WO2014204261A1 - Tpl2의 발현억제제 또는 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 신세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Tpl2의 발현억제제 또는 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 신세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2014204261A1
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tpl2
renal cell
expression
cells
inhibitor
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남도현
주경민
이정일
정병창
이혜원
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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Definitions

  • composition for the prevention or treatment of renal cell carcinoma comprising T P 12 expression inhibitor or activity inhibitor as an active ingredient
  • the present invention was made by the task number HI12C-0388-020013 under the support of the Ministry of Health and Welfare of the Republic of Korea, the research and management institution of the above task is the Korea Health Industry Development Institute, the research project name is "health and medical technology research and development project”, the research title is " A final preclinical study for the clinical application of GM autologous mesenchymal stem cells for intractable brain cancer. ”
  • the host institution is Seoul National University Industry-University Cooperation Group, and the period is 2012.08.01 ⁇ 2014.07.31.
  • the present invention is made by a task number HI09C1552 under the support of the Republic of Korea Ministry of Health and Welfare, the 'research management professional organization of challenges, Korea Health Industry crimson circle, Research Project is "health care technology research and development project", research found “leading type Intractable Cancer Research Group ”, the host institution is Samsung Seoul Hospital, and the research period is from December 1, 2013 to November 30, 2014.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating renal cell carcinoma comprising an expression inhibitor or an inhibitor of ⁇ 12 as an active ingredient.
  • Renal cell carcinoma is the most common cancer among kidney cancers, and the incidence and mortality rate has steadily increased in recent 30 years. Renal cell carcinoma accounts for 3% of adult cancers in the United States, with an estimated 32,000 new cases per year and about 12,000 people dying from renal cell carcinoma worldwide. It is increasing. In Korea, according to the 2002 Central Cancer Registry, 1,587 new patients were registered, accounting for 1.63 ⁇ 4 of all cancer cases. Especially men It is about twice as common as females. In 2002, 1104 patients occurred in men, with the long-term enrollment rate of male cancer 2.0%. The treatment of renal cell carcinoma known to date depends on the progression of the cancer, the age of the patient, the general condition, and the presence of other diseases associated with it.
  • Tpl2 tumor progression locus 2
  • MAPK mitogen activated protein kinase kinase
  • JNK act ivator protein 1
  • AP-1 act ivator protein 1
  • ⁇ 12 is related to the immune system, and ⁇ 12 is known to overexpress in various tumors and promote transformation and proliferation.
  • ⁇ 12 is known to be associated with metastasis of various tumor cells, and may be regarded as a kind of ongogene, but the exact mechanism of Tpl2 in renal cell carcinoma is not known yet.
  • the inventors of the present invention when knocking down TpI2 in renal cell carcinoma Caki-1 cells, inhibited cell proliferation, cell migration invasion and adhesion, and transplanted the ⁇ 12 knocked down Caki-1 cells into a mouse model.
  • the present invention was completed by confirming that tumor growth and metastasis to the lung are suppressed.
  • the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating renal cell carcinoma comprising an expression inhibitor or an activity inhibitor of Tpl2 as an active ingredient.
  • the present invention is to provide a method for preventing or treating renal cell cancer, comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of the composition.
  • the present invention is to provide a method for screening a prophylactic or therapeutic material for renal cell carcinoma comprising the step of measuring a change in the amount of expression of Tpl2 by treating the candidate with a biological sample. [Measures of problem]
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating renal cell carcinoma comprising ⁇ 12 expression inhibitor or activity inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating renal cell cancer, comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of the composition.
  • the present invention provides a method for screening a prophylactic or therapeutic material for renal cell carcinoma comprising the step of measuring a change in the amount of expression of ⁇ 12 by treating the candidate with a biological sample.
  • ⁇ 12 according to the present invention is inhibited in the expression or activity of renal cell carcinoma cells, the proliferation of cancer cells, anoikis resistance, cell adhesion, cell migration and invasion ability is inhibited, the expression of the Tpl2 When these suppressed renal cell carcinoma cells are transplanted into mice, tumor growth and metastasis to the lungs of the mouse are inhibited, and thus, ⁇ 12 expression or activity inhibitors can be usefully used for the prevention or treatment of renal cell carcinoma.
  • FIG. 1 is a diagram confirming the association between renal cell carcinoma and ⁇ 12 ( ⁇ : comparison of ⁇ 12 expression level in patients with various stages of renal cell carcinoma; shows the relationship between expression of ⁇ : ⁇ 12 and survival rate)
  • FIG. 2 is a diagram comparing the amount of Tpl2 expression of Caki-1-sh-T P 12 cells (shRNA transduced to Tpl2) and the control group using Western blot and quantitative RT-PCR (qRT—PCR). .
  • Figure 3 is a diagram confirming the growth of tumors when transplanted Caki- l-sh-Tpl2 cells to the mouse.
  • 4 is a diagram confirming metastasis to the lung when Caki-l-sh-Tpl2 cells are transplanted into mice.
  • 5 is a diagram confirming the effect on the cell signaling pathway of Tpl2 inhibition in Caki-l cells.
  • FIG. 6 is a diagram confirming the effect on the cell signaling pathway of Tpl2 inhibition when treated with IL- ⁇ Caki-l cells.
  • FIG. 7 is a diagram confirming the proliferative capacity of cells when Tpl2 is inhibited by shRNA in Caki-l cells.
  • FIG. 8 is a diagram confirming the proliferation capacity of the cell when treated with Tpl2 kinase inhibitor in Caki-l cells.
  • FIG. 9 is a diagram showing the change in cell cycle when Tpl2 is inhibited in Caki-1 cells.
  • FIG. 10 is a diagram confirming clonal formation ability when Tpl2 is inhibited by shRNA in Caki-l cells.
  • 11 is a diagram confirming the clonal formation ability when treated with Tpl2 kinase inhibitor in Caki-1 cells.
  • 13 is a diagram confirming the relationship between Tpl2 inhibition and cell adhesion in Caki-l cells.
  • Figure 14 is a diagram confirming the mobility of cells when Tpl2 is suppressed by shRNA in Caki-l cells using a wound healing assay.
  • Figure 15 is a diagram confirming the mobility of cells when treated with Tpl2 kinase inhibitor in Caki-l cells using the wound treatment assay.
  • FIG. 16 is a diagram illustrating the migration and invasion ability of cells when Tpl2 was inhibited by shRNA in Caki-l cells using a trans-well migration and invasion assay.
  • 17 is a diagram confirming the migration and infiltration capacity of cells when treated with Tpl2 kinase inhibitor in Caki ⁇ cells using a trans-well migration and infiltration assay.
  • 18 is a diagram confirming the proliferation capacity of cells when Tpl2 is inhibited in Caki-1 cells using two-dimensional culture.
  • 19 and 20 are diagrams showing the results of culturing Caki-1 cells in a three-dimensional culture system.
  • FIG. 22 shows the effect on CXCR4-mediated cell signaling pathways when Cpl-1 cells inhibited Tpl2 with shRNA and treated CXCL12.
  • FIG. 23 shows the effects on CXCR4-mediated cell signaling pathways when Tpl2 kinase inhibitors and CXCL12 were treated in Caki-1 cells.
  • FIG. 24 shows the migration and invasion of cells when CXCL12 is treated in Caki-1 cells with ⁇ 12 inhibition.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating renal cell carcinoma comprising an expression inhibitor or activity inhibitor of Tpl2 (tumor progression locus 2) as an active ingredient.
  • Inhibitors of expression of the Tpl2 protein of the present invention are antisense nucleotides, short hairpin RNAs (shRNAs), small interfering RNAs (siRNAs), and ribozymes that complementarily bind to mRNA of the ⁇ 12 gene. It may be at least one selected from the group consisting of, the activity inhibitor of the Tpl2 protein is a protein peptide that specifically inhibits the activity of ⁇ 12 or ⁇ 12 protein peptide, peptide mimetics, substrate analogs, aptamers, natural extracts And it is preferably one or more selected from the group consisting of antibodies, but is not limited thereto.
  • ⁇ 12 expression inhibitor or activity inhibitor used in the present invention inhibits tumor growth and metastasis to the lung by inhibiting the proliferation of neoplastic cancer, resistance to aikis, cell migration and invasive capacity.
  • antisense nucleotide refers to DNA or RNA containing nucleic acid sequences complementary to the sequence of a particular mRNA or to Derivatives, which bind to complementary sequences in mRNA, inhibit the translation of mRNA into proteins.
  • Antisense sequence refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to Tpl2 mRNA and capable of binding to Tpl2 mRNA, and that is responsible for the translation of Tpl2 mRNA, translocat ion, maturat ion, or any other overall biological function. May inhibit essential activity.
  • the antisense nucleic acid has a length of 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, and more preferably 10 to 40 bases.
  • the antisense nucleic acid can be modified at the position of one or more bases, sugars or backbones to enhance efficacy (De Mesmaeker et al. UrrOpin Struct Biol., 5 (3): 343-55 (1995)).
  • the nucleic acid backbone can be modified with phosphorothioate, phosphoroester, methylphosphonate, short chain alkyl, cycloalkyl, short chain heteroatomic, heterocyclic intersaccharide linkage, and the like.
  • antisense nucleic acids may include one or more substituted sugar moieties.
  • Antisense nucleic acids can include modified bases.
  • Modified bases include hypoxanthine, 6-methyladenine, 5-me pyrimidine (particularly 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytoic acid (HMC), glycosyl ⁇ C, gentobiosyl (2-amino) Adenine, 2-thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6-aminonucleosil) adenine, 2,6-dia Minopurine, etc.
  • the antisense nucleic acids of the invention can also be chemically bound to one or more moieties or conjugates that enhance the activity and cellular adsorption of the antisense nucleic acids.
  • the modified nucleic acids can increase the stability to nucleases and increase the binding affinity of antisense nucleic acids with target mRNAs.
  • Antisense oligonucleotides can be synthesized in vitro by conventional methods for administration in vivo or to allow antisense and nucleotide synthesis in vivo.
