ES2714875T3 - Métodos de diagnóstico y tratamiento del cáncer en pacientes que presentan o desarrollan resistencia a una primera terapia del cáncer - Google Patents

Abstract

Método de identificación de un sujeto con cáncer que es probable que se beneficie del tratamiento con una terapia de combinación con un inhibidor de RAF y un segundo inhibidor, en el que el sujeto presenta células de cáncer que comprenden una mutación B-RAFV600E, comprendiendo el método: (a) someter a ensayo el número de copia génica, el nivel de ARNm o de una proteína o de fosforilación de una o más dianas quinasas seleccionadas del grupo que consiste en MAP3K8 (TPL2/COT), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl), o PAK3 (Pak3) en células de cáncer obtenidas del sujeto y comparar el número de copia génica, el nivel de ARNm o de la proteína o la fosforilación con un número de copia génica, un nivel de ARNm o de una proteína o de fosforilación de la quinasa diana en células obtenidas de un sujeto sin cáncer, y (b) correlacionar el número de copia génica incrementado o una alteración de la expresión de ARNm o la sobreexpresión de proteína o fosforilación de la quinasa diana en las células de cáncer respecto a las células del sujeto sin el cáncer, con el sujeto con cáncer que es probable que se beneficie del tratamiento con la terapia de combinación.

Description

Métodos de diagnóstico y tratamiento del cáncer en pacientes que presentan o desarrollan resistencia a una primera terapia del cáncer

Antecedentes

Se observan mutaciones oncogénicas en la serina/treonina quinasa B-RAF (también conocida como BRAF) en 50% a 70% de los melanomas malignos (Davies, H. et al., Nature 417:949-954, 2002).) Los estudios preclínicos han demostrado que la mutación de B-RAF(V600E) predice una dependencia de la cascada de señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK, por sus siglas en inglés) en el melanoma (Hoeflich K.P. et al., Cancer Res.

69:3042-3051,2009), McDermott U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:19936-19941, 2007), Solit D. B. et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature 439:358-362, 2006), Wan P. T. et al., Cell 116:855-867, 2004), Wellbrock, C. et al., Cancer Res. 64:2338-2342, 2004)- una observación que ha sido validada por el éxito de los inhibidores de RAF o MEK en ensayos clínicos (Flaherty K. T. et al., N. Engl. J. Med. 363:809-819, 2010), Infante J. R. et al., J. Clin. Oncol. 28 (supl.):2503, 2010), Schwartz G. K. et al., J. Clin. Oncol. 27 (supl.):3513, 2009). Sin embargo, las respuestas clínicas a terapéuticos anticáncer dirigidos con frecuencia se confunden con frecuencia con resistencias de novo o adquiridas (Engelman J. A. et al., Science 316:1039-1043, 2007), Gorre, M. E. et al., Science 293:876-880, 2001); Heinrich M. C. et al., J. Clin. Oncol. 24:4764-4774, 2006);

Daub H., Specht K. y Ullrich A., Nature Rev. Drug Discov. 3:1001-1010, 2004). De acuerdo con lo anteriormente expuesto, sigue existiendo una necesidad de nuevos métodos de identificación de mecanismos de resistencia de manera que se eluciden las dianas "tratables farmacológicamente" para estrategias de tratamiento a largo plazo eficaces, de nuevos métodos de identificación de los pacientes que es probable que se beneficien de las estrategias de tratamiento y de métodos de tratamiento de pacientes con las estrategias de tratamiento a largo plazo eficaces.

Breve descripción resumida

La presente invención se refiere al desarrollo de resistencia a agentes terapéuticos en el tratamiento del cáncer y a la identificación de dianas que proporcionan resistencia frente al tratamiento del cáncer. La presente invención se refiere además a la identificación de dianas farmacológicas paralelas que faciliten una estrategia de tratamiento a largo plazo eficaz y a la identificación de pacientes que se beneficiarían de dicho tratamiento.

De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, un método de identificación de un sujeto con cáncer que es probable que se beneficie del tratamiento con una terapia de combinación con un inhibidor de RAF y un segundo inhibidor, en el que el sujeto presenta células de cáncer que comprenden una mutación B-RAFV600E, donde el método comprende:

(a) someter a ensayo el número de copia génica, el nivel de ARNm o de una proteína o la fosforilación de una o más dianas quinasas seleccionadas del grupo que consiste en MAP3K8 (TPL2/COT), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl), o PAK3 (Pak3) en células de cáncer obtenidas del sujeto y comparar el número de copia génica, el nivel de ARNM o de la proteína o la fosforilación con un número de copia génica, un nivel de ARNm o de una proteína o la fosforilación de la quinasa diana en células obtenidas de un sujeto sin cáncer, y

(b) correlacionar el número de copia génica incrementado o una alteración de la expresión de ARNm o la sobreexpresión de proteína o fosforilación de la quinasa diana en las células de cáncer respecto a las células del sujeto sin el cáncer, con el sujeto con cáncer que es probable que se beneficie del tratamiento con la terapia de combinación.

En otro aspecto, se proporciona una cantidad eficaz de un inhibidor de RAF y una cantidad eficaz de un segundo inhibidor, en donde el segundo inhibidor es un inhibidor de MEK o un inhibidor MAP3K8 (TPL2/COT) para la utilización en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, presentando el sujeto células de cáncer que comprenden una mutación B-RAFV600E y presentando el sujeto células de cáncer que comprenden un número de copia génica incrementado o una alteración de la expresión del ARNm o la sobreexpresión de una proteína o la fosforilación de una quinasa diana en las células de cáncer, donde la quinasa diana se selecciona del grupo que consiste en MAP3K8 (TPL2/COT), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl) o PAK3 (Pak3).

En otro aspecto, los presentes inventores proporcionan la utilización de una cantidad eficaz de un inhibidor de RAF y una cantidad eficaz de un segundo inhibidor, en donde el segundo inhibidor es un inhibidor de MAP3K8 (TPL2/COT) en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, presentando el sujeto células de cáncer que comprenden una mutación B-RAFV600E y presentando el sujeto células de cáncer que comprenden un número de copia génica incrementado o una alteración de la expresión del ARNm o la sobreexpresión de una proteína o la fosforilación de una quinasa diana en las células de cáncer, donde la quinasa diana se selecciona del grupo que consiste en MAP3K8 (TPL2/COT), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl) o PAK3 (Pak3).

En la presente memoria los presentes inventores describen un método para identificar una quinasa diana que proporciona resistencia frente a un primer inhibidor. El método incluye el cultivo de células que presentan sensibilidad al primer inhibidor y que expresan una pluralidad de clones de ORF de quinasa en los cultivos celulares, expresando cada cultivo celular un clon de ORF de quinasa diferente. El método incluye además exponer cada cultivo celular al exposición al inhibidor con el fin de identificar el clon de ORF de quinasa que proporciona resistencia al primer inhibidor.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra un cribado funcional basado en ORF que identifica las quinasas COT y C-RAF como controladoras de la resistencia a la inhibición de B-RAF. (a) Vista general esquemática de la recolección de ORF de quinasa del CCSB/Broad Institute. Se indica la clasificación de las quinasas y el número de quinasas en cada clase; (b) se sometieron a ensayo célula A375 que expresaban la colección de ORF de quinasa del CCSB/Broad Institute para su viabilidad relativa en PLX4720 1 pM y se normalizaron respecto a MEK1 constitutivamente activo (MEK1DD). Nueve ORF (círculos) puntuaron a 2 desviaciones estándar (línea discontinua, 58,64%) de la media de todos los ORF (línea discontinua, 44,26%); (c) los ORF indicados se expresaron en 5 líneas celulares B-RAF^V600E con DMSO o PLX4720 1 pM. Se cuantificó la viabilidad (respecto a DMSO) tras 4 días. Las barras de error representan la desviación estándar entre réplicas (n=6); (d) el cribado secundario en A375 y SKMEL28 prioriza los 9 ORF candidatos mejores en una escala de concentración multipunto de PLX4720.

La figura 2 ilustra la resistencia a la inhibición de B-RAF mediante activación de la ruta de MAPK. (a) Los ORF indicados se expresaron en A375. Se sometieron a ensayo los niveles de MEK y ERK fosforilados tras 18 h de tratamiento con DMSO (-) o PLX4720 (se indica la concentración); (b) proliferación de A375 que expresa los ORF indicados. Las barras de error representan la desviación estándar entre réplicas (n=6). (c) Fosforilación de C-RAF (S338) y ERK en lisados de A375 que expresan los ORF indicados. (d) Expresión de COT en lisados procedentes de melanocitos primarios inmortalizados que expresan BRAFV600E o vector vacío. El ARNm de COT presenta un codón de inicio interno (30M) que resulta en dos productos proteicos de diferente longitud; los aminoácidos 1-1467 o 30-467 se señalan con flechas. (e) Fosforilación de COT y ERK en lisados de A375 que expresan los ORF indicados tras la reducción de B-RAF mediada por ARNhp (BRAFhp) respecto al ARNhp de control (Luc_hp). (f) Fosforilación de ERK en lisados de A375 que expresan los ORF indicados tras la reducción de C-RAF mediada por ARNhp (CRAFhp) o ARNhp de control (Luc_hp), tras 18 h de tratamiento con DMSO (-) o PLX4720 1 pM (+).

La figura 3 ilustra que la expresión de COT predice la resistencia a la inhibición de B-RAF en líneas celular de cáncer. (a) Número de copia de MAP3K8/COT; columnas rojas: Amplificación de COT, columnas azules: COT no amplificado; (b) expresión de COT en líneas celulares B-RAF^V600E y (c) cultivos a corto plazo, (d) PLX4720 GI50 en líneas celulares B-RAF^V600E. Los colores son tal como en (a); (e) fosforilación de MEK y ERK tras el tratamiento con DMSO o PLX4720 (se indica la concentración), (f) fosforilación de ERK en lisados de M307 (AZD-R, resistentes a AZD6244) tratados con DMSO o PLX4720 (PLX) 1 pM o CI-1040 (CI), (g) expresión de ARNm (QRT/PCR) en muestras de tejido de melanoma metastásico tratado con PLX4032 correspondientes de paciente/lesión. En los pacientes 1 y 3 se realizaron múltiples biopsias de la misma lesión. Las barras de error representan SEM (n=3) U, indeterminado/indetectable, (h) fosforilación de ERK y MEK en RPMI-7951 tras la reducción de COT mediada por ARNhp (COThp) frente al control (Luc_hp) y tratamiento con DMSO (-) o PLX4720 1 pM (+). Se cuantificó la fosforilación de ERK y Me K, (i) fosforilación de e RK y MEK en RPMI-7951 tras 1 h de tratamiento con un inhibidor de quinasa COT de molécula pequeña. Se cuantificó la fosforilación de ERK y MEK. (j) Curvas de sensibilidad a PLX4720 en un panel de líneas celulares B-RAF^V600E. OUMS-23 y M307 representan líneas celulares con expresión/amplificación de COT y todas las demás representan líneas celulares con COT no detectable/no alterado, (k) expresión selectiva de COT y activación de ruta MAPK correspondiente en un melanoma maligno subcutáneo metastásico con resistencia adquirida a PLX4032 (*indica una banda de fondo, MET-MM (PLX-R), melanoma maligno metastásico, resistente a PLX4032).

La figura 4 ilustra que las líneas celulares B-RAF^V600E expresantes de COT muestran resistencia a inhibidores de MEK alostéricos. (a) GI⁵⁰ de CI-1040 en un panel de líneas celulares B-RAF^V600E, (b) fosforilación de MEK y ERK en lisados de las líneas celulares indicadas con DMSO o CI-1040 (se indica la concentración), (c) factor de cambio (respecto a MEK1) de GI⁵⁰ de A375 que expresan ectópicamente los ORF indicados para PLX4720, RAF265, CI-1040 y AZD6244, (d) fosforilación de ERK en A375 que expresan los ORF indicados tras el tratamiento con DMSO o PLX4720 1 pM, rAf265, CI-1040 o AZD6244, (e) viabilidad de A375 que expresan los ORF indicados y tratados con DMSO, PLX4720 (se indica la concentración) y PLX4720 en combinación con CI-1040 o AZD6244 (todos 1 pM). Las barras de error representan las desviaciones estándar (n=6), (f) fosforilación de ERK en A375 que expresan los ORF indicados tras el tratamiento con DMSO, PLX4720 (1 pM) o PLX4720 en combinación con CI-1040 o AZD6244 (todos 1 pM), (g) las líneas celulares con número de copia/expresión de MAP3K8/COT aberrante son insensibles al inhibidor de MEK alostérico CI-1040, o (h) AZD6244, (i) diagrama esquemático de la formación de complejos de MAP3K en respuesta a la inhibición de B-RAF en líneas celulares mutantes B-RAF^V600E. PLX4720 posiciona C-RAF en un complejo de señalización competente (panel derecho superior) que resulta activado por sucesos oncogénicos cadena arriba de C-RAF (panel derecho inferior), seguidamente induciendo la resistencia. En el contexto de la expresión de COT, los complejos que contienen COT/RAF resultan suficientes para activar la ruta de MAPK y mediar en la resistencia (panel izquierdo inferior).

