KR20120139767A - 1차 암 요법에 대한 저항성을 갖는 또는 발달시키는 환자에서 암을 진단 및 치료하는 방법 - Google Patents

1차 암 요법에 대한 저항성을 갖는 또는 발달시키는 환자에서 암을 진단 및 치료하는 방법 Download PDF

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레비 에이. 개러웨이
코리 엠. 요한센
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더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드
다나-파버 캔서 인스티튜트 인크.
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Abstract

RAF 저해제와 2차 저해제를 갖는 조합물 요법으로의 치료에서 혜택을 받을 가능성이 있는, 암을 가진 피험자를 식별하는 방법이 제공된다. 병든 피험자에서 암을 치료하는 방법이 또한 제공되고 그리고 RAF 저해제의 유효량 및 2차 저해제의 유효량을 피험자에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 2차 저해제는 MEK 저해제, CRAF 저해제, CrkL 저해제 또는 TPL2/COT 저해제이다. 1차 저해제에 대한 저항성을 부여하는 키나아제 표적을 식별하는 방법이 또한 제공된다.

Description

1차 암 요법에 대한 저항성을 갖는 또는 발달시키는 환자에서 암을 진단 및 치료하는 방법{METHODS OF DIAGNOSING AND TREATING CANCER IN PATIENTS HAVING OR DEVELOPING RESISTANCE TO A FIRST CANCER THERAPY}
본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에 다음의 미국 특허 가출원 일련번호: 2010년 3월 9일에 제출된 61/312,193, 2010년 3월 10일에 제출된 61/312,519, 2010년 4월 20일에 제출된 61/326,021; 및 2010년 11월 19일에 제출된 61/415,569의 출원일의 이익을 주장하며, 상기 문헌은 모두 그 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다.
연방 정부가 후원하는 연구 또는 개발
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 부여된 연방 수혜번호 K08 CA115927 및 1DP20D002750 하에 정부의 지원으로 발명되었다.
세린/트레오닌 키나아제 B-RAF (또한 BRAF라고도 알려진)에서 종양형성 돌연변이(oncogenic mutations)는 50-70%의 악성 흑색종에서 발견된다(Davies, H. et al ., Nature 417, 949-954 (2002).). 사전-임상 연구는 B-RAF(V600E) 돌연변이가 흑색종에서 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 신호전달 캐스캐이드에 대한 의존성을 예측한다는 것을 증명하였다 (Hoeflich, K. P. et al ., Cancer Res . 69, 3042-3051 (2009) ; McDermott, U. et al ., Proc . Natl Acad . Sci. USA 104, 19936-19941 (2007); Solit, D. B. et al . BRAF 돌연변이는 MEK 저해제에 대한 민감도를 예측한다(BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.). Nature 439, 358-362 (2006); Wan, P. T. et al ., Cell 116, 855-867 (2004); Wellbrock, C. et al ., Cancer Res . 64, 2338-2342 (2004))?임상 실험에서 RAF 또는 MEK 저해제의 성공으로 입증된 관찰 (Flaherty, K. T. et al ., N. Engl . J. Med . 363, 809-819 (2010) ; Infante, J. R. et al ., J. Clin. Oncol . 28 (suppl.), 2503 (2010); Schwartz, G. K. et al ., J. Clin . Oncol. 27 (suppl.), 3513 (2009).) 하지만, 표적화 항암 치료법에 대한 임상 반응은 새로운 (de novo) 또는 후천적 저항성에 의해 자주 혼동된다. (Engelman, J. A. et al ., Science 316, 1039-1043 (2007); Gorre, M. E. et al., Science 293, 876-880 (2001); Heinrich, M. C. et al ., J. Clin . Oncol . 24, 4764-4774 (2006); Daub, H., Specht, K. & Ullrich, A. Nature Rev . Drug Discov. 3, 1001-1010 (2004).) 따라서, 유효한 장기적인 치료 전략을 위한 "의약품이 될 만한(druggable)" 표적을 밝히는 방식으로 저항성 메커니즘의 식별에 대한 새로운 방법, 치료 전략에서 혜택을 받을 가능성이 있는 환자를 식별하는 새로운 방법, 및 유효한 장기적인 치료 전략으로 환자를 치료하는 방법에 대한 필요성이 남아있다.
본 발명은 암 치료에서 치료제에 대한 저항성의 개발 및 암 치료에 대한 저항성을 부여하는 표적의 식별과 관련된다. 본 발명은 유효한 장기적인 치료 전략을 용이하게 하기 위한 병행 약물 표적의 식별 및 이러한 치료에서 혜택을 받을 환자의 식별과 또한 관련된다.
따라서, 한 가지 측면에서, RAF 저해제와 2차 저해제를 갖는 조합 요법으로의 치료에서 혜택을 받을 가능성이 있는, 암을 가진 피험자를 식별하는 방법이 제공된다. 방법은 피험자에서 얻은 암 세포에서 MAP3K8 (TPL2/COT), RAF1 (CRAF), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl), 또는 PAK3 (Pak3)로 구성된 집단에서 선택된 하나 이상의 키나아제 표적의 유전자 복제개수, mRNA 또는 단백질 수준 또는 인산화를 분석하는 단계를 포함한다. 방법은 상기 유전자 복제개수, mRNA 또는 단백질 수준 또는 인산화를 암이 없는 피험자에서 얻은 세포에서 표적 키나아제의 유전자 복제개수, mRNA 또는 단백질 수준 또는 인산화와 비교하는 단계 및 암이 없는 피험자로부터의 세포에 대하여 암세포에서 표적 키나아제의 증가된 유전자 복제개수 또는 mRNA 발현에서의 변형 또는 단백질 과발현 또는 인산화를 조합 요법으로의 치료에서 혜택을 받을 가능성이 있는, 암을 가진 피험자와 관련시키는 단계를 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 병든 피험자에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 RAF 저해제의 유효량 및 2차 저해제의 유효량을 피험자에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 2차 저해제는 MEK 저해제 또는 TPL2/COT 저해제이다.
다른 측면에서, 1차 저해제에 대한 저항성을 부여하는 키나아제 표적을 식별하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 1차 저해제에 대한 민감도를 갖는 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양에서 다수의 키나아제 ORF 클론을 발현하는 단계를 포함하며, 각각의 세포 배양은 상이한 키나아제 ORF 클론을 발현한다. 상기 방법은 각각의 세포 배양을 저해제에 노출시키는 단계 및 1차 저해제에 대한 저항성을 부여하는 키나아제 ORF 클론을 식별하기 위해 저해제에 노출 후 대조군 세포 배양보다 더 큰 생존력을 갖는 세포 배양을 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 암의 치료에서 치료제에 대한 저항성의 발달 및 암의 치료에 대한 저항성을 부여하는 표적의 식별과 관련된다. 본 발명은 유효한 장기적인 치료 전략을 용이하게 하기 위한 병행 약물 표적의 식별 및 이러한 치료에서 혜택을 받을 환자의 식별과 또한 관련된다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 키나아제 그리고 특히 MAP 키나아제 경로 구성요소와 관련된다.
본 발명의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 전통적인 기술을 사용할 것이며, 이들은 당업계의 기술 내에 있다. 가령, Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, (최신 판); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds., (최신 판)); METHODS IN ENZYMOLOGY 시리즈 (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (최신 판) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL 및 ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)). A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 최신 판); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 최신 판); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 최신 판); Fundamental Virology, 2 판, vol. I & II (B. N. Fields 및 D. M. Knipe, eds.)를 참고.
미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 캐스캐이드는 성장 인자, 사이토카인, 및 원-종양형성유전자(proto-oncogene)를 포함한, 다양한 세포외 자극에 응하여 신호전달을 조절하는 중요한 세포내 신호전달 경로이다. 이 경로의 활성화는 유전자 발현에서 전사인자 활성화 및 변형을 야기하며 이는 궁극적으로 세포 증식, 세포 주기 조절, 세포 생존, 혈관 형성 및 세포 이동을 포함한 세포의 기능에서 변화를 유발한다. 고전적인 MAPK 신호전달은 세포 표면에서 수용체 타이로신 키나아제에 의해 시작되지만, 인테그린(integrin), 이원삼취체 G-단백질(heterotrimeric G-protein), 및 사이토카인 수용체를 포함한 많은 다른 세포 표면 분자는 MAPK 캐스캐이드를 활성화시킬 수 있다.
세포 표면 수용체, 가령, 수용체 타이로신 키나아제로의 리간드(ligand) 결합은 전형적으로 수용체의 인산화를 야기한다. 연결자 단백질 Grb2 (adaptor protein Grb2)는 활성화된 수용체의 인산화된 세포내 도메인에 결합하고, 그리고 이 결합은 SOS-I 및 CDC25를 포함한 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자를 세포막으로 모집한다. 이들 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자는 GTPase Ras와 상호작용하고 GTPase Ras를 활성화시킨다. 일반적인 Ras 이소폼(isoform)은 K-Ras, N-Ras, H-Ras 등을 포함한다. Ras 활성화 후, 세린/트레오닌 키나아제 Raf (가령, A-Raf, B-Raf 또는 Raf-1)는 Ras와 상호작용을 통하여 세포막으로 모집된다. Raf는 그 다음 인산화된다. Raf는 위치 217 및 221에서 2개의 세린 잔기의 인산화에 의해 MEK 1 및 MEK 2를 직접적으로 활성화시킨다. 활성화 후, MEK 1 및 MEK 2은 세린/트레오닌 키나아제 Erkl 및 Erk2에서 타이로신(Tyr-185) 및 트레오닌(Thr-183) 잔기를 인산화시키고, 이는 Erk 활성화를 야기한다. 활성화된 Erk는 세포 기질에서 많은 표적을 조절하고 또한 세포핵으로 전위되며, 여기서 상기 활성화된 Erk는 유전자 발현을 조절하는 다수의 전사 인자를 인산화한다. Erk 키나아제는 Elk-I, c-Etsl, c-Ets2, p90RSKI, MNKI, MNK2, MSKI, MSK2 및 TOB를 포함하여, 많은 표적을 갖는다. 전술한 경로가 MAPK 신호전달의 고전적인 대표인 반면에, MAPK 경로 및 다른 신호전달 캐스캐이드 사이에는 고려할만한 논점이 있다.
MAPK 신호전달에서의 이상(aberration)은 암 세포학에서 중요한 역할을 갖는다. Ras의 변화된 발현은 많은 암에서 일반적이며, 그리고 Ras에서 활성 돌연변이가 또한 식별되었다. 이러한 돌연변이는 모든 암의 최대 30%에서 발견되며, 그리고 췌장 (90%) 및 결장 (50%) 암종에서 특히 일반적이다. 게다가, 활성 Raf 돌연변이가 흑색종 및 난소암에서 식별되었다. 가장 일반적인 돌연변이인 BRAFV600E는 다운스트림(downstream) MAP 키나아제 경로의 본질적인 활성화를 야기하고, 그리고 흑색종 세포 증식, 연한천 성장(soft agar growth), 및 종양 이종이식편 형성에 필수적이다. 인간 암에서 MAPK 과-활성화의 정의된 역할에 기반하여, MAPK 경로의 구성 요소를 특정한 저해제로 표적화하는 것은 암 요법에 대해 유망한 접근방식이다. 하지만 환자는 이들 유망한 요법에 선천적 저항성 또는 후천적 저항성을 가질 수 있다. 선천적 저항성 또는 후천적 저항성을 가진 이들 환자를 위한 표적 키나아제의 식별,　진단 및/또는 예후 마커(marker)　및 치료요법이 아래에서 설명된다.
고 처리량 기능적 선별 분석
몇몇 측면에서, 본 발명은 고 처리량 선별 분석을 이용하여 임상적으로 효과적인 요법에 대한 저항성을 일으킬 수 있는 표적을 선별하는 방법과 관련된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 치료제에 대한 저항성을 일으키는 키나아제를 위한 개방형 해독틀(open reading frame, ORF)-기반 기능적 선별을 포함한다. 상기 방법은 종양형성 돌연변이(oncogenic mutation)를 갖는 것으로 알려진 키나아제를 세포주에 제공하는 것을 포함한다. 키나아제 ORF의 라이브러리(library)는 세포주에서 개별적으로 발현되어 라이브러리로부터 상이한 ORF를 각각 발현하는 다수의 클론(clone)이 추가로 평가될 수 있다. 각각의 클론은 (1) 세포주에서 알려진 키나아제의 저해제에 노출될 수 있고 그리고 (2) 저해제없이 세포주에서 ORF의 발현에 기반한 성장 변화에 대해 관찰될 수 있다. 양성 성장이든, 음성 성장이든, ORF 발현 단독으로부터 성장 효과를 갖는 임의의 클론이 제거된다. 상이한 키나아제를 각각 발현하는 나머지 클론은 그 다음 대조군 및 처리된 클론 사이의 생존력에 대해 비교되고 양성 대조군에 대해 표준화된다. 저해제로 처리 후 증가된 세포 생존력은 저항성을 부여하는 ORF를 식별하고 따라서 추가적인 저해제로의 처리를 위한 키나아제 표적을 식별한다. 몇몇 실시양태에서, 표준화된 평균에서부터 상기 2개의 표준 편차를 얻은 클론은 추가적인 저해제로의 치료가 피험자에게 이롭다는 것을 명시하는 표적 키나아제가 될 수 있다.
비-제한적 예시의 방식으로, B-RAF에 대한 저항성을 일으키는 키나아제를 위한 고 처리량 기능적 선별 분석의 도식이 도 5에서 보여진다. 모든 설명된 키나아제의 ~75%를 차지하는, ~600개의 클론된 및 서열 입증된 ORF의 컬렉션(collection)이 집합되었다(Center for Cancer Systems Biology (CCSB)/Broad Institute Kinase ORF Collection, 도 1 a, 1 b, 표 3). 이 공개적으로 이용가능한 컬렉션은 여러 가지 최종-적용을 위한 여러 가지의 발현 벡터로 신속하게 이동될 수 있다. 당업계에서 숙련자에게 알려진 발현 벡터의 임의의 유형은 키나아제 ORF 컬렉션을 발현하는데 이용될 수 있다. 비-제한적 예시의 방식으로, 포유류 세포에서 높은 역가 바이러스 및 강력한 ORF 발현을 유발할 수 있는 선택가능한, 항원결정부위(epitope)-표지된, 렌티바이러스성 발현 벡터가 키나아제 컬렉션을 발현하기 위해 생성될 수 있다(pLX-BLAST-V5, 도 6a).