  • One example of antisense and nucleotide synthesis in vitro is the use of RNA polymerase I.
  • One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to allow the antisense RNA to be transcribed using vectors whose origin of the recognition site (MCS) is in the opposite direction.
  • MCS origin of the recognition site
  • Such antisense RNA is preferably such that a translation stop codon is present in the sequence so that it is not translated into the peptide sequence.
  • antisense oligonucleotides that can be used in the present invention can be readily prepared according to methods known in the art (Weiss, B. (ed.): Ant i sense 01 igodeoxynucleotides and Ant i sense RNA: Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997; Weiss, B., et al., Ant i sense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes.Cell.Mol.Life Sci., 55: 334-358 ( 1999). ⁇
  • the Tpl2 expression inhibitor of the invention is a shRNA or siRNA comprising a sequence complementary to the ⁇ 12 gene.
  • the Tpl2 expression inhibitor of the present invention comprises an shRNA comprising the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • shRNA small hairpin RNA or short hairpin RNA
  • shRNA refers to the sequence of RA which makes a robust hairpin turn, which can be used to silence gene expression via RNA interference.
  • shRNA uses a vector for cell introduction and mainly uses a U6 promoter capable of expressing shRNA. These vectors are always delivered to daughter cells, allowing gene silencing to be inherited.
  • the shRNA hairpin structure is broken down into siRNA, which is an intracellular machinery, and bound to an RNA-induced silencing complex. The complex described above binds to and degrades mRNA matched to siRNA bound thereto.
  • shRNA is transcribed by RNA polymerase III, and in mammalian cells shRNA production suggests that It can also cause interferon reactions, as if it were recognized as a virus attack and a defense was found.
  • shRNA can be used in plants and other systems and the U6 promoter is not necessary.
  • the CaMV (cauli flower mosaic virus) 35S promoter a traditional promoter with very strong continuous expression, can be used.
  • siRNA small interference RNA
  • siRNA refers to a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (W0 00/44895, W0 01/36646, W0 99/32619, W0 01 / 29058, W0 99/07409 and W0 00/44914.
  • siRNA is provided as an efficient gene knockdown method or gene therapy method because it can inhibit the expression of the target gene.
  • siRNA was first discovered in plants, worms, fruit flies and parasites, but has recently been applied to mammalian cell research by developing / using siRNA (Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).
  • the siRNA molecule of the present invention may have a structure in which the sense strand and the antisense strand are positioned opposite to each other to form a double chain.
  • the siRNA molecules of the present invention may have a single chain structure with self-complementary sense and antisense strands.
  • complementarity encompasses not only 100% complementarity but also incomplete complementarity, preferably 90% complementarity, more preferably 98% complementarity, and most preferably 100% complementarity. do. In the present specification, 100% complementarity is specifically described as completely complementary.
  • siRNAs are not limited to fully paired double-stranded RNA portions of RNA, but are paired by mismatches (bases not complementary), bulges (no bases on one chain), and the like. May be included.
  • the total length is 10 to 100 bases, preferably 15 to 80 bases, even more preferably 20 to 70 bases.
  • the siRNA is composed of a 15 to 30 mer sense sequence selected from the base sequence of the mRNA of the gene encoding the Tpl2 protein and an antisense sequence complementary to the sense sequence, wherein the sense sequence is Although not limited to this in particular, it is preferable that it consists of 25 bases.
  • the siRNA terminal structure can be either blunt or cohesive, as long as the expression of the Tpl2 gene can be inhibited by the RNAi effect.
  • the siRNA molecules of the present invention may have a form in which a short nucleotide sequence (eg, about 5-15 nt) is inserted between the self-complementary sense and antisense strands, in which case the siRNA molecule formed by expression of the nucleotide sequence is a molecule
  • the hairpin structure is formed by the internalization, and the stem-and-loop structure is formed as a whole. This stem-and-loop structure is processed in vitro or in vivo to produce an active siRNA molecule capable of mediating RNAi.
  • the siRNA of the present invention has a sequence included in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • RNAKRNA interference molecules that specifically bind to the Tpl2 gene, which is an active ingredient of the composition of the present invention, are inserted into a gene carrier.
  • the gene carrier of the present invention is a plasmid, recombinant adenovirus (Thi ⁇ appaya, B. et al., Cell, 31: 543-551 (1982); and Riordan, JR et al., Science, 245: 1066—1073 (1989)), adeno-associated viruses (AAV) (LaFace et al, Viology, 162: 483486 (1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY) , 21: 928-933 (1993), Walsh et al, J. CI in.
  • AAV adeno-associated viruses
  • antisense nucleotide refers to DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to a sequence of a particular mRNA, and binds to a complementary sequence in the mRNA to translate the mRNA into a protein. It acts to inhibit.
  • Antisense and nucleotide sequences of the invention refers to DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to a sequence of a particular mRNA, and binds to a complementary sequence in the mRNA to translate the mRNA into a protein. It acts to inhibit.
  • the antisense nucleic acid has a length of 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, and more preferably 10 to 40 bases.
  • the antisense oligonucleotides may be modified at one or more base, sugar or backbone positions to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr0pinStruct Biol., 5 (3): 343-55 (1995)).
  • Nucleic acid backbones can be modified with phosphorothioates, phosphoroesters, methylphosphonates, short chain alkyls, cycloalkyls, short chain heteroatomics, heterocyclic sugar linkages, and the like.
  • antisense nucleic acids may include one or more substituted sugar moieties.
  • Antisense nucleic acids can include modified bases.
  • Modified bases include hypoxanthine, 6-methyladenine, 5-tne pyrimidine (particularly 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, gentobiosil HMC, 2-aminoadenine, 2 —Thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5—hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6-aminonucleosil) adenine, 2,6-diaminopurine, etc. There is this.
  • the antisense oligonucleotides of the present invention may be chemically bound to one or more moieties or conjugates that enhance the activity and cellular adsorption of the antisense oligonucleotides.
  • Oligonucleotides comprising fat-soluble moieties and methods of preparation are already well known in the art (US Pat. Nos. 5,138,045, 5,218,105 and 5,459,255).
  • the modified oligonucleotides may increase stability to nucleases and increase binding affinity of antisense nucleic acids with target mRNAs.
  • antisense oligonucleotides it can be synthesized in vitro by conventional methods for administration in vivo or for antisense oligonucleotides to be synthesized in vivo.
  • One example of synthesizing antisense oligonucleotides in vitro is using RNA polymerase I.
  • antisense RNA is synthesized in vivo.
  • MCS origin of the recognition site
  • antisense RNA allows for the presence of a translational stop codon within the sequence. It is desirable to avoid translation.
  • the antisense nucleotides as defined by the Watson-Crick base pair, bind (combine) to the complementary sequences of DNA, immature -mRNA, or mature mRNA to disrupt the flow of genetic information as DNA in the protein. It is.
  • the nature of antisensenucleotides specific for the target sequence makes them exceptionally multifunctional. Since antisensenucleotides are long chains of monomeric units they can be easily synthesized for the target RNA sequence. Many recent studies have demonstrated the utility of antisensenucleotides as biochemical means for studying target proteins (Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81: 1539-1544, 1999).
  • antisensenucleotides can be considered as a new type of inhibitor because of recent advances in the field of nucleotide synthesis that exhibit oligonucleotide chemistry and improved cell adsorption, target binding affinity and nuclease resistance.
  • the inhibitor of Tpl2 protein is a protein that inhibits the activity of ⁇ 12 or a compound, a peptide, a peptide mimetic, a substrate analog, an aptame natural extract or an antibody that specifically binds to a ⁇ 12 protein.
  • the antibody having the activity of specifically binding to the ⁇ 12 protein that can be used in the present invention is a polyclonal or monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • Antibodies to ⁇ 12 protein may be prepared by methods commonly practiced in the art, such as fusion methods (Kohler and Milstein, European Journal of I of unology, 6: 511—519 (1976)), recombinant DNA methods (US patents). 4,816,56) or phage antibody library method (Clackson et al, Nature 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991). General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E.
  • Peptides capable of specifically binding to Tpl2 and inhibiting the activity of ⁇ 12 can be obtained by conventional methods known in the art, for example, by phage display (Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface ".Science 228 (4705): 13151317 (1985); Smith GP, Petrenko VA,” Phage display ". Chem. Rev. 97 (2): 391410 (1997)).
  • the protein that specifically inhibits the activity of Tpl2 or a compound that specifically binds to Tpl2 is preferably a ⁇ 12 kinase inhibitor, and more preferably, 4- (3—chloro-4-fluorophenylamino) -6- ( Pyridin-3-yl-methylamino) -3-cyano-1,7-naphthyridine, 8-bromo-4- (3-chloro-4-holurophenylamino) —6— [(1—methyl -1 ⁇ -imidazol-4-yl) methylamino] quinoline-3-carbonitrile), 4- (cycloheptylamino) -6- (pyridin-3-yl-methylamino) -3-cyano- [1 , 7] -naphthyridine, [1,7] nathithyridine-3-carbonitrile and quinoline-3-carbonitrile.
  • the peptide mimetics inhibit the activity of ⁇ 12 protein by inhibiting the binding domain of Tpl2 protein.
  • Peptide mimetics may be peptides or non-peptides and may be incorporated by non-peptide bonds, such as psi bonds (Benkirane, N., et al. J. Biol. Chem., 271: 33218-33224, 1996). It may consist of bound amino acids.
  • a "conformational ly constrained" peptide, a cyclic mimetics, at least one exocyclic domain, a binding moiety (binding amino acid) and an active site It may be a click mimic.
  • Peptide mimetics are structured similar to the secondary structural properties of UBAP2 (Ubiqui n-Associated Protein 2) proteins and are antibodies (Park, BW et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) or water soluble receptors (Takasaki,. Et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997), which can mimic the inhibitory properties of large molecules and may be novel small molecules that can act as an equivalent to natural antagonists (Wrighton, NC et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).
