、突然変異 の領域に作用する長プローブを使用するハイブリダイゼーション、の各工程が含 まれ、洗浄とオートラジオグラフィの後、得られた断片の大きさが分析されて、 検出されるべき突然変異の存在もしくは不存在が証明される。しかしこの手法で は、突然変異は制限位置に影響を与えるものでなければならない。それ以外の場 合では、１７〜２４個のヌクレオチドから成る短かいオリゴヌクレオチドプロー ブを、そのプローブの中心が検出しようとする突然変異と一致するように合成す る。適当なハイブリダイゼーシヨンと水洗の条件（各システムに特異的）を選択 することにより、完全に相同の場合にのみ（突然変異の位置等において一個でも ヌクレオチドが異なれば、ハイブリダイゼーションは不安定化する）、標識オリ ゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが生ずる。

しかし、上記の方法には次のような問題がある。

−適当なハイブリダイゼーションを得るための温度条件の管理が難しいこと、− 制限位置の絶対的存在、 一膜上での核酸の不動化（ササンプロット）、である。

アマ−ジャムの米国特許第４，６５６．１２７号は、以上の問題を軽減させるも のであり、特に、制限酵素による開裂部を育しない位置に存在する突然変異の検 出を可能とした。

上記の米国特許第４．６５６．１２７号は、標的核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ） 断片における所定のヌクレオチド塩基の突然変異を検出する方法を開示する。す なわち、 （ａ）標的配列とプローブとをハイブリッド化することにより、プローブの一端 が所定のヌクレオチド塩基と隣接する核酸ハイブリッドを形成し、（ｂ）プロー ブの延長に適した条件の下でそのハイブリッドとヌクレオチド誘導体とを混合す ることにより、標的配列における前記所定の塩基が検出されるべき突然変異であ るかもしくはない場合にのみ、ヌクレオチド誘導体とプローブの端との結合を許 容するようにし、しかも、ヌクレオチド誘導体と関係するプローブは所定の条件 の下で分解に対して抵抗を示し、（Ｃ）前記プローブの端がヌクレオチド誘導体 と結合されない限り２本鎖フラグメントがそのプローブの端から次第に分解され るという条件の下で、エクソヌクレアーゼによってハイブリッドを分解し、（ｄ ）核酸鎖とハイブリッド化しないプローブの余った部分を除去し、（ｅ）標的配 列における所定のヌクレオチド塩基の突然変異を、分解後のプローブ存在もしく は不存在の検出によって、検出する。

上記の方法では、プローブの他に、所定の性質を育するヌクレオチド誘導体が特 に使用され、そのために、工程の数が増加している。また、その実施には、核酸 を膜上で不動化することと、（プローブもしくはヌクレオチド誘導体の）標識化 とが必要である。

従って、本発明の目的は、所定のヌクレオチド塩基を同定する方法であって、実 施が容易かつ迅速であり、従来の方法よりも実用上の要求をより良く満たし、ま た、ＤＮＡの不動化やプローブの標識のような複雑な操作法を必要とせず、遺伝 病、癌疾患、感染症やヒト、動物もしくは植物の個体識別における所定の核酸配 列の検出に応用し得る方法を提供することである。

本発明の主題は、核酸配列上に存在する所定のヌクレオチド塩基を検出及び／又 は同定する方法であって、 （１）反応温度と無関係に、前記所定のヌクレオチド塩基を含む標的配列を、該 ヌクレオチドの３′末端が前記所定のヌクレオチド塩基と隣接するように、充分 な長さのヌクレオチドとハイブリッド化し、（２）（１）の工程で得られたハイ ブリッドの相補性績の合成を、前記ヌクレオチドをプライマとして、 一３″→５°エクソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼと、−前記プライ マの延長物に取り込まれ得る態様で修飾され、その取り込みにより該延長物の延 長を遮断する少なくとも１種類のヌクレオチド塩基との存在下において開始し、 （３）前記遮断ヌクレオチド塩基を適当な手段で検出することにより、骸塩基と 相補性の前記所定のヌクレオチド塩基を同定することを特徴とする方法を提供す ることである。

本発明において、ヌクレオチドとは、１０〜５０個の塩基を含むオリゴヌクレオ チドと、１００個以上の塩基を含むヌクレオチドとの両者を意味する。

上記の方法の有利な態様においては、前記遮断ヌクレオチド塩基が複数種類のジ デオキシヌクレオチドである。

上記の方法の他の有利な態様においては、前記遮断ヌクレオチド塩基が、放射性 物質と、酵素と１発色基蛍光物質ないし化学発光物質と、適当な抗体とを含む群 の中から選択された標識を使用すること等の適当な方法で標識されている。