RAF 저해를 피할 수 있는 키나아제를 식별하기 위해, 배열된 키나아제 ORF 컬렉션은 RAF 키나아제 저해제 PLX4720에 대해 민감한 B-RAFV600E 악성 흑색종 세포주인 A375에서 안정되게 발현될 수 있다(도 1a, 1b 및 6c, 표 3). 1 μM PLX4720으로 처리된 ORF 발현 세포의 클론은 처리되지 않은 세포에 대하여 생존력을 위해 선별되고 그리고 분석-특정 양성 조절, MEK1 S218 2220 (MEK1 DD)에 대해 표준화된다(표 4). 기준(baseline) 생존력 또는 증식에 영향을 주는 ORF가 분석에서 제거된다. 표준화된 평균에서부터 상기 2개의 표준 편차를 얻은 클론은 2차 저해제에 대한 표적 키나아제를 부여하는 저항성을 식별하기 위해 추가로 평가될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표적 키나아제를 암호화하는 유전자는 MAP3K8 (TPL2/COT), RAF1 (CRAF), CRKL (CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl), 또는 PAK3 (Pak3)일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표적 키나아제를 암호화하는 유전자는 MAPK 경로 활성자일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표적 키나아제를 암호화하는 유전자는 직접적으로 MEK을 인산화 및 활성화 시키는 MAP3 키나아제일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표적 키나아제를 암호화하는 유전자는 흑색종에서 증폭 및 인산화되는 연결자 단백질을 암호화할 수 있다.
다른 실시양태에서, ORF 컬렉션은 B-RAF에서 상이한 돌연변이, 예를 들어, V600K, V600D, 및 V600R과 같은 대략 아미노산 위치 600에서 다른 돌연변이를 갖는 세포주에서 안정되게 발현될 수 있다. 추가적인 B-RAF 돌연변이는 Davies et al. Nature, 417, 949-954, 2002, 도 1에서 설명된 돌연변이를 포함한다. 세포주는 PLX4032; GDC-0879; RAF265; 소라페닙(sorafenib); SB590855 및/또는 ZM 336372를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 다른 RAF 키나아제 저해제에 대해 민감한 것으로 이용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, ORF 컬렉션은 MEK 저해제에 대해 민감성을 갖는 세포주에서 안정되게 발현될 수 있다. MEK 저해제의 비-제한적 예시는 AZD6244; CI-1040; PD184352; PD318088, PD98059, PD334581, RDEA1 19, 6- 메톡시-7-(3-모르폴린-4-일-프로폭시)-4-(4-페녹시-페닐아미노)-퀴놀린-3- 카르보니트릴 및 4-[3-클로로-4-(1-메틸-1H-이미다졸-2-일설파닐)-페닐아미노]-6-메톡시-7-(3-모르폴린-4-일-프로폭시)-퀴놀린-3-카르보니트릴을 포함한다. 추가적인 RAF 및 MEK 저해제는 아래에서 설명된다. 비-제한 예시의 방식에 의하여, 예시적인 RAF 저해제는 표 1에서 보여지고, 예시적인 MEK 저해제는 표 2에서 보여진다.
예시적인 RAF 저해제
명칭 CAS 번호 구조
1 RAF265 927880-90-
Figure pct00001
2 소라페닙 토실레이트
(Sorafenib Tosylate)
넥사바 (Nexavar)
베이 43-9006 (Bay 43-9006)		 475207-59-1
Figure pct00002
소라페닙
4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카르바모일아미노]페녹시-N-메틸-피리딘-2-카르복사마이드		 284461-73-0
Figure pct00003
3 SB590885
Figure pct00004
4 PLX4720 918505-84-7
Figure pct00005
5 PLX4032 1029872-54-5
Figure pct00006
6 GDC-0879 905281-76-7
Figure pct00007
7 ZM 336372 208260-29-1
Figure pct00008
예시적인 MEK 저해제
명칭 CAS 번호 구조
1 CI-1040/PD184352 212631-79-3
Figure pct00009
2 AZD6244 606143-52-6
Figure pct00010
3 PD318088 391210-00-7
Figure pct00011
4 PD98059 167869-21-8
Figure pct00012
5 PD334581
Figure pct00013
6 RDEA 119
N-[3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오드페닐)아미노]-6-메톡시페닐]-1-[(2R)-2,3-디하이드록시프로필]-사이클로프로판설폰아마이드		 923032-38-6
Figure pct00014
7 6-메톡시-7-(3-모르폴린-4-일-프로폭시)-4-(4-페녹시-페닐아미노)-퀴놀린-3-카르보니트릴
Figure pct00015
8 4-[3-클로로-4-(1-메틸-1H-이미다졸-2-일설파닐)-페닐아미노]-6-메톡시-7-(3-모르폴린-4-일-프로폭시)-퀴놀린-3-카르보니트릴
Figure pct00016
표적화된 요법에 대한 선천적 및 후천적 저항성을 위한 진단 및/또는 예후 마커
몇몇 측면에서, 본 발명은 샘플(가령, 암 환자로부터의 생물학적 샘플)에서 하나 이상의 진단 및 예후 마커의 존재를 탐지하는 방법과 관련된다. 당업계에서 숙련자에게 알려진 여러 가지의 선별 방법이 DNA, RNA 및 단백질 탐지를 포함한 샘플에서 마커의 존재를 탐지하는 데 이용될 수 있다. 아래에서 설명된 기술은 환자에서 얻은 샘플에서 키나아제 표적화된 요법의 존재 또는 부재를 결정하는 데 이용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 환자는 B-RAF 저해제 또는 MEK 저해제를 포함하여, 키나아제 표적화된 요법에 대한 선천적 또는 후천적 저항성을 가질 수 있다. 예를 들어, 환자는 B-RAF 저해제 PLX4720 및/또는 PLX4032에 대한 선천적 또는 후천적 저항성을 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 환자는 MEK 저해제 AZD6244에 대한 선천적 또는 후천적 저항성을 가질 수 있다. 환자에서 하나 이상의 키나아제 표적 마커의 식별은 내과 의사가 환자를 위해 치료 프로토콜을 결정하는 것을 보조한다. 예를 들어, 하나 이상의 키나아제 표적 마커를 갖는 환자에서, 내과 의사는 아래에 더 자세하게 설명된 바와 같은 조합 요법으로 환자를 치료할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 키나아제 표적은 MAP3K8 (TPL2/COT), RAF1 (CRAF), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl), 또는 PAK3 (Pak3)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 마커는 키나아제 표적에 대해, 하나 이상의 MAP 키나아제 경로 구성원의 유전자 복제개수의 증가, 단백질 발현의 증가, 인산화, mRNA 발현에서의 변화 등이 될 수 있다.
비-제한적 예시의 방식으로, B-RAF에서 종양형성 돌연변이를 갖는 환자에서, 활성화된 표적 키나아제의 식별은 환자를 위한 치료 프로토콜의 특징화에 유용할 수 있다. 예를 들어, B-RAFV600E 돌연변이를 가는 환자에서, RAF 저해제 단독으로의 치료는 환자가 일정 시간 후 상기 치료에 대한 후천적 저항성의 상대적으로 높은 위험에 있다는 것을 또한 명시할 수 있다. 종양형성 돌연변이를 갖는 환자에서, 상기 환자에서의 활성화된 키나아제 표적의 식별은 치료 프로토콜에서 2차 저해제의 포함을 명시할 수 있다.
활성화된 키나아제 표적의 식별은 유전자 복제개수의 분석 및 표적 키나아제의 복제개수 증가의 식별을 포함할 수 있다. 예를 들어, MAP3K8에서 얻은 복제개수 증가는 특히 환자가 B-RAFV600E 돌연변이를 또한 갖는다면, 선천적 저항성을 갖는 또는 후천적 저항성을 발달시킨 환자를 명시한다.
몇몇 실시양태에서, 활성화된 키나아제 표적의 식별은 키나아제 표적의 인산화의 분석 및/또는 MAP 키나아제 경로의 구성원을 포함할 수 있다. 예를 들어, S338에서 C-RAF의 인산화는 특히 환자가 B-RAFV6OOE 돌연변이를 또한 갖는다면, 선천적 저항성을 갖는 또는 후천적 저항성을 발달시킨 환자를 명시한다. 몇몇 실시양태에서, MEK/ERK 인산화의 증가의 식별은 선천적 저항성을 갖는 또는 후천적 저항성을 발달시킨 환자를 명시할 수 있다. B-RAFV6OOE 돌연변이를 갖는 환자에서 증가된 COT 단백질 발현은 RAF 저해 및 MEK 저해에 대한 저항성을 예측할 수 있다.
활성화된 키나아제 표적의 식별은 키나아제 표적의 mRNA 발현의 분석을 포함할 수 있다. 예를 들어, 1차 키나아제 저해제로 초기 치료 후 COT mRNA 발현의 증가는 저항성을 갖는 또는 발달시킨 환자를 명시한다. 몇몇 실시양태에서, 1차 키나아제 저해제는 RAF 저해제 또는 MEK 저해제일 수 있다.
치료의 방법
여러 가지 실시양태에서, 본 발명은 암 환자의 치료를 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 1차 저해제 및 2차 저해제의 투여를 일반적으로 포함한다. 한 가지 저해제는 RAF 저해제일 수 있다. RAF 저해제는 pan-RAF 저해제 또는 선택적인 RAF 저해제 일 수 있다. Pan-RAF 저해제는 RAF265, 소라페닙, 또는 SB590885를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, RAF 저해제는 B-RAF 저해제이다. 몇몇 실시양태에서, 선택적인 RAF 저해제는 PLX4720, PLX4032, 또는 GDC-0879-A이다. 한 가지 저해제는 MEK 저해제일 수 있다(예시적인 MEK 저해제를 설명한 표 2를 참고). 한 가지 저해제는 COT 저해제일 수 있다. 비-제한적 예시의 방식으로, COT 저해제는 아래에 설명된 바와 같은 shRNA 저해제 또는 작은 분자 COT 저해제, 4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-6-(피리딘-3-일-메틸아미노)-3-시아노-[1,7]-나프티리딘 (EMD;TPL2 저해제 I; 목록 번호 616373, PubChem ID: 9549300)일 수 있다. 본 발명의 저해제는 MAP3K8 (TPL2/COT), RAF1 (CRAF), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl), 또는 PAK3 (Pak3) 또는 다른 MAP 키나아제 경로 표적을 포함한 키나아제 표적 중 하나 이상을 저해한다.
몇몇 실시양태에서, RAF 저해제의 유효량 및 MAP3K8 (TPL2/COT) 저해제의 유효량을 포함한, 암에 대한 조합 요법이 제공된다. 또한 여기서 제공된 것은, RAF 저해제의 유효량 및 MEK 저해제의 유효량을 포함한, 암에 대한 조합 요법이다. 다른 조합 요법은 RAF 저해제의 유효량 및 다음 중 하나 이상으로 암호화된 유전자, mRNA 또는 단백질을 표적으로 하는 2차 저해제의 유효량을 포함한다: MAP3K8 (TPL2/COT), RAF1 (CRAF), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl), 또는 PAK3 (Pak3). 상기 조합 요법은 환자의 치료에 적합하며, 여기서 암은 B-RAF 돌연변이 세포 및 특히, B-RAFV600E 돌연변이 세포를 포함한다. 본 발명은 RAF 저해제의 유효량 및 MEK 저해제의 유효량을 포함한, 암에 대한 조합 요법을 추가로 제공하며, 여기서 암을 가진 피험자는 변형된 MAP3K8 (TPL2/COT) 발현 또는 유전자 복제개수를 갖는 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, MEK 저해제는 CI-1040/PD184352 또는 AZD6244이다.
비-제한적 예시와 같이, 여기서 제공된 MEK 저해제는 Cl-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA1 19, 6-메톡시-7-(3-모르폴린-4-일-프로폭시)-4-(4-페녹시-페닐아미노)-퀴놀린-3-카르보니트릴 또는 4-[3-클로로-4-(1-메틸-1H-이미다졸-2-일설파닐)-페닐아미노]-6-메톡시-7-(3-모르폴린-4-일-프로폭시)-퀴놀린-3-카르보니트릴, 로슈(Roche) 화합물 RG7420, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 당업계에서 알려진 추가적인 MEK 저해제가 또한 이용될 수 있다.
전술한 측면의 예시적인 실시양태에서, 여기서 제공된 RAF 저해제는 PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (소라페닙), ZM 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613, 또는 CJS352 (NVP-AAL881 -NX (이하 AAL881로 언급됨)이고 그리고 NVP-LBT613-AG-8 (LBT613)은 이소퀴놀린 화합물이다 (Novartis, Cambridge, MA). 조합 요법에 유용한 추가적 예시적인 RAF 저해제는 pan-RAF 저해제, B-RAF 저해제, A-RAF 저해제, RAF-1 저해제를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 조합 요법에 유용한 RAF 저해제는 PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (소라페닙), ZM 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613, 및 CJS352를 포함한다. 예시적인 RAF 저해제는 PCT 공개 공보 제 WO/2008/028141에서 발표된 화합물을 추가로 포함하며, 전체 내용은 참조로서 편입된다. 예시적인 RAF 저해제는 PCT 공개 공보 제 WO/2006/024836에서 설명된 퀴나졸리논 유도체, 및 PCT 공개 공보 제 WO/2008/020203에서 설명된 피리디닐퀴나졸린아민 유도체를 포함하며, 전체 내용은 참조로서 편입된다.
조합물의 투여는 단일 제제 또는 단위(unit) 제형으로 조합물을 투여하는 것, 개별 약물의 조합을 동시에 그러나 분리하여 투여하는 것, 또는 개별 약물의 조합을 임의의 적절한 경로에 의해 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 조합물의 개별적인 약물의 용량은 조합물에서 다른 약물과 비교하여 약물 중 한가지의 더 빈번한 투여를 필요로 할 수 있다. 따라서, 적절한 주입을 허용하기 위해, 포장된 의약품은 약물의 조합을 포함한 하나 이상의 제형, 및 약물의 조합 중 한 가지를 포함하지만, 조합물의 다른 약물(들)은 포함하지 않는 하나 이상의 제형을 포함할 수 있다.
약물은 입체중심(stereogenic center) 또는 입체축(stereogenic axe)과 같은 하나 이상의 비대칭 원소, 가령, 비대칭 탄소 원자를 포함하여, 화합물이 상이한 입체이성질체 형태(stereoisomeric form)로 존재할 수 있다. 이들 화합물은, 예를 들어, 라세미체(racemate) 또는 광학 활성 형태일 수 있다. 두개 이상의 비대칭 원소를 갖는 화합물의 경우에, 이들 화합물은 추가적으로 부분입체이성질체 (diastereomer)의 혼합물이 될 수 있다. 비대칭 중심을 갖는 화합물의 경우에, 모든 광학 이성질체 및 이들의 혼합물이 포함된다는 것으로 이해되어야 한다. 게다가, 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 화합물은 Z- 및 E-형태로 발생할 수 있다; 화합물의 모든 이성질체 형태는 본 발명에 포함된다. 이러한 상황에서, 단일 거울상 이성질체(enantiomer) (광학 활성 형태)가 비대칭 합성, 광학 순수 전구체 (optically pure precursor)로부터의 합성에 의해, 또는 라세미체의 분할에 의해 얻어질 수 있다. 라세미체의 분할은 예를 들어, 분리 시약의 존재에서 결정화, 또는 예를 들어 키이랄 HPLC 칼럼을 이용한 크로마토그래피와 같은 전통적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 또는 본문에 의해 명백하게 명시되지 않는 한, 본 발명의 조합 요법에서 유용한 화합물에 대한 참조는 화합물의 유리 염기(free base), 및 화합물의 모든 제약학적으로 허용되는 염 둘 모두를 포함한다. 바람직한 염은 염산 염(hydrochloride salt)이다.