  • the aptamer is a single-stranded DNA or RNA molecule that is attached to a specific chemical or biological molecule by an evolutionary method using an oligonucleotide library called systemat ic evolution of 1gands by exponential enrichment (SELEX).
  • Loliomers that bind with high affinity and selectivity can be obtained by separating (C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505-510, 2005; AD Ellington and JW Szostak, Nature 346, 818-822, 1990; M. Famulok, et.al., Acc. Chem. 'Res. 33, 591-599, 2000; DS Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611-647, 1999).
  • the antibody is specific and direct binding to Tpl2 can effectively inhibit the activity of ⁇ 12. It is preferable to use a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as the antibody specifically binding to ⁇ 12.
  • the antibody specifically binding to Tpl2 may be prepared by a known method known to those skilled in the art, and commercially known ⁇ 12 antibody may be purchased and used.
  • the antibody can be prepared by injecting a ⁇ 12 protein, an immunogen, into an external host according to conventional methods known to those skilled in the art. External hosts include mammals such as mice, rats, sheep and rabbits. Immunogens are injected intramuscularly, intraperitoneally or subcutaneously, usually with an adjuvant to increase antigenicity May be administered.
  • Antibodies can be isolated by collecting blood from an external host at regular intervals and collecting serum showing specificity for antigens and antigens formed.
  • the inhibitor of the expression or activity of Tpl2 according to the present invention exhibits an excellent effect of inhibiting the expression or activity of ⁇ 12 and can be usefully used for the prevention or treatment of renal cell carcinoma.
  • composition of the present invention may contain one or more known active ingredients having the effect of inhibiting the expression or activity of ⁇ 12.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to a desired method, and the dosage may be weight, age, sex, The range varies depending on the state of health, diet, administration time, administration method, administration period or interval, excretion rate, constitution specificity, and the nature of the preparation.
  • the daily dosage of the ⁇ 12 expression or activity inhibitor of the present invention is about 0.001 to 1000 mg / kg, preferably about
  • It may be 0.1 ⁇ 500mg / kg but it may be added or subtracted according to the clinical test results, and it is preferable to administer it once or several times a day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in various formulations for administration, and may be formulated in various forms by addition of excipients.
  • the excipients are nontoxic and inert pharmaceutically suitable solid, semisolid or liquid formulation aids of all types, for example fillers, weights, binders, wetting agents, disintegrants, dispersants, surfactants or diluents, etc. Can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in dosage unit form.
  • the formulated dosage unit may comprise 1, 2, 3 or 4 times, or 1/2, 1/3 or 1/4 times the daily individual dosage of the active compound.
  • Preferably said individual dosage contains an amount in which the active compound is administered at one time, which usually corresponds to the total, 1/2, 1/3 or 1/4 times the daily dose.
  • compositions of the present invention may be formulated as tablets, coated tablets, capsules, pills, granules, suppositories, solutions, suspensions and emulsions, pastes, ointments, gels, creams, lotions, powders or sprays. Can be converted.
  • the present invention provides a method for preventing or treating renal cell cancer, comprising the step of administering to a subject a therapeutically effective amount of the composition.
  • the method of treatment of the present invention includes administering an anticancer composition of the present invention in a therapeutically effective amount.
  • a suitable total daily dose may be determined by treatment within the correct medical judgment.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient may be based on the specific composition, including the type and extent of reaction desired to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, body weight, general health status, gender and diet, time of administration, administration of the patient. It is desirable to apply differently depending on the various factors and similar factors well known in the medical field, including the route and the rate of release of the composition, the duration of treatment, and the drugs used with or concurrent with the specific composition. Therefore, the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the above matters.
  • the anticancer effect can be enhanced by concurrently administering a known anticancer agent together with the composition of the present invention.
  • the present invention is applicable to any mammal having cancer expressing Tpl2, and mammals include humans and primates, as well as domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs and cats.
  • the present invention is applicable to any mammal having cancer expressing Tpl2, and mammals include humans and primates, as well as domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs and cats.
  • step 2) measuring the change in the amount of mRNA or protein expression of ⁇ 12 in the biological sample of step 1) provides a method for screening a prophylactic or therapeutic material for renal cell cancer.
  • the sample includes, but is not limited to, blood, urine, saliva, tissue of an animal with cancer.
  • the method for measuring the mRNA expression change of Tpl2 is reverse transcriptase (RT-PCR), competitive reverse transcriptase reaction (Competitive RT-PCR), real time reverse transcriptase reaction (Real time RT-PCR), RNase protection assay (RPA; RNase protection assay, Northern blotting and DNA chips.
  • RT-PCR reverse transcriptase
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcriptase reaction
  • Real time RT-PCR real time reverse transcriptase reaction
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • Northern blotting and DNA chips.
  • the method of measuring the change in the expression level of the Tpl2 protein is Western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RI A), radioimmunoassay (radioi , unodi f fusion), oukteroni ( Ouchterkmy) Immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) and protein chip ).
  • RI A radioimmunoassay
  • radioimmunoassay radioimmunoassay
  • radioi i radioimmunoassay
  • oukteroni Ouchterkmy
  • Immunodiffusion rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) and protein chip ).
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sort
  • step (a) measuring the expression or activity of Tpl2 from a biological sample;
  • step (b) As a step of analyzing the measurement result of step (a), it is determined that the expression or activity of Tpl2 is higher than that of the normal control sample, and the risk of renal cell cancer is increased.
  • diagnosis refers to determining an object's susceptibility (311 ⁇ 6 ⁇ ) to a particular disease or condition, determining whether an object currently has a particular disease or condition, a particular disease Or determining the prognosis of one subject with the disease, or therametrics (eg, monitoring the condition of the subject to provide information about treatment efficacy).
  • the term "(expression or activity of Tpl2) increased” means that the expression amount or activity of ⁇ 12 is measurably increased in comparison with healthy people, and preferably, it is increased by 70% or more, More preferably 30% or more.
  • the expression level of ⁇ 12 gene in biological samples can be determined by identifying mRNA or its protein amount.
  • the process of separating mRNA and protein from biological samples can be performed using a known process, and the amount of mRNA and protein can be varied.
  • the term "biological sample” includes body fluids, such as urine, saliva, blood, plasma, serum, etc., which can be simply collected to detect the difference between the mRNA level of Tpl2 gene or its protein.
  • mRNA level measurement 1 is used to determine the mRNA presence and expression of Tpl2 genes in biological samples to detect Tpl2 genes.
  • RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay, Northern blotting and DNA chips are available, but are not limited to these.
  • mRNA expression in normal control group and mRNA expression in patients with suspected renal cell carcinoma can be compared, and the actual renal cells of cardiac patients with renal cell carcinoma were judged by increasing the significant expression of Tpl2 gene to mRNA. Can diagnose whether cancer is invented.
  • Each primer pair specific for the Tpl2 gene is used to measure mRNA levels by RT-PCR.
  • a primer is a nucleotide having a sequence specific for the nucleic acid sequence of each marker gene, about 7 to 50 bp in length, more preferably about 10 to 30 bp in length. It may also contain primers specific for the nucleic acid sequence of the control gene.
  • Other RT-PCR kits include test tubes or other suitable containers, reaction supernatants, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitor DEPC water (DEPC water), sterile water, etc. May contain
  • a "primer” is a nucleic acid sequence with a short 3 'hydroxyl group, meaning a short nucleic acid sequence that can form complementary template and base pairs and that serves as a starting point for copying the template strand.
  • Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization reaction and four different nucleoside triphosphates at the appropriate complete solution and temperature. Primers can incorporate additional features that do not change the basic properties of the primer, which acts as a starting point for DNA synthesis. Primers can be chemically synthesized using phosphoramidite solid support methods or other well known methods. These nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art.
  • Protein level measurement refers to the presence and expression of proteins expressed in the Tpl2 gene in a biological sample. Preferably, the amount of protein is determined using an antibody that specifically binds to the protein of the gene. Check it.
  • Antibody refers to specific protein molecules that are directed against antigenic sites. Antibodies for the purpose of the present invention refer to antibodies that specifically bind to ⁇ 12 renal cell carcinoma marker protein and include all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies.
  • Analytical methods for measuring protein levels using antibodies include Western blots, Enzyme linked immunosorbent assay (EL ISA), Radioimmunoassay (RIA), Radioimmunoassay (Radioi ⁇ unodi f fusion), Ouchter lony immunodiffusion method, Rocket Immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitat ion, complementation assay, FACS, protein chip, etc., but are not limited to the methods described.
  • EL ISA Enzyme linked immunosorbent assay
  • RIA Radioimmunoassay
  • Radioi ⁇ unodi f fusion Radioimmunoassay
  • Ouchter lony immunodiffusion method Rocket Immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitat ion, complementation assay, FACS, protein chip, etc.
  • Tpl2 protein By judging whether Tpl2 protein has a significant increase in expression, it is possible to diagnose the actual renal cell carcinoma of patients with renal cell carcinoma.
  • antigen-antibody complex refers to the combination of ⁇ 12 protein and its specific antibody, and the amount of antigen-antibody complex formation can be quantitatively determined by the signal size of the detection label.
  • the detection label can be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but not limited to those listed above.
  • Fluorescent materials include fluorescein, phycocyanin and fluorescarmine, but are not limited to those listed above.
  • Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives.
  • Luminescent materials include, but are not limited to, luciferin.
  • Microparticles include, but are not limited to colloidal gold.
  • Redox molecules include, but are not limited to, quinones, 1,4 4-benzoquinone hydroquinone, and the like. Radioisotopes include, but are not limited to, 3H and 14C.
  • Protein expression level measurement is preferably using an ELISA.
  • ELISA includes a direct sandwich ELISA using another antibody labeled with an antibody attached to a solid support and an antibody labeled with an antigen, and another antibody that recognizes an antigen with a complex of antibodies and antigens attached to a solid support.
  • Various ELISA methods are included, including indirect sandwich ELISA using labeled secondary antibodies that recognize the antibody.