La figura 5 ilustra un diagrama esquemático de un cribado funcional basado en ORF para quinasas que inducen resistencia a la inhibición de B-RAF. La línea celular A375 B-RAF^V600E se transdujo lentivíricamente con las 597 quinasas de la colección del CCSB/Broad Institute. Se identificaron y eliminaron del análisis final los ORF con un efecto positivo o negativo sobre la proliferación en las A375 tratadas con el control. Se identificaron los ORF promotores de resistencia mediante la generación de una proporción de viabilidad diferencial entre células con inhibición de B-RAF (tratadas con PLX4720) y tratadas con el control. Se normalizó la viabilidad diferencial respecto a un alelo de MEK1 constitutivamente activo, MEK1^DD; un control positivo específico de ensayo.

La figura 6 ilustra que la colección de ORF de quinasa del CCSB/Broad Institute se expresa bien mediante lentivirus de título elevado. (a) Esquema del vector de expresión lentivírico pLX-BLAST-V5 utilizado para todos los cribados de ORF y posterior validación. (b) los ORF etiquetados con GFP representantes de un amplio abanico de tamaños se expresaron lentivíricamente en células Jurkat y se cuantificó el porcentaje de células expresantes de GFP/ORF (p.ej. células infectadas), demostrando un elevado título vírico en todo el abanico de tamaños de ORF. (c) expresión de 96 ORF aleatorios detectados mediante LiCor con anticuerpos contra la etiqueta de epítopo V5, respecto al ADN celular. La expresión era detectable en 83% de los pocillos.

La figura 7 ilustra la expresión de candidatos a ORF de resistencia. Se transfectaron transitoriamente 293T con pLX-BLAST-V5-ORF (indicado) y se detectó la expresión utilizando un anticuerpo anti-V5-HRP. El clon AXL está 'cerrado' y presenta un codón de parada antes de la etiqueta V5. Ver la figura 12 para la verificación de la expresión; (*) en exposición oscura indica la expresión de tres o Rf no visibles en la exposición más clara.

La figura 8 ilustra que un cribado secundario prioriza los mejores 9 candidatos a ORF a resistencia a inhibidor de B-RAF. Los nueve ORF de mejor puntuación en el cribado primario se expresaron en A375 o SKMEL28 y una GI⁵⁰ de un intervalo de concentración de 8 puntos de PLX4720.

La figura 9 ilustra los efectos de la expresión de ORF sobre la proliferación en las líneas celulares B-RAF^V600E. La proliferación, respecto a MEK1, en (a) A375 o (b) SKMEL28 que expresa los ORF indicados tras 7 días de crecimiento.

La figura 10 ilustra la expresión ectópica de MEK1 constitutivamente activos (MEK1^DD) y COT conduce a pMEK/pERK incrementado en A375, mientras que C-RAF reduce los niveles de pMEK/pERK. Los lisados de A375 que expresan ectópicamente GFP, MEK1, MEK^DD, COT o C-RAF se analizaron mediante inmunotransferencia para los niveles de pERK y pMEK. Se separaron GFP y MEK1 (carriles 1-3) de COT/C-RAF (carriles 4-5) para evitar que la señal de V5-MEK1 residual sobrepasase las señales de COT y C-RAF, que se expresan a niveles mucho más bajos.

La figura 11 ilustra que la actividad de quinasa de COT y C-RAF resulta necesaria para la fosforilación sostenida de ERK en el contexto del tratamiento de PLX4720. El análisis de inmunotransferencia de A375 que expresa ectópicamente (a) MEK1, COT de tipo salvaje o quinasa inactiva COT (COT^K167R) o (b) MEK1, C-RAF de tipo salvaje o quinasa inactiva C-RAF (C-RAF^K375M) tratada con PLX4720 1 pM durante 18 h.

La figura 12 ilustra los efectos de la expresión de ORF sobre la señalización de MAPK en el contexto del inhibidor de B-RAF llamado PLX4720. La activación de la ruta de MAPK se evaluó mediante análisis de inmunotransferencia de pERK y pMEK en A375 que expresaba los ORF indicados en presencia de PLX4720 (18 h, concentración indicada). (*) indica la utilización de un anticuerpo dirigido contra el ORF expresado, no el epítopo V5. AXL se clonó sin la etiqueta V5.

La figura 13 ilustra que B-RAF se asocia a C-RAF inmunoprecipitado en A375 tras el tratamiento de 18 h con PLX4720 (+) 1 pM o DMSO (-), (a). ECC: controles de extracto de células completas. C-RAF expresado ectópicamente se asocia constitutivamente con B-RAF y se fosforila en S338, lo que es consistente con la localización y activación membranales. Las células A375 que expresan MEK1, MEK^DD y COT no muestran evidencia de activación de C-RAF, (b).

La figura 14 ilustra que la expresión retrovírica de un C-RAF de tipo salvaje o un mutante por truncado de alta actividad de C-RAF (C-RAF(22W)) convierte a las A375 en resistentes al inhibidor-B PLX4720 (a) y conduce a niveles sostenidos de pERK en el contexto del tratamiento de PLX4720 (1 pM, 18 h), (b). Los niveles de expresión de C-RAF alcanzados con retrovirus eran significativamente inferiores a los obtenidos con sistemas basados en lentivirus, dando como resultado un GI⁵⁰ más baja que la conseguida con C-RAF lentivírico.

La figura 15 ilustra los efectos de B-RAF^V600E sobre el ARNm de COT, (a) la RT/PCR cuantitativa de la expresión de ARNm de COT respecto a la expresión de ARNm de GAPDH en melanocitos primarios transformados que expresan B-RAF de tipo salvaje (vector) o la expresión de COT B-RAF^V600E se normalizó respecto a melanocitos primaros expresantes de vector. (**) Significativo, p 0,05 (prueba t de Student pareada de dos colas). El ARNm de COT endógeno era indetectable en A375 sensible a PLX4720 y los niveles de ARNm de COT expresados ectópicamente no resultaron afectados por el tratamiento de PLX4720 1 pM. A375 que expresaban GFP o COT se trataron durante 18 h con PLX47201 pM. Se analizó el ARNm transcrito inversamente para la expresión de COT normalizado respecto a GAPDH, respecto a A375 expresante de GFP tratadas con DMSO. (*) No significativo, p > 0,05 (prueba t de Student pareada de dos colas). Las barras de error representan SEM.

La figura 16 ilustra que los niveles de proteína B y C-RAF no resultan necesarios para la fosforilación de ERK mediada por COT. A375 expresantes de MEK1 ectópico (control) o COT se infectaron secuencialmente con lentivirus que expresaba ARNhp con diana en B-RAF, C-RAF o ARNhp de control (Luc_hp) y se sometieron a ensayo para la expresión de las proteínas indicadas en presencia (+) o ausencia (-) de PLX4720 1 pM, 18 h.

La figura 17 ilustra que el análisis de PNU de 752 líneas celulares revela alteraciones del número de copia de MAP3K8/COT. De las 752 líneas celulares que se sometieron a análisis del número de copia, 534 también se habían sometido al perfilado de mutaciones. Treinta y ocho (7,1%) de las células de mutaciones perfiladas alojaban la

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con la ganancia del número de copia en MAP3KB/COT.

La figura 18 ilustra las alteraciones de MAP3K8/COT en la línea celular de cáncer OUMS-23. (a) señal de RMA de una sonda de MAP3K8 /COT (señalada) del análisis de micromatrices de ARNm. OUMS-23 es una de las 2% superiores (de entre 765 líneas celulares) que expresan ARNm de COT. (b) expresión de ARNm de COT en un panel de líneas celulares mutantes B-RAFV600E. (c) Expresión endógena de la proteína COT en OUMS-23 respecto a COT expresado ectópicamente en líneas celulares A375 y SKMEL28 según determinación mediante análisis de inmunotransferencia de las células indicadas.

La figura 19 ilustra que el ARNm de COT y la proteína se expresan en líneas celulares y tejido resistentes al inhibidor de B-RAF. (a) Análisis de RT/PCR de la expresión de ARNm de COT normalizada respecto a GAPDH en un panel de líneas celulares, cultivos a corto plazo y tejido procedente de melanoma maligno tratado con PLX4032 en recaída (MM-R). La expresión de proteína correspondiente para las líneas celulares y cultivos a corto plazo se muestra en las figuras 3b y 3c, respectivamente. (b) Análisis de transferencia western de lisados de melanocitos primarios (1° Mel(B-RAF, WT), piel normal de pacientes correspondientes ('Piel') y de melanoma maligno metastásico (MM-R; el ARNm de COT se muestra en el panel a), células A375 y melanocitos primarios que expresan B-RAF^V600E (1° Mel (B-RAF^V600E).

La figura 20 ilustra que la reducción de COT afecta a la viabilidad en la línea celular de COT amplificada RPMI-7951. (a) Cuantificación de la viabilidad de RPMI-7951 tras la reducción de COT mediada por ARNhp lentivírico (COThp) respecto al ARNhp de control (Luc_hp). Las barras de error representan la desviación estándar entre réplicas. (b) Análisis de inmunotransferencia que muestra la expresión relativa de proteína COT en RPMI-7951 que expresan Luc_hp y COT_hp.

La figura 21 ilustra los efectos de la expresión de ORF sobre la GI⁵⁰ de un panel de inhibidores de la ruta de MAPK en SKMEL28. La concentración inhibidora del crecimiento semimáxima (GI⁵⁰) de SKMEL28 que expresa ectópicamente MEK1, MEK1^DD o COT se determinó para los inhibidores de RAF, PLX4720 y RAF265 y para los inhibidores de MEK1/2, CI-1040 y AZD6244. El cambio de GI⁵⁰ para MEK1^DD y COT (respecto a MEK1) se determinó para cada compuesto.

La figura 22 ilustra que COT puede activar ERK mediante mecanismos independientes de MEK y dependientes de MEK. (a) Análisis de inmunotransferencia de la fosforilación de ERK en lisados de A375 tras la expresión de GFP o COT y posterior reducción de MEK1, MEK2 o MEK1 y MEK2 (MEK1+2) mediada por ARNhp lentivírico, respecto al ARNhp de control (Luc_hp). Los paneles a la izquierda y derecha representan dos parejas diferentes de constructos de ARNhp de MEK1 y MEK2. (b) Análisis de inmunotransferencia de la fosforilación de ERK inactiva recombinante (Thr202/Tyr204) por COT recombinante en un ensayo de quinasa in vitro.

La figura 23 ilustra que la inhibición combinatorial de la ruta de MAPK suprime eficazmente la proliferación en SKMEL28. La viabilidad (respecto a DMSO) de SKMEL28 que expresa ectópicamente MEK1, MEK1^DD o COT y tratado con DMSO, PLX4720 (concentración indicada), PLX4720 (1 pM) y CI-1040 (1 pM) o PLX4720 (1 pM) y AZD6244 (1 pM). Las barras de error representan la desviación estándar entre réplicas.

La figura 24 ilustra que la sobreexpresión de COT resulta suficiente para convertir a las células de cáncer de melanoma con la mutación en resistentes a la inhibición de B-RAF.

La figura 25 ilustra que los nueve ORF de puntuación superior en el cribado primario se expresaban en (a) SKEL28 de (b) A375 y se muestra GI⁵⁰ para los 4 inhibidores de la ruta de MAPK (PLX4720, RAF265, CI-1040 y AZD-6244).

La figura 26 ilustra que la expresión de CRKL modifica la sensibilidad al inhibidor selectivo de B-RAF, PLX4720 en un panel de líneas celulares B-RAF^V600E.

La figura 27 ilustra que la línea celular de cáncer mutante B-RAF^V600E de MAP3KB/COT amplificados muestra fosforilación constitutiva de ERK/MEK en todo el rango de dosis de PLX4720.

La figura 28 ilustra que la insensibilidad a la inhibición de la ruta de MAPK se corresponde con la ganancia del número de copia de MAP3K8/COT en un subgrupo de líneas celulares de cáncer de piel. Se muestra un panel de 20 líneas celulares mutantes B-RAF^V600E y su sensibilidad a: (a) el inhibidor de B-Ra F, PLX4720 y (b) el inhibidor de MEK, AZD6244.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al desarrollo de resistencia a agentes terapéuticos en el tratamiento del cáncer y a la identificación de dianas que proporcionan resistencia al tratamiento del cáncer. La presente invención se refiere además a la identificación de dianas farmacológicas paralelas que faciliten una estrategia de tratamiento a largo plazo eficaz y a la identificación de pacientes que se beneficiarían de dicho tratamiento. La presente exposición se refiere a quinasas y en particular a componentes de la ruta de la quinasa MAP.

La práctica de la presente invención utiliza, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, inmunología, microbiología, biología celular y ADN recombinante, las cuales se encuentran comprendidas . , . ., , ,

LABORATORY MANUAL, (Edición actual); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds., (Edición actual)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (edición actual) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed., 1987). DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., edición actual); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames y S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., edición actual); Fundamental Virology, 2a edición, vol. I y II (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds.)