この態様の有利な構成では、前記標識が、前記複数種類の遮断ヌクレオチド塩基 の各々について同一かもしくは互いに異なる。

この構成のある例では、４種類の遮断塩基を互いに異なる標識を使用して標識。

することにより、該４種類の遮断ヌクレオチドの検出を同時に行なう。

上記の方法の他の有利な態様においては、４種類の遮断塩基を同一の態様で標識 するかもしくは何れも標識しないで、該４種類の遮断ヌクレオチドの検出を連続 的および／または互いに独立して行なう。

この態様の有利な構成では、重合反応中に生成するピロ燐酸を適当な方法で測定 することにより、前記４種類の塩基の中のどの塩基が重合反応に関与したかを決 定する。

実際には、重合反応の結果、以下のようにしてピロ燐酸（ρｙｒｏｐｈｏｓｐｈ ａｔｅ　）が生成する。

基質−プライマ＋ｄＮＴＰ　→　基質−（プライマ＋ａＮＭＰ）＋ＰＰ。

各反応チューブ中のど口燐酸を測定することにより、重合反応に関与した塩基を 決定することができる。

上記態様の他の有利な構成では、各標識遮断ヌクレオチド塩基が検出される。

この場合実際には、各反応チューブ中は、一種類の標識ヌクレオチド塩基と他の ３種類の非標識ヌクレオチド塩基とを含み、（螢光、放射能等によって）標識さ れた塩基を決定することにより、どの塩基が重合反応に関与したかを決定するこ とができる。取り込まれなかった標識塩基は洗って除去される。

本発明の方法の特に有利な点は、同定されるべきヌクレオチド塩基とは無関係に 操作条件を規定することができ、さらに、核酸を膜上で不動化する必要がないこ とである。

本発明はまた、上記の方法を実施するための直ちに使用可能な診断用キットない しボックスであって、該方法の実施のための適当な量の試薬および緩衝剤に加え 、 一３′末端が前記所定のヌクレオチド塩基と隣接するように前記標的配列とハイ ブリッド化し得、かつ、プライマとして作用する適当な量のヌクレオチドと、− 前記プライマの延長物に取り込まれ得る態様で修飾され、かつ、該延長物の延長 を遮断するそれぞれ適当な量の４種票のヌクレオチド塩基と、−３′→５′エク ソヌクレアーゼ活性を有しない適当な量のポリメラーゼと、を含むことを特徴と する診断用キットないしボックスに関する。

上記キットもしくはボックスの有利な態様においては、前記修飾ヌクレオチド塩 基がジデオキシヌクレオチド（ｄｄＴＴＰ、ｄｃｌＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣ ＴＰ）である。

上記キットもしくはボックスの他の有利な態様においては、前記修飾ヌクレオチ ド塩基が、放射性物質と、酵素と１発色基蛍光物質ないし化学発光物質と、適当 な抗体とを含む群の中から選択された標識を使用すること等の適当な方法で標識 されている。

上記キットもしくはボックスのさらに他の有利な態様においては、さらに、前記 ピロ燐酸の測定のための試薬を含む。

上記のような構成の他に、本発明は、以下の記載から明らかとなる他の構成をも その範囲に含む。

本発明は、その主題である方法の実施例についての以下の記載を参照することに より、より明確に理解されるであろう。

もっともこれらの実施例は本発明の詳細な説明するためにのみ示されるものであ って、本発明を何等限定するものではないことが理解されるべきである。

実施例１：本発明の方法による鎌状細胞症の診断（螢光ジデオキシヌクレオチド の決定） 鎌状細胞症すなわち線状赤血球貧血は、ヘモグロビン（Ｈｂ）のβ鎖に対応する β遺伝子の暗号化の構造配列（ｅｘｏｎｓ　）の一つに突然変異が生ずることに 起因する。この突然変異がアデニン（Ａ）のチミン（Ｔ）による置換を含む場合 には、正常なＨｂ（の位置Ｇ）においてグルタミン酸に翻訳されるべきＧＡＧコ ドンがＧＴＧコドンに修飾され、このコドンがバリンに翻訳される結果、異常な Ｈｂ（ＨｂＳ）となる。

本実施例で使用されたＤＮＡは、一本鎖増幅ＤＮＡ配列である。

ａ）増幅プライマの遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）＊各ＤＮＡ基質（ｍａｔｒｉｘ） について、以下のものを微小遠心分離チューブ中で混合する。

−ＤＮＡ　（増幅−重鎖）　１０１００ｎシーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｚｅ　 ）　５　Ｘ緩衝液（＝ｐＨ７，５のトリス塩酸、２００ｍＭ：ＮａＣ１，２５０ ｍＭ：ＭｇＣＪｔ、１００ｍＭ）　７μｍ−ＨｌＯｑｓ　２２μｉ！ ＊渦撹拌器を使用して撹拌し、迅速に遠心分離する。