  • the antibody is attached to a solid support and the sample is reacted, followed by enzymatic coloration by attaching a labeled antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex, or against an antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex.
  • the secondary antibody is attached and detected by a sandwich ELISA method which enzymatically develops color.
  • Renal Cell Carcinogenesis by Checking the Complex Formation of Tp 12 Renal Cell Cancer Marker Protein and Antibody.
  • one or more antibodies to Tp 12 can be arranged in a substrate-positioned, high-density protein chip.
  • the analysis of samples using protein chips involves separating proteins from samples, and hybridizing them with protein chips to form antigen-antibody complexes and to read them for protein presence.
  • the degree of expression can be checked whether renal cell carcinoma is developed.
  • Another way is to perform western blotting with antibodies against Tpl2. Isolate the whole protein from the sample,
  • the present invention provides a kit for diagnosing renal cell cancer, comprising an antibody or uptamer that specifically binds to ⁇ 12.
  • the kit for diagnosing renal cell cancer of the present invention is a kit for immunoassay.
  • the expression pattern of ⁇ 12 was confirmed.
  • the mRNA sequence data of TCGA http://cancergenome.nih.gov) was used to compare the clinical results and expression of Tpl2 in 936 RCC patients. The results are shown in FIG. 1.
  • ⁇ 12 of the present invention is involved in the progression of renal cell carcinoma.
  • Caki-1 Cells Expressing shRNA Inhibiting 1 ⁇ ⁇ 12 Caki-1 cells a human RCC cell line, were obtained from American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va, USA. The cells were treated with RPMI 1640 medium (Gibco, Grand Island, NY, USA) to which 10% fetal bovine serum (FBS / RPMI, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was added, containing 5% CO 2 at 37 ° C. Were incubated in a dried incubator. The method described in Huynh H, Ong RW, Li PY, et al.
  • Caki-1 cells expressing non-targeted shRNA by transducing sh-Tpl2 (SEQ ID NO: 1 sequence) or untargeted shRNA (SEQ ID NO: 2 sequence) using a rental virus vector (hereafter caki) Caki-1 cells expressing sh-T l2 (hereinafter referred to as caki-1-sh-Tpl2) were constructed.
  • the transduced cells were selected by treatment with puromycin 2yg / i, Gibco) for 48 hours and used in the following experiments. 2.
  • qRT-PCR was performed as follows. The cells were extracted using RNeasy kit (Qiagen, Hi 1 den, Germany). After that, Superscript ⁇ . RT-PCR was performed using First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen), and qPCR was performed on the cDNA obtained by RT PCR using SYBR Green PCR Master Mix and primers of Tpl2 in Table 1 below.
  • Knockdown efficacy was verified using qRT-PCR and Western blot analysis, which is shown in FIG. 2.
  • similarities of lung nodules were counted with or without a microscope.
  • the extracted organs were fixed in paraffin and stained with hematoxylin and eosin (H & E) to confirm the presence of tumors or tumors that have metastasized to lung cancer.
  • Tpl2 is very important in the tumor formation and progression of RCC.
  • the primary function of ⁇ 12 was to counteract interleukin-1 stimulation, measuring the phosphorylation of MAPK, including ERK, JN and p38, by activating the ⁇ downstream. It was.
  • caki-l-sh-Con after treatment with a Tpl2 inhibitor in caki-l-sh-Con, caki-l-sh-Tpl2 cells or normal Caki-1 cells, anti-ERK, anti-p-ERK, anti p-JNK, anti - Western blots were performed as in Example 2 using JNK, anti-P38 and anti-P-P38, anti-GAPDH and anti-a-tubulin antibodies.
  • the Western blot results are shown in FIG. 5, and after the 100 ng / ml IL- ⁇ treatment, the Western blot results are shown in FIG. 6.
  • caki-l-sh-Tpl2 or caki-1-sh—Con cells were seeded in 96-well plates at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml with 10% FBS / RPMI of 100L. Thereafter, cell viability after 1 hour, 24 hours, 48 hours or 72 hours was determined using the EZ-Cytox cell viability assay kit (Daeil Lab Service, Seoul, Korea) according to the manufacturer's manual.
  • FIG. 7 caki-l-sh-Tpl2
  • FIG. 8 Tpl2 kinase inhibitor treatment
  • caki-l-sh-Con caki-l-sh-Con
  • caki-l-sh-Tpl2 cells were seeded in 6-well plates at 300 cell / well and 10% of FBS / RPMI with Tpl2 kinase inhibitor ( ⁇ , 2.5 ⁇ or 5 ⁇ ) wells The plates were treated for 3 weeks. After staining with 0.2% crystal violet, the number of surviving clonies per well was calculated. The results are shown in Figure 10 (caki-l-sh-Con cells and caki-1-sh- Tpl2 cells) and Figure 11 ( ⁇ 12 kinase inhibitor treatment).
  • each well in a 96-well plate was subjected to 10yg / mL of fibronectin (Millipore, Billerica, MA, USA) was coated and inoculated with 1 ⁇ 10 5 of caki-1-sh-Con or caki-l_sh-Tpl2 cells and incubated for 1 hour. Washed three times with PBS to remove unattached cells. Attached cells were stained with 0.1% crystal violet, lysed using 2% SDS (150yL / well), and absorbance was measured at 550 nm. The results are shown in FIG. 13.
  • RCC cells are involved in cell cycle progression, cell proliferation, cloniogenesis, anocitic resistance and adhesion.
  • caki-l-sh-Tpl2 caki-1-sh-Con cells or normal Caki-1 cells were cultured in 24-well plates containing 10% FBS / RPMI. Wounds were made using a pipette tip of 20 on a confluent cell monolayer. The width of the wound line was confirmed by taking pictures for 24 hours. The results are shown in FIGS. 14 and 15 (when Tpl2 kinase inhibitor is administered).
  • 3D culture is Eiraku M, Takata N, Ishibashi H, et al. Self-organizing optics cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature 2011; 472: 51-6. Briefly, caki-1-sh-Con or Caki-l-sh_Tpl2 cells (2x103 cell Ave 11) were cultured in lipid-based low-cell-celled 96-well plates in 10% FBS / RPMI (Lipidure, NF Corporation, Tokyo, Japan). Afterwards, spheroid formation was observed after 0, 1, 3, 6 and 9 days, and the spheres were separated into single cells using Accumax stratum solution (Mi 11 ipore).
  • Tpl2 silencing had no significant effect on Caki-1 cell proliferation in the two-dimensional culture system.
  • caki-1-sh-Con cells and caki-l-sh-Tpl2 cells formed spheres without branching structures in the three-dimensional culture system. Afterwards, it was confirmed that caki-1-sh-Con cells were sequentially changed in morphology, formed a radial structure, or detached cells in the sphere.
  • caki-l-sh-Tpl2 cells were found to have little detachment of cells from the spheres and delayed detachment.
  • the increase of ERK activity induces secondary spherical formation, and it was confirmed that secondary spherical formation was suppressed by inhibiting the ERK activity.

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Abstract

본 발명은 Tpl2의 발현억제제 또는 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 신장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Tpl2가 신세포암 세포에서 발현 또는 활성을 저해되는 경우, 암세포의 증식, 아노이키스 저항성(anoikis resistance), 세포부착능, 세포의 이동능 및 침윤능력이 저해되고, 상기 Tpl2의 발현이 억제된 신세포암 세포를 마우스에 이식한 경우, 마우스의 신장에서 종양 성장 및 폐로의 전이가 억제됨으로써, Tpl2 발현 또는 활성 억제제는신세포암에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
TP12 의 발현억제제 또는 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 신세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
【기술분야】
본 발명은 대한민국 보건복지부의 지원 하에서 과제번호 HI12C-0388- 020013에 의해 이루어진 것으로서， 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국보건산업진흥원， 연구사업명은 "보건의료기술연구개발사업" , 연구과제명은 "난치성뇌암에 대한 유전자 재조합 자가 중간엽줄기세포의 임상적용을 위한 최종 단계의 전임상연구" ， 주관기관은 서울대학교산학협력단, 연구기간은 2012.08.01 ~ 2014.07.31이다.
본 발명은 대한민국 보건복지부의 지원 하에서 과제번호 HI09C1552에 의해 이루어진 것으로서,상기 ' 과제의 연구관리전문기관은 한국보건산업진홍원， 연구사업명은 "보건의료기술연구개발사업" ， 연구과제명은 "선도형 난치암연구사업단" ， 주관기관은 삼성서울병원， 연구기간은 2013.12.01 ~ 2014.11.30이다.
본 특허출원은 2013 년 6 월 21 일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2013-0071735 호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 Τρ12 의 발현억제제 또는 활성억제제를 유효성분으로' 포함하는 신 세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
【발명의 배경이 되는 기술】
신세포암 (Renal cell carcinoma; RCC)은 신장암 중 가장 일반적인 암으로， 최근 30 년 동안 발병률과 사망률이 꾸준히 증가하고 있다. 신세포암은 미국에서는 성인암의 3%를 차지하며 , 연간 약 32000 명 정도의 새로운 환자가 발생하고 약 12000 명 정도가 신세포암으로 인해 사망하는 것으로 추정되고 있으며 전 세계적으로 매년 그 발생빈도가 증가하고 있다. 우리나라의 경우 2002 년 중앙암등록 자료에 따르면， 1，587 명의 환자가 새로 등록되어 전체 암발생의 1.6¾>를 차지하고 있습니다. 특히 남성이 여성에 비해 2 배 정도 많이 발생하는데， 2002 년에 남성에서 1104 명의 환자가 발생하여 남성암의장기별 등록분율 2.0%로 열 번째로 많이 발생하는 암이다. 현재까지 알려진 신세포암의 치료방법은 암의 진행정도와 환자의 연령， 전신상태， 동반된 다른 질환의 유무 등에 따라 결정되는데， 일반적으로 방사선치료나 항암화학요법에 잘 반웅하지 않아 현재로는 수술로 암을 제거하는 것이 최선이나， 출혈， 감염， 수술 후 통증과 함께 장폐색， 기흉， 색전증 등의 부작용이 발생될 수 있다. 면역화학요법 시행시에도면역억제제에 대한 과민반웅, 오한 및 발열, 오심 및 구토， 전신 쇠약감， 식욕부진， 두통， 빈혈， 백혈구감소증 등이 발생될 수 있다.