La cascada de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK, por sus siglas en inglés) es una ruta de señalización intracelular crítica que resulta la transducción de señales en respuesta a diversos estímulos extracelulares, incluyendo factores de crecimiento, citoquinas y protooncogenes. La activación de esta ruta resulta en la activación del factor de transcripción y en alteraciones de la expresión génica, que finalmente conducen a cambios en funciones celulares, incluyendo la proliferación celular, la regulación del ciclo celular, la supervivencia celular, la angiogénesis y la migración celular. La señalización de MAPK clásica es iniciada por receptor tirosina quinasas en la superficie celular; sin embargo, muchas otras moléculas de superficie celular son capaces de activar la cascada de MAPK, incluyendo integrinas, proteínas G heterotriméricas y receptores de citoquina.

La unión de un ligando a un receptor de superficie celular, p.ej. una receptor tirosina quinasa, típicamente resulta en la fosforilación del receptor. La proteína adaptadora Grb2 se asocia con el dominio intracelular fosforilado del receptor inactivado y esta asociación atrae factores de intercambio de nucleótido guanina, incluyendo SOS-I y CDC25 a la membrana celular. Estos factores de intercambio de nucleótido guanina interactúan con la GTPasa Ras y la activan. Entre las isoformas de Ras comunes se incluyen K-Ras, N-Ras, H-Ras y otras. Tras la activación de Ras, la serina/treonina quinasa Raf (p.ej., A-Raf, B-Raf o Raf-1) resulta atraída a la membrana celular mediante la interacción con Ras. A continuación, Raf resulta fosforilada. Raf activa directamente MEK1 y MEK2 mediante la fosforilación de dos residuos de serina en las posiciones 217 y 221. Tras la activación, MEK1 y MEK2 fosforilan los residuos de tirosina (Tyr-185) y treonina (Thr-183) en las serina/treonina quinasas Erk1 y Erk2, resultando en la activación de Erk. Erk activada regula muchas dianas en el citosol y también se transloca al núcleo, donde fosforila varios factores de transcripción que regulan la expresión génica. La Erk quinasa presenta numerosas dianas, incluyendo Elk-1, c-Ets1, c-Ets2, p90RSKI, MNKI, MNk2, MSKI, MSK2 y TOB. Aunque la ruta anterior es una representación clásica de la señalización de MAPK, existe una considerable comunicación cruzada entre la ruta de MAPK y otras cascadas de señalización.

Las aberraciones en la señalización de MAPK desempeñan un papel significativo en la biología del cáncer. La expresión alterada de Ras es común en muchos cánceres y también se han identificado mutaciones activadoras en Ras. Tales mutaciones se observan en hasta 30% de todos los cánceres, y son especialmente comunes en los carcinomas pancreático (90%) y de colon (50%). Además, las mutaciones de Raf activadoras se han identificado en el cáncer de melanoma y en el cáncer ovárico. La mutación más común, BRAFV600E, resulta en la activación constitutiva de la ruta de MAP quinasa cadena abajo y resulta necesaria para la proliferación celular del melanoma, el crecimiento en agar blando y la formación de xenoinjerto tumoral. Basándose en el papel definido de la sobreactivación de MAPK en los cánceres humanos, el reconocimiento de componentes de la ruta de MAPK por inhibidores específicos es un enfoque prometedor para la terapia del cáncer. Sin embargo, los pacientes pueden presentar una resistencia innata o resistencia adquirida a estas terapias prometedoras. La identificación de las quinasas diana, los marcadores diagnósticos y/o pronósticos y las terapias de tratamiento para estos pacientes con resistencia innata o adquirida se describen a continuación.

Ensayo de cribado funcional de alto rendimiento

Los presentes inventores dan a conocer en la presente memoria métodos de identificación de dianas capaces de controlar la resistencia a terapias clínicamente eficaces utilizando un ensayo de cribado de alto rendimiento. El método puede incluir un cribado funcional basado en un marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en inglés) para quinasas que controlan la resistencia a agentes terapéuticos. El método puede incluir proporcionar una línea celular con una quinasa que es conocido que presenta una mutación oncogénica. Puede expresarse individualmente una biblioteca de ORF de quinasa en la línea celular de manera que puede evaluarse adicionalmente una pluralidad de clones, cada uno de los cuales expresa un ORF diferente de la biblioteca. Cada clon puede (1) exponerse a un inhibidor de la quinasa conocida en la línea celular y (2) monitorizarse para cambios de crecimiento basados en la expresión del ORF en la línea celular sin el inhibidor. Se eliminan cualesquiera clones con un efecto de crecimiento, positivo o negativo a partir de exclusivamente la expresión del ORF. Los clones restantes, cada uno de los cuales expresa una quinasa diferente, seguidamente se comparan para su viabilidad en un control y un clon tratado y se normalizan respecto a un control positivo. La viabilidad celular incrementada tras el tratamiento con el inhibidor identifica las ORF que proporcionan resistente y, por lo tanto, identifica las dianas quinasa para el tratamiento con un inhibidor adicional. Los clones con puntuaciones superiores a dos desviaciones estándar sobre la media normalizada pueden ser quinasa diana, indicando que el tratamiento con un inhibidor adicional resulta beneficioso para el sujeto.

A título de ejemplo no limitativo, un esquema de un ensayo de cribado funcional de alto rendimiento para quinasas que controla la resistencia a la inhibición de B-RAF se muestra en la figura 5. Se ensambló una colección de ~600 ORF clonadas y de secuencia validada, constituyendo ~75% de todas las quinasas anotadas (colección de ORF de quinasa del Center for Cancer Systems Biology (CCSB)/Broad Institute, figs. 1A, 1b y Tabla 3). Esta colección públicamente disponible puede transferirse rápidamente a una diversidad de vectores de expresión para diversas .

la colección de ORF de quinasa. A título de ejemplo no limitativo, puede crearse un vector de expresión lentivírico etiquetado con epítopo, seleccionable, capaz de producir un virus elevado de virus y una expresión de ORF robusta en células de mamífero a fin de expresar la colección de quinasas (pLX-BLAST-V5, figura 6a).

A fin de identificar las quinasas capaces de evitar la inhibición de RAF, la colección de ORF de quinasa en matrices puede expresarse establemente en A375, una línea celular de melanoma maligno B-RAFV600E que es sensible al inhibidor de quinasa RAF, PLX4720 (figs. 1a, 1b y 6c, Tabla 3). Se cribaron clones de células que expresaban ORF con PLX4720 1 |jM para viabilidad respecto a las células no tratadas y se normalizaron respecto a un control positivo específico de ensayo, MEK1S218/222D (Me K1dd) (Tabla 4). Los ORF que afectaban a la viabilidad o proliferación basal fueron eliminados del análisis. Los clones con puntuaciones superiores a dos desviaciones estándar respecto a la media normalizada pueden evaluarse adicionalmente con el fin de identificar una quinasa diana que proporciona resistencia a un segundo inhibidor. En algunas formas el gen codificante de la quinasa diana puede ser MAP3K8 (TPL2/COT), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl) o PAK3 (Pak3). En algunas realizaciones, el gen codificante de la quinasa diana puede ser un activador de la ruta de MAPK. El gen codificante de la quinasa diana puede ser una MAP3 quinasa que fosforila directamente y activa MEK. El gen codificante de la quinasa diana puede codificar una proteína adaptadora que es amplificada y fosforilada en el melanoma.

La colección de ORF puede expresarse establemente en una línea celular con una mutación diferente en B-RAF, por ejemplo otra mutación en la posición aminoácida aproximada 600, tal como V600K, V600D y V600R. Entre las mutaciones de B-RAF adicionales se incluyen las mutaciones indicadas en Davies et al., Nature 417:949-954, 2002; Tabla 1. Pueden utilizarse las líneas celulares que son sensibles a otros inhibidores de RAF quinasa, incluyendo, aunque sin limitación, PLX4032; GDC-0879; RAF265; sorafenib; SB590855 y/o ZM 336372. La colección de ORG puede expresarse establemente en una línea celular con una sensibilidad a un inhibidor de MEK. Entre los ejemplos no limitativos de inhibidores de MEK se incluyen AZD6244; CI-1040; PD184352; PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, 6-metoxi-7-(3-morfolín-4-il-propoxi)-4-(4-fenoxi-fenilamino)-quinolín-3-carbonitrilo y 4-[3-cloro-4-(1-metil-1H-imidazol-2-ilsulfanil)-fenilamino]-6-metoxi-7-(3-morfolín-4-il-propoxi)-quinolín-3-carbonitrilo. Se describen posteriormente inhibidores de RAF y MEK adicionales. A título de ejemplo no limitativo, se muestran inhibidores de RAF ejemplares en la Tabla 1 y se muestran inhibidores de MEK ejemplares en la Tabla 2.

Tabla 1: inhibidores de RAF ejemplares

Marcadores diagnósticos/pronósticos de resistencia innata y adquirida a terapias dirigidas

En algunos aspectos, la presente invención se refiere a métodos de detección de la presencia de uno o más marcadores diagnósticos o pronósticos en una muestra (p.ej., una muestra biológica de un paciente de cáncer). Puede utilizarse una diversidad de métodos conocidos por el experto en la materia para detectar la presencia del marcador en la muestra, incluyendo ADN, ARN y detección de proteínas. Las técnicas indicadas posteriormente pueden utilizarse para determinar la presencia o ausencia de una quinasa diana en una muestra obtenida de un paciente. El paciente puede presentar una resistencia innata o adquirida a terapias dirigidas a quinasas, incluyendo inhibidores de B-RAF o inhibidores de MEK. Por ejemplo, el paciente puede presentar una resistencia innata o adquirida a los inhibidores de B-RAF, PLX4720 y/o PLX4032. El paciente puede presentar resistencia innata o adquirida al inhibidor de MEK llamado AZD6244. La identificación de uno o más marcadores de quinasa diana en un paciente ayuda al médico a determinar un protocolo de tratamiento para el paciente. Por ejemplo, en un paciente con uno o más marcadores de quinasa diana, el médico puede tratar al paciente con una terapia de combinación, tal como se indica en mayor detalle posteriormente.

La quinasa diana puede ser MAP3K8 (TPL2/COT), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl) o PAK3 (Pak3). El marcador puede ser un incremento del número de copia génica, un incremento de la expresión de proteína, la fosforilación de uno o más elementos de la ruta de la MAP quinasa, un cambio en la expresión de ARNm y similar, para la quinasa diana.

A título de ejemplo no limitativo, en un paciente con una mutación oncogénica en B-RAF, la identificación de una quinasa diana activada puede resultar útil para caracterizar un protocolo de tratamiento para el paciente. Por ejemplo, en un paciente con una mutación B-RAFV600E, el tratamiento con un inhibidor de RAF únicamente puede indicar que el paciente presenta un riesgo relativamente elevado de adquirir resistencia al tratamiento después de un periodo de tiempo. En un paciente con una mutación oncogénica, la identificación de una quinasa diana activada en ese paciente puede indicar la inclusión de un segundo inhibidor en el protocolo de tratamiento.

La identificación de una diana quinasa activada puede incluir un análisis del número de copia génica y la identificación de un incremento del número de copia de una quinasa diana. Por ejemplo, una ganancia en el número de copia en MAP3K8 es indicativo de que un paciente presenta resistencia innata o que desarrolla resistencia adquirida, en particular en el caso de que el paciente presente una mutación B-RAFV600E.

La identificación de una quinasa diana activada puede incluir un análisis de la fosforilación de la quinasa diana y/o de un elemento de la ruta de la MAP quinasa. Por ejemplo, la fosforilación de C-RAF en S338 es indicativa de que un paciente presenta resistencia innata o que desarrolla resistencia adquirida, en particular en el caso de que el paciente presente una mutación B-RAFV600E. La identificación de un incremento de la fosforilación de MEK7ERK puede ser indicativa de que un paciente presenta resistencia innata o de que ha desarrollado una resistencia adquirida. Una expresión incrementada de la proteína COT en pacientes con una mutación B-RAFV600E puede predecir la resistencia a la inhibición de RAF y a la inhibición de MEK.

La identificación de una quinasa diana activada puede incluir un análisis de la expresión de ARNm de una quinasa diana. Por ejemplo, un incremento de la expresión de ARNm de COT tras el tratamiento inicial con un primer inhibidor de quinasa es indicativo de que un paciente presenta o está desarrollado resistencia.