용어, "제약학적으로 허용되는 염"은 개시된 화합물의 유도체를 포함하며, 여기서 모체 화합물은 이의 비-독성 산 또는 염기 부가염을 만듦으로써 변형되고, 그리고 이러한 화합물 및 이러한 염의 제약학적으로 허용되는 용매화합물(수화물 포함)을 추가로 나타낸다. 제약학적으로 허용되는 염의 예시는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산 또는 유기산 부가염; 카르복시산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 부가염; 등, 그리고 전술한 염 중 하나 이상을 포함한 조합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 제약학적으로 허용되는 염은 예를 들어, 비-독성 무기산 또는 유기산으로부터 형성된 모체 화합물의 비-독성 염 및 사차 암모늄 염을 포함한다. 예를 들어, 비-독성 산 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 술팜산, 인산, 및 질산과 같은 무기산; 나트륨염, 칼륨염, 및 세슘염와 같은 금속염을 포함한 허용되는 다른 무기 염류; 및 칼슘염 및 마그네슘염과 같은 알칼리토금속 염; 및 전술한 염 중 하나 이상을 포함한 조합물로부터 파생된 것들을 포함한다.
제약학적으로 허용되는 유기 염류는 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 석신산, 글리콜산, 스테아르산, 젖산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 팜산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 메실산, 에실산, 베실산, 설파닌산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메판설폰산, 에텐 디설폰산, 옥살산, 이세티온산, HOOC(CH2)nCOOH (n은 0-4); 트리에틸아민 염, 피리딘 염, 피콜린 염, 에탄올아민 염, 트리에탄올아민 염, 디사이클로헥실아민 염, N,N'-디벤질에틸렌디아민 염과 같은 유기 아민 염; 및 알지네이트, 아스파라기네이트, 및 글루타메이트와 같은 아미노산 염, 및 전술한 염 중 하나 이상을 포함한 조합물과 같은 유기산으로부터 제조된 염을 포함한다.
약물의 조합(가령, MEK 및 RAF 저해제, 또는 RAF 및 COT 저해제, 또는 RAF 및 MAP3K8 (TPL2/COT), RAF1 (CRAF), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl), 또는 PAK3 (Pak3)을 표적으로 하는 저해제)의 "유효량"은 상기 조합물로 치료된 질환의 임상학적으로 관찰할 수 있는 징후 및 증상을 기준 이상으로 관찰가능하게 개선하도록 제공하는데 충분한 양이다.
의약품은 경구 또는 다른 형태(가령, 직장으로 또는 비경구 주입으로)로 투여될 수 있다. "경구 제형"은 경구 투여로 처방된 또는 의도된 단위 제형을 포함하는을 의미한다. 경구 제형은 예를 들어, 단일 분량으로 투여를 위해 포장된, 마이크로캡슐 또는 마이크로정제와 같은 다수의 하위 단위(subunit)를 포함할 수도 또는 안 할 수도 있다.
의약품은 여러 가지 형태로 방출될 수 있다. "방출 형태"는 순간-방출(instant-release), 즉각적인-방출(immediate-release), 조절된-방출(controlled-release) 및 지속적인-방출(sustained-release) 형태를 포함하는 것을 의미한다.
"순간-방출"은 더 신속한 용해법을 얻기 위해 활성 약물의 정상적인 결정 형태를 변형함으로써 활성 약물의 신속한 용해를 보장하기 위해 설계된 제형을 포함하는 것을 의미한다.
"즉각적인-방출"은 활성 약물의 약 50%보다 크거나 동일하거나 더욱 바람직하게는 약 75% 보다 크거나 동일한 전통적인 또는 비-변형 방출 형태가 투여 2시간 내에, 바람직하게는 투여 한 시간 내에 방출되는 것을 포함하는 것을 의미한다.
"지속적인-방출" 또는 "연장된-방출"은 혈중(가령, 혈장) 농도가 정상-상태(steady-state)에서 투여 후 최소 약 8시간, 바람직하게는 최소 약 12시간, 더욱 바람직하게는 최소 약 24시간 동안 치료 범위 이내지만 독성 수준보다는 낮게 유지되는 이러한 속도의 활성 약물의 방출을 포함한다. 용어 "정상-상태"는 주어진 활성 약물 또는 활성 약물의 조합에 대한 혈장 농도가 달성되었고, 상기 농도가 활성 약물(들)의 이후 투여로 최소 유효 치료 농도이거나 그 이상의 수준으로 유지되며, 주어진 활성 약물(들)에 대한 최소 독성 혈장 농도 이하인 것을 의미한다.
용어 "치료하다", "치료된", "치료하는" 또는 "치료"는 피험자에서 질병의 최소한 하나의 증상을 경감, 감소 또는 완화하기 위한 의미로 여기서 이용된다. 예를 들어, 치료는 암과 같은 질환의 하나 또는 여러 가지 증상의 약화 또는 질환의 완전한 박멸이 될 수 있다. 본 발명의 의미 내에서, 용어 "치료하다는 발병 (즉, 질병의 임상적 징후를 앞선 시기)을 저지, 지연 및/또는 질병의 발생 또는 악화의 위험을 감소시키는 것을 또한 의미한다. 용어 "보호하다"는 피험자에서 질병의 발생 또는 지속 또는 악화를, 적절하게, 예방, 지연 또는 치료, 또는 모두를 의미하는 것으로 여기서 이용된다. 본 발명의 의미 내에서, 상기 질병은 암과 연관이 있다.
용어 "피험자" 또는 "환자"는 암 또는 암을 직접적 또는 간접적으로 수반하는 임의의 질환으로 고통받거나 시달릴 수 있는 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 피험자의 예시로 포유류, 가령, 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 생쥐(mouse), 토끼, 쥐(rat), 그리고 형질전환 비-인간 동물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 피험자는 인간, 가령 암을 앓거나, 암을 앓을 위험에 있거나, 또는 잠정적으로 암을 앓을 수 있는 인간이다.
용어 "약(about)" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내를, 더욱 바람직하게는 10% 이내를, 그리고 가장 바람직하게는 여전히 5% 이내를 주로 의미한다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약"은 주어진 값의 약 로그 (즉, 10 배) 이내, 바람직하게는 두 배 이내를 의미한다.
본 발명을 설명하는 맥락에서 (특히 다음 청구항의 단락에서) 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 지시어의 사용은 여기서 달리 명시되지 않는 한 또는 맥락에서 명백하게 부인되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 모두를 포함시키는 것으로 이해하기 위함이다. 용어 "포함한(comprising)", "갖는(having)", "포함한(including)", "함유한(containing)"은 달리 명시되지 않는 한 개방형 용어(즉, "포함하지만, 이에 한정되지 않는"을 의미)로서 이해하기 위함이다. 여기서 범위 값의 열거는 여기서 달리 명시되지 않는 한, 범위 내로 떨어지는 각각 별개의 값을 개별적으로 나타내는 속기법으로서 제공되는 것으로 단지 의도되고 그리고 각각 별개의 값은 여기서 개별적으로 나열된 것과 같이 명세서에 편입된다.
상기 명시된 바와 같이, 한 가지 측면에서, 본 발명은 피험자에서 암의 발병을 치료, 예방, 저지, 지연 및/또는 암의 발달 위험을 감소, 또는 암의 최소한 한 가지 증상을 역전시키는데 유용한 약물 조합을 제공하며, 이는 RAF 저해제의 유효량 및 MAP3K8 (TPL2/COT) 저해제의 유효량, 또는 RAF 저해제의 유효량 및 MEK 저해제의 유효량 또는 RAF 저해제의 유효량 및 MAP3K8 (TPL2/COT), RAF1 (CRAF), CRKL(CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl), 또는 PAK3 (Pak3)을 표적으로 하는 2차 저해제의 유효량을 포함한 조합 요법을 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 이들 저해제는 결합될 때 이로운 효과를 제공하는, 치료상으로 효과적인 용량으로 투여된다.
용어 "암"은 여기서 모든 고형 종양 및 혈액학적 악성도를 포함한 광범위한 종양을 의미하는 데 이용된다. 이러한 종양의 예시는 백혈병, 림프종, 골수종, 암종, 전이성 암종, 육종, 선종, 신경계 암 및 비뇨생식기 암을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예시적인 실시양태에서, 전술한 방법은 성인 및 소아 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질암, 에이즈-관련 암, 항문암, 충수암, 성상세포종, 기저세포암, 담관암, 방광암, 골암, 골육종, 섬유성 조직구종, 뇌암, 뇌간암, 소뇌 성상세포종, 악성 뇌교종, 상의세포종, 수아세포종, 천막위 원시신경외배역종양, 시상하부 신경교종, 유방암, 남성 유방암, 기관지 선종, 버킷 림프종, 유암종, 원인불명의 암종, 중추신경계 림프종, 소뇌 성상세포종, 악성 뇌교종, 자궁경부암, 소아암, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 질환, 대장암, 피부 T 세포 림프종, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 유윙 가족성 종양, 두개외 생식세포종, 생식샘외 생식세포종, 간외 담관암, 안구내 흑색종, 망막아세포종, 담낭암, 위암, 위장관 간질 종양, 두개외 생식세포종, 생식샘외 생식세포종, 난소 생식세포종, 임신성 영양막 종양, 신경교종, 모발 세포성 백혈병, 두경부암, 간세포암, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 하인두암, 시상하부 및 신경경로 신경종, 안구내 흑색종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 신세포암, 후두암, 구순 및 구강암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 원발성 중추신경계 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 악성섬유성 조직구종, 수아세포종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 악성 중피종, 편평 경부암, 다발성 내분비 종양 증후군, 다발성 골수종, 균상 식육종, 골수이형성 증후군, 골수증식성 질환, 만성 골수증식성 질환, 비강 및 코곁굴암, 비인두암, 신경아세포종, 구인두암, 난소암, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화성세포종, 송과체아세포종 및 천막상부 원시신경외배역종양, 뇌하수체암, 혈장세포암, 흉막폐 아세포종, 전립선암, 직장암, 횡문근육종, 침샘암, 연조직 육종, 자궁 육종, 세자리 증후군, 비-흑색종 피부암, 소장암, 편평 세포암종, 편평 경부암, 천막상부 원시신경외배역종양, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선암종, 갑상선암, 이행 세포암, 영양막 종양, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 및 빌름스 종양을 치료하는데 유용하다.
특히, 암은 B-RAF 유전자에서 돌연변이와 연관이 있을 수 있다. 이들 암은 흑색종, 유방암, 대장암, 신경교종, 폐암, 난소암, 육종 및 갑상선암을 포함한다.
특정 실시양태에서, 여기서 제공된 치료적 조합물은 피험자에서 중등도(moderate) 내지 중증(severe) 암의 치료에 효과적이다.
용량
암의 치료를 위한 약물의 조합의 최적 분량은 알려진 방법을 이용하여 각각의 피험자에 대해 실증적으로 결정될 수 있고 약물의 활성도; 피험자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식습관; 투여의 시간 및 경로; 및 피험자가 복용하는 다른 약물을 포함하여, 여러 가지 요인에 의존할 것이다. 최적 용량은 당업계에서 잘 알려진 정기적인 검사 및 절차를 이용하여 정해질 수 있다.
단일 제형을 생산하기 위해 담체 물질과 결합될 수 있는 약물의 조합의 양은 치료되는 개인 및 투여의 특정 방식에 의존하여 다양할 것이다. 몇몇 실시양태에서, 여기서 설명된 바와 같은 약물의 조합을 포함한 단위 제형은 약물이 단독으로 투여될 때 전형적으로 투여되는 각각의 조합약물의 양을 포함할 것이다.
당업계에서 일반적인 기술을 가진 내과 의사 또는 수의사는 요구되는 제약학적 조성물의 유효량을 쉽게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 내과 의사 또는 수의사는 원하는 치료 효과를 달성하기 위하여 요구되는 수준보다 낮은 수준으로 제약적 조성물에서 사용된 본 발명의 화합물의 분량을 시작할 수 있고 원하는 효과를 달성할 때까지 점진적으로 용량을 증가시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 화합물의 적합한 일일 분량은 치료적 효과를 야기하는데 효과적인 가장 낮은 분량인 화합물의 양일 것이다. 이러한 효과적인 분량은 일반적으로 상기 설명된 요인에 의존할 것이고 당업계에서 숙련자에 의해 쉽게 결정된다.
일반적으로, 환자를 위한 본 발명의 화합물의 치료적으로 효과적인 분량은, 명시된 진통제 효과에 이용될 때, 범위가 하루에 체중의 킬로그램 당 약 0.0001 내지 약 1000 mg, 더욱 바람직하게는 하루에 kg 당 약 0.01 내지 약 50 mg에 이를것이다.
원하는 경우, 활성 화합물의 효과적인 일일 분량은 단위 제형에서, 선택적으로, 하루종일 적절한 간격으로 분리하여 투여되는 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 하위-분량(sub-dose)으로 투여될 수 있다.
제약적 제제 및 투여의 경로
여기서 암, 가령 흑색종의 치료를 위해 약물의 조합을 포함하는 제약적 제제가 제공된다. 제약적 제제는 담체 또는 부형제, 안정제, 착향제, 및/또는 착색제를 추가적으로 포함할 수 있다.
여기서 예를 들어, 약물: (1) RAF 저해제 및/또는 RAF 저해제의 약물학적으로 활성인 대사산물, 염, 용매 화합물 및 라세미체 그리고 (2) MAP3K8 (TPL2/COT) 저해제 및/또는 COT 저해제의 약물학적으로 활성인 대사산물, 염, 용매 화합물 및 라세미체 중 두 가지 유형의 조합물이 될 수 있는 약물의 조합을 포함하는 제약적 제제가 제공된다. 다른 실시양태에서, 약물의 조합이 BRAF 돌연변이 세포를 포함하는 또는 MAP3K8 (TPL2/COT)을 과발현하는 세포를 포함하는 피험자를 위해 제공될 수 있고 이는 다음을 포함한다: RAF 저해제 및/또는 RAF 저해제의 약물학적으로 활성인 대사산물, 염, 용매 화합물 및 라세미체 그리고 (2) MEK 저해제 및/또는 MEK 저해제의 약물학적으로 활성인 대사산물, 염, 용매 화합물 및 라세미체.
약물의 조합은 당업계에서 숙련자에게 알려진 투여의 여러 가지 경로를 이용하여 투여될 수 있다. 약물의 조합은 원하던 바와 같이 전통적인 비독성의 제약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 및 비이클(vehicle)를 포함하는 용량 단위 제제로 인간 및 다른 동물에게 경구로, 비경구로, 혀 밑으로, 스프레이 주입 또는 흡입 스프레이로, 직장으로, 소뇌연수조내로, 질내로, 복강내로, 구강으로, 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 국부적 투여는 경피형 패치 또는 이온영동 장치와 같은 경피형 투여의 이용을 또한 수반할 수 있다. 여기서 이용된 바와 같은 용어, 비경구는 피하주사, 정맥내 주사, 근육내 주사, 흉골내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다.