한편, Tpl2(tumor progression locus 2)는 MAPK 및 JNK(c-Jim N- terminal Kinase) 경로를 자극하는 유일한 MAP3K8(mi togen activated protein kinase kinase kinase)이며， AP-l(act ivator protein 1)및 NF— Κ β를 상향 조절한다. 상기 Τρ12 는 면역 시스템과 관련이 있음이 밝혀졌으며， Τρ12 는 다양한 종양에서 과발현되고， 형질전환 및 증식을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, Τρ12 는 다양한 종양 세포의 전이랑 관련이 있는 것으로 알려져 있어， 종양 형성 유전자 (ongogene)의 일종으로 간주될 수 있으나， 신세포 암에서 Tpl2 의 정확한 기작은 아직 알려진 바가 없다.
이에 본 발명자들은 신세포 암세포인 Caki-1 세포에서 TpI2를 넉다운 시킨 경우， 세포의 증식, 세포의 이동능력 침윤능 및 부착능이 저해되고， 상기 Τρ12 가 넉다운된 Caki-1 세포를 마우스 모델에 이식하는 경우， 종양 성장 및 폐로의 전이가 억제됨을 확인함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
【발명의 내용】
【해결하고자 하는 과제】
본 발명은 Tpl2 의 발현억제제 또는 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 신세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다. 또한， 본 발명은 상기 조성물의 치료적 유효량을 개체에 투여하는단계를 포함하는， 신세포암의 예방 또는 치료 방법을 제공하고자 한다. 또한, 본 발명은 후보물질을 생물학적 시료에 처리하여 Tpl2 의 발현양 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 신세포암의 예방 또는 치료물질의 스크리닝방법을 제공하고자 한다. 【과제의 해결 수단】
본 발명은 Τρ12 의 발현억제제 또는 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 신세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물의 치료적 유효량을 개체에 투여하는단계를 포함하는, 신세포암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 후보물질을 생물학적 시료에 처리하여 Τρ12 의 발현양 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 신세포암의 예방 또는 치료물질의 스크리닝방법을 제공한다.
[발명의 효과]
본 발명에 따른 Τρ12 가 신세포암 세포에서 발현 또는 활성이 저해되는 경우, 암세포의 증식， 아노이키스 저항성 (anoikis resistance), 세포부착능， 세포의 이동능 및 침윤능력이 저해되고， 상기 Tpl2 의 발현이 억제된 신세포암 세포를 마우스에 이식한 경우, 마우스의 신장에서 종양 성장 및 폐로의 전이가 억제됨으로써, Τρ12 발현 또는 활성 억제제가 신세포암에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 신세포암과 Τρ12 의 연관성을 확인한 도이다 (Α:다양한 단계의 신세포암 환자에서 Τρ12 발현 수준 비교; Β:Τρ12 의 발현과 생존률 관계를 나타냄)
도 2 는 웨스턴 블롯 및 정량적 RT-PCR(qRT— PCR)을 이용하여 Caki-1- sh-TP12 세포 (Tpl2 에 대한 shRNA 가 형질도입된 세포)와 대조군의 Tpl2 발현양을 비교한 도이다.
도 3는 Caki— l-sh-Tpl2 세포를 마우스에 이식한 경우, 종양의 성장을 확인한 도이다. 도 4는 Caki-l-sh-Tpl2 세포를 마우스에 이식한 경우， 폐로의 전이를 확인한 도이다.
도 5 는 Caki-l 세포에서 Tpl2 억제의 세포 신호 경로에 대한 영향을 확인한 도이다.
도 6은 IL-Ιβ를 Caki-l 세포에 처리한 경우, Tpl2 억제의 세포 신호 경로에 대한 영향을 확인한 도이다.
도 7 은 Caki-l 세포에서 shRNA 로 Tpl2 를 억제한 경우， 세포의 증식능을 확인한 도이다.
도 8은 Caki-l 세포에서 Tpl2 키나아제억제제를 처리한 경우， 세포의 증식능을 확인한 도이다.
도 9 는 Caki— 1 세포에서 Tpl2 를 억제한 경우, 세포 주기의 변화를 나타난 도이다.
도 10 은 Caki-l 세포에서 shRNA 로 Tpl2 를 억제한 경우， 클로니형성능을 확인한 도이다.
도 11 은 Caki-l 세포에서 Tpl2 키나아제억제제를 처리한 경우， 클로니형성능을 확인한 도이다.
도 12는 Caki-l 세포에서 Tpl2 억제와 아노이키스 저항성과 관련성을 확인한 도이다.
도 13 은 Caki-l 세포에서 Tpl2 억제와 세포 부착증과의 관련성을 확인한 도이다.
도 14 는 상처 치료 어세이 (Wound healing assay)를 이용한 Caki-l 세포에서 shRNA로 Tpl2를 억제한 경우， 세포의 이동능을 확인한 도이다. 도 15 는 상처 치료 어세이를 이용한 Caki-l 세포에서 Tpl2 키나아제억제제를 처리한 경우， 세포의 이동능을 확인한 도이다.
도 16 은 트랜스-웰 이동 및 침윤 어세이 (Trans-well migration and invasion assay)를 이용한 Caki-l 세포에서 shRNA 로 Tpl2 를 억제한 경우， 세포의 이동 및 침윤능을 확인한 도이다.
도 17 은 트랜스—웰 이동 및 침윤 어세이를 이용한 Cakiᅳ세포에서 Tpl2 키나아제억제제를 처리한 경우， 세포의 이동 및 침윤능을 확인한 도이다. 도 18은 2차원 배양을 이용한 Caki-1 세포에서 Tpl2를 억제한 경우， 세포의 증식능을 확인한 도이다.
도 19 및 도 20 은 3 차원 배양 시스템에서 Caki-1 세포의 배양 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 3차원 배양 시스템에서 Caki-1 세포의 Tpl2가 억제된 경우,
ERK 활성의 정도를 확인한 도이다.
도 22 는 Caki-1 세포에서 shRNA 로 Tpl2 를 억제하고 CXCL12 를 처리한 경우， CXCR4 매개 세포 신호 경로에 대한 영향올 확인한 도이다. 도 23 은 Caki-1 세포에서 Tpl2 키나아제억제제 및 CXCL12 를 처리한 경우， CXCR4 매개 세포 신호 경로에 대한 영향을 확인한 도이다.
도 24 는 Τρ12 가 억제된 Caki-1 세포에 CXCL12 를 처리한 경우, 세포의 이동 및 침윤능을 확인한 도이다.
【발명을 실시하가 위한 구체적인 내용】
본 발명은 Tpl2(tumor progression locus 2)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 신세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하， 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 Tpl2 단백질의 발현 억제제는 Τρ12 유전자의 mRNA 에 상보적으로 결합하는 안티센스뉴클레오티드， 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) , 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 리보자임 (ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상 일 수 있고， 상기 Tpl2 단백질의 활성 억제제는 Τρ12 의 활성을 ^억제하는 단백질 또는 Τρ12 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물 펩티드， 펩티드 모방체， 기질유사체, 앱타머， 천연추출물 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용되는 Τρ12 발현억제제 또는 활성억제제는신세포암의 증식， 아노이키스 저항성， 세포부착능 세포의 이동능 및 침윤능력을 저해시킴으로써 종양의 성장 및 폐로의 전이를 억제한다.
본 명세서에서 용어 "안티센스뉴클레오타이드" 란 특정 mRNA 의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고， mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA 의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 서열은 Tpl2 mRNA 에 상보적이고 Tpl2 mRNA 에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고， Tpl2 mRNA 의 번역， 세포질내로의 전위 (translocat ion)， 성숙 (maturat ion) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고， 바람직하게는 8 내지 60 염기이고， 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.
상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격 (backbone)의 위치에서 변형될 수 있다 (De Mesmaeker et al. urrOpinStruct Biol., 5(3) :343-55(1995)) . 핵산 골격은 포스포로티오에이트， 포스포트리에스테르， 메틸포스포네이트， 단쇄알킬, 시클로알킬， 단쇄헤테로아토믹， 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한， 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티 (sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴， 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘 (특히 5-메틸시토신)， 5-하이드록시메틸시토산 (HMC), 글리코실 匪 C, 젠토비오실 丽 (， 2-아미노아데닌， 2-티오우라실， 2-티오티민， 5-브로모우라실， 5- 하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌， N6 (6- 아미노핵실)아데닌， 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성올 향상시키는 하나 이상의 모이어티 (moiety) 또는 컨쥬게이트 (conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테를 모이어티， 콜레스테릴모이어티， 콜릭산， 티오에테르， 티오콜레스테를， 지방성 사슬， 인지질， 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬， 아다맨탄 아세트산, 팔미틸모이어티， 옥타데실아민, 핵실아미노-카르보닐 -옥시콜에스테를모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 ¾고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 을리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다 (미국특허 제 5,138,045호, 제 5，218，105호 및 제 5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다. 안티센스올리고뉴클레오타이드의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스을리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다 . 시험관에서 안티센스을리고뉴클레오타이드를 합성하는 한 예는 RNA 중합효소 I 를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA 가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위 (MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 백터를 사용하여 안티센스 RNA 가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA 는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스을리고뉴클레오타이드의 디자인은 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다 (Weiss, B. (ed.): Ant i sense 01 igodeoxynucleot ides and Ant i sense RNA ： Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press , Boca Raton, FL, 1997； Weiss, B. , et al . , Ant i sense RNA gene therapy for studying and modulat ing biological processes. Cell. Mol . Life Sci .， 55： 334- 358(1999). ■
본 발명의 일구현예에따르면， 본 발명의 Tpl2 발현억제제는 Τρ12 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 shRNA또는 siRNA이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면， 본 발명의 Tpl2 발현억제제는 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 shRNA 를 포함한다.