＊９５℃の水浴中において２分間インキュベートする。

＊直ちに取り出して３７℃の水浴中において１０分間インキュベートする。

＊ＤＮＡサンプルのための以下の組成の反応緩衝液を調製する。

−０，１Ｍ　ＤＴ７　２．５μ！ −ｄｄＮＴＰの混合物（ｄｄＴＴＰ、１１２μＭ；ｄｄＧＴＰ、１．１２μＭａ ｄｄＡＴＰ、３．３６μＭ：ｄｄＣＴＰ、８．９６μＭ）の４００分の１の希釈 物　１−Ｈｚ　Ｏｑｓ　６．５　μＩ！ −シーケナーカーｌμｊ７（３単位） ＊水浴からチューブを取り出し、迅速に遠心分離する。

＊反応緩衝液を加え、混合する。

＊３７℃の水浴中に５分間置き、 ＊チューブを取り出して、氷の中に置く。

を用いる。これは、遠心分離で加速される膜濾過（ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｆｉｌｔ ｒａｔｉｏｎ　）によって、３，０００〜１０，０００ダルトン以上の分子量（ 例えばヌクレオチド１個は３３０Ｄに相当し、２０個のマトリックスからなる合 成オリゴヌクレオチドは６，６００Ｄに相当する）の分子種を捕捉するものであ る。

−上記ａ）で得られた反応系（ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ　）を“セント リコン′３もしくはｌＯ中に置き、必要に応じて希釈し、−製造業者の指示に従 い５．０００ｇ以下で遠心分離して、最小量（ｍｉｎｉｍｕｍ　ｖ。

ｌｕｍｅ）を分離し、 −”セントリコン°系を逆転し、 一遠心分離して反応系（ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ　）を回収し、−得ら れた量を１２μｌに戻す。

Ｃ）微小配列決定（ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　、本発明の方法）＊ＤＮ Ａの各チューブについて、上記１２μｌに以下のものを加える。

−突然変異の位置に隣接する塩基までの配列に対応するオリゴヌクレオチド５゛ ＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧ３’　（ＯＡ）　１５μｇ−ａ）で 規定したシーゲナーゼ５Ｘ緩衝液　７μ！以下、上記ａ）と同様に進める。

＊各すンプルについて、以下の組成の反応緩衝液を調製する。

−Ｏ，１Ｍ　Ｉ）ＴＴ　２．５μ！ 〜螢光ｄｄＮＴＰの混合物（ｄｄＴＴＰ’、１１２μＭ；ｄｄＧＴＰ”、１．１ ２μＭ、ｄｄＡＴＰ’、３．３６μＭ；ｄｄＣＴＰ”、８．９６μＭ）の４００ 分の１の希釈物　１μ１０螢光ジデオキシヌクレオチドはデュポン社製（ジエネ シスＧｅｎｅｓｉｓ　”２０００　ＤＮＡ分析システム）を使用する。

−ＨｘＯｑｓ　６．５μｌ −シーケカーゼ　１μｆ（３単位） ＊水浴からチューブを取り出し、迅速に遠心分離する。

＊反応緩衝液を加え、混合する。

＊３７°Ｃの水浴中に５分間置き、次いで、＊チューブを取り出して、氷の中に 置く。

ｄ）過剰の螢光ジデオキシヌクレオチドを洗う＊試料をセファデックス０５０カ ラムを通過させ、＊その溶出物を回収する。

ｅ）検出 各サンプルについて、電気泳動による移動とレーザ等の光源による励起によって 検出を行う。信号は、螢光光度計を用いて分析する。

その結果、図１のような曲線ａ（対照）と曲Ｍｂ（患者）とが得られた。これら の曲線から、突然変異の生じ得る位置において、健康な個体についての曲線ａで はｄｄＡＴＰが取り込まれたのに対し、ホモ接合患者についの曲ｓｂではｄｄＴ ＴＰが取り込まれたことがわかる。

実施例２：核酸配列（Ｍ１３ｍｐ８バクテリオファージのＤＮＡ）上の塩基の微 ＊Ｍ１３ｍｐ８バクテリオファージから得た一本１ｍ、ＤＮＡ＊配列３″ＴＧＡ ＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧ５“を有しプライマユニバーサル（Ｐｒ４ｒｎｅ ｒ　［Ｊｎｉｖｅｒｓａｌ）として知られる合成オリゴヌクレオチドこのプライ マの５’　−３’　の方向における最初の塩基はＧである。