조제의 방법은 당업계에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th Edition (1995)에 개시되어 있다. 본 발명에서 이용하기 위한 제약적 조성물은 멸균, 비-발열성 액체 용액 또는 현탁액, 코팅된 캡슐, 좌약, 동결건조된 분말, 경피형 패치의 형태 또는 당업계에서 알려진 다른 형태일 수 있다.
주사 가능한 제조물, 예를 들어 멸균의 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 이용하여 알려진 기술에 따라서 조제될 수 있다. 멸균의 주사가능한 제조물은 또한 비독성 비경구로 허용되는 희석액 또는 용매, 예를 들어, 1,3 프로판디올 또는 1,3 부탄디올의 용액으로서 멸균의 주사가능한 용액, 현탁액 또는 유제일 수 있다. 허용되는 비이클 및 용매 중 사용될 수 있는 것은 물, 링거 용액, U.S.P. 및 등장 식염용액이다. 게다가, 멸균의, 불휘발성 오일(fixed oil)은 용매 또는 현탁 매체로서 전통적으로 사용된다. 이 목적을 위해, 임의의 무자극 불휘발성 오일은 합성 모노- 또는 디- 글리세라이드를 포함하여 사용될 수 있다. 게다가, 올레산과 같은 지방산은 주사 가능한 제조물에서의 용도를 발견한다. 주사 가능한 제제는 이용에 앞서 예를 들어, 박테리아성-보유 여과기를 통한 여과로써, 또는 멸균수 또는 다른 멸균의 주사 가능한 매체에서 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고형 조성물의 형태로 멸균제를 편입시킴으로써 멸균될 수 있다.
약물의 효과를 연장시키기 위하여, 피하 또는 근육 내 주사에서 약물의 흡수를 늦추는 것이 종종 바람직하다. 이는 불량한 수용성을 갖는 비정질(amorphous material) 또는 결정질(crystalline)의 액체 현탁액의 이용으로 수행될 수 있다. 그 다음, 약물의 흡수 속도는 결과적으로 결정체 크기 및 결정질 형태에 의존할 수 있는, 약물의 용해 속도에 의존한다. 대안적으로, 비경구로 투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 오일 비이클에서 약물을 용해 및 부유시킴으로써 수행될 수 있다. 주사 가능한 데포(depot) 형태는 폴리락티드 폴리글리콜리드(polylactide polyglycolide)와 같은 생분해성 폴리머에서 약물의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성함으로써 만들어진다. 약물 대 폴리머의 비율 및 사용된 특정 폴리머의 성질에 의존하여, 약물 방출의 속도는 조절될 수 있다. 다른 생분해성 폴리머의 예시는 폴리(오쏘에스터) 및 폴리(무수물)포함한다. 데포 (depot) 주사 제제는 리포솜 또는 마이크로유제에서 약물을 포획함(entrapping)으로써 또한 제조될 수 있으며, 이는 신체 조직과 상용할 수 있다.
직장 또는 질의 투여를 위한 조성물은 바람직하게는 본 발명의 화합물을 주위 온도에서 고형이지만 신체 온도에서는 액체이고 따라서 직장의 또는 질의 강(cavity)에서 녹아 활성 화합물을 방출하는 코코아버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌약 왁스와 같은 적합한 비-자극 부형제 또는 담체와 혼합함으로써 제조 될 수 있는 좌약이다.
경구 투여를 위한 고형 제형은 캡슐, 정제, 알약, 분말, 및 과립을 포함한다. 이러한 고형 제형에서, 활성 화합물은 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트와 같은 최소한 한 가지의 불활성의, 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체 및/또는 a) 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨 및 규산과 같은 충전제 또는 증량제, b) 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스, 알지네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 수크로오스, 및 아카시아와 같은 고착제, c) 글리세롤과 같은 보습제, d) 한천(agar-agar), 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트 및 소듐 카보네이트와 같은 붕해제, e) 파라핀과 같은 용해 지연제, f) 사차 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제, g) 예를 들어, 아세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제, h) 카올린 및 벤토나이트 점토와 같은 흡수제, 및 i) 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고형 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 및 이들의 혼합물과 같은 활택제와 혼합된다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 제형은 완충제를 또한 포함할 수 있다.
유사한 유형의 고형 조성물은 락토오스 또는 유당 그리고 고분자 중량 폴리에틸렌 글리콜 등으로서 이러한 부형제를 이용한 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 또한 사용될 수 있다.
정제, 당과(dragees), 캡슐, 알약, 및 과립의 고형 제형은 장용 코팅 및 제약적 조제 업계에서 잘 알려진 기타 코팅과 같은 코팅 및 쉘(shell)을 이용하여 제조될 수 있다. 이들은 불투명화제를 선택적으로 포함할 수 있고 또한 활성 성분(들)을 단독으로 방출하거나 바람직하게는 장관의 특정 부위에서, 선택적으로, 지연된 방식으로 방출하는 조성물로 이루어질 수 있다. 이용될 수 있는 포매 조성물(embedding composition)의 예시는 폴리머 물질 및 왁스를 포함한다.
활성 화합물은 상술한 바와 같이 하나 이상의 부형제를 갖는 마이크로-캡슐화된 형태로 또한 존재할 수 있다. 정제, 당과, 캡슐, 알약, 및 과립의 고형 제형은 장용 코팅, 방출 조절 코팅 및 제약적 조제 업계에서 잘 알려진 기타 코팅과 같은 코팅 및 쉘(shell)을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 고형 제형에서, 활성 화합물은 수크로오스, 락토오스 또는 전분과 같은 최소한 한 가지의 불활성 희석제와 혼합될 수 있다. 이러한 제형은, 일반적인 실시에서와 같이, 불활성 희석제, 가령, 마그네슘 스테아레이트 및 마이크로결정 셀룰로오스와 같은 정제화 활택제 및 다른 정제화 보조제 이외에 추가적인 물질을 또한 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 제형은 완충제를 또한 포함할 수 있다. 이들은 불투명화제를 선택적으로 포함할 수 있고 또한 활성 성분(들)을 단독으로 방출하거나 바람직하게는 장관의 특정 부위에서, 선택적으로, 지연된 방식으로 방출하는 조성물로 이루어질 수 있다. 이용될 수 있는 포매 조성물의 예시는 폴리머 물질 및 왁스를 포함한다.
경구 투여를 위한 액체 제형은 제약학적으로 허용되는 유제, 마이크로유제, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르제를 포함한다. 활성 화합물 외에도, 액체 제형은 예를 들어, 물 또는 다른 용매, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, EtOAc, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3 부틸렌 글리콜, 디메틸포름아마이드, 오일(특히, 목화씨유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유, 및 참깨유), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스터, 및 이들의 혼합물과 같은 가용화제 및 유화제와 같이 당업계에서 일반적으로 이용되는 불활성 희석제를 포함할 수 있다. 불활성 희석제 외에, 경구 조성물은 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 착향제, 및 향신제를 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물의 국부적 또는 경피형 투여를 위한 제형은 연고, 반죽, 크림, 로션, 젤, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패치를 포함한다. 활성 성분은 요구될 수 있는 바와 같이 멸균 조건하에 제약학적으로 허용되는 담체 및 임의의 필요한 방부제 또는 완충제와 혼합된다. 안과용 제제, 점이액 등은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 또한 고려된다.
연고, 반죽, 크림 및 젤은, 본 발명의 활성 화합물 외에도, 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트래거캔스, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크 및 징크 옥사이드, 또는 이들의 혼합물과 같은 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 액체 에어로졸(aerosol) 또는 호흡식 건조 분말로서 전달을 위해 또한 조제될 수 있다. 액체 에어로졸 제제는 대개 종말 및 호흡 세기관지로 전달될 수 있는 입자 크기로 분무될 수 있다.
본 발명의 에어로졸화 제제는 분출, 진동 투과성 플레이트 또는 초음파 분무기와 같은 에어로졸 형성 장치를 이용하여 전달될 수 있고 바람직하게는 대개 1 내지 5 μm의 질량 중앙 평균 지름을 갖는 에어로졸 입자의 형성을 허용하도록 선택될 수 있다. 더욱이, 제제는 바람직하게는 감염 부위로 본 발명의 화합물의 효과적인 분량을　전달할 수 있는　균형화된 몰삼투압 농도 이온 강도 및 염화물 농도, 및 가장 작은 에어로졸화가능한 부피를 갖는다. 추가적으로, 에어로졸화 제제는 바람직하게는 기도의 기능을 부정적으로 손상시키지 않고 원하지 않는 부작용을 야기하지 않는다.
본 발명의 에어로졸 제제의 투여에 적합한 에어로졸화 장치는 본 발명의 제제를 대개 1 내지 5 μm부터의 크기 범위의 에어로졸 입자 크기로 분무할 수 있는, 예를 들어, 분출, 진동 투과성 플레이트 또는 초음파 분무기 및 충전식 건조 분말 흡입기를 포함한다. 대개 본 출원에서 최소한 70% 하지만 바람직하게는 90% 이상의 모든 생성된 에어로졸 입자는 1 내지 5 μm 범위 내에 있다는 것을 의미한다. 분출 분무기는 액체 용액을 에어로졸 액적(droplet)으로 쪼개기 위해 공기 압력에 의해 작동한다. 진동 투과성 플레이트는 투과성 플레이트를 통해 용매 액적을 압출하기 위한 급속 진동 투과성 플레이트에 의해 유발되는 음속 진공을 이용함으로써 작동한다. 초음파 분무기는 액체 용액을 에어로졸 액적으로 전단하는 압전 결정체(piezoelectric crystal)에 의해 작동한다. 여러 가지 적합한 장치는 예를 들어, AERONEB 및 AERODOSE 진동 투과성 플레이트 분무기 (AeroGen, Inc., Sunnyvale, California), SIDESTREAM 분무기 (Medic Aid Ltd., West Sussex, England), PARI LC 및 PARI LC STAR 분출 분무기 (Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Virginia), 및 AEROSONIC (DeVilbiss Medizinische Produkte (Deutschland) GmbH, Heiden, Germany) 및 ULTRAAIRE (Omron Healthcare, Inc., Vernon Hills, Illinois) 초음파 분무기를 포함하여 이용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 본 발명의 화합물 외에도, 락토오스, 탈크, 규산, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 분말, 또는 이들 물질의 혼합물과 같은 부형제를 포함할 수 있는 국부적 분말 및 스프레이로서 이용을 위해 또한 조제될 수 있다. 스프레이는 클로로플루오로하이드로카본과 같은 관례적인 추진제를 추가적으로 포함할 수 있다.
경피형 패치는 화합물의 조절된 전달을 신체에 제공하는 추가 장점을 갖는다. 이러한 제형은 적절한 매체에서 화합물을 용해 또는 분산시킴으로써 만들수 있다. 흡수 촉진제는 피부에 걸쳐 화합물의 유동을 증가시키는데 또한 이용될 수 있다. 속도는 속도 조절 막을 제공하거나 폴리머 매트릭스 또는 젤에 화합물을 분산 시킴으로써 조절될 수 있다. 본 발명의 화합물은 리포좀의 형태로 또한 투여될 수 있다. 당업계에서 알려진 바와 같이, 리포좀은 일반적으로 인지질 또는 다른 지질 물질로부터 유래된다. 리포좀은 수성 매체에서 분산되는 하나의 또는 다수의 층상(lamellar) 수화 액체 결정체에 의해 형성된다. 리포좀을 형성할 수 있는, 임의의 비 독성의, 생리학적으로 허용되는 및 대사성의 지질이 이용될 수 있다. 리포좀 형태의 본 조성물은 본 발명의 화합물 외에도, 안정제, 방부제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 바람직한 지질은 천연 및 합성 둘 모두의 인지질 및 포스파티딜 콜린(레시틴)이다. 리포좀을 형성하는 방법은 당업계에서 알려져 있다. 예를 들어, Prescott (ed.), "Methods in Cell Biology," Volume XIV, Academic Press, New York, 1976, p. 33 et seq.를 참고.
도 1은 B-RAF 저해에 대한 저항성의 동인(driver)으로서 COT 및 C-RAF 키나아제를 식별하는 ORF-기반 기능적 선별(screen)을 설명한다. (a) CCSB/Broad Institute Kinase ORF Collection의 개요도. 키나아제 분류 및 분류 당 키나아제의 번호가 표시된다; (b) CCSB/Broad Institute Kinase ORF collection을 발현하는 A375 세포는 1 μM PLX4720 에서 상대적인 생존력에 대해 분석되었고 그리고 본질적으로 활성인 MEK1 (MEK1DD)에 대해 표준화되었다. 9개의 ORF (원형)는 모든 ORF의 평균(쇄선, 44.26%)으로부터 2개의 표준 편차 (쇄선, 58.64%)를 얻었다; (c) 명시된 ORF는 5 B-RAFV600E 세포주에서 발현되었고 그리고 DMSO 또는 1 μM PLX4720으로 처리되었다. 생존력 (DMSO에 대하여)은 4일 후 정량화되었다. 에러 바(error bar)는 복제체(replicate, (n=6)) 사이의 표준편차를 나타낸다; (d) A375 및 SKMEL28에서의 2차 선별에서는 다지점 PLX4720 농도 규모에 걸쳐 상위 9개의 후보 ORF의 순위를 매긴다.
도 2는 MAPK 경로 활성화를 통하여 B-RAF 저해에 대한 저항성을 설명한다. (a) 명시된 ORF가 A375에서 발현하였다. 인산화된 MEK 및 ERK의 수준이 DMSO (-) 또는 PLX4720 (농도가 표시됨)으로 18시간 처리 후 분석되었다; (b) 명시된 ORF를 발현하는 A375의 증식. 에러 바(error bar)는 복제체 (n=6) 사이의 표준편차를 나타낸다. (c) 명시된 ORF를 발현하는 A375로부터의 용해물에서 C-RAF (S338) 및 ERK 인산화. (d) 빈 벡터 또는 BRAFV600E를 발현하는 불멸화된 초기 멜라닌세포로부터의 용해물에서 COT 발현. COT mRNA는 상이한 길이의 두 개의 단백질 생산물; 화살표로 표시된 아미노산 1-467 또는 30-467를 야기시키는 내부 개시 코돈 (30M)을 갖는다. (e) 대조 shRNA (shLuc)에 대하여 shRNA-매개된 B-RAF 고갈 (shBRAF) 후 명시된 ORF를 발현하는 A375로부터의 용해물에서 COT 및 ERK 인산화. (f) DMSO (-) 또는 1 μM PLX4720 (+)로 18시간 처리 후, shRNA-매개된 C-RAF 고갈 (shCRAF) 또는 대조 shRNA (shLuc) 이후 명시된 ORF를 발현하는 A375로부터의 용해물에서 ERK 인산화.