본 발명에서 용어 "shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)" 는 견고한 해어핀 턴을 만드는 R A 의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 사일런스시키는 데 이용될 수 있다. shRNA 는 세포 도입용 백터를 이용하며 shRNA 를 발현할 수 있는 U6 프로모터를 주로 이용한다. 이러한 백터는 항상 딸세포로 전달되어 유전자 사일런싱이 유전될 수 있도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작 (machinery)인 siRNA 로 분해되어 RNAᅳ유도 사일런싱 복합체 (RNA- induced silencing complex)에 결합된다. 상술한 복합체는 이에 결합된 siRNA 에 상웅하는 (matched) mRNA 에 결합하여 분해시킨다. shRNA 는 RNA 폴리머라제 III 에 의해 전사되며, 포유동물 세포에서 shRNA 생산은 세포가 shRNA 를 바이러스 공격으로 인식하여 방어 수단을 찾는 것처럼 인터페론 반웅을 야기시킬 수도 있다. 또한， shRNA 는 식물 및 다른 시스템에서도 이용될 수 있으며 U6 프로모터가 반드시 필요한 것은 아니다. 식물의 경우에는 매우 강력한 연속적인 발현 능력을 보유한 전통적인 프로모터인 CaMV(cauli flower mosaic virus) 35S프로모터가 이용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "siRNA(small interference RNA)" 는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다 (참조: W0 00/44895, W0 01/36646, W0 99/32619, W0 01/29058， W0 99/07409 및 W0 00/44914). siRNA 는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물， 벌레， 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나， 최근에 siRNA 를 개발 /이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다 (Degot S, et al. 2002； Degot S, et al . 2004； Ballut L, et al. 2005) .
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한， 본 발명의 siRNA 분자는, 자기—상보성 (self -complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 상보적은 100% 상보적인 경우 뿐만 아니라 불완전한 상보성도 포괄하는 의미이며, 바람직하게는 90%의 상보성， 보다 바람직하게는 98%의 상보성， 가장 바람직하게는 100%의 상보성을 의미한다. 본 명세서에서 100% 상보성을 표현하는 경우에는 완전 상보적 (completely complementary)으로 특별하게 기재된다. siRNA 는 RNA 끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치 (대웅하는 염기가 상보적이지 않음)， 벌지 (일방의 사슬에 대웅하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기， 바람직하게는 15 내지 80 염기， 보다 더 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. 상기 siRNA 는 Tpl2 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30 머 (mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며， 이때， 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나， 25 개의 염기로 구성되는 것이 바람직하다. siRNA 말단 구조는 Tpl2 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 (blunt) 말단 혹은 점착 (cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' -말단 돌출 구조와 5' -말단 돌출 구조 모두 가능하다. 본 발명의 siRNA 분자는， 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열 (예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 흔성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며， 전체적으로는 스템-앤드- 루프 (stem-and-loop) 구조를 형성하게 된다. 이 스템—앤드 -루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi 를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 siRNA는 서열목록 제 1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 포함된 서열을 가진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물의 유효성분인 Tpl2 유전자에 특이적으로 결합하는 RNAKRNA interference) 분자는 유전자 캐리어에 삽입되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 유전자 캐리어는플라스미드, 재조합 아데노바이러스 (Thi画 appaya, B. et al . , Cell, 31：543-551(1982)； 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066— 1073(1989)), 아데노 -관련 바이러스 (Aden으 associated viruses: AAV)(LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al , J. CI in. Invest . , 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al . , Gene Therapy, 2:29—37(1995))， 레트로바이러스 (Mann et al. , Cell, 33:153-159(1983))， 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest . 104(11) :R55-62( 1999)) , 헤르페스심플렉스 바이러스 (Chamber R.， et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411- 1415(1995)), 배시니아바이러스 (Puhhnann M. et al . , Human Gene Therapy 10：649-657(1999)), 리포좀 또는 니오좀이며， 가장 바람직하게는 재조합 렌티바이러스이다.
본 발명에서 용어 "안티센스뉴클레오타이드 "란 특정 mRNA 의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고， mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA 의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스을리고뉴클레오타이드 서열은
Tpl2 mRNA 에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, Tpl2 mRNA 의 번역, 세포질 내로의 전위 (translocation), 성숙 (maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고， 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.
상기 안티센스올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기， 당 또는 골격 (backbone)의 위치에서 변형될 수 있다 (De Mesmaeker et al . ,Curr0pinStruct Biol. , 5(3) :343-55(1995)) . 핵산 골격은 포스포로티오에이트， 포스포트리에스테르， 메틸포스포네이트， 단쇄알킬, 시클로알킬, 단쇄헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한， 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티 (sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴， 6-메틸아데닌， 5-tne 피리미딘 (특히 5- 메틸시토신)， 5-하이드록시메틸시토신 (HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌， 2—티오우라실， 2-티오티민, 5-브로모우라실， 5— 하이드록시메틸우라실， 8-아자구아닌， 7-데아자구아닌， N6 (6- 아미노핵실)아데닌， 2，6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스올리고뉴클레오타이드는 상기 안티센스올리고뉴클레오타이드의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티 (mo.iety) 또는 컨쥬게이트 (conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티， 콜레스테릴모이어티， 콜릭산， 티오에테르， 티오콜레스테를， 지방성 사슬， 인지질， 폴리아민， 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸모이어티， 옥타데실아민， 핵실아미노-카르보닐- 옥시콜에스테롤모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다 (미국특허 제 5,138,045 호, 제 5，218，105 호 및 제 5,459,255 호). 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다. 안티센스올리고뉴클레오타이드의 경우, 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스을리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스올리고뉴클레오타이드를 합성하는 한 예는 RNA 중합효소 I 를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA 가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위 (MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 백터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로. 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
상기 안티센스뉴클레오티드는왓슨—크릭 (Watson-Crick) 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙 -mRNA 또는 성숙된 mRNA 의 상보적 염기서열에 결합 (흔성화)하여 DNA 에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스뉴클레오티드의 특성은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스뉴클레오티드는모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다 (Rothenberg et al . , J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544， 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착， 표적결합의 친화도 및 뉴클레아제 (nuclease) 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
상기 Tpl2 단백질의 활성 억제제는 Τρ12 의 활성을 ^억제하는 단백질 또는 Τρ12 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드， 펩티드 모방체， 기질유사체， 앱타메 천연추출물또는 항체이다.
본 발명에서 이용될 수 있는 Τρ12 단백질에 특이적으로 결합하는 활성을 갖는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. Τρ12 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들， 예를 들어， 융합 방법 (Kohler and Milstein, European Journal of I隱 unology, 6:511—519(1976))， 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제 4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법 (Clackson et al, Nature 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1- 597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D. , Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York, 1999； Zola, H. , Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. , Boca Raton, Florida, 1984； 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN I匪 UN0L0GY, Wi ley /Greene, NY, 1991 에 상세하게 기재되어 있으며， 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어， 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화세포주를 항체 -생산 림프구와 융합시켜 이루어지며， 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 Tpl2 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성 (affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
Tpl2 에 특이적으로 결합하여 Τρ12 의 활성을 억제할 수 있는 펩타이드는당업계에 공지된 통상의 방법， 예를 들어 파아지 디스플레이 방식으로 얻을 수 있다 (Smith GP, "Filamentous fusion phage： novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface" . Science 228 (4705)： 13151317(1985)； Smith GP, Petrenko VA, "Phage display". Chem. Rev. 97(2) :391410(1997)) .
상기 Tpl2 의 활성을 ^억제하는 단백질 또는 Tpl2 에 특이적으로 결합하는 화합물은 Τρ12 키나아제 억제제가 바람직하고， 보다 더 바람직하게는， 4-(3—클로르 -4-플루오로페닐아미노) -6- (피리딘 -3-일- 메틸아미노) -3-시아노 -1 ,7-나프티리딘， 8-브로모 -4-(3-클로로 -4- 홀루오로페닐아미노 )—6— [(1—메틸 -1 Η-이미다졸 -4- 일)메틸아미노]퀴놀린 -3- 카르보니트릴)， 4- (시클로헵틸아미노 )-6- (피리딘 -3-일-메틸아미노) -3- 시아노- [ 1 , 7]-나프티리딘， [ 1， 7]나트티리딘 -3-카르보니트릴및 퀴놀린 -3- 카르보니트릴을 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 펩티드 모방체 (Peptide mimetics)는 Tpl2 단백질의 결합 도메인을 억제하여 Τρ12 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고， psi 결합 (Benkirane, N. , et al. J.Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은， 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된 (conformational ly constrained)" 펩티드, 사이클릭모방체 (cyclic mimetics), 적어도 하나의 액소사이클릭 도메인 (exocycl ic domain), 결합 부분 (결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭모방체일 수 있다. 펩티드 모방체는 UBAP2(Ubiqui n-Associated Protein 2) 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체 (Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198， 2000) 또는 수용성 수용체 (Takasaki , . et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997)와 같은—거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며， 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다 (Wrighton, N. C. et al . Nat Biotechnol 15， 1261-1265, 1997).
상기 앱타머 (aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로세 SELEX(systemat ic evolution of 1 i gands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오티드 (oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 을리고머를 분리하여 수득할 수 있다 (C. Tuerand L. Gold, Science 249， 505 - 510, 2005； A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822， 1990; M. Famulok, et . al . , Acc. Chem. 'Res. 33, 591 - 599， 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68， 611 - 647, 1999).앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데， 예컨대， 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.