Métodos de tratamiento

En la presente memoria se dan a conocer métodos para el tratamiento de un paciente con cáncer. Los métodos generales comprenden la administración de un primer inhibidor y un segundo inhibidor. Un inhibidor puede ser un inhibidor de RAF. El inhibidor de RAF puede ser un inhibidor de pan-RAF o un inhibidor selectivo de RAF. Entre los inhibidores de pan-RAF se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, RAF265, sorafenib o SB590885. En algunas realizaciones, el inhibidor de RAF es un inhibidor de B-RAF. En algunas realizaciones, el inhibidor selectivo de RAF es PLX4720, PLX4032 o GDC-0879-A. Un inhibidor puede ser un inhibidor de MEK (ver la Tabla 2, que ilustra inhibidores de MEK ejemplares). Un inhibidor puede ser un inhibidor de COT. A título de ejemplo no limitativo, el inhibidor de COT puede ser un inhibidor de ARNhp tal como se indica posteriormente o un inhibidor de COT de molécula pequeña, 4-(3-cloro-4-fluorofenilamino)-6-(piridín-3-il-metilamino)-3-ciano-[1,7]naftiridina (EMD, inhibidor I de TPL2, número de catálogo 616373, PubChem ID: 9549300). Los inhibidores para la utilización en la presente invención inhiben una o más quinasas diana, incluyendo MAP3K8 (TPL2/COT), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl) o PAK3 (Pak3) u otras dianas de la ruta de la MAP quinasa.

En algunas realizaciones, se proporciona una terapia de combinación para el cáncer que comprende una cantidad eficaz de un inhibidor de RAF y una cantidad eficaz de un inhibidor de MAP3K8 (TPL2/COT). Se proporciona además en la presente memoria una terapia de combinación para el cáncer que comprende una cantidad eficaz de un inhibidor de rAf y una cantidad eficaz de un inhibidor de m Ek . Entre otras terapias de combinación se incluye una cantidad eficaz de un inhibidor de RAF y una cantidad eficaz de un segundo inhibidor con diana en el gen, ARNm o proteína codificado por uno o más de los siguientes: MAP3K8 (TPL2/COT), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl) o PAK3 (Pak3). La terapia de combinación resulta adecuada para el tratamiento de un paciente en el que el cáncer contiene células mutantes B-RAF y, en particular, células mutantes. La presente invención proporciona además una terapia de combinación para el cáncer, que comprende una cantidad eficaz de un inhibidor de RAF y una cantidad eficaz de un inhibidor de MEK, en el que el sujeto con el cáncer contiene células con la expresión o número de copia génica de MAP3K8 (TPL2/COT) alterado. En algunas realizaciones, el inhibidor de MEK es CI-1040/PD184352 o AZD6244.

A título de ejemplo no limitativo, el inhibidor de MEK proporcionado en la presente memoria puede ser CI-1040, AZD6244, p D318088, PD98059, PD334581, RDEA119, 6-metoxi-7-(3-morfolín-4-il-propoxi)-4-(4-fenoxi-fenilamino)-quinolín-3-carbonitrilo o 4-[3-cloro-4-(1-metiMH-imidazol-2-ilsulfanil)-fenilamino]-6-metoxi-7-(3-morfolm-4-il-propoxi)-quinolín-3-carbonitrilo, compuesto de Roche n° RG7420, o combinaciones de los mismos. También pueden utilizarse inhibidores de MEK adicionales conocidos en la técnica.

En realizaciones ejemplares de los aspectos anteriormente indicados, el inhibidor de RAF proporcionado en la presente memoria es PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), ZM 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613 o CJS352 (NVP-AAL881-NX (denominado posteriormente en la presente memoria AAL881) y NVP-LBT613-AG-8 (LBT613) son compuestos isoquinolina (Novartis, Cambridge, MA). Entre los inhibidores de RAF ejemplares adicionales útiles para la terapia de combinación se incluyen inhibidores de pan-RAF, inhibidores de B-RAF, - - . ,

terapia de combinación se incluyen PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), ZM 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613 y CJS352. Entre los inhibidores de RAF ejemplares se incluyen además los compuestos indicados en la publicación de patente PCT n° WO/2008/028141. Entre los inhibidores de RAF ejemplares adicionalmente se incluyen los derivados quinazolinona descritos en la publicación de patente PCT n° WO2006/024836 y los derivados piridinilquinazolinamina descritos en la publicación de patente PCT n° WO2008/020203.

La administración de la combinación incluye la administración de la combinación en una formulación individual o forma de dosis unitaria, la administración de los agentes individuales de la combinación concurrente, aunque separadamente, o la administración de los agentes individuales de la combinación secuencialmente por cualquier vía adecuada. La dosis de los agentes individuales de la combinación puede requerir una administración más frecuente de uno de los agentes en comparación con el otro agente en la combinación. Por lo tanto, para permitir una administración apropiada, los productos farmacéuticos envasados pueden contener una o más formas de administración que contienen la combinación de agentes y una o más formas de administración que contienen una de las combinaciones de agentes, pero no el otro agente o agentes de la combinación.

Los agentes pueden contener uno o más elementos asimétricos, tales como centros estereogénicos o ejes estereogénicos, p.ej., átomos de carbono asimétrico, de manera que los compuestos pueden existir en diferentes formas estereoisoméricas. Estos compuestos pueden ser, por ejemplo, racematos o formas ópticamente activas. Para los compuestos con dos o más elementos asimétricos, estos compuestos pueden ser adicionalmente mezclas de diastereómeros. Para los compuestos con centros asimétricos, debe entenderse que se encuentran comprendidos todos los isómeros ópticos y mezclas de los mismos. Además, los compuestos con dobles enlaces carbono-carbono pueden encontrarse en formas Z y E; todas las formas isoméricas de los compuestos se encuentran incluidas en la presente invención. En estas situaciones, los enantiómeros individuales (formas ópticamente activas) pueden obtenerse mediante síntesis asimétrica, síntesis a partir de precursores ópticamente puros o mediante resolución de los racematos. La resolución de los racematos también puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, métodos convencionales, tales como la cristalización en presencia de un agente de resolución, o mediante cromatografía, por ejemplo, una columna de HPLC quiral.

A menos que se indique lo contrario, o lo indique claramente el texto, la referencia a compuestos útiles en la terapia de combinación de la invención incluye tanto la base libre de los compuestos como todas las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos. Una sal preferente es la sal hidrocloruro.

La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" incluye derivados de los compuestos dados a conocer, en la que el compuesto parental se modifica mediante la preparación de sales de ácido o base no tóxicos del mismo, y se refiere además a solvatos farmacéuticamente aceptables, incluyendo hidratos, de tales compuestos y tales sales. Entre las sales farmacéuticamente aceptables se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, sales minerales o de adición de ácido orgánico de residuos básicos, tales como aminas; sales alcalinas o de adición orgánicas de residuos ácidos, tales como ácidos carboxílicos, y similares, y combinaciones que comprenden una o más de las sales anteriormente indicadas. Entre las sales farmacéuticamente aceptables se incluyen sales no tóxicas y las sales de amonio cuaternario del compuesto parental formado, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Por ejemplo, entre las sales de ácido no tóxicas se incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos, tales como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico y nítrico; entre otras sales inorgánicas aceptables se incluyen sales de metales, tales como sal sódica, sal potásica y sal de cesio, y sales de metal alcalinotérreo, tal como sal de calcio y sal de magnesio, y combinaciones que comprenden una o más de las sales anteriormente indicadas.

Entre las sales orgánicas farmacéuticamente aceptables se incluyen las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos, tales como los ácidos acético, trifluoroacético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, mesílico, esílico, besílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etanodisulfónico, oxálico, isetiónico, HOOC(CH²)ⁿCOOH en el que n es 0-4; sales de amina orgánica, tales como sal trietilamina, sal piridina, sal picolina, sal etanolamina, sal trietanolamina, sal diciclohexilamina, sal N,N'-dibenciletilendiamina y sales de aminoácido, tales como arginato, asparginato y glutamato, y combinaciones que comprenden una o más de las sales anteriormente indicadas.

Una "cantidad eficaz" de una combinación de agentes (p.ej., inhibidores de MEK y RAF, o inhibidores de RAF y COT, o RAF y un inhibidor con diana en MAP3K8 (TPL2/COT), RAF1 (CRAF), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl) o PAK3 (Pak3)) es una cantidad suficiente para proporcionar una mejora observable respecto a los signos y síntomas clínicamente observables de línea base del trastorno tratado con la combinación.

Los productos farmacéuticos pueden administrarse por vía oral u otras formas, p.ej., rectalmente o mediante inyección parenteral. La expresión "forma de administración oral" pretende incluir una forma de administración unitaria prescrita o destinada a la administración oral. Una forma de administración oral puede comprender o no una pluralidad de subunidades tales como, por ejemplo, microcápsulas o microtabletas, envasadas para la administración en una sola dosis.

Los productos farmacéuticos pueden liberarse en diversas formas. "Forma liberable" pretende incluir las formas de liberación instantánea, liberación inmediata, liberación controlada y liberación sostenida.

"Liberación instantánea" pretende incluir una forma de administración diseñada para garantizar la rápida disolución del agente activo mediante modificación de la forma cristalina normal del agente activo con el fin de obtener una disolución más rápida.

"Liberación inmediata" pretende incluir una forma de liberación convencional o no modificada en la que se libera aproximadamente 50% o más, o más preferentemente aproximadamente 75%, de los agentes activos dentro de las primeras dos horas de administración, preferentemente dentro de la primera hora de administración.

"Liberación sostenida" o "liberación prolongada" incluye la liberación de agentes activos a una velocidad tal que los niveles sanguíneos (p.ej., plasmáticos) se mantienen dentro de un intervalo terapéutico, aunque inferiores a los niveles tóxicos durante por lo menos aproximadamente 8 horas, preferentemente por lo menos aproximadamente 12 horas, más preferentemente aproximadamente 24 horas después de la administración en el estado estacionario. La expresión "estado estacionario" se refiere a que un nivel plasmático de un agente activo o combinación de agentes activos dado se ha alcanzado y se mantiene con dosis posteriores del agente o agentes activos a un nivel que es igual o superior al nivel terapéutico eficaz mínimo y es inferior al nivel plasmático tóxico mínimo para un agente o agentes activos dados.

El término "tratar", "tratado", "tratando" o "tratamiento" se utiliza en la presente memoria para referirse a disminuir, reducir o aliviar por lo menos un síntoma de una enfermedad en un sujeto. Por ejemplo, el tratamiento puede reducir en uno o varios síntomas un trastorno o producir la erradicación completa de un trastorno, tal como el cáncer. En el sentido de la presente invención, el término "tratar" se refiere además a detener, retrasar la aparición (es decir, el periodo previo a la manifestación clínica de una enfermedad) y/o reducir el riesgo de desarrollo o agravamiento de una enfermedad. El término "proteger" se utiliza en la presente memoria para referirse a evitar el retraso o tratar, o ambos, según resulte apropiado, el desarrollo o continuación o agravamiento de una enfermedad en un sujeto. Dentro del significado del presente contexto, la enfermedad está asociada a un cáncer.

El término "sujeto" o "paciente" pretende incluir animales que son capaces de sufrir o están afectados por un cáncer o cualquier trastorno que implica, directa o indirectamente, un cáncer. Entre los ejemplos de sujetos se incluyen mamíferos, p.ej., seres humanos, perros, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, gatos, ratones, conejos, ratas y animales no humanos transgénicos. En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano, p.ej., un ser humano que sufre de, o está en riesgo de sufrir, o es potencialmente capaz de sufrir cánceres.

El término "aproximadamente" habitualmente se refiere a dentro del 20%, más preferentemente dentro del 10%, y lo más preferentemente todavía dentro del 5%, de un valor o intervalo dado. Alternativamente, especialmente en sistemas biológicos, el término "aproximadamente" se refiere a dentro de aproximadamente un log (es decir, un orden de magnitud), preferentemente dentro de un factor de dos de un valor dado.

La utilización de los términos "un" o "una" y "el" o "la" y referentes similares en el contexto (especialmente en el contexto de las reivindicaciones, posteriormente) debe interpretarse que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria o resulte claramente contradicho por el contexto. Los términos "comprendiendo", "presentando", "incluyendo" y "conteniendo" deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significan "incluyendo, aunque sin limitación"), a menos que se indique lo contrario. Los intervalos de valores indicados en la presente memoria pretenden meramente servir como método abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor separado comprendido dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria, y cada valor separado se incorpora en la memoria como si se hubiera indicado individualmente en la presente memoria.

Tal como se ha especificado anteriormente, en un aspecto, la presente invención proporciona una combinación de fármacos útil para tratar, prevenir, detener o retrasar la aparición y/o reducir el riesgo de desarrollar o revertir por lo menos un síntoma de cáncer en un sujeto, que comprende administrar en el sujeto una terapia de combinación que comprende una cantidad eficaz de un inhibidor de rA f y una cantidad eficaz de un inhibidor de MAP3K8 (TPL2/COT) o una cantidad eficaz de un inhibidor de RAF y una cantidad eficaz de inhibidor de MEK o una cantidad eficaz de un inhibidor de RAF y una cantidad eficaz de un segundo inhibidor con diana en MAP3K8 (TPL2/COT), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl) o PAK3 (Pak3). Preferentemente, dichos inhibidores se administran a dosis terapéuticamente eficaces que, en combinación, proporcionan un efecto beneficioso. La administración puede ser simultánea o secuencial.