도 3은 COT 발현이 암 세포주에서 B-RAF 저해에 대한 저항성을 예측한다는 것을 설명한다. (a) MAP3K8/COT 복제개수; 붉은 막대: COT 증폭, 파란 막대: 비-증폭된 COT; (b) B-RAFV600E 세포주에서 COT 발현 및 (c) 단기 배양; (d) B-RAFV600E 세포주내 PLX4720 GI50. (a)에서와 같은 색상; (e) DMSO 또는 PLX4720 (농도가 표시됨)으로 처리 후 MEK 및 ERK 인산화; (f) DMSO 또는 1 μM PLX4720 (PLX) 또는 CI-1040 (CI)으로 처리된 M307 용해물 (AZD-R; AZD6244-저항성)에서 ERK 인산화; (g) 환자/병변-일치된 PLX4032-처리된 전이성 흑색종 조직샘플에서 COT mRNA 발현 (QRT/PCR). Pt 1 및 3은 동일한 병변에서 다수의 생체검사를 하였다. 에러 바(error bar)는 SEM (n=3) U를 나타낸다; 미결정된/탐지할 수 없는; (h) 대조 (shLuc)에 비해 shRNA-매개된 COT 고갈 (shCOT) 및 DMSO (-) 또는 1 μM PLX4720 (+)으로 처리 후 RPMI-7951에서 ERK 및 MEK 인산화. ERK 및 MEK 인산화는 정량화된다; (i) 작은 분자 COT 키나아제 저해제로 1시간 처리 후 RPMI-7951에서 ERK 및 MEK 인산화. ERK 및 MEK 인산화는 정량화된다. (j) BRAFV600E 세포주의 패널에서 PLX4720 민감도 곡선. OUMS-23 및 M307은 COT 발현/증폭을 갖는 세포주를 나타내고 그리고 다른 것 모두는 탐지할 수 없는/변하지 않는 COT를 갖는 세포주를 나타낸다; (k) PLX4032에 대한 후천적 저항성을 갖는 전이성 피하 악성 흑색종에서 COT의 선택적인 발현 및 해당 MAPK 경로 활성화(*는 백그라운드 밴드(background band)를 나타낸다, MET-MM (PLX-R); 전이성 악성 흑색종, PLX4032-저항성)
도 4는 다른 자리 입체성(allosteric) MEK 저해제에 대한 저항성을 보이는 COT-발현 B-RAFV600E 세포주를 설명한다. (a) B-RAFV600E 세포주의 패널에서 CI-1040 GI50; (b) DMSO 또는 CI-1040으로 처리(농도가 표시됨)된 명시된 세포주로부터의 용해물에서 MEK 및 ERK 인산화; (c) PLX4720, RAF265, CI-1040 및 AZD6244에 대한 명시된 ORF를 이소성으로 발현하는 A375의 배수 변화 (MEK1에 대하여) GI50; (d) DMSO 또는 1 μM의 PLX4720, RAF265, CI-1040 또는 AZD6244로 처리 후 명시된 ORF를 발현하는 A375에서 ERK 인산화; (e) 명시된 ORF를 발현하는 A375의 생존력 및 DMSO, PLX4720(농도는 표시됨) 그리고 CI-1040 또는 AZD6244 (모두 1 μM)와 조합한 PLX4720으로 처리. 에러 바(error bar)는 표준 편차(n=6)를 나타낸다; (f) DMSO, PLX4720 (1 μM) 또는 CI-1040 또는 AZD6244 (모두 1 μM)와 조합한 PLX4720으로 처리 후 명시된 ORF를 발현하는 A375에서 ERK 인산화; (g) 비정상적 MAP3K8/COT 복제개수/발현을 갖는 세포주는 다른 자리 입체성 MEK 저해제 CI-1040 또는 (h) AZD6244에 대해 둔감하다; (i) B-RAFV600E-돌연변이 세포주에서 B-RAF 저해제에 대응하는 MAP3K 복합체의 형성의 개요도. PLX4720는 C-RAF의 종양형성 사건 업스트림 (오른쪽 하부 패널)에 의해 활성화된 신호전달-일으키는 복합체 (오른쪽 상부 패널)에 C-RAF를 배치하여 이후에 저항성을 일으킨다. COT 발현의 맥락에서, COT/RAF-함유 복합체는 MAPK 경로를 활성화시키고 그리고 저항성을 조정하는 데에 충분하다(왼쪽 하부 패널).
도 5는 B-RAF 저해에 대한 저항성을 일으키는 키나아제을 위한 ORF-기반 기능적 선별의 개요도를 설명한다. B-RAFV600E 세포주 A375는 CCSB/Broad Institute Kinase ORF Collection에서 597개의 키나아제를 이용하여 렌티바이러스성으로 형질도입이 되었다. 대조-처리된 A375에서 증식에 대한 양성 또는 음성 효과를 갖는 ORF가 최종분석에서 확인 및 제거되었다. B-RAF 저해된(PLX4720-처리된) 세포 및 대조-처리된 세포 사이에서 차등 생존력 비율을 발생시킴으로써 저항성-촉진 ORF가 식별되었다. 차등 생존력은 본질적으로 활성인 MEK1 대립형질, MEK1DD에 대해 표준화되었다; 특정 양성 조절 분석.
도 6은 CCSB/Broad Institute Kinase ORF Collection이 높은 역가 렌티바이러스를 통하여 잘 발현된다는 것을 설명한다. (a) 모든 ORF-선별 및 후속 검증에서 이용된 pLX-BLAST-V5 렌티바이러스의 발현 벡터의 도식. (b) 다양한 크기 범위를 나타내는 GFP-표지된 ORF는 Jurkat 세포에서 렌티바이러스성으로 발현되었고 그리고 GFP-발현 세포/ORF(가령, 감염된 세포)의 백분율이 수량화되었으며, 이는 ORF 크기의 범위에 걸쳐 높은 바이러스성 역가를 증명한다. (c) 세포 DNA에 대하여, V5-항원결정부위(epitope) 표지에 대항하는 항체를 갖는 LiCor를 통해 탐지된 96 랜덤 ORF의 발현. 발현은 83%의 웰(well)에서 탐지될 수 있었다.
도 7은 후보 저항성 ORF의 발현을 설명한다. 293T는 pLX-BLAST-V5-ORF (명시됨)를 이용하여 일시적으로 형질감염되었고 그리고 발현은 항-V5-HRP 항체를 이용하여 탐지하였다. AXL 클론은 '폐쇄' 되었고 그리고 V5 표지 앞에 정지 코돈을 갖는다. 발현의 검증을 위해 도 12를 참고; 어두운-노출 상에 (*)는 더 밝은 노출에서는 보이지 않는 세 가지 ORF의 발현을 나타낸다.
도 8은 2차 선별이 상위 9개의 후보 B-RAF 저해제 저항성 ORF의 우선순위를 매기는 것을 설명한다. 1차 선별에서 얻은 상위 9개의 ORF는 A375 또는 SKMEL28에서 발현되었고 GI50은 다지점 PLX4720 농도 범위에서부터 나타났다.
도 9는 B-RAFV600E 세포주에서 증식에 대한 ORF 발현의 효과를 설명한다. MEK1에 대하여, 성장 7일 후 명시된 ORF를 발현하는 (a) A375 또는 (b) SKMEL28에서 증식.
도 10은 본질적으로 활성인 MEK1 (MEK1DD) 및 COT의 이소성 발현이 A375에서 증가된 pMEK/pERK를 유발하고, 반면에 C-RAF는 pMEK/pERK 수준을 감소시킨다는 것을 설명한다. GFP, MEK1, MEKDD, COT 또는 C-RAF를 이소성으로 발현하는 A375로부터의 용해물이 pERK 및 pMEK의 수준을 위한 면역블롯(immunoblot)을 통하여 분석되었다. 훨씬 낮은 수준에서 발현되는 COT 및 C-RAF의 신호가 잔여 V5-MEK1 신호에 압도되는 것을 방지하기 위해 GFP 및 MEK1 (레인(lane) 1-3)은 COT/C-RAF (레인(lane) 4-5)에서 분리되었다.
도 11은 COT 및 C-RAF의 키나아제 활성도가 PLX4720 처리의 맥락에서 지속적인 ERK 인산화에 필수적이라는 것을 설명한다. 18시간 동안 1 μM PLX4720으로 처리된 이소성 (a) MEK1, 야생형 COT 또는 키나아제 불활성 COT (COTK167R) 또는 (b) MEK1, 야생형 C-RAF 또는 키나아제 불활성 C-RAF (C-RAFK375M)를 발현하는 A375의 면역블롯 분석.
도 12는 B-RAF 저해제 PLX4720의 맥락에서 MAPK 신호전달에 대한 ORF 발현의 효과를 설명한다. MAPK 경로 활성화는 발현하는 PLX4720의 존재 (18 시간, 농도는 명시됨)에서 명시된 ORF를 발현하는 A375에서 pERK 및 pMEK의 면역블롯 분석에 의해 평가되었다. (*)는 V5 항원결정부위가 아닌, 발현된 ORF를 지향하는 항체의 이용을 나타낸다. AXL은 V5 표지없이 복제되었다.
도 13은 B-RAF는 1 μM PLX4720 (+) 또는 DMSO (-)으로 18시간 처리 후, A375에서 면역침전된 C-RAF와 결합한다는 것을 설명한다, (a). WCE; 전체 세포 추출물 조절. 이소성으로 발현된 C-RAF는 B-RAF와 본질적으로 결합하고 막의 국부화 및 활성화와 동일하게 S338에서 인산화된다. MEK1, MEKDD 및 COT-발현 A375는 C-RAF 활성화의 증거를 보여주지 않는다, (b).
도 14는 야생형 C-RAF 또는 C-RAF (C-RAF(22W))의 고-활성도 절단 돌연변이의 레트로바이러스성 발현은 B-저해제 PLX4720에 대한 저항성이 있는 A375를 만드는 것 (a) 및 PLX4720 처리(1 μM, 18 시간)의 맥락에서 지속적인 pERK 수준을 유발하는 것 (b)을 설명한다. 레트로바이러스를 이용하여 성취된 C-RAF 발현 수준은 렌티바이러스-기반 시스템을 이용한 것보다 유의적으로 낮으며, 이는 렌티바이러스성 C-RAF를 이용하여 성취되는 것보다 낮은 GI50을 야기시킨다.
도 15는 COT mRNA에 대한 B-RAFV600E의 효과를 설명한다 (a) 야생형 B-RAF (벡터) 또는 B-RAFV600E를 발현하는 형질전환된 초기 멜라닌세포에서 GAPDH mRNA의 발현에 대하여 COT mRNA 발현의 정량 RT/PCR. COT 발현은 벡터-발현 초기 멜라닌세포의 발현에 대해 표준화되었다. (**) 유의한, p 0.05 (스튜던트 양방적, 대응표본 T-검정(Student's two-tailed, paired T-Test)). 내생 COT mRNA은 PLX4720-민감성 A375에서 탐지될 수 없고, 이소성으로 발현된 COT mRNA 수준은 1 μM PLX4720 처리로 영향을 받지 않는다. GFP 또는 COT를 발현하는 A375는 18시간 동안 1 μM PLX4720으로 처리되었다. GFP-발현, DMSO 처리된, A375에 대하여, 역-전사 mRNA는 GAPDH-표준화 COT 발현에 대해 분석되었다. (*) 유의하지 않은, p > 0.05 (스튜던트 양방적, 대응표본 T-검정). 에러 바(error bar)는 SEM을 나타낸다.
도 16은 B- 및 C-RAF 단백질 수준이 COT-매개된 ERK 인산화에 필수적이지 않다는 것을 설명한다. 이소성 MEK1 (대조) 또는 COT를 발현하는 A375는 B-RAF, C-RAF 또는 대조 shRNA (shLuc)를 표적으로 하는 shRNAs을 발현하는 렌티바이러스로 연속적으로 감염되었고 18시간 동안, 1 μM PLX4720의 존재 (+) 또는 부재 (-)하에 명시된 단백질의 발현에 대해 분석되었다.
도 17은 752개의 세포주의 SNP 분석이 MAP3K8/COT 에서 복제개수 변형을 나타내는 것을 설명한다. 복제개수가 분석된 752개의 세포주 중에서, 534개의 세포주는 또한 돌연변이 프로파일링(profiling)이 되었다. 38(7.1 %)개의 돌연변이-프로파일된 세포는 B-RAFV600E 돌연변이를 갖는다. 2개의 세포주 (OUMS-23, RPMI-7951, 명시됨)는 MAP3K8/COT에서 복제개수 증가와 함께 B-RAFV600E 돌연변이를 갖는다.
도 18은 암 세포주 OUMS-23에서의 MAP3K8/COT 변형를 설명한다. (a) mRNA 마이크로어레이 분석에서 MAP3K8/COT 탐침(probe)의 RMA 신호 (표시됨). OUMS-23은 COT mRNA를 발현하는 상위 2% (765개의 세포주의) 중 하나이다. (b) B-RAFV600E-돌연변이 세포주의 패널에서의 COT mRNA 발현. (c) 명시된 세포의 면역블롯 분석을 통하여 결정된 바와 같이, A375 및 SKMEL28 세포주에서 이소성으로 발현된 COT에 대하여 OUMS-23에서의 내생 COT 단백질 발현.
도 19는 COT mRNA 및 단백질이 B RAF-저해제 저항성 세포주 및 조직에서 발현된다는 것을 설명한다. (a) 재발된, PLX4032-처리된, 악성 흑색종 (MM-R)에서의 세포주, 단기배양, 및 조직의 패널에서 GAPDH 표준화 COT mRNA 발현의 RT/PCR 분석. 세포주 및 단기 배양에 대한 해당 단백질 발현이 도 3b 및 3c에서 각각 보여진다. (b) 초기 멜라닌세포 (1°Mel(B-RAF WT)), 환자와 일치된 정상 피부(Skin) 및 전이성 악성 흑색종(MM-R; 패널 a에서 보여진 COT mRNA), A375 세포 및 B-RAFV600E을 발현하는 원발성 흑색종(1°Mel(B-RAFV600E))으로부터의 용해물의 웨스턴 블롯 분석.
도 20은 COT의 고갈이 COT 증폭된 세포주 RPMI-7951에서 생존력에 영향을 미친다는 것을 설명한다. (a) 대조 shRNA (shLuc)에 대하여, 렌티바이러스성 shRNA-매개된 COT 고갈 (shCOT) 후 RPMI-7951 생존력의 정량화. 에러 바(error bar)는 복제체 사이의 표준편차를 나타낸다. (b) shLuc 및 shCOT-발현 RPMI-7951에서 상대적인 COT 단백질 발현을 보이는 면역블롯 분석.