상기 항체는 Tpl2에 특이적이고 직접적으로 결합하여 Τρ12 의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 Τρ12 에 특이적으로 결합하는 항체로는 폴리클로날 (polyclonal) 항체 또는 모노클로날 (monoclonal ) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 Tpl2 에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며， 상업적으로 알려진 Τρ12 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 Τρ12 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스， 랫트， 양， 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근육 내, 복강 내 또는 피하 주사방법으로 주사되며， 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제 (adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형성된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다. 본 발명에 따른 Tpl2 의 발현 또는 활성 억제제는 Τρ12 의 발현 또는 활성을 억제하는 효과를 우수하게 나타냄으로써， 신세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 Τρ12의 발현 또는 활성 억제 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1 종 이상 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여 (예를 들어 정맥 내 , 피하 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며， 투여량은 환자의 체중， 연령， 성별， 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격， 배설율， 체질 특이성， 제제의 성질 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 Τρ12 의 발현 또는 활성 억제제의 일일 투여량은 약 0.001~1000mg/kg, 바람직하게는 약
0.1~500mg/kg이나 임상실험결과에 따라 가감될 수 있으며 , 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다 .
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여 여러 가지 제제로 제형화 될 수 있으며， 부형제를 첨가하여 다양한 형태로 제형화될 수 있다. 상기 부형제는비독성이고 불활성인 약제학적으로 적합한 고상， 준고상 또는 액상의 모든 유형의 제형 보조물로서， 예를 들면， 충진제， 중량제, 결합제, 습윤제， 붕해제, 분산제， 계면활성제 또는 회석제 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 투약 단위 형태로 제형화 될 수 있다. 예를 들면， 상기 제형화된 투약 단위는 상기 유효 화합물의 1 일 개별 투약량의 1， 2， 3 또는 4 배로， 또는 1/2， 1/3 또는 1/4 배를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 개별 투약량은 유효 화합물이 1 회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1 일 투여량의 전부， 1/2, 1/3 또는 1/4 배에 해당한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 정제， 피복 정제, 캡슬제, 환제, 과립제， 좌약， 액제, 현탁액제 및 에멀전제， 페이스트제 (pastes), 연고제, 겔제, 크림제, 로션제 산제 또는 분무제로 제형화될 수 있다. 또한， 본 발명은 상기 조성물의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는， 신세포암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
■ 본 발명의 치료방법은 본 발명의 항암 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1 일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반웅의 종류와 정도， 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령， 체중， 일반 건강 상태 성별 및 식이, 투여 시간， 투여 경로 및 조성물의 분비율， 치료기간， 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
또한, 경우에 따라， 본 발명의 조성물과 함께 공지의 항암제를 병용 투여하여 항암 효과를 증대시킬 수 있다. 본 발명은 Tpl2 를 발현하는 암에 걸린 임의의 포유동물에 적용가능하며， 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라， 소， 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다. 한， 본 발명은
1)후보물질을 생물학적 시료에 처리하는 단계;
2)상기 제 1)단계의 생물학적 시료에서 Τρ12 의 mRNA 또는 단백질 발현양의 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 신세포암의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 시료는 암에 걸린 동물의 혈액， 소변, 타액, 조직을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 Tpl2 의 mRNA 발현양 변화를 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반웅 (Competitive RT-PCR) , 실시간 역전사 중합효소반웅 (Real time RT-PCR) , RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay) , 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩을 포함한다.
상기 Tpl2 단백질의 발현양 변화를 측정하는 방법은 웨스턴 블롯팅， ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) , 방사선면역분석 (RI A: Radioimmunoassay) , 방사 면역 확산법 (radioi隱 unodi f fusion)， 오우크테로니 (Ouchterkmy) 면역확산법， 로케트 (rocket) 면역전기영동， 조직면역 염색， 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay) , 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩 (protein chip)을 포함한다. 본 발명의 다른 일 양태에 따르면 다음 단계를 포함하는 신세포암의 진단방법을 제공한다:
(a) 생물학적 시료로부터 Tpl2 의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 측정 결과를 분석하는 단계로서 측정된 Tpl2 의 발현양 또는 활성이 정상 대조구 시료의 것보다 높을 경우 증가된 신세포암 위험도를 갖는 것으로 판단한다.
본 명세서에서 용어 "진단" 은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성 (311^6 ^^ )을 판정하는 것， 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후 (prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스 (therametrics) (예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "(Tpl2의 발현양 또는 활성) 증가" 는 건강한 사람들에 비해 Τρ12의 발현양 또는 활성이 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미하며， 바람직하게는 70% 이상 증가된 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 30% 이상 증가된 것을 의미한다.
생물학적시료중의 Τρ12 유전자의발현수준은 mRNA 또는이의단백질양을확인함으로써알수있으며， 생물학적시료에서 mRNA와단백질을분리하는과정은공지의공정을이용하여수행할수있으며, mRNA와 단백질의양은다양한방법으로측정할수있다. 본발명에서 "생물학적시료' '란간단히채취하여 Tpl2유전자의 mRNA 또는이의단백질수준의차이를검출할수있는체액즉 뇨， 타액， 혈액， 혈장, 혈청등을포함한다.
본발명에서 "mRNA 수준측정1'이란 Tpl2유전자를검출하기위하여생물학적시료에서 Tpl2 유전자들의 mRNA 존재여부와발현정도를확인하는과정으로 mRNA의양을측정한다. 이를위한분석방법으로는 RT— PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase보호분석법 (RNase protection assay), 노던블랏팅 (Nothernblott ing) , DNA 칩등이있으나이로제한되는것은아니다.
상기검출방법들을통하여정상대조군에서의 mRNA 발현량과신세포암 의심환자에서의 mRNA 발현량을비교할수있고, Tpl2 유전자에서 mRNA로의유의한발현량의증가여부를판단하여신세포암의심환자의실제신세포암 발명 여부를진단할수있다.
mRNA 수준을 RT-PCR로측정하기위해서는 Tpl2유전자에대한특이적인각각의프라이머쌍을이용한다.
프라이머는각마커유전자의핵산서열에특이적인서열을가지는뉴클레오타이드로 서， 약 7 내지 50bp의길이， 좀더바람직하게는약 10 내지 30bp의길이이다. 또한， 대조군유전자의핵산서열에특이적인프라이머를포함할수있다. 그외 RT- PCR 키트는테스트튜브또는다른적절한컨테이너， 반응완층액， 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머레이즈및역전사효소와같은효소, DNase, RNase억제제 DEPC수 (DEPC water), 멸균수등을포함할수있다. "프라이머"는짧은자유 3' 말단수산화기 (free 3' hydroxyl group)를가지는핵산서열로상보적인템플레이트와염기쌍을형성할수있고템플레 이트가닥복사를위한시작지점으로기능하는짧은핵산서열을의미한다 .
프라이머는적절한완층용액및온도에서중합반웅을위한시약및상이한네가지뉴클 레오사이드 3인산의존재하에서 DNA 합성을개시할수있다. 프라이머는 DNA 합성의개시점으로작용하는프라이머의기본성질을변화시키지않는추가의특징을 흔입할수있다. 프라이머는포스포르아미다이트 고체지지체방법또는기타널리공지된방법을사용하여화학적으로합성할수있다. 이러한핵산서열은또한당해분야에공지된많은수단을이용하여변형시킬수있다. 본발명에서 "단백질수준측정 ' '이란생물학적시료에서 Tpl2유전자에서발현된단백질의존재여 부와발현정도를확인하는과정으로서바람직하게는상기유전자의단백질에대하여 특이적으로결합하는항체를이용하여단백질의양을확인한다.
"항체 "란항원성부위에대해서지시되는특이적인단백질분자를의미한다 . 본발명의목적상항체는 Τρ12신세포암마커단백질에대해특이적으로결합하는항체 를의미하며， 폴리클론항체, 모노클론항체및재조합항체를 모두포함한다.
항체를이용하여단백질수준을측정하는분석방법으로는웨스턴블랏， EL ISA (Enzyme linked immunosorbent assay) , RIA(Radioimmunoassay) , 방사면역확산법 (Radioi誦 unodi f fusion)， 오크털로니 (Ouchter lony) 면역확산법， 로켓면역전기영동， 조직면역염색， 면역침전분석 (Immunoprecipitat ion) , 보체고정분석 (Com lementf ixat ion assay) , FACS, 단백질칩등이있으며， 기재된방법으로제한되는것은아니다. 위와같은분석방법을통하여정상대조군의항원- 항체복합체의형성량과신세포암의심환자의항원—항체복합체의
형성량을비교할수있고，
Tpl2단백질의유의한발현량증가여부를판단하여신세포암의심환자의실제신세포 암암여부를진단할수있다.
"항원- 항체복합체 "란 Τρ12단백질과이에특이적인항체의결합물을의미하고 항원- 항체복합체의형성량은 검출라벨 (detection label)의신호크기를통하여정량적으로측정할수있다. 검출라벨은효소， 형광물질，리간드， 발광물질， 미소입자 (microparticle), 레독스분자및방사선동위원소로이루어진그룹중에서선택할 수있으며， 상기기재된물질로제한되는것은아니다.
검출라벨로효소를사용하는경우이용할수있는효소로는 β-글루쿠로니다제， β- D-글루코시다제 β-D-갈락토시다제， 우레아제, 퍼옥시다아제또는알칼라인포스파타아제， 아세틸콜린에스터라아제， 글루코스옥시다아제， 핵소키나아제등이있으며， 상기기재된범위로제한되지않는다. 형광물질로는플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민등이있고， 상기기재된물질로제한되는 것은아니다. 리간드로는바이오틴유도체등이있고， 이에제한되지는않는다. 발광물질로는루시페린등이있고 , 이에제한되지는않는다. 미소입자로는콜로이드금등이있고， 이에제한되는것은아니다. 레독스분자로는퀴논， 1,4 4-벤조퀴논 하이드로퀴논등이있고ᅳ 이에제한되는것은아니다. 방사선동위원소에는 3H,14C 등이 포함되며, 이에제한되는것은아니다.
단백질발현수준측정은바람직하게는 ELISA를이용한다.
ELISA로는고체지지체에부착된항체와항원의복합체에서항원을인지하는표지된 또다른항체를이용하는직접적샌드위치 ELISA, 고체지지체에부착된항체와 항원의복합체에서항원을인지하는또다른항체와반웅시킨후이항체를인지하는표 지된 2차항체를이용하는간접적샌드위치 ELISA 등다양한 ELISA 방법을포함한다.