El término "cáncer" se utiliza en la presente memoria para referirse a un amplio espectro de tumores, incluyendo todos los tumores sólidos y neoplasias malignas hematológicas. Entre los ejemplos de tales tumores se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, leucemias, linfomas, mielomas, carcinomas, carcinomas metastásicos, sarcomas, adenomas, cánceres del sistema nervioso y cánceres genitourinarios. En realizaciones ejemplares, los métodos anteriores resultan útiles para tratar leucemia linfoblástica aguda adulta y pediátrica, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, cáncer anal, cáncer del apéndice, astrocitoma, carcinoma de células basales, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer óseo, osteosarcoma, histiocitoma fibroso, cáncer cerebral, glioma del tallo cerebral, astrocitoma cerebelar, glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma hipotalámico, cáncer de mama, cáncer de mama masculino, adenomas bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, carcinoma de origen desconocido, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebelar, glioma maligno, cáncer cervical, cánceres de la infancia, leucemia linfocítica , , , ,

cutáneo, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer esofágico, tumores de la familia de Ewing, tumor de células germinales extracraneal, tumor de células germinales extragonadal, cáncer de conductos biliares extrahepáticos, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de la vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor estromal gastrointestinal, tumor de células germinales extracraneal, tumor de células germinales extragonadal, tumor de células germinales de ovario, tumor trofoblástico gestacional, glioma, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma hipotalámico y de la vía visual, melanoma intraocular, tumores de las células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer renal, cáncer de células renales, cáncer laríngeo, cáncer de labios y cavidad oral, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, linfoma del sistema nervioso central primario, macroglobulinemia de Waldenstrom, histiocitoma fibroso maligno, meduloblastoma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma maligno, cáncer escamoso de cuello, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoides, síndromes mielodisplásicos, trastornos mieloproliferativos, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de la cavidad nasal y seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer orofaríngeo, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer paratiroideo, cáncer peneano, cáncer faríngeo, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, cáncer de la pituitaria, neoplasmas de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer rectal, rabdomiosarcoma, cáncer de las glándulas salivales, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, síndrome de Sézary, cáncer de piel no-melanoma, cáncer del intestino delgado, carcinoma de células escamosas, cáncer escamoso de cuello, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer tiroideo, cáncer de células transicionales, tumores trofoblásticos, cáncer uretral, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer vulvar y tumor de Wilms.

En particular, el cáncer puede estar asociado a una mutación en el gen de B-RAF. En estos cánceres se incluye melanoma, cáncer de mama, cánceres colorrectales, glioma, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, sarcoma y cáncer de tiroides.

En una realización particular, la combinación terapéutica proporcionada en la presente memoria resulta eficaz para el tratamiento de cáncer moderado a severo en un sujeto.

Dosis

La dosis óptima de la combinación de agentes para el tratamiento del cáncer puede determinarse empíricamente para cada sujeto utilizando métodos conocidos y dependerá de una diversidad de factores, incluyendo la actividad de los agentes, la edad, el peso corporal, la salud general, el género y la dieta del sujeto, el tiempo y vía de administración y otras medicaciones que tome el sujeto. Las dosis óptimas pueden establecerse utilizando ensayos y procedimientos rutinarios que son bien conocidos en la técnica.

La cantidad de combinación de agentes que pueden combinarse con los materiales portadores para producir una forma de administración individual variará según el individuo tratado y el modo de administración particular. En algunas realizaciones, las formas de administración unitaria que contienen la combinación de agentes tal como se describe en la presente memoria contiene la cantidad de cada agente de la combinación que se administra típicamente al administrar los agentes solos.

Un médico o veterinario con conocimientos ordinarios en la materia podrá determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar las dosis de los compuestos indicados en la presente memoria, utilizados en la composición farmacéutica a niveles más bajos que los requeridos con el fin de conseguir el efecto terapéutico deseado y gradualmente incrementar las dosis hasta conseguir el efecto deseado.

En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto indicado en la presente memoria será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico. Dicha dosis eficaz generalmente dependerá de los factores indicados anteriormente y será fácilmente determinada por el experto en la materia.

Generalmente, las dosis terapéuticamente eficaces de los compuestos indicados en la presente memoria para un paciente, al utilizarlos para los efectos analgésicos indicados, se encontrará comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 0,0001 y aproximadamente 1.000 mg por kilogramo de peso corporal al día, más preferentemente de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 50 mg por kg al día.

Si se desea, la dosis diaria eficaz del compuesto activo puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados durante el día, opcionalmente en formas de administración unitarias.

Formulaciones farmacéuticas y vías de administración

En la presente memoria se proporcionan formulaciones farmacéuticas que comprenden una combinación de agentes para el tratamiento del cáncer, p.ej., el melanoma. Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un portador o excipiente, estabilizador, agente saborizante y/o agente colorante.

En la presente memoria se proporcionan formulaciones farmacéuticas que comprenden una combinación de agentes , ,

farmacológicamente activos, sales, solvatos y racematos del inhibidor y (2) un inhibidor de MAP3K8 (TPL2/COT) y/o metabolitos, sales, solvatos y racematos farmacológicamente activos del inhibidor de COT. En otra realización, la combinación de agentes puede proporcionarse para un sujeto que comprende células mutantes de BRAF o que comprende células que sobreexpresan MAP3K8 (TPL2/COT) e incluye: (1) un inhibidor de RAF y/o metabolitos farmacológicamente activos, sales, solvatos y racematos del inhibidor y (2) un inhibidor de MEK y/o metabolitos, sales, solvatos y racematos farmacológicamente activos del inhibidor de MEK.

La combinación de agentes puede administrarse utilizando una diversidad de vías de administración conocidas por el experto en la materia. La combinación de agentes puede administrarse en el ser humano y otros animales por vía oral, parenteral, sublingual, mediante aerosolización o spray de inhalación, rectal, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, bucal o tópica en formulaciones de dosis unitaria que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos según se desee. La administración tópica también puede implicar la utilización de administración transdérmica, tal como parches transdérmicos o dispositivos de yontoforesis. El término parenteral tal como se utiliza en la presente memoria incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular o intrasternal, o técnicas de infusión.

Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y se dan a conocer en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19a edición (1995). Las composiciones farmacéuticas para la utilización en la presente invención pueden encontrarse en forma de soluciones o suspensiones líquidas no pirogénicas estériles, cápsulas recubiertas, supositorios, polvos liofilizados, parches transdérmicos u otras formas conocidas en la técnica.

Las preparaciones inyectables, por ejemplo, las suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, pueden formularse según la técnica conocida, utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, en forma de solución en 1,3-propanodiol o 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden utilizarse se encuentran el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro sódico. Además, pueden utilizarse convencionalmente aceites fijos estériles como solvente o medio de suspensión. Con este fin puede utilizarse cualquier aceite fijo suave, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Además, pueden utilizarse ácidos grasos tales como el ácido oleico, en la preparación de inyectables. Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse mediante, por ejemplo, filtración mediante un filtro de retención bacteriana o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o suspenderse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de la utilización.

En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un fármaco, con frecuencia resulta deseable retrasar la absorción del fármaco a partir de la inyección subcutánea o intramuscular. Lo anterior puede llevarse a cabo mediante la utilización de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo de solubilidad en agua pobre. La velocidad de absorción del fármaco depende entonces de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada por vía parenteral se consigue mediante la disolución o suspensión del fármaco en un vehículo aceite. Las formas de depósito inyectable se preparan mediante la formación de matrices de microcápsulas del compuesto en polímeros biodegradables, tales como poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de la proporción de fármaco a polímero y de la naturaleza del polímero particular utilizado, puede controlarse la tasa de liberación de fármaco. Entre los ejemplos de otros polímeros biodegradables se incluyen (poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones de depósito inyectable también se preparan atrapando el compuesto en liposomas o microemulsiones, los cuales son compatibles con los tejidos corporales.

Las composiciones para la administración rectal o vaginal preferentemente son supositorios que pueden prepararse mediante la mezcla de los compuestos de la presente invención con excipientes o portadores no irritantes adecuados, tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera supositoria que son sólidas a temperatura ambiente pero líquidas a temperatura corporal y, por lo tanto, se funden en el recto o cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.

Entre las formas de administración sólidas para la administración oral se incluyen cápsulas, tabletas, píldoras, polvos y gránulos. En dichas formas de administración sólidas, el compuesto activo se mezcla con por lo menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable inerte, tal como citrato sódico o fosfato dicálcico y/o a) rellenos o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) ligantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y acacia, c) humectantes, tales como glicerol, d) agentes desintegrantes, tales como agar agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos y carbonato sódico, e) agentes de retardo de la solución, tales como parafina, f) aceleradores de la absorción, tales como compuestos cuaternarios de amonio, g) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita, e i) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato sódico y mezclas de los mismos. En el caso de las cápsulas, tabletas y píldoras, la forma de administración puede comprender además agentes tamponadores.

Las composiciones sólidas de un tipo similar también pueden utilizarse como rellenos en cápsulas rellenas de gelatina blanda y dura utilizando dichos excipientes como lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Las formas de administración sólidas de las tabletas, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y cápsulas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Pueden contener opcionalmente agentes opacificadores y también pueden ser de una composición con la que liberan el ingrediente o ingredientes activos sólo, o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente de manera retardada. Entre los ejemplos de composiciones de inclusión que pueden utilizarse se incluyen sustancias poliméricas y ceras.

Los compuestos activos también pueden encontrarse en forma microencapsulada con uno o más excipientes, tal como se ha indicado anteriormente. Las formas de administración sólidas de las tabletas, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y cápsulas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. En dichas formas de administración sólidas, el compuesto activo puede mezclarse con por lo menos un diluyente inerte, tal como sacarosa, lactosa o almidón. Dichas formas de administración pueden comprender, además, tal como es la práctica normal, sustancias adicionales diferentes de los diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes de tableteo y otros adyuvantes de tableteo, tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de las cápsulas, tabletas y píldoras, las formas de administración pueden comprender además agentes tamponadores. Pueden contener opcionalmente agentes opacificadores y también pueden ser de una composición con la que liberan el ingrediente o ingredientes activos sólo, o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente de manera retardada. Entre los ejemplos de composiciones de inclusión que pueden utilizarse se incluyen sustancias poliméricas y ceras.

Entre las formas de administración líquidas para la administración oral se incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de administración líquidas pueden comprender diluyentes inertes utilizados comúnmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizadores y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, EtOAc, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (por ejemplo aceites de semilla de algodón, de cacahuete, de maíz, de germen, de oliva, de ricino y de sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácido graso de sorbitán y mezclas de los mismos. Aparte de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes.

Entre las formas de administración para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de la presente invención se incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, sprays, inhalantes o parches. El componente activo se mezcla bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y cualesquiera conservantes o tampones necesarios según se requiera. También se encuentran contempladas formulaciones oftálmicas, gotas óticas y similares.

Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto activo descrito en la presente memoria, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o mezclas de los mismos.

Las composiciones dadas a conocer en la presente memoria también pueden formularse para la administración como un aerosol líquido o polvos secos inhalables. Las formulaciones de aerosol líquidas pueden nebulizarse, predominantemente en partículas de tamaños que pueden administrarse en los bronquiolos terminales y respiratorios.

Las formulaciones aerosolizadas pueden administrarse utilizando un dispositivo formador de aerosol, tal como un nebulizador de chorro, placa porosa vibratoria o ultrasónico, preferentemente seleccionado para permitir la formación de partículas de aerosol con un diámetro medio en masa predominantemente de entre 1 y 5 pm. Además, la formulación preferentemente presenta una fuerza iónica, osmolaridad y concentración de cloro equilibradas y el volumen aerosolizable más pequeño capaz de administrar una dosis eficaz de los compuestos dados a conocer en la presente memoria en el sitio de la infección. Además, la formulación aerosolizada preferentemente no afecta negativamente la funcionalidad de las vías respiratorias y no provoca efectos secundarios no deseables.

Los dispositivos de aerosolización adecuados para la administración de formulaciones de aerosol incluyen, por ejemplo, nebulizadores de chorro, placa porosa vibratoria y ultrasónicos, e inhaladores de polvos secos energizados, los cuales son capaces de nebulizar la formulación en un tamaño de partícula del aerosol predominantemente en el intervalo de tamaños de 1,5 pm. 'Predominante' en la presente solicitud significa que por lo menos 70%, aunque preferentemente más de 90%, de todas las partículas de aerosol generadas se encuentran dentro del rango de 1,5 pm. Un nebulizador de chorro funciona utilizando presión de aire para romper una solución de líquido en gotas de aerosol. Los nebulizadores de placa porosa vibratoria funcionan mediante la utilización de un vacío sónica producido por una placa poroso en rápida vibración para extrusionar una gota de solvente a través de la placa porosa. Un nebulizador ultrasónico funciona mediante un cristal piezoeléctrico que rompe un líquido en gotitas de aerosol. Se encuentra disponible una diversidad de dispositivos adecuados, incluyendo, por ejemplo, los nebulizadores de placa porosa vibratoria AERONEB y AERODOs E (AeroGen, Inc., Sunnyvale, California), los nebulizadores SIDESTREAM (Medic Aid Ltd., West Sussex, Inglaterra), los nebulizadores de chorro PARI LC y PARI LC STAR (Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Virginia) y los nebulizadores ultrasónicos AEROSONIC (DeVilbiss Medizinische Produkte (Deutschland) GmbH, Heiden, Alemania) y ULTRAAIRE (Omron Healthcare, Inc., Vernon Hills, Illinois).