도 21은 SKMEL28에서 MAPK 경로 저해제의 패널의 GI50에 대한 ORF 발현의 효과를 설명한다. MEK1, MEK1DD 또는 COT를 이소성으로 발현하는 SKMEL28의 반-최대 성장-저해성 농도 (GI5o)는 RAF 저해제 PLX4720 및 RAF265 및 MEK1 /2 저해제 Cl-1040 및 AZD6244에 대해 결정되었다. MEK1DD 및 COT(MEK1에 대하여)에 대한 GI5o에서의 변화는 각 화합물에 대해 결정되었다.
도 22는 COT가 MEK-독립성 및 MEK-의존성 메커니즘을 통하여 ERK를 활성화할 수 있다는 것을 설명한다. (a) 대조 shRNA (shLuc)에 대하여, GFP 또는 COT의 발현 및 이후의 렌티바이러스성 shRNA-매개된 MEK1, MEK2 또는 MEK1 및 MEK2 (MEK1+2) 고갈 후 A375로부터의 용해물에서 ERK 인산화의 면역블롯 분석. 왼쪽 및 오른쪽 패널은 MEK1 및 MEK2 shRNA 구성체의 2개의 상이한 쌍을 나타낸다. (b) 시험관내 키나아제 분석에서 재조합 COT에 의한 재조합형의, 불활성 ERK 인산화 (Thr202/Tyr204)의 면역블롯 분석.
도 23은 조합 MAPK 경로 저해가 SKMEL28에서 증식을 효과적으로 억제한다는 것을 설명한다. DMSO, PLX4720 (농도는 명시됨), PLX4720 (1 μM) 및 CI-1040 (1 μM) 또는 PLX4720 (1 μM) 및 AZD6244 (1 μM)으로 처리된 및 MEK1, MEK1DD 또는 COT를 이소성으로 발현하는 SKMEL28의 생존력 (DMSO에 대하여). 에러 바(error bar)는 복제체(n=6) 사이의 표준편차를 나타낸다.
도 24는 COT 과발현이 B-RAF 저해에 대한 B-RAFV600E 돌연변이 저항성을 갖는 흑색종 암 세포를 만들기에 충분하다는 것을 설명한다.
도 25는 1차 선별에서 얻은 상위 9개의 ORF가 (a) SKEL28 및 (b) A375에서 발현되었고 GI50은 4개의 MAPK 경로 저해제(PLX4720, RAF265, CI-1040, AZD-6244)에 대해 보여진다는 것을 설명한다.
도 26은 CRKL 발현이 B-RAFv600E 세포주의 패널에서 선택적인 B-RAF 저해제 PLX4720에 대한 민감도를 변화시킨다는 것을 설명한다.
도 27은 MAP3K8/COT-증폭된 / B-RAFV600E-돌연변이 암 세포주 OUMS-23이 PLX4720의 분량 범위에 걸쳐 ERK/MEK의 본질적인 인산화를 보여준다는 것을 설명한다.
도 28은 피부암 세포주의 하위집합(subset)에서 MAPK 경로 저해에 대한 둔감도가 MAP3K8/COT 복제개수 증가와 상응한다는 것을 설명한다. 20 B-RAFV600E-돌연변이 세포주의 패널과 (a) B-RAF 저해제 PLX4720 및 (b) MEK 저해제 AZD6244에 대한 이들의 민감도가 보여진다.
실시예1
ORF -기반 기능적 선별은 B- RAF 저해에 대한 저항성의 동인으로서 특정한 키나아제를 식별한다.
RAF 저해를 피할 수 있는 키나아제를 식별하기 위해, ~75%의 설명된 키나아제(Center for Cancer Systems Biology (CCSB)/Broad Institute Kinase ORF Collection)를 나타내는 597개의 서열-입증 키나아제 ORF 클론은 RAF 키나아제 저해제 PLX4720에 대해 민감한 B-RAFV600E 악성 흑색종 세포주인 A375에서 집합되고 안정되게 발현되었다(Tsai, J. et al . Proc . Natl Acad . Sci . USA 105, 3041-3046 (2008)) (도 1a, 1b, 표 3, 도 6c). 1 μM PLX4720로 처리한 ORF 발현 세포는 처리되지 않은 세포에 대하여 생존력을 위해 선별되고 그리고 분석-특정 양성 조절, MEK1S218 222D (MEK1DD)에 대해 표준화되었다(Emery, C. M. et al . Proc . Natl Acad . Sci . USA 106, 2041 1-20416 (2009).) (표 4 및 도 5에 요약됨). 9개의 ORF는 평균에서 2개의 표준편차를 초과하는 수준에서 저항성을 부여하였고(도 1b 및 표 4) 후속 분석을 위해 선택되었다(도 7). 9개의 후보 ORF 중 3개는 수용체 타이로신 키나아제였으며, 이는 저항성 경로를 개입시키기 위한 이 종류의 키나아제의 잠재성을 강조한다. 저항 효과는 B-RAFV600E 세포주 A375 및 SKMEL28에서 다지점 PLX4720 약물 농도 규모에 걸쳐 입증되었고 그리고 순위를 매겼다. Ser/Thr MAP 키나아제 키나아제 키나아제 (MAP3Ks) MAP3K8 (COT/Tpl2) 및 RAF1 (C-RAF)는 둘 모두의 세포주에서 상위 후보로서 나타났다; 이들 ORF는 PLX4720 GI50을 생존력에는 영향을 주는 것 없이 10-600 배로 바꾸었다(표 5 및 도 8 및 9). PLX4720 GI50을 더 작은 정도(SKMEL28 세포에서 9.7 배; 도 8)로 바꾼 ORF인, CRKL은 BCR-ABL과 같은 타이로신 키나아제로 인산화된 연결자 단백질을 암호화(Birge, R.B. et al., Cell Commun Signal 7, 13 (2009))하지만, 고유한 키나아제 활성도는 없다. COT 및 C-RAF는 다수의 B-RAFV600E 세포주(도 1c)에서 PLX4720에 대한 민감도를 감소시켜 RAF 저해에 대한 저항성을 조정하기 위한 이들 키나아제의 능력을 확인하였다. A375 및 SKMEL28에서의 2차 선별에서는 다지점 PLX4720 약물 농도 규모에 걸쳐 상위 9개의 후보 ORF의 순위를 매겼다(도 1d).
흥미롭게도, 상위 2개의 입증된 키나아제는 여러 가지 맥락에서 MEK/ERK 신호전달을 활성화시키는 것으로 알려진 Ser/Thr MAP 키나아제 키나아제 키나아제 (MAP3Ks) 둘 모두이다. B-RAF 처럼, C-RAF는 pan-RAF 저해제(Montagut, C. et al . Cancer Res 68, 4853-4861 (2008))를 이용하여 시험관 내에서 단계적 선택과 연관되는 저항성을 이전에 관계시켰던, 표준이 되는 MPAK 캐스캐이드(McKay, M.M. 및 Morrison, D.K. Oncogene 26, 31 13-3121 (2007))에서 MAP3K이다. COT (인간 MAP3K8 유전자의 단백질 생산물)은 염증 세포(Banerjee, A. et al ., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103, 3274-3279 (2006))에서 MFKB 신호전달의 MAP3K(Salmeron, A. et al. EMBO J 15, 817-826 (1996)) 다운스트림으로서 가장 특징화된 것이다; 하지만 인간의 암에서 이의 기능적 중요성은 이전에도 밝혀지지 않았다.
실시예 2
MAPK 경로 활성화를 통한 B- RAF 저해에 대한 저항성.
이들 유전자의 과발현이 MAPK 경로를 활성화시키는데 충분한지 또한 검사되었다. 기준에서, MEK1과 필적하는 방식으로 ERK 인산화가 증가된 COT 발현은 MAP 키나아제 경로 활성화와 일치한다 (도 2a 및 10). 야생형 COT 또는 C-RAF의 과발현은 PLX4720의 존재에서 ERK 및 MEK의 본질적인 인산화를 야기하였고, 반면에 키나아제-비작동 유도체는 효과가 없었다(도 2a 및 11). 따라서, COT및 C-RAF는 대개 MAPK 신호전달의 재-활성화를 통하여 RAF 저해에 대한 저항성을 일으킨다. 특히, 초기 선별로부터의 9개의 후보 ORF 중에서, 하위집합 (3)은 RAF 저해 후 지속적인 ERK/MEK 인산화를 나타내지 않았고, 이는 약물 민감도의 MAPK 경로-독립성 변형을 제시한다(도 12).
실시예 3
B- RAF 를 이용한 C- RAF 활성화 및 헤테로다이머화 .
B-RAF를 이용한 C-RAF 활성화 및 헤테로다이머화는 B-RAF 저해에 반응하는 세포의 중요 성분으로 여겨진다. A375 세포에서, 내생 C-RAF: B-RAF 헤테로다이머는 PLX4720으로 처리 후 측정 및 유도될 수 있다(도 13). 하지만, S338에서 내생 C-RAF 인산화 - C-RAF 활성화를 필요로 하는 사건- 는 낮게 남아있었다(도 13). 대조적으로, 이소성으로 발현된 C-RAF는 S338에서 인산화되었고(도 13) 그리고 이의 PLX4720 저항 표현형은 지속적인 MEK/ERK 활성화와 연관되었다(도 2a 및 13). 더욱이, 고-활성도 C-RAF 절단 돌연변이(C-RAF(W22))의 이소성 발현은 PLX4720 저항성 및 ERK 활성화의 조정에서 야생형 C-RAF보다 더 효과적이었고(도 14), 이는 상승된 C-RAF활성도가 이 약물에 대한 저항성을 지시한다는 것으로 추가로 나타냈다. 이 모델과 일치하여, NRAS 및 KRAS의 종양형성 대립유전자는 A375 세포에서 PLX4720 저항성을 부여하였고(도 2b) 그리고 약물치료의 맥락에서 지속적인 C-RAF(S338) 및 ERK 인산화를 산출하였다(도 2c). 따라서, C-RAF 활성화를 일으키는 유전적 변형(가령, 종양형성 RAS 돌연변이)는 B-RAFV600E 돌연변이와 상호 배타성을 보인다는 경향에도 불구하고, 이러한 공동-발생 사건은 B-RAF 저해에 대한 후천적 저항성의 맥락에서 선호된다.
실시예 4
흑색종에서 COT 발현의 조사.
C-RAF가 이전에 흑색종 및 MAPK 경로 의존(Montagut, C. et al . 2008; Karreth, F.A., DeNicola, G.M. et al ., 2009; Dumaz, N. et al . Cancer Res 66, 9483-9491 (2006); Hatzivassiliou, G. et al . Nature (2010); Heidorn, S.J. et al., Cell 140, 209-221 (2010); Poulikakos, P.I. et al ., Nature (2010))과 연관되었던 반면에, COT는 흑색종-연관 키나아제로서 설명되지 않았다.
흑색종에서 COT의 역할이 조사되었고, 인간 멜라닌세포에서의 이의 발현이 검사되었다. 이소성 B-RAFV600E 발현이 COT mRNA 수준을 감소시키고(도 15) 그리고 탐지될 수 없는 COT 단백질을 만들었음에도 불구하고(도 2d), 초기 불멸화 멜라닌세포 (B-RAF 야생형)는 COT를 발현하였다(도 2d). 역으로, 이소성으로 발현된 COT는 A375 세포에서 단지 약하게 탐지될 수 있는 반면에(도 2a, 2e), 내생 B-RAFV600E 의 shRNA-매개된 고갈은 B-RAF 녹다운(knockdown)의 정도와 관련된 COT 단백질 수준의 증가를 야기하였다(도 2e). 더욱이, PLX4720으로 COT-발현 A375 세포의 처리는 이소성 COT mRNA 수준에는 영향을 주는 것 없이(도 15) COT 단백질에서 분량-의존성 증가를 유발하였다(도 2a). 종양형성 B-RAF는 대체로 변형된 단백질 안정도를 통하여 COT 발현에 대항하고(도 2a, d, e, 및 15), 그리고 B-RAF 저해는 처리과정 동안 COT-발현 세포의 돌출성장을 증가시킨다. 단독 또는 조합으로된 C-RAF 또는 B-RAF 중 어느 것도 COT발현의 맥락에서, 심지어 PLX4720의 존재에서 C-RAF 또는 B-RAF 단독 중 어느 한 가지도 또는 조합도 ERK 인산화를 위해 요구되지 않았다(도 2e, 2f 및 도 16). 보여진 바와 같이, COT 발현은 RAF-독립성 방식으로 MAP 키나아제 경로 활성화를 유도하는 데 충분하다.
실시예 5
COT 발현은 암 세포주에서 B- RAF 저항에 대한 저항성을 예측한다.
B-RAFV600E 백그라운드에서 상승된 COT를 발현하는 세포주가 PLX4720 처리에 대해 새로운(de novo) 저항성을 나타내는지 검사되었다. 이러한 경우를 식별하기 위해, 세포주의 패널이 B-RAFV600E 돌연변이와 일치하는 MAP3K8/COT 복제 개수 증가의 증거를 위해 선별되었다. 복제 개수 분석 및 돌연변이 프로파일링(profiling)을 실시한 534개의 세포주 중에서, 38개의 세포주 (7.1%)가 B-RAFV600E 돌연변이를 포함하였다. 이 하위집단 내에서, 2개의 세포주- OUMS-23 (결장암) 및 RPMI-7951 (흑색종)-는 MAP3K8/COT 유전자 자리(locus) (도 3a 및 17) 및 강력한 COT 단백질 발현(도 3b 및 18)을 포괄하여 염색체 복제 증가의 증거를 또한 보여주었다. 흑색종 단기 배양의 패널이 COT 단백질 발현을 위해 또한 선별되었다. 단기 배양인, COT: M307를 발현하는 이들 세포주 중 한 가지는 초기 질환 안정화 후 다른 자리 입체성 MEK 저해에 대한 저항성이 발달된 B-RAFV600E 종양으로부터 유래되었다(도 3c). 세개의 세포주 모두는 PLX4720 처리에 대해 불응성이었고, 이는 B-RAF 저해의 맥락에서, 8-10 μM의 범위에서 GI50 값을 나타내고 지속적인 ERK 인산화를 보여주었다(도 3e, 3f). OUMS-23 및 RPMI-7951은 MAPK 경로 저해제-미접촉(naive) 세포주이다; 따라서, 이들 결과는 COT가 RAF 저해에 대한 새로운 (de novo) 저항성을 부여한다는 것을 증명한다(~10%의 B-RAFV600E 흑색종에서 관찰된 현상).
실시예 6
RAF 저해제로 치료된 환자에서 COT 발현.