ｂ）方法 方法は、実施例１の工程Ｃ以下の点突然変異の検出のための方法と同様である。

Ｍ１３ファージのＤＮＡはオリゴヌクレオチドの混入がなく、工程ａおよびｂは 不要である。

方法の一例を以下に示す。

−Ｍ１３一本ｌＤＮＡ　３μｇ −プライマユニバーサルオリゴヌクレオチド　１５ｎｇ−シーゲナーゼ５Ｘ緩衝 液　７μ！ −Ｈ，Ｏｑｓ　２２ｕｌ！ 検出の結果、事前の予想通り、プライマへのジデオキシＧＴＰの取り込みが確認 された。第２図には、ｄｄＮＴＰの異なる希釈物（２００分の１　（ａ）と４０ ０分のｒ（ｂ））について得られた結果が図示されている。

以上本発明の実施例について詳細に説明したが、本発明は記載された実施例、実 施態様ないし応用例に何等限定されるず、本発明の範囲を逸脱しない限りにおい て当業者に自明であるすべての変更をも含むものである。

■ 国際調査１１Ｉ４牛 国際調査報告 ＦＲ９０００５８５ Ｓ＾　３９５０９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸配列上に存在する所定のヌクレオチド塩基を検出及び／又は同定する方 法であって、 （１）反応温度と無関係に、前記所定のヌクレオチド塩基を含む標的配列を、該 ヌクレオチドの３′末端が前記所定のヌクレオチド塩基と隣接するように、充分 な長さのヌクレオチドとハイブリッド化し、（２）（１）の工程で得られたハイ ブリッドの相補性鎖の合成を、前記ヌクレオチドをプライマとして、 一３′→５′エクソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼと、−前記プライ マの延長物に取り込まれ得る態様で修飾され、その取り込みにより該延長物の延 長を遮断する少なくとも１種類のヌクレオチド塩基との存在下において開始し、 （３）前記遮断ヌクレオチド塩基を適当な手段で検出することにより、該塩基と 相補性の前記所定のヌクレオチド塩基を同定することを特徴とする方法。 ２．前記遮断ヌクレオチド塩基が複数種類のジデオキシヌクレオチドである請求 項１の方法。 ３．前記遮断ヌクレオチド塩基が、放射性物質と，酵素と，発色基蛍光物質ない し化学発光物質と，適当な抗体とを含む群の中から選択された標識を使用するこ と等の適当な方法で標識されている請求項１もしくは２の方法。 ４．前記標識が、前記複数種類の遮断ヌクレオチド塩基の各々について同一かも しくは互いに異なる請求項３の方法。 ５．４種類の遮断塩基を互いに異なる標識を使用して標識することにより、該４ 種類の遮断ヌクレオチドの検出を同時に行なう請求項４の方法。 ６．４種類の遮断塩基を同一の態様で標識するかもしくは何れも標識しないで、 該４種類の遮断ヌクレオチドの検出を連続的および／または互いに独立して行な う請求項１〜４の何れかの方法。 ７．重合反応中に生成するピロ燐酸を適当な方法で決定することにより、前記４ 種類の塩基の中のどの塩基が重合反応に関与したかを決定する請求項６の方法。 ８．各標識遮断ヌクレオチド塩基を検出する請求項６の方法。 ９．請求項１〜８の何れかの方法を実施するための直ちに使用可能な診断用キッ トないしボックスであって、該方法の実施のための適当な量の試薬および緩働剤 に加え、 −３′末端が前記所定のヌクレオチド塩基と隣接するように前記標的配列とハイ ブリッド化し得、かつ、プライマとして作用する適当な量のヌクレオチドと、− 前記プライマの延長物に取り込まれ得る態様で修飾され、かつ、該延長物の延長 を遮断するそれぞれ適当な量の４種類のヌクレオチド塩基と、−３′→５′エク ソヌクレアーゼ活性を有しない適当な量のポリメラーゼと、を含むことを特徴と する診断用キットないしボックス。 １０．前記修飾ヌクレオチド塩基がジデオキシヌクレオチドである請求項９の診 断用キットないしボックス。 １１．前記修飾ヌクレオチド塩基が、放射性物質と，酵素と，発色基蛍光物質な いし化学発光物質と，適当な抗体とを含む群の中から選択された標識を使用する こと等の適当な方法で標識されている請求項９もしくは１０の診断用キットない しボックス。 １２．さらに、前記ピロ燐酸の決定のための試薬を含む請求項９〜１１の何れか の診断用キットないしボックス。 １３．遺伝病もしくは癌疾患等の疾患または感染症に関係する所定の核酸配列、 または、ヒト，動物もしくは植物の個体識別のための所定の核酸配列の存在の検 出への、請求項１〜８の何れかの方法の応用。