Los compuestos dados a conocer en la presente memoria también pueden formularse para la utilización como polvos tópicos y sprays que pueden contener, además de los compuestos dados a conocer en la presente memoria, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvos de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los sprays pueden contener adicionalmente propelentes habituales, tales como clorofluorohidrocarburos.

Los parches transdérmicos presentan la ventaja añadida de proporcionar una administración controlada de un compuesto en el cuerpo. Dichas formas de administración pueden llevarse a cabo mediante la disolución o dispensación del compuesto en el medio apropiado. Los intensificadores de absorción también pueden incrementarse para incrementar el flujo del compuesto a través de la piel. La tasa puede controlarse proporcionando una membrana de control de la tasa o mediante la dispersión del compuesto en una matriz o gel de polímero. Los compuestos dados a conocer en la presente memoria también pueden administrarse en forma de liposomas. Tal como es conocido en la técnica, los liposomas se derivan generalmente de fosfolípidos y otras sustancias lipídicas. Los liposomas están formados de cristales líquidos hidratados mono- o multi-lamelares que están dispersados en un medio acuoso. Puede utilizarse cualquier lípido fisiológicamente aceptable y metabolizable no tóxico capaz de formar liposomas. Las presentes composiciones en forma de liposoma pueden contener, además de un compuesto descrito en la presente memoria, estabilizadores, conservantes, excipientes y similares. Los lípidos preferentes son los fosfolípidos y fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturales como sintéticas. Los métodos para formar liposomas son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Prescott (ed.), "Methods in Cell Biology," volumen XIV, Academic Press, New York, 1976, p. 33 y siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1: cribado funcional basado en ORF que identifica quinasas específicas como inductores de resistencia a la inhibición de B-RAF.

Con el fin de identificar las quinasas capaces de evitar la inhibición de RAF, se ensamblaron 597 clones de ORF de quinasa de secuencia validada, que representaban ~75% de las quinasas anotadas (colección de ORF de quinasa del Center for Cancer Systems Biology (CCSB)/Broad Institute) y se expresaron establemente en A375, una línea celular de melanoma maligno B-RAF^V600E que es sensible al inhibidor de la quinasa RAF, PLX4720 (Tsai J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 3041-3046, 2008) (fig. 1a, 1b, Tabla 3, fig. 6c). Las células expresantes de ORF tratadas con PLX4720 1 |jM se cribaron para viabilidad respecto a células no tratadas y se normalizaron respecto a un control positivo específico de ensayo, MEK1^S218/222D (Me K1dd) (Emery C.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:20411-20416, 2009) (Tabla 4 y resumen en la fig. 5). Nueve ORF proporcionaron resistencia a niveles superiores a dos desviaciones estándar de la media (fig. 1B y Tabla 4) y se seleccionaron para los análisis siguientes (fig. 7). Tres de nueve ORF candidatos eran receptor-tirosina quinasas, subrayando el potencial de esta clase de quinasas para intervenir en las rutas de resistencia. Los efectos de resistencia se validaron y priorizaron a lo largo de una escala de concentración multipunto del fármaco PLX4720 en las líneas celulares B-RAF^V600Ellamadas A375 y SKMEL28. Las Ser/Thr MAP quinasas (MAP3K) MAP3K8 (COT/Tpl2) y RAF1 (C-RAF) emergieron como los mejores candidatos de ambas líneas celulares; estos ORF modificaron la GI⁵⁰ de PLX4720 en un factor de 100 a 600 sin afectar a la viabilidad (Tabla 5 y figs. 8 y 9). CRKL, un ORF que modificó la GI⁵⁰ de PLX4720 en mayor medida (9,6 veces en células SKMEL28; fig. 8), codifica una proteína adaptadora fosforilada por tirosina quinasas, tales como BCR-ABL (Birge R.B. et al., Cell Commun. Signal 7:13, 2009), pero que no presenta actividad intrínseca de quinasas. COT y C-RAF redujeron la sensibilidad a PLX4720 en múltiples líneas celulares B-RAF^V600E (fig. 1C), confirmando la capacidad de estas quinasas de mediar en la resistencia a la inhibición de RAF. Un cribado secundario en A375 y SKMEL28 prioriza los 9 mejores ORF candidatos a lo largo de una escala multipunto de concentración de PLX4720 (fig. 1d).

Resulta interesante que las dos mejores quinasas validadas son ambas Ser/Thr MAP quinasas (MAP3K) que es conocido que activan la señalización de MEK/ERK en varios contextos. Al igual que B-RAF, C-RAF es una MAP3K en la cascada de MAPK canónico (McKay M.M. y Morrison D.K., Oncogene 26:3113-3121, 2007) que anteriormente se había implicado en la resistencia asociada a la selección escalonada in vitro utilizando un inhibidor pan-RAF (Montagut C. et al. Cancer Res 68:4853-4861, 2008). COT (el producto proteína del gen MAP3K8 humano) se caracteriza mejor como el MAP3K (Salmeron A. et al., EMBO J. 15:817-826, 1996) cadena abajo de la señalización de NFKB en células inflamatorias (Banerjee A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3274-3279, 2006); sin embargo, su importancia funcional en el cáncer humano todavía no ha sido aclarada.

Ejemplo 2: resistencia a la inhibición de B-RAF mediante activación de la ruta de MAPK

También se sometió a ensayo si la sobreexpresión de estos genes resultaba suficiente para activar la ruta de MAPK. En la línea base, la expresión de COT incrementó la fosforilación de ERK de una manera comparable a MEK1^DD, consistentemente con la activación de la ruta de la MAP quinasa (figs. 2a y 10). La sobreexpresión de COT o C-RAF de tipo salvaje resultó en la fosforilación constitutiva de ERK y MEK en presencia de PLX4720, mientras que los derivados de quinasa muerta no presentaron ningún efecto (figs. 2a y 11). De esta manera, COT y C-RAF inducen la resistencia a la inhibición de RAF predominantemente mediante reactivación de la señalización de MAPK. En particular, de los nueve ORF candidatos del cribado inicial, un subgrupo (3) no mostró una fosforilación de ERK/MEK persistente tras la inhibición de RAF, sugiriendo una alteración independiente de la ruta de MAPK de la sensibilidad a fármaco (figura 12).

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la activación de C-RAF y heterodimerización con B-RAF constituyen componentes críticos de la respuesta celular a la inhibición de B-RAF. En las células A375, eran medibles heterodímeros endógenos de C-RAF: B-RAF e inducibles tras el tratamiento con PLX4720 (fig. 13). Sin embargo, la fosforilación de C-RAF endógena en S-338 -un suceso requerido para la activación de C-RAF, se mantuvo a niveles bajos (fig. 13). En contraste, C-RAF expresado ectópicamente se fosforiló en S338 (fig. 13) y su fenotipo de resistencia a PLX4720 estaba asociado a una activación sostenida de MEK/ERK (figs. 2a y 13). Además, la expresión ectópica de un mutante por truncado de C-RAF de alta actividad (C-RAF(W22)) era más eficaz que C-RAF de tipo salvaje en la mediación de la resistencia a PLX4720 y la activación de ERK (fig. 14), indicando adicionalmente que una actividad de C-RAF elevada dirige la resistencia a este agente. Consistentemente con este modelo, los alelos oncogénicos de NRAS y KRAS proporcionaron resistencia a PLX4720 en las células A375 (fig. 2B) y rindieron una fosforilación sostenida de C-RAF(S338) y ERK en el contexto del tratamiento farmacológico (fig. 2c). De esta manera, aunque las alteraciones genéticas que produjeron la activación de C-RAF (p.ej., las mutaciones oncogénicas de RAS) tienden a mostrar exclusividad mutua con la mutación B-RAFV600E, dichos sucesos concurrentes resultan favorecidos en el contexto de la resistencia adquirida a la inhibición de B-RAF.

Ejemplo 4: investigación de la expresión de COT en el melanoma

Aunque C-RAF se ha asociado anteriormente a melanoma y dependencias de la ruta de MAPK (Montagut C. et al., 2008; Karreth F.A., DeNicola G.M. et al., 2009; Dumaz N. et al. Cancer Res 66:9483-9491, 2006; Hatzivassiliou G. et al., Nature (2010); Heidorn S.J. et al., Cell 140:209-221, 2010; Poulikakos, P.I. et al., Nature (2010), COT no ha sido descrito como una quinasa asociada a melanoma.

Se ha investigado el papel de COT en el melanoma y se ha examinado su expresión en melanocitos humanos. Los melanocitos inmortalizados primarios (B-RAF de tipo salvaje) expresaban COT (fig. 2d), aunque la expresión ectópica de B-RAFV600E redujo los niveles de ARNm de COT (fig. 15) y convirtió la proteína COT en indetectable (fig. 2d). A la inversa, mientras que COT expresado ectópicamente sólo era débilmente detectable en células A375 (figs. 2a, 2e), la reducción mediada por ARNhp de B-RAFV600E endógeno provocó un incremento de los niveles de la proteína COT que se correlacionaba con el grado de inactivación de B-RAF (fig. 2e). Además, el tratamiento de las células A375 expresantes de COT con PLX4720 condujo a un incremento dependiente de la dosis de la proteína COT (fig. 2A) sin afectar a los niveles ectópicos de ARNm de COT (fig. 15). B-RAF oncogénico antagoniza la expresión de COT en gran medida a través de una estabilidad alterada de la proteína (figs. 2a, d, e y 15) y la inhibición de B-RAF potencia el crecimiento de las células expresantes de COT durante el curso del tratamiento. Cabe destacar que ni C-RAF ni B-RAF por sí solos o en combinación resultaron necesarios para la fosforilación de ERK en el contexto de la expresión de c Ot , ni siquiera en presencia de PLX4720 (figs. 2e, 2f y fig. 16). Tal como se muestra, la expresión de COT resultó suficiente para inducir la activación de la ruta de la quinasa MAP de una manera independiente de RAF.

Ejemplo 5: la expresión de COT predice la resistencia a la inhibición de B-RAF en líneas celulares de cáncer.

Se sometió a ensayo si las líneas celulares que expresaban niveles elevados de COT en un fondo de B-RAF^V660E mostraban resistencia de novo al tratamiento de PLX4720. Para identificar tales casos, se cribó un panel de líneas celulares para evidencia de ganancias de número de copia de MAP3K8/COT coincidentes con la mutación B-RAF^V600E. De las 534 líneas celulares sometidas a análisis de número de copia y perfilado de mutaciones, 38 líneas celulares (7,1%) contenían la mutación B-RAF^V600E. Dentro de este subgrupo, dos líneas celulares -OUMS-23 (cáncer de colon) y RPMI-7951 (melanoma), también mostraron pruebas de ganancias de copia cromosómica que comprendía el locus AMP3K8/COT (figs. 3a y 17) y una expresión robusta de la proteína COT (figs. 3b y 18). También se cribó un panel de cultivos a corto plazo de melanoma para la expresión de la proteína COT. Una de estas líneas expresaba COT: M307, un cultivo a corto plazo derivado de un tumor B-RAF^V600E que desarrolló resistencia a la inhibición alostérica de MEK tras la estabilización inicial de la enfermedad (fig. 3c). La totalidad de las tres líneas celulares eran refractarias al tratamiento de PLX4720, mostrando valores de GI⁵⁰ en el intervalo de 8 a 10 pM (fig. 3D) y que mostraban una fosforilación sostenida de ERK en el contexto de la inhibición de B-RAF (figs. 3e, 3f). OUm S-23 y RPMI-7951 son líneas celulares nunca expuestas a inhibidor de la ruta de MAPK; de esta manera, estos resultados demuestran que COT proporciona resistencia de novo a la inhibición de RAF (un fenómeno observado en ~10% de los melanomas B-RAF^V600E),

Ejemplo 6: expresión de COT en pacientes tratados con un inhibidor de RAF.

La expresión de COT en el contexto de la resistencia al inhibidor clínico de RAF, PLX4032, se examinó mediante la obtención de material de biopsia procedente de 3 pacientes con melanoma B-RAFV600Emetastásico. Cada caso consistía en material de biopsia congelado de una lesión correspondiente, obtenido antes y durante el tratamiento ("pretratamiento" y "durante tratamiento", fig. 3g, Tabla 6); además, una muestra contenía dos especímenes de biopsia independientes del mismo sitio tumor en recaída ("post-recaída", fig. 3g). Consistentemente con los modelos experimentales presentados anteriormente, el análisis de RT-PCR en tiempo real cuantitativo (qRT/PCR) reveló una expresión incrementada de ARNm de COT concurrente con el tratamiento de PLX4032 en 2 de 3 casos. Los niveles de ARNm de COT se incrementaron adicionalmente en un espécimen de recaída respecto a sus contrapartidas pretratamiento y de durante tratamiento (fig. 3g, paciente n° 1). Una biopsia adicional de melanoma maligno en recaída no correspondiente mostró una expresión elevada de ARNm de COT comparable a los niveles observados en líneas celulares con COT amplificado resistentes a inhibidor de RAF (fig. 19). Este espécimen también mostró una activación

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o líneas celulares B-RAFV600E (fig. 19). Los estudios de secuenciación de este tumor no revelaron mutaciones adicionales en BRAF, NRAS o KRAS (datos no mostrados). Estos análisis proporcionan evidencia clínica de que operan mecanismos dependientes de COT en los melanomas malignos resistentes a PLX4032.