임상의 RAF 저해제 PLX4032에 대한 저항성의 맥락에서 COT 발현이 전이성 B-RAFV600E 흑색종을 가진 3명의 환자로부터 생체검사 물질을 얻음으로써 검사되었다. 냉동된, 병변-일치 생체검사 물질로 구성된 각각의 사례는 치료에 앞서 그리고 치료 중에 얻었다("치료-전(pre-treatment)" 및 "치료-중(on-treatment)"; 도 3g, 표 6); 추가적으로, 한 가지 샘플은 동일한 재발성 종양 부위로부터 2개의 독립적인 생체검사 표본을 포함하였다("재발-후(post-relapse)"; 도 3g). 위에 제시된 실험적 모델과 일치하여, 정량 실-시간 RT-PCR (qRT/PCR) 분석은 3가지 사례 중 2가지에서 PLX4032 치료와 동시에 증가된 COT mRNA 발현을 나타냈다. COT mRNA 수준은 이의 치료-전 및 치료-중 대응에 대하여 재발성 표본에서 추가로 증가하였다(도 3g, 환자 #1). 추가적으로, 부정합 재발성 악성 흑색종 생체검사는 RAF 저해제-저항성, COT-증폭 세포주에서 관찰된 수준과 필적하는 상승된 COT mRNA 발현을 보여주었다(도 19). 이 표본은 일치된 정상 피부 또는 B-RAFV600E 세포주에 대하여 강력한 MAPK 경로 활성화 및 B-RAF, C-RAF 및 COT의 상승된 발현을 또한 나타냈다(도 19). 이 종양의 서열 연구는 BRAF, NRAS 또는 KRAS에서 추가적인 돌연변이가 없다는 것을 나타냈다(자료는 제시되지 않음). 이들 분석은 COT-의존성 메커니즘이 PLX4032-저항성 악성 흑색종에서 작용한다는 임상적 증거를 제공하였다.
실시예 7
MEK / ERK 인산화의 COT 조절.
COT를 표적으로 하는 shRNA 구성체를 RPMI-7951 세포 내로 유입시킴으로써 COT가 B-RAFV600E 세포에서 MEK/ERK 인산화를 활발하게 조절하는지 검사되었다. COT의 고갈은 RPMI-7951 생존력을 억제하였고(도 20) 그리고 ERK 인산화를 감소시켰다(도 3h); 따라서, 표적 COT 키나아제 활성도는 COT를 과발현하거나 또는 증폭시키는 암세포에서 MEK/ERK 인산화를 억제한다. 추가적으로, 표적 COT 키나아제 활성도는 B-RAF 저해제(PLX4720)의 존재에서 MEK/IRK 인산화를 억제한다(도 3h). 소분자 COT 키나아제 저해제(Wyeth, Abbot compound ID 9549300) (George, D. et al ., Bioorg . Med . Chem . Lett . 18, 4952-4955 (2008); Hirata, K. et al., Biol . Pharm . Bull . 33, 133-137 (2010); Lee, K. M. et al , Cancer Res . 69, 8043-8049 (2009))로 RPMI-7951 세포의 처리는 MEK 및 ERK 인산화의 분량-의존성 억제를 야기하였고, 이는 COT가 이들 세포에서 MEK/ERK 활성화에 기여한다는 추가적인 증거를 제공한다(도 3i).
실시예 8
COT -발현 B- RAF V600E 세포주는 다른 자리 입체성 MEK 저해제에 대한 저항성을 나타낸다.
COT-발현 암세포가 COT 또는 RAF의 표적 다운스트림에서 MAPK 경로 저해에 민감하게 남아있는지 분석되었다. OUMS-23 및 RPMI-7951 세포주는 MEK1/2 저해제 CI-1040에 대한 민감도에 대해 의문이 제기되었다. 둘 모두의 세포주는 심지어 1 μM CI-1040에서 MEK 저해에 대해 불응성이었고 (도 4a) 그리고 지속적인 ERK 인산화를 나타냈다(도 4b). A375 및 SKMEL28 세포에서 이소성의 COT 발현은 MEK 저해제 CI-1040 및 AZD6244에 대한 감소된 민감도를 또한 부여하였고, 이는 단독의 COT 발현 이 표현형을 유도하는데 충분했다는 것을 제시한다(도 4c, 4d 및 21). 약물학적 MEK 저해제로 관찰된 결과와 유사하게, MEK1/2 녹다운은 A375 세포에서 COT-매개 ERK 인산화를 단지 약간만 억제하였다(도 22). 이들 자료는 COT가 MEK-독립성 및 MEK-의존성 메커니즘을 통하여 ERK를 활성화시킨다는 것을 증명한다. 더욱이, 재조합 COT 및 ERK1를 이용한 시험관내 키나아제 분석이 수행되었고, 그리고 재조합 COT가 시험관 내에서 ERK1의 pThr202/Tyr204 인산화를 유도하였다는 것이 증명되었다(도 22). 따라서, COT 발현은 MEK-독립성 방식으로 ERK 활성화를 증가시킨다.
실시예 9
세포 증식을 억제하기 위한 조합 MAPK 경로 저해.
조합물에서 RAF 및 MEK 저해제의 용도는 도 23에서 보여진 바와 같이 단일-약물에 대한 저항성을 중단시킬 수 있다. 조합된 RAF/MEK 저해가 COT-주동 저항성을 피할 수 있는지 검사되었다. 이소성 COT 발현 설정에서, PLX470과 조합한 AZD6244 또는 CI-1040에 노출(각각 1 μM)은 심지어 10 μM의 농도에서, 단일-약물 PLX4720에 노출한 것보다 세포 성장 및 pERK 발현을 더 효과적으로 감소시켰다(도 4e, 4f 및 23). 이들 자료는 B-RAFV600E 종양 세포에서 이 경로의 중요성을 강조하고 그리고 이중 B-RAF/MEK 저해가 RAF 저해제에 대한 저항성을 피하는 것을 돕는다는 것을 증명한다.
방법
암 시스템 생물학을 위한 센터( CCSB )/ 브로드 인스티튜트 키나아제 개방형 해독틀 컬렉션( Center for Cancer Systems Biology ( CCSB )/ Broad Institute Kinase Open Reading Frame Collection )
pDONR-223 엔트리(Entry) 벡터 (Invitrogen)에서 597개의 키나아제 ORF의 라이브러리가 집합되었다. 개별적인 클론은 양쪽 방향에서 벡터-특정 프라이머(primer)를 이용하여 말단-서열화(end-sequenced)가 되었다. 보고된 서열로부터의 상당한 편차를 갖는 클론은 폐기되었다. 엔트리(Entry) 클론 및 서열은 Addgene (http://www.addgene.org/human_kinases)을 통해 이용가능하다. 키나아제 ORF는 다수의 원천으로부터 집합되었다; 337개의 키나아제는 ORFeome 5.1 컬렉션 (http://horfdb.dfci.harvard.edu)으로부터 단일 클론으로서 분리되었고, 183개의 키나아제는 게이트웨이(Gateway) 서열(Invitrogen)을 첨가하기 위해 역전사 및 연속 PCR 증폭에 의해 정상적인 인간 조직 RNA(Ambion)로부터 복제되었고, 64개의 키나아제는 Harvard Institute of Proteomics (HIP)에 의해 제공된 주형으로부터 복제되었고, 그리고 13개의 키나아제는 협동 실험실에서 얻은 주형으로부터 게이트웨이(Gateway) 시스템 내로 복제되었다. 게이트웨이(Gateway)-상용성 렌티바이러스성 벡터 pLX-Blast-V5가 pLKO.1 백본(pLKO.1 backbone)으로부터 만들어졌다. LR Clonase 효소 재조합 반응은 제조자의 프로토콜 (Invitrogen)에 따라 597개의 키나아제를 pLX-Blast-V5로 유입시키기 위해 수행되었다.
고 처리량 기능적 선별 분석
A375 흑색종 세포는 A375-웰 마이크로적정 플레이트 (웰 당 500 개의 세포)에 도말되었다. 그 다음날, 세포는 8 ug/ml 폴리브렌의 존재에서 렌티바이러스성으로 포장된 키나아제 ORF 라이브러리로 회전-감염되었다(spin-infected). 감염 48시간 후, 배지는 표준 성장 배지 (2개의 복제체), 1 μM PLX4720를 포함한 배지(2개의 복제체, 2개의 시점(time point)) 또는 10 ug/ml 블라스티사이딘을 포함한 배지 (2개의 복제체)로 교체되었다. 4일 내지 6일 후, 세포 성장이 제조자의 지시에 따라 Cell Titer-Glo (Promega)를 이용하여 분석되었다. 전체 실험은 2번 수행되었다.
후보 저항성 ORF 의 식별
비가공 발광값(raw luminescence value)을 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)로 불러왔다. 감염 효율성은 비-선택된 세포에 대하여 블라스티사이딘 선택된 세포에서 중복체-평균 비가공 발광값의 백분율로 결정되었다. 0.70 보다 작은 감염 효율성을 갖는 ORF는 중복체 사이에서 >15,000 비가공 발광값 단위(unit)의 표준편차를 갖는 임의의 ORF와 함께 추가적인 분석에서 제외되었다. 발현시 증식에 영향을 주는 ORF를 식별하기 위해, z-점수, 또는 표준점수, 아래의 식을 통하여 조절-처리된 세포 모두의 평균 및 표준편차에 대하여 개별적인 ORF의 중복체-평균 비가공 발광값을 비교하였다.
Figure pct00017
여기서 x = 주어진 ORF의 평균 비가공 발광, μ= 모든 ORF의 평균 비가공 발광 및 σ= 모든 웰의 비가공 발광의 표준 편차이다. z-점수 >+2 또는 <-2를 갖는 임의의 개별적인 ORF는 증식에 영향을 준다는 것으로서 설명되었고 그리고 최종 분석에서 제거되었다. 차등 증식은 처리되지 않은 세포에 대하여 PLX4720 (1 μM) 처리된 세포에서 결정되었다. 이후에, 차등 증식은 MEK1DD 차등 증식= 1.0으로, PLX4720 저항성, MEK1S218 /222D (MEK1DD)에 대한 양성 조절에 대해 표준화되었다. 각각 개별적인 ORF에 대한 MEK1DD 표준화된 차등 증식은 각각의 실험에 대해 2개의 시점(4일 및 6일)으로, 2 번의 중복 실험에 걸쳐 평균이 계산되었다. 그 다음, z-점수가 평균 MEK1DD 표준화된 차등 증식에 대해 상기 설명된 바와 같이, 발생되었다. >2의 z-점수를 갖는 ORF는 히트(hit)로 간주되었고, 2차 선별에서 후속조치되었다.
ORF 및 shRNA 발현
ORF는 pLX-Blast-V5 (렌티바이러스성) 또는 pWZL-Blast, pBABE-Puro 또는 pBABE-제오신(zeocin) (레트로바이러스성) 발현 플라스미드로부터 발현되었다. 렌티바이러스성 형질도입을 위해, 293T 세포가 1μg의 pLX-Blast-V5-ORF 또는 pLKO.1-shRNA, 6 μl Fugene6 형질감염 시약(Roche)을 이용한 900 ng △8.9 (gag, pol) 및 100 ng VSV-G로 형질감염되었다. 바이러스의 상청액은 형질감염 72시간 후 수확되었다. 포유류 세포는 5 μg/ml 폴리브렌의 존재에서 6-웰 프레이트내 바이러스의 1:10-1:20 희석으로 감염되었고 1시간 동안 37℃에서 2250 RPM으로 원심분리되었다. 감염 24시간 후, 블라스티사이딘 (pLX-Blast-V5, 10 μg/ml) 또는 퓨로(puro)(pLKO.1, 0.75 μg/ml)가 첨가되었고 그리고 세포는 48시간 동안 선택되었다. 레트로바이러스 생성을 위해, 293T가 상기 설명된 바와 같이, 1 μg의 레트로바이러스성 플라스미드-ORF, 1 μg pCL-AMPHO 및 100 ng VSV-G로 형질감염되었다. 세포는 하룻밤 동안 5 μg/ml 폴리브렌에서 1:2 희석으로 레트로바이러스 함유 상청액으로 감염되었고, 그 다음 배지는 성장 배지로 교체되었다. 상기와 같이, 감염은 한번 더 반복되었고(전체 2번), 이후 선택되었다.
2차 선별
A375 (1.5 x 103) 및 SKMEL28 세포(3 x 103)가 18시간 동안 96-웰 플레이트에 접종되었다. ORF-발현 렌티바이러스는 8 μg/ml 폴리브렌의 존재에서 1:10 희석으로 첨가되었고, 그리고 1시간 동안 37℃에서 2250 RPM으로 원심분리되었다. 원심분리 후, 바이러스-함유 배지는 정상 성장 배지로 교체되었고 18시간 동안 배양이 허용되었다. 감염 24시간 후, DMSO (1:1000) 또는 10x PLX4720 (DMSO 내에)이 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 또는 0.00001 μM의 최종 농도에 첨가되었다. 세포 생존력은 PLX4720의 첨가 4일 후, 제조자의 권고에 따라, WST-1 (Roche)을 이용하여 분석되었다.
세포주 및 시약
A375, SKMEL28, SKMEL30, COLO-679, WM451lu, SKMEL5, Malme 3M, SKMEL30, WM3627, WM1976, WM3163, WM3130, WM3629, WM3453, WM3682 및 WM3702는 모두 RPMI (Cellgro), 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신에서 성장하였다. M307은 1 mM 소듐 피루베이트로 보충된 RPMI (Cellgro), 10% FBS and 1% 페니실린/스트렙토마이신에서 성장하였다. 293T 및 OUMS-23은 DMEM (Cellgro), 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신에서 성장하였다. RPMI-7951 세포 (ATCC)는 MEM (Cellgro), 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신에서 성장하였다. 야생형 초기 멜라닌세포는 HAM's F10 (Cellgro), 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신에서 성장하였다. B-RAFV600E-발현 초기 멜라닌세포는 TIVA 배지 [Ham's F-10 (Cellgro), 7% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2mM 글루타민 (Cellgro), 100 uM IBMX, 50 ng/ml TPA, 1mM dbcAMP (Sigma) 및 1 μM 소듐 바나데이트]에서 성장하였다. CI-1040 (PubChem ID: 6918454)은 Shanghai Lechen International Trading Co.에서, AZD6244 (PubChem ID: 10127622)는 Selleck Chemicals에서, 그리고 PLX4720 (PubChem ID: 24180719)은 Symansis에서 구입하였다. RAF265 (PubChem ID: 11656518)은 Novartis Pharma AG로부터 제공되었다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 약물치료는 16시간 동안 이루어진다. NRAS 및 KRAS의 활성화된 대립유전자는 이전에 설명되었다 (Boehm, J. S. et al . Cell 129, 1065-079 (2007); Lundberg, A. S. et al . Oncogene 21, 4577-586 (2002)).