Ejemplo 7: regulación de COT de la fosforilación de MEK/ERK

Se sometió a ensayo si COT regula activamente la fosforilación de MEK/ERK en células B-RAFV600Eque contienen naturalmente una expresión elevada de COT, mediante la introducción de constructos de ARNhp con diana en COT en células RPMI-7951. La reducción de COT suprimió la viabilidad de RPMI-7951 (fig. 20) y redujo la fosforilación de ERK (fig. 3H); de esta manera, la utilización como diana de la actividad de la quinasa de c Ot suprime la fosforilación de MEK/ERK en las células de cáncer con sobreexpresión o amplificación de COT. Además, la utilización como diana de la actividad de la quinasa de COT en presencia de un inhibidor de B-RAF (PLX4720) suprime la fosforilación de MEK/IRK (fig. 3h). El tratamiento de las células RPMI-7951 con un inhibidor de quinasa de c Ot de molécula pequeña (Wyeth, Abbot compuesto n° ID 9549300) (George D. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18:4952-4955, 2008; Hirata K. et al., Biol. Pharm. Bull. 33:133-137, 2010; Lee K. M. et al., Cancer Res. 69:8043-8049, 2009) resultó en la supresión dependiente de la dosis de la fosforilación de MEK y ERK, proporcionando evidencia adicional de que COT contribuye a la activación de MEK/ERK en estas células (fig. 3i).

Ejemplo 8: las líneas celulares B-RAFV600E expresantes de COT muestran resistencia a inhibidores de MEK alostéricos.

Se analizó si las células de cáncer expresantes de COT seguían siendo sensibles a la inhibición de la ruta de MAPK en una diana posterior a COT o RAF. Se analizaron las líneas celulares OUMS-23 y RPMI-7951 para sensibilidad al inhibidor de MEK1/2, CI-1040. Ambas líneas celulares eran refractarias a la inhibición de MEK (fig. 4A) y mostraban una fosforilación de ERK sostenida incluso con CI-1040 1 pM (fig. 4b). La expresión ectópica de COT en célula A375 y SKMEL28 también proporcionó una menor sensibilidad frente a los inhibidores de MEK llamados CI-1040 y AZD6244, sugiriendo que la expresión de COT por sí sola resultaba suficiente para inducir este fenotipo (figs. 4c, 4d y 21). De manera similar a los resultados observados con inhibidores farmacológicos de MEK, la inactivación de MEK1/2 sólo suprimió modestamente la fosforilación de ERK mediada por COT en células A375 (fig. 22). Estos datos demuestran que COT activa ERK mediante mecanismos independientes de MEK y dependientes de MEK. Además, se llevó a cabo un ensayo de quinasa in vitro utilizando COT y ERK1 recombinantes y se demostró que COT recombinante inducía la fosforilación de pThr202/Tyr204 de ERK1 in vitro (fig. 22). De esta manera, la expresión de COT potencia la activación de ERK de una manera independiente de MEK.

Ejemplo 9: la inhibición combinatorial de la ruta de MPAK suprime la proliferación celular.

La utilización de inhibidores de RAF y MEK en combinación puede superar la resistencia frente a agentes individuales, tal como se muestra en la fig. 23. Se sometió a ensayo si la inhibición combinada de RAF/MEK podría evitar la resistencia inducida por COT. En el contexto de la expresión ectópica de COT, la exposición a AZD6244 o CI-1040 en combinación con PLX470 (1 pM cada uno) redujo el crecimiento celular y la expresión de pERK más eficazmente que PLX4720 como agente único, incluso a concentraciones de 10 (figs. 4e, 4f y 23). Estos datos subrayan la importancia de esta ruta en las células tumorales B-RAFV600E y demuestran que la inhibición doble de B-RAF/MEK ayuda a evitar la resistencia a los inhibidores de RAF.

Métodos

Colección de marcos de lectura abiertos de quinasa del Center for Cancer Systems Biology (CCSB)/Broad Institute

Se construyó una biblioteca de 597 ORF de quinasa en vectores de entrada pDONR-223 (Invitrogen). Se secuenciaron los extremos de los clones individuales utilizando cebadores específicos de vector en ambas direcciones. Los clones con desviaciones sustanciales respecto a las secuencias publicadas fueron descartados. Los clones de entrada y secuencias se encuentran disponibles en Addgene (http://www.addgene.org/human_kinases). Se ensamblaron ORF de quinasa a partir de múltiples fuentes: se aislaron 337 quinasas en forma de clones individuales de la colección de ORFeoma 5.1 (http://horfdb.dfci.harvard.edu), 183 quinasas fueron clonadas a partir de ARN de tejido humano normal (Ambion) mediante transcripción inversa y posterior amplificación por PCR para añadir secuencias Gateway (Invitrogen); 64 quinasas se clonaron a partir de moldes proporcionados por el Harvard Institute of Proteomics (HIP) y 13 quinasas se clonaron en el sistema Gateway a partir de moldes obtenidos de laboratorios colaboradores. El vector lentivírico compatible con Gateway pLX-Blast-V5 se creó a partir del esqueleto de pLKO.1. Se llevaron a cabo reacciones de recombinación enzimática de LR clonasa para introducir las 597 quinasas en pLX-Blast-V5 siguiendo el protocolo del fabricante (Invitrogen).

Cribado de ORF de alto rendimiento

Se sembraron células de melanoma A375 en placas de microtitulación de 384 pocillos (500 células en cada pocillo). Al día siguiente, las células se infectaron mediante centrifugación con la biblioteca de ORF de quinasa empaquetada en lentivirus, en presencia de 8 pg/ml de polibreno. 48 horas después de la infección, se sustituyó el medio por medio de crecimiento estándar (2 réplicas), medio que contenía 1 PLX4720 (2 réplicas, 2 puntos temporales) o medio que contenía 10 pg/ml de blasticidina (2 réplicas). Tras cuatro días y 6 días, se sometió a ensayo el crecimiento utilizando Cell Titer-Glo (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se llevó a cabo el experimento entero dos veces.

Identificación de ORF candidatos de resistencia

Se importaron los valores en bruto de luminiscencia a Microsoft Excel. Se determinó la eficiencia de infección a partir del porcentaje de luminiscencia en bruto (media de muestras de por duplicado) en células seleccionadas con blasticidina respecto a células no seleccionadas. Los ORF con una eficiencia de infección inferior a 0,70 se excluyeron de análisis posteriores junto con cualquier ORF con una desviación estándar >15.000 unidades de luminiscencia en bruto entre duplicados. Para identificar los ORF cuya expresión afectaba a la proliferación, los presentes inventores compararon la luminiscencia en bruto (media de duplicados) de ORF individuales con la media y desviación estándar de todas las células tratadas con control mediante la puntuación z, o puntuación estándar, a continuación:

X-P

z = ----------------

CT

en donde x = luminiscencia en bruto media de un ORF dato, y = luminiscencia en bruto media de todos los ORF y a = desviación estándar de la luminiscencia en bruto de todos los pocillos. Se anotó cualquier ORF individual con una puntuación z >+2 o <-2 como ORF con efecto sobre la proliferación y se descartó del análisis final. Se determinó la proliferación diferencial a partir del porcentaje de valores en bruto de luminiscencia, medias de duplicados, en células tratadas con PLX4720 (1 j M) respecto a las células no tratadas. A continuación, se normalizó la proliferación diferencial respecto al control positivo para resistencia a PLX4720.

MEK1S218/222D (MEK1dd), con proliferación diferencial de MEK1DD=1,0. La proliferación diferencial normalizada, MEK1DD (días 4 y 6) de cada ORF individual se promedió para dos experimentos por duplicado con dos puntos temporales en cada experimento (días 4 y 6). A continuación, se generó la puntuación z, tal como se ha indicado anteriormente para la proliferación diferencial normalizada MEK1DD media. Los ORF con una puntuación z >2 se consideraron aciertos y se realizó un seguimiento en el cribado secundario.

Expresión de ORF y ARNhp

Se expresaron los ORF a partir de los plásmidos de expresión pLX-Blast-V5 (lentivírico) o pWZL-Blast, pBABE-Puro o pBABE-zeocina (retrovírico). Para la transducción lentivírica, se transfectaron células 293T con 1 jg de pLX-Blast-V5-ORF o pLKO.I-ARNhp, 900 ng de A8.9 (gag, pol) y100 ng de VSV-G utilizando 6 j l de reactivo de transfección Fugene6 (Roche). Se recolectó el sobrenadante vírico 72 h después de la transfección. Se infectaron células de mamífero a una dilución de 1:10-1:20 de virus en placas de 6 pocillos en presencia de 5 jg/m l de polibreno y se centrifugaron a 2.250 rpm durante 1 h a 37°C. Veinticuatro horas después de la infección, se añadió blasticidina (pLX-Blast-V5, 10 jg/m l) o Puro (pLKO.1, 0,75 jg/m l) y las células se seleccionaron durante 48 h. Para la producción de retrovirus, se transfectaron células 293T con 1 jg de ORF de plásmido retrovírico, 1 jg de pCL-AMPHO y 100 ng de VSV-G, tal como se ha indicado anteriormente. Las células se infectaron con sobrenadante que contenía retrovirus a una dilución 1:2 en 5 jg/m l de polibreno durante la noche, seguido de cambio del medio a medio de crecimiento. Se repitió la infección una vez adicional (dos en total), seguido de la selección, indicada anteriormente.

Cribado secundario

Se sembraron células A375 (1,5x103) y SKMEL28 (3x103) en placas de 96 pocillos durante 18 h. Se añadieron lentivirus que expresaban ORF a una dilución de 1:10 en presencia de 8 jg/m l de polibreno y se centrifugaron a 2.250 rpm y a 37°C durante 1 h. Tras la centrifugación, el medio que contenía virus se cambió por medio de crecimiento normal y se dejó bajo incubación durante 18 h. Veinticuatro horas después de la infección, se añadió DMSO (1:1.000) o 10x PLX4720 (en DMSO) hasta una concentración final de 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 o 0,00001 jM . Se sometió a ensayo la viabilidad celular utilizando WST-1 (Roche), siguiendo las recomendaciones del fabricante, 4 días después de la adición de PLX4720.

Líneas celulares y reactivos

Se cultivaron A375, SKMEL28, SKMEL30, COLO-679, WM451lu, SKMEL5, Malme 3M, SKMEL30, WM3627, WM1976, WM3163, WM3130, WM3629, WM3453, WM3682 y WM3702 en RPMI (Cellgro), FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1%. Se cultivó M307 en RPMI (Cellgro), FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1% complementado con piruvato sódico 1 mM. Se cultivaron 293T y OUMS-23 en DMEM (Cellgro), FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1%. Se cultivaron células RPMI-7951 (ATCC) en MEM (Cellgro), FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1%. Se cultivaron melanocitos primarios de tipo salvaje en medio F10 de Ham (Cellgro), FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1%. Se cultivaron melanocitos primarios expresantes de B-RAFV600E en medio TIVA [f 10 de Ham (Cellgro), FBS al 7%, penicilina/estreptomicina al 1%, glutamina 2 mM (Cellgro), IBMX 100 jM , TPA 50 ng/ml, dbcAMP 1 mM (Sgima) y vanadato sódico 1). Se obtuvo CI-1040 (PubChem ID: 6918454) de Shanghai Lechen International Trading Co., AZD6244 (PubChem ID: 10127622) de Selleck Chemicals, y PLX4720 (PubChem ID: 24180719) de Symansis. RAF265 (PubChem ID: 11656518) fue generosamente proporcionado por Novartis Pharma AG. A menos que se indique lo contrario, todos los tratamientos farmacológicos fueron de 16 h. Los alelos activados de NRAS y KRAS han sido descritos anteriormente. (Boehm J. S. et al., Cell 129:1065-1079, 2007; Lundberg A. S. et al. Oncogene 21:4577-4586, 2002).