약물학적 성장 저해 분석
배양된 세포는 모든 흑색종 세포주에 대해 96-웰 플레이트(웰 당 3,000 개의 세포)에 접종되었고; A375에 대해 1,500 개의 세포가 접종되었다. 접종 24시간 후, DMSO에서 제조된, 관련있는 화합물의 연속적인 희석물이 세포에 첨가되어, 100 μM 내지 1 x 105 μM의 범위의 최종 약물 농도가 산출되었고, 여기서, DMSO의 최종 부피는 1%를 초과하지 않는다. 세포는 약물의 추가 후 96시간 동안 배양되었다. 세포 생존력은 WST1 생존력 분석 (Roche)을 이용하여 측정되었다. 생존력은 백그라운드 공제 후 대조군(처리되지 않은 세포)의 백분율로서 계산되었다. 최소한의 여섯 개의 복제체는 각각의 세포주 및 약물 조합물에 대해 수행되었다. 성장-저해 분석에서의 자료는 S자 모양(sigmoid)의 분량-반응으로 비선형 회귀 곡선 적합(nonlinear regression curve fit)을 이용하여 모형화(modeled)되었다. 이들의 곡선은 윈도우용 GraphPad Prism 5(GraphPad)를 이용하여 나타냈고 GI50을 생성하였다. 10 μM에서 또는 그 이상에서 50% 저해 지점을 가로지르는 S자-반응 곡선은 >10 μM로서 설명된 GI50 값을 갖는다. 단일-분량 연구를 위해, 명시된 약물(달리 명시되지 않는 한 1μM)의 단일 분량을 이용하여, 상기 동일한 프로토콜을 따랐다.
면역블롯 및 면역침전
세포는 아주 찬 PBS(ice-cold PBS)로 2번 세척되었고 2x 프로테아제 저해제 (Roche) 및 1x 포스파타아제 저해제 칵테일 I 및 II (CalBioChem)를 포함한 1% NP-40 완충액[150 mM NaCl, 50 mM 트리스 pH 7.5, 2 mM EDTA pH 8, 25 mM NaF 및 1% NP-40]로 용해되었다. 용해물(lysate)은 10% 트리스/글리신 겔 (Invitrogen) 상에서 SDS 겔 전기영동에 의해 정량화(Bradford 분석), 표준화, 감소, 변성 (95℃) 및 분해되었다. 단백질은 PVDF 막으로 이동되었고 pERK1/2 (T202/Y204), pMEK1/2 (S217/221), MEK1/2, MEK1, MEK2, C-RAF (토끼 숙주), pC-RAF (pS338) (Cell Signaling Technology; 1:1,000), V5-HRP (Invitrogen; (1:5,000), COT (1:500), B-RAF (1:2,000), 액틴 (1:1,000), 액틴-HRP (1:1,000; Santa Cruz)), C-RAF (생쥐 숙주; 1:1,000; BD Transduction Labs), 빈쿨린(Vinculin) (Sigma; 1:20,000), AXL (1:500; R&D Systems)를 인식하는 일차 항체로 조사되었다. 적절한 2차 항체(항-토끼, 항-생쥐 IgG, HRP-연관; 1:1,000 희석, Cell Signaling Technology 또는 항-염소 IgG, HRP-연관; 1:1,000 희석; Santa Cruz)로 배양 후, 단백질이 화학발광 (Pierce)을 이용하여 탐지되었다. 면역침전은 C-RAF (1:50; Cell Signaling Technology)를 인식하는 항체를 이용하여 1 μg/μl 전체 단백질의 농도에서, 상기 설명된 바와 같이, 1% NP-40 용해 완충액에서 4℃의 하룻밤 동안 수행되었다. 항체: 항원 복합체는 4℃에서 2시간 동안 단백질 A 아가로오스(25 μL, 50% 슬러리(slurry); Pierce)에 결합되었다. 비드(bead)는 용해 완충액에서 원심분리 및 3번 세척되고 그리고 2x 감소된 샘플 완충액(Invitrogen)에서 용출 및 변성(95℃)되었다. 면역블롯은 상기와 같이 수행되었다. 인-단백질 정량화는 NIH Image J를 이용하여 수행되었다.
종양 및 일치된 정상 피부로부터의 용해는 상기와 같이, 프로테아제 및 포스파타아제 저해제를 포함한 RIPA [50 mM 트리스 (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 1.0% NaDOC, 1.0% 트리톤(Triton) X-100, 25 mM NaF, 1mM NA3VO4]에서 조직의 기계적 균질화에 의해 발생되었다.
생체검사된 흑색종 종양 물질
생체검사된 종양 물질은 사전 동의하에 얻은 그리고 프로토콜 02-017 (짝을 이룬 샘플, Massachusetts General Hospital) 및 07-087 (짝을 이루지 않은 샘플, Dana-Farber Cancer Institute) 하에 특징화된, 폐기된 및 알 수 없는 조직으로 구성되었다. 짝을 이룬 샘플의 경우, '치료-중(on-treatment)' 샘플은 PLX4032 치료의 시작 10-14일 후 수집되었다(표 6).
COT 키나아제 활성도의 저해
부착된 RPMI-7951 세포는 1x PBS로 두번 세척되었고 혈청-없는 성장 배지에서 하룻밤 동안 배양되었다. 이후에, 명시된 농도로 DMSO에서 부유된, 4-(3-클로로-4-플루오로페닐아민)-6-(피리딘-3-일-메틸아미노)-3-시아노-[1,7]-나프티리딘 (EMD;TPL2 저해제 I; Cat#: 616373, PubChem ID: 9549300)이 1시간 동안 세포에 첨가되었고, 이후, 단백질 추출물이 상기 설명된 바와 같이 만들어졌다.
정량 RT - PCR
mRNA가 RNeasy 키트(Qiagen)를 이용하여 세포주 및 신선한-냉동된 종양으로부터 추출되었다. 전체 mRNA는 세포주 및 짝을 이루지 않은 종양 샘플에 대해 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen), 그리고 짝을 이룬 냉동된 종양 샘플에 대해 SuperScript VILO cDNA 합성 키트 (Invitrogen) 를 이용하여 연속적인 역전사에 이용되었다. 5μl의 RT 반응은 ABI 7300 Real Time PCR System을 이용하여, 3배로, SYBR Green PCR Master Mix 및 유전자-특정 프라이머를 이용하여 정량 PCR을 위해 이용되었다. 탐지에 이용된 프라이머는 다음과 같다:
Figure pct00018
실험관내 키나아제 분석
실험관내 키나아제 분석은 각각 1 μg의 COT (아미노산 30-397, R&D Systems) 및 불활성 ERK1 (Millipore)을 이용하여 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다.
세포 생존력 분석
부착된 RPMI-7951 세포는 상기 설명된 바와 같이 COT 또는 발광효소(luciferase)에 대항하여 shRNA를 발현하는 바이러스로 감염되었다. 선택 후, 세포는 24-웰 플레이트에 사중복으로 도말되었다(1.5x105개 세포/웰). 생세포는 제조자의 설명서에 따라, VI-CELL Cell Viability Analyzer를 이용한 트리판 블루(trypan blue) 배제를 통하여 계산되었다. 사중복된 세포 수는 대조 shRNA에서의 세포 수에 대하여 평균이 계산되고 표준화되었다.
암 세포주 백과사전 ( The Cancer Cell Line Encyclopedia , CCLE )
암 세포주 백과사전(The Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE) 프로젝트는 인간 암 모델의 대형 패널의 상세한 유전적 및 약물학적 특징을 안내하기 위해, 분명한 약물학적 취약성을 유전체 패턴에 연결시키는 통합된 계산적 분석을 발달시키기 위해, 그리고 세포주 통합 유전체학을 암 환자 분류로 바꾸기 위해 Biomedical Research (NIBR)를 위한 Novartis Institutes, Broad Institute와 Genomics Institute of the Novartis Research Foundation (GNF) 사이의 협동이다. 본 연구에 이용된 염색체 복제개수 및 유전자 발현 자료가 http://www.broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi에서 온라인으로 이용될 수 있다.
암 세포주의 발현 프로파일링
올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 분석은 GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Affymetrix 발현 어레이(Affymetrix)를 이용하여 수행되었다. 샘플은 발현 마이크로어레이에서 이용을 위한 Affymetrix 프로토콜에 따라 표지된(labeled), 단편화된 cRNA로 전환되었다.
이용된 shRNA 구조체 ( pLKO .1)
이용된 shRNA 구조체를 제조하기 위한 DNA 서열은 다음과 같다:
Figure pct00019
본 명세서에서 제공된 정의 및 개시는 참조로서 편입된 다른 모든 것들에 우선하며 대체된다. 본 발명이 이들의 바람직한 실시양태와 관련하여 설명되었지만, 정하게 설명되지 않은 첨가, 변형, 치환, 및 결실은 첨부된 청구항에서 정의된 바와 같이 본 발명의 사상 및 범위에서 벗어나지 않고 만들어질 수도 있다는 것으로 당업계에서 숙련자에 의해 인식될 것이다. 따라서, 전술한 상세한 설명은 제한보다는 예시로서 간주되는 것으로, 본 발명의 사상 및 범위를 정의하는 것으로 의도되는 것은 모든 등가물을 비롯한 다음의 청구항으로 이해되는 것으로 의도된다.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
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Figure pct00067
Figure pct00068
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Claims (29)

  1. RAF 저해제와 2차 저해제를 갖는 조합 요법으로의 치료에서 혜택을 받을 가능성이 있는, 암을 가진 피험자를 식별하는 방법에 있어서:
    (a) 피험자에서 얻은 암 세포에서 MAP3K8 (TPL2/COT), RAF1 (CRAF), CR L (CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl), 또는 PAK3 (Pak3)로 구성된 집단에서 선택된 하나 이상의 키나아제 표적의 유전자 복제개수, mRNA 또는 단백질 수준 또는 인산화를 분석 및 상기 유전자 복제개수, mRNA 또는 단백질 수준 또는 인산화를 암이 없는 피험자에서 얻은 세포에서 표적 키나아제의 유전자 복제개수, mRNA 또는 단백질 수준 또는 인산화를 비교; 그리고
    (b) 암이 없는 피험자로부터의 세포에 대하여 암세포에서 표적 키나아제의 증가된 유전자 복제개수 또는 mRNA 발현에서의 변형 또는 단백질 과발현 또는 인산화를 조합 요법으로의 치료에서 혜택을 받을 가능성이 있는, 암을 가진 피험자와 관련시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, (c) 아미노산 위치 600에서 돌연변이를 가진 B-RAF 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자내 돌연변이의 존재에 대해 암세포에서 얻은 핵산 샘플을 분석 및 (d) B-RAF 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자내 돌연변이의 존재를 조합 요법으로의 치료에서 혜택을 받을 가능성이 있는 피험자와 관련시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, B-RAF를 암호화하는 핵산 분자내 아미노산 위치 600(V600E)에서 발린에서 글루탐산으로의 돌연변이의 존재를 조합 요법으로의 치료에서 혜택을 받을 가능성이 있는 피험자와 관련시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, MAP3K8 (TPL/COT)의 유전자 복제개수, mRNA 또는 단백질 수준을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 아미노산 S338에서 C-RAF의 인산화를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 2차 저해제는 MEK 저해제, CRAF 저해제, CrkL 저해제 또는 TPL2/COT 저해제인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, RAF 저해제는 B-RAF 저해제 또는 pan-RAF 저해제인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, RAF 저해제는 RAF265, 소라페닙, SB590885, PLX 4720, PLX4032, GDC-0879 및 ZM 336372로 구성된 집단에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 피험자는 RAF 저해제에 대한 선천적 저항성을 가지거나 또는 RAF 저해제에 대한 저항성을 발달시킬 가능성이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 암은 흑색종, 유방암, 대장암, 신경교종, 폐암, 난소암, 육종 및 갑상선암으로 구성된 집단에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 암은 흑색종인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 병든 피험자에서 암을 치료하는 방법에 있어서, RAF 저해제의 유효량 및 2차 저해제의 유효량을 피험자에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 2차 저해제는 MEK 저해제, 또는 MAP3K8 (TPL2/COT) 저해제인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 피험자는 B-RAF에서 돌연변이를 포함하는 암세포를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 피험자는 B-RAFV600E 돌연변이가 포함된 암세포를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 12에 있어서, 피험자에서 얻은 암세포에서 MAP3K8 (TPL2/COT), RAF1 (CRAF), CRKL (CrkL), FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch), ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl), 또는 PAK3 (Pak3)로 구성된 집단에서 선택된 하나 이상의 키나아제 표적의 유전자 복제개수, mRNA 또는 단백질 수준, 또는 인산화 분석 및 상기 유전자 복제개수, mRNA 또는 단백질 수준 또는 인산화를 암이 없는 피험자에서 얻은 세포에서 표적 키나아제의 유전자 복제개수, mRNA 또는 단백질 수준 또는 인산화를 비교; 그리고 표적 키나아제의 증가된 유전자 복제개수 또는 mRNA 발현에서의 변형 또는 암세포에서 단백질 과발현 또는 인산화를 갖는 피험자에서 RAF 저해제의 유효량 및 2차 저해제의 유효량을 피험자에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 12에 있어서, RAF 저해제는 of RAF265, 소라페닙, SB590885, PLX 4720, PLX4032, GDC-0879 및 ZM 336372로 구성된 집단에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 12에 있어서, MEK 저해제는 CI-1040/PD184352, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA1 19, 6-메톡시-7-(3-모르폴린-4-일-프로폭시)-4-(4-페녹시-페틸아미노)-퀴놀린-3-카르보니트릴 및 4-[3-클로로-4-(1-메틸-1H-이미다졸-2-일설닐)-페닐아미노]-6-메톡시-7-(3-모르폴린-4-일-프로폭시)-퀴놀린-3-카르보니트릴로 구성된 집단에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 12에 있어서, 피험자는 RAF 저해제에 대한 선천적 저항성을 가지거나 또는 RAF 저해제에 대한 저항성을 발달시킬 가능성이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 12에 있어서, 암은 흑색종, 유방암, 대장암, 신경교종, 폐암, 난소암, 육종 및 갑상선암으로 구성된 집단에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 12에 있어서, 암은 흑색종인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 청구항 12에 있어서, 피험자는 MEK 저해제에 대한 선천적 저항성을 가지거나 또는 MEK 저해제에 대한 저항성을 발달시킬 가능성이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 12에 있어서, 2차 저해제는 MAP3K8 (TPL2/COT) 저해제인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 1차 저해제에 대한 저항성을 부여하는 키나아제 표적을 식별하는 방법에 있어서:
    (a) 1차 저해제에 대한 민감도를 갖는 세포를 배양;
    세포 배양에서 다수의 키나아제 ORF 클론을 발현하고, 각 세포 배양은 상이한 키나아제 ORF 클론을 발현;
    (b) 각 세포 배양을 저해제에 노출;
    (c) 1차 저해제에 대한 저항성을 부여하는 하나 이상의 키나아제 ORF 클론을 식별하기 위해 저해제에 노출 후 대조군 세포 배양보다 더 큰 생존력을 갖는 세포 배양을 식별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 배양된 세포는 RAF 저해제에 대한 민감도를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 23에 있어서, 배양된 세포는 MEK 저해제에 대한 민감도를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 23에 있어서, 배양된 세포는 B-RAF 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 배양된 세포는 B-RAFV600E 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 23에 있어서, 배양된 세포는 흑색종 세포주를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 청구항 23에 있어서, 렌티바이러스성 벡터 또는 레트로바이러스성 벡터에서 다수의 키나아제 ORF 클론을 제공하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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