Ensayos de inhibición de crecimiento farmacológicos

Se cultivaron células en placas de 96 pocilios (3.000 células en cada pocilio) para todas las líneas celulares de melanoma; se sembraron 1.500 células en el caso de A375. Veinticuatro horas después de la siembra, se prepararon diluciones en serie del compuesto relevante en DMSO añadido a las células, rindiendo concentraciones de fármaco finales comprendidas entre 100 y 1x 105 j M, con un volumen final de DMSO no superior a 1%. Las células se incubaron durante 96 h desde la adición del fármaco. Se estimó la viabilidad celular utilizando el ensayo de viabilidad WST1 (Roche). Se calculó la viabilidad como porcentaje del control (células no tratadas) tras restar el fondo. Se preparó un mínimo de seis réplicas para cada línea celular y combinación de fármacos. Los datos de los ensayos de inhibición del crecimiento se modelaron utilizando un ajuste de curva de regresión no lineal con una curva sigmoidal de dosis-respuesta. Se representaron estas curvas y la GI⁵⁰ generada utilizando el programa GraphPad Prism 5 para Windows (GraphPad). Las curvas sigmoidales de respuesta que cruzaban el punto de 50% de inhibición o superior a 10 presentaban valores de GI⁵⁰ anotados como >10 j M. Para los estudios de dosis única, se siguió un protocolo idéntico utilizando una sola dosis del fármaco indicado (1, a menos que se indique lo contrario).

Inmunotransferencias e inmunoprecipitaciones

Las células se lavaron dos veces con PBS helado y se lisaron con tampón NP-40 al 1% (NaCl 150 mM, Tris 50 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, pH 8, NaF 25 mM y NP-40 al 1%) que contenía 2x inhibidores de proteasa (Roche) y 1x inhibidor de fosfatasa, cócteles I y II (CalBioChem). Se cuantificaron los lisados (ensayo de Bradford), se normalizaron, se redujeron, se desnaturalizaron (95°C) y se resolvieron mediante electroforesis en gel de SDS en geles de tris/glicina al 10% (Invitrogen). Se transfirió la proteína a membranas de PVDF y se sondearon con anticuerpos primarios que reconocían pERK1/2 (T202/Y204), pMEK1/2 (S217/221), MEK1/2, MEK1, MEK2, C-RAF (huésped conejo), pC-RAF (pS338) (Cell Signaling Technology; 1:1,000), V5-HRP (Invitrogen; (1:5,000), COT (1:500), B-RAF (1:2,000), actina (1:1,000), actina-HRP (1:1,000; Santa Cruz)), C-RAF (huésped ratón; 1:1,000; b D Transduction Labs), Vinculina (Sigma; 1:20,000), AXL (1:500; R&D Systems). Tras la incubación con el anticuerpo secundario apropiado (IgG anticonejo antiratón, unido a HRP, dilución 1:1.000, Cell Signaling Technology o anti-IgG de cabra, unido a HRP, dilución 1:1.000, Santa Cruz), se detectaron las proteínas utilizando la quimioluminiscencia (Pierce). Se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones durante la noche a 4°C en tampón de lisis NP-40 al 1%, tal como se ha indicado anteriormente, a una concentración de 1 jg / j l de proteína total utilizando un anticuerpo que reconocía C-RAF (1:50, Cell Signaling Technology). Se unieron complejos de anticuerpo:antígeno a proteína A-agarosa (25 jl, suspensión al 50%, Pierce) durante 2 h a 4°C. Se centrifugaron las perlas y se lavaron tres veces en tampón de lisis y se eluyeron y desnaturalizaron (95°C) en 2x tampón para muestras reducido (Invitrogen). Se llevaron a cabo inmunotransferencias tal como anteriormente. Se llevó a cabo una cuantificación de fosfoproteína utilizando el programa Image J de NIH.

Se generaron lisados de tumores y de piel normal correspondiente mediante homogeneización mecánica del tejido en RIPA [Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, SDS al 0,1%, NaDOC al 1,0%, Triton X-100 al 1,0%, NaF 25 mM y Na³VO⁴1 mM] que contenía inhibidores de proteasa y de fosfatasa, tal como anteriormente. La normalización e inmunotransferencias siguientes se llevaron a cabo tal como anteriormente.

Material de tumor de melanoma biopsiado

El material tumoral biopsiado consistía en tejido descartado y des-identificado que se obtuvo con consentimiento informado y caracterizado bajo el protocolo 02-017 (muestras apareadas, Massachusetts General Hospital) y 07-087 (muestra no apareada, Dana-Farber Cancer Institute). Para los especímenes apareados, se recogieron muestras 'durante tratamiento' 10 a 14 días después de iniciar el tratamiento de PLX4032 (Tabla 6).

Inhibición de la actividad de la quinasa COT

Las células RPMI-7951 adherentes se lavaron dos veces con 1x PBS y se incubaron durante la noche en medio de crecimiento sin suero. A continuación, se añadió a las células durante 1 hora 4-(3-cloro-4-fluorfenilamino)-6-(piridín-3-il-metilamino)-3-ciano-[1,7]naftiridina (EMD, inhibidor TPL2 I, n° de cat. 616373, PubChem ID: 9549300), suspendido en DMSO a la concentración indicada, seguido de la preparación de los extractos de proteína tal como se ha indicado anteriormente.

RT-PCR cuantitativa

Se extrajo el ARNm a partir de las líneas celulares y tumores congelados en fresco, utilizando el kit RNeasy (Qiagen). Se utilizó el ARNm total para la posterior transcripción inversa utilizando la mezcla SuperMix para síntesis de primera cadena SuperScript III (Invitrogen) para líneas celulares y muestras tumorales no apareadas, y el kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO (Invitrogen) para las muestras tumorales congeladas de tumor apareadas. Se utilizaron 5 j l de la reacción de RT para la PCR cuantitativa utilizando la mezcla maestra de PCR SYBR Green y cebadores específicos de gen, por triplicado, utilizando un sistema de PCR en tiempo real ABI 7300. Los cebadores utilizados para la detección fueron los siguientes:

Ensayo de quinasa in vitro

Se llevaron a cabo ensayos de quinasa in vitro tal como se ha indicado anteriormente, utilizando 1 |jg de cada uno de COT (aminoácidos 30 a 397, R&D Systems) y ERK1 inactivo (Millipore).

Ensayos de viabilidad celular

Se infectaron células RPMI-7951 adherentes con virus que expresaba ARNhp contra COT o luciferasa tal como se ha indicado anteriormente. Tras la selección, las células se sembraron (1,5x106 células/pocillo) en una placa de 24 pocillos por cuadruplicado. Se contaron las células viables mediante exclusión de azul tripán utilizando un analizador de viabilidad celular VI-CELL, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se calcularon medias de los recuentos celulares por cuadruplicado y se normalizaron respecto a los del ARNhp de control.

Enciclopedia de líneas celulares de cáncer (CCLE)

El proyecto 'Cancer Cell Line Encyclopedia' (CCLE) es una colaboración entre el Broad Institute, el Novartis Institute for Biomedical Research (NIBR) y el Genomics Institute of the Novartis Research Foundation (GNF) para llevar a cabo una caracterización genética y farmacológica detallada de un gran panel de modelos de cáncer humano, con el fin de desarrollar análisis computacionales integrados que relacionan las diferentes vulnerabilidad farmacológicas a patrones genómicos y a fin de traducir la genómica integrativa de líneas celulares a la estratificación de los pacientes de cáncer. Los datos de número de copia cromosómica y de expresión génica de este estudio se encuentran disponibles en internet, en http://www.broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi.

Perfilado de expresión de líneas celulares de cáncer

El análisis de micromatrices de oligonucleótidos se llevó a cabo utilizando la matriz de expresión GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Affymetrix (Affymetrix). Las muestras se convirtieron en ARNc fragmento y marcado siguiendo el protocolo de Affymetrix para la utilización en la micromatriz de expresión.

Constructos de ARNhp utilizados (pLKO.1)

Las secuencias de ADN para preparar los constructos de ARNhp utilizados fueron las siguientes:

Tabla 3: descripción de la biblioteca de ORF y clasificación de ORF del CCSB/Broad Institute. Abreviaturas: RS/TK (receptor de serina/treonina quinasa); RTK (receptor de tirosina quinasa); NRS/TK (no receptor de serina/treonina quinasa); NRTK (no receptor de tirosina quinasa)

Tabla 3 (continuación)

Tabla 3 (continuación)

Tabla 3 (continuación)

Tabla 3 (continuación)

Tabla 3 (continuación)

Tabla 3 (continuación)

Tabla 3 (continuación)

Tabla 3 (continuación)

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Tabla 3 (continuación)

Tabla 3 (continuación)

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Tabla 3 (continuación)

Tabla 4: clasificación de proliferación diferencial media (PLX4720 1 pM/control) para 597 ORF relacionadas con quinasa, respecto a MEK DD

Tabla 4 (continuación)

Tabla 4 (continuación)

Tabla 4 (continuación)

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Tabla 4 (continuación)

Tabla 4 (continuación)

Tabla 4 (continuación)

Tabla 4 (continuación)

Tabla 4 (continuación)

Tabla 4 (continuación)

Tabla 5: resultados de un cribado secundario de cuantificación del cambio de la GI50 de PLX4720 inducido por los 9 mejores candidatos a ORF de resistencia

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Método de identificación de un sujeto con cáncer que es probable que se beneficie del tratamiento con una terapia de combinación con un inhibidor de RAF y un segundo inhibidor, en el que el sujeto presenta células de cáncer que comprenden una mutación B-RAFV600E, comprendiendo el método:

(a) someter a ensayo el número de copia génica, el nivel de ARNm o de una proteína o de fosforilación de una o más dianas quinasas seleccionadas del grupo que consiste en MAP3K8 (TPL2/COT), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl), o PAK3 (Pak3) en células de cáncer obtenidas del sujeto y comparar el número de copia génica, el nivel de ARNm o de la proteína o la fosforilación con un número de copia génica, un nivel de ARNm o de una proteína o de fosforilación de la quinasa diana en células obtenidas de un sujeto sin cáncer, y

(b) correlacionar el número de copia génica incrementado o una alteración de la expresión de ARNm o la sobreexpresión de proteína o fosforilación de la quinasa diana en las células de cáncer respecto a las células del sujeto sin el cáncer, con el sujeto con cáncer que es probable que se beneficie del tratamiento con la terapia de combinación.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende someter a ensayo el número de copia génica, el nivel de ARNm o de proteína de MAP3K8 (TPL/COT).

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo inhibidor es un inhibidor de MEK, un inhibidor de CRAF, un inhibidor de CrkL o un inhibidor de TPL2/COT.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el inhibidor de RAF es un inhibidor de B-RAF o un inhibidor de pan-RAF, preferentemente en el que el inhibidor de RAF se selecciona del grupo que consiste en RAF265, sorafenib, SB590885, PLX 4720, PLX4032, GDC-0879 y ZM 336372.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sujeto presenta resistencia innata al inhibidor de RAF o es probable que desarrolle resistencia al inhibidor de RAF.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer de mama, cánceres colorrectales, glioma, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, sarcoma y cáncer de tiroides, preferentemente en el que el cáncer es melanoma.

7. Cantidad eficaz de un inhibidor de RAF y una cantidad eficaz de un segundo inhibidor, en donde el segundo inhibidor es un inhibidor de MEK o un inhibidor de MAP3K8 (TPL2/COT) para la utilización en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, presentando el sujeto células de cáncer que comprenden una mutación B-RAFV600E y presentando el sujeto células de cáncer que comprenden un número de copia génica incrementado o una alteración de la expresión del ARNm o la sobreexpresión de una proteína o la fosforilación de una quinasa diana en las células de cáncer, donde la quinasa diana se selecciona del grupo que consiste en MAP3K8 (TPL2/COT), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl) o PAK3 (Pak3).

8. Inhibidor según la reivindicación 7, en el que el inhibidor de RAF se selecciona del grupo que consiste en RAF265, sorafenib, SB590885, PLX 4720, PLX4032, GDC-0879 y ZM 336372 y/o en el que el inhibidor de MEK se selecciona del grupo que consiste en Cl-1040/PD184352, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, 6-metoxi-7-(3-morfolín-4-il-propoxi)-4-(4-fenoxi-fenilamino)-quinolín-3-carbonitrilo y 4-[3-cloro-4-(1-metil-1H-imidazol-2-ilsulfanil)-fenilamino]-6-metoxi-7-(3-morfolín-4-il-propoxi)-quinolín-3-carbonitrilo o en el que el segundo inhibidor es un inhibidor de MAP3K8 (TPL2/COT).

9. Inhibidor según la reivindicación 7 o 8, en el que el sujeto presenta resistencia innata al inhibidor de RAF o es probable que desarrolle resistencia al inhibidor de RAF y/o el sujeto presente resistencia innata al inhibidor de MEK o es probable que desarrolle resistencia al inhibidor de MEK.

10. Inhibidor según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer de mama, cánceres colorrectales, glioma, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, sarcoma y cáncer de tiroides, preferentemente en el que el cáncer es melanoma.

11. Utilización de una cantidad eficaz de un inhibidor de RAF y una cantidad eficaz de un segundo inhibidor, en donde el segundo inhibidor es un inhibidor de MAP3K8 (TPL2/COT) en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, presentando el sujeto células de cáncer que comprenden una mutación B-RAFV600E y presentando el sujeto células de cáncer que comprenden un número de copia génica incrementado o una alteración de la expresión del ARNm o la sobreexpresión de una proteína o la fosforilación de una quinasa diana en las células de cáncer, donde la quinasa diana se selecciona del grupo que consiste en MAP3K8 (TPL2/COT), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl) o PAK3 (Pak3).