좀더바람직하게는고체지지체에항체를부착시키고시료를반웅시킨후항원- 항체복합체의항원을인지하는표지된항체를부착시켜효소적으로발색시키거나， 항원 -항체복합체의항원을인지하는항체에대해표지된
2차항체를부착시켜효소적으로발색시키는샌드위치 ELISA 방법에의해서검출한다.
Tp 12신세포암마커단백질과항체의복합체형성정도를확인하여신세포암발병
여부를확인할수있는것이다.
또다른방법으로 Tp 12에대한하나이상의항체가기판위정해진위치에배열되 어고밀도로고정화되어있는단백질칩을이용할수있다.
단백질칩을이용하여시료를분석하는방법은시료에서단백질을분리하고， 분리한단백질을단백질칩과흔성화시켜항원- 항체복합체를형성시키고이를판독하여단백질의존재
또는발현정도를확인하여신세포암발병여부를확인할수있다. , 또다른방법으로 Tpl2에대한항체를이용하여웨스턴블랏팅을하는것이다. 시료에서전체단백질을분리하고，
이것을전기영동하여단백질을크기에따라분리한다음나이트로셀를로스막으로이 동시켜항체와반웅시킨다. 생성된항원- - 항체복합체의양을표지된항체를이용하여확인함으로써신세포암발병여부를확인 할수 있다.
위와같은검출방법들은정상대조군의 Τρ12유전자발현량과신세포암발병세 포에서의 Tpl2유전자의발현량을비교하는단계를포함한다. mRNA 또는단백질의수준은 Tpl2단백질의절대적또는상대적차이로나타낼 수있다. 본 발명의 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 Τρ12 에특이적으로 결합하는 항체 또는 업타머를 포함하는 신세포암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 신세포암 진단용 키트는 면역분석 (immunoassay)용 키트이다. 이하， 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
신세포암 (RCC; renal cell cancer)과 Tpl2의 연관성 확인
신세포암과 Τρ12 의 임상적 관련성을 확인하기 위하여， 신세포암에서
Τρ12 의 발현 양상을 확인하였다. TCGA(http://cancergenome. nih.gov)의 mRNA서열 데이트를 이용하여 , 936 명의 RCC환자의 임상적 결과 및 Tpl2 의 발현을 비교하였다. 이의 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1 의 Α 에 나타난 바와 같이， 전이 단계 IV의 RCC(n=157)환자의 경우， 전이 단계 I 및 전이 단계 Π(η=542)의 RCC 환자보다 Τρ12 발현 수준이 유의적으로 높음을 확인하였다.
또한， 도 1 의 Β 의 카플란-마이어 (Kaplan— Meier)그래프에 나타낸 바와 같이， RCC 환자에서 TP12 의 발현이 높은 경우， 전체적인 생존률이 유의적으로 감소하였다.
따라서, 본 발명의 Τρ12 는 신세포암 진행과정에 관련이 있음을 확인하였다.
[실시예 2]
Caki-1 세포의 동소 이식 및 폐 전이 모델에서 Tpl2 침묵의 효과확인. 1·Τρ12를 억제하는 shRNA를 발현하는 Caki-1 세포 구축 인간의 RCC 세포주인 Caki-1 세포를 ATCC(American Type culture collection; Manassas, Va, USA)에서 얻었다. 상기 세포를 10%의 소 태아혈청 (FBS/RPMI, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 첨가된 RPMI 1640 배지 (Gibco, Grand Island, NY, USA)로 37°C에서 5%의 C02 를 포함하는 건조된 배양기에서 배양하였다. 문헌 (Huynh H, Ong RW, Li PY, et al. Targeting receptor tyrosine kinase pathways in hepatocellular carcinoma. Anticancer Agents Med Chem 2011; 11 :560-75)에 제시된 방법으로， 상기 세포에 pGIPZ 및 pLKO.l-TRC 렌터바이러스 백터를 이용하여 sh-Tpl2(서열목록 제 1 서열) 또는 비ᅳ표적화된 shRNA (서열목록 제 2 서열) 를 형질도입하여, 비-표적화된 shRNA 를 발현하는 Caki-1 세포 (이하， caki- 1-sh-Con 이라 함) 또는 sh-T l2를 발현하는 Caki-1 세포 (이하, caki-1-sh- Tpl2 라 함)를 구축하였다. 상기 형질도입된 세포를 퓨로마이신 2yg/i , Gibco)을 48시간 동안 처리하예 선별하여 하기의 실험들에 사용하였다. 2. Caki-1 세포에서 Tpl2 shRNA를 통한 Tpl2 침묵 (si lencing) 확인 신세포암에서 Tpl2 의 역할을 확인하기 위하여， 실시예 2-1 에서 구축한 Caki-1 sh-Tpl2 또는 caki-1— sh-Con 세포에서, qRT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 12 넉다운의 효율성을 검증하였다.
우선， qRT-PCR 을 하기와 같이 수행하였다. 상기 세포들에서 RNeasy 키트 (Qiagen, Hi 1 den, Germany)를 이용하여 추출하였다. 이 후， Superscript Τΰ. First-Strand Synthesis SuperMix( Invitrogen)을 이용하여 RT PCR을 수행하였고， 상기 RT PCR 을 통하여 얻은 cDNA를 SYBR Green PCR Master Mix 및 하기 표 1 의 Tpl2 의 프라이머를 이용하여 qPCR 을 수행하였다.
【표 1】
Figure imgf000023_0001
또한， 웨스턴 블롯은 하기와 같이 수행하였다. 상기 세포들을 RIPA 용해 완층액 (15mM NaCl, 1%의 NP-40, 0.5%의 sodium deoxycholate, 0.1%의 SDS, 50mMTris(pH 8.0))를 이용하여 용해시킨 후， 5 분 동안 10,000 x g 로 원심분리하고， 상층액을 수득하였다. BCA 단백질 어세이 키트 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 단백질 농도를 분석하였고, SDS( sodium dodecyl sul f ate)-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis) 전기영동을 100V에서 2시간 수행하여 3(hig의 단백질을 분리시켰다. 상기 겔 상의 단백질을 100V에서 1시간동안 PVDF 막( ^011 111(^1 fluoride; Whatman, Pi scat away, NJ, USA)에 옮겼다. 이 후， 항 -Tpl2 및 항- GAPDH(glycer aldehyde 3ᅳ phosphate dehydrogenase; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz , CA, USA) 항체를 처리하였다.
넉다운의 효을성을 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 검증하였고, 이를 도 2에 나타내었다.
도 2 에 나타난 바와 같이, sh-Tpl2 를 렌티 바이러스를 이용하여 형질도입한 경우， Caki-1에서 Tpl2의 발현이 저해됨을 확인하였다.
3. Caki-1 세포 동소 이식 모델 (orthotopic) 구축 및 상기 모델을 이용한 Tpl-2 침묵의 효과 확인.
RCC 동물 모델에 IX 106 의 caki-1— sh-Tp 12 (n=9) 또는 caki-l-sh-
Con(n=9)를 신장에 투여하여， Cakl-1 세포 동소 이식 모델을 구축하였다. 보다 구체적으로， 이하 진행할 모든 동물에 대한 실험은 삼성 메디컬 센터 (Institutional Review Boards; Seoul , Korea)에 허가를 받아 NIHFCUA(Nat ional Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; NIH publication No. 80-23, Revised in 1996)에 따라 수행하였다. 우선， 40 yL Hank^s Balanced salt solut ion(HBSS, Gibco)에 1X106의 caki-l-sh-Tpl2(n=9) 또는 caki-l-sh-Con(n=9)를 흔합하여 6 내지 8 주령의 BALB/c-nu 마우스의 왼쪽 신장의 피막 아래에 투여하였다. 이식 4 주 후ᅳ 신장 및 폐를 추출하여 종양의 무게를 측정하였고， 종양 무게를 종양세포가 이식된 왼쪽 신장의 무게에서 오른쪽 정상 신장의 무게를 빼서 측정하였고， 오른쪽 신장의 무게가 왼쪽 심장의 무게보다 무거우면 종양의 무게를 0으로 하였다.
또한， 2X105 의 caki-l-sh-Tpl2(n=9) 또는 caki-l-sh-Con(n=9)를 6 내지 8 주령의 BALB/c-nu 마우스의 꼬리 정맥에 투여하였고， 이식 4 주 후， 폐의 혹의 슷자를 현미경 또는 현미경 없이 계산하였다. 추출한 기관을 파라핀에 고정시켜 H&E( hematoxylin and eosin)으로 염색하여 폐암으로 전이된 종양 또는 신장의 종양의 존재를 확인하였다.
caki-l-sh-TP12를 BALB/c-nu 마우스의 왼쪽 신장의 피막 아래 투여한 경우의 신장의 종양 또는 폐의 종양의 성장에 대한 결과를 도 3 에 나타내었고, BALB/c-nu 마우스의 꼬리 정맥에 투여한 경우 폐로 전이가 일어났는지 확인한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 3 에 나타난 바와 같이， Tpl2 를 넉다운시킨 경우 (caki-1-sh- Τρ12 를 이식한 경우)， Caki-1 세포의 일차 종양 성장이 유의적으로 억제됨을 확인하였다. 또한， Tpl2 을 넉다운시킨 그룹에서는 폐로의 전이가 전혀 발생하지 않았지만， 다른 그룹에서 폐로의 전이가 관찰되었다.
도 4 에 나타난 바와 같이， Τρ12 를 넉다운시킨 경우， 폐로 전이된 혹 (lung metastatic foci)이 유의적으로 감소함을 확인하였고， 폐의 무게가 증가함을 확인하였다.
상기 결과에 의해， Tpl2 가 RCC 의 종양 형성 및 진행과정에서 매우 중요함을 확인하였다.
[실시예 3]
Τρ12 저해에 의한 RCC 세포의 부착능 증식능， 클론형성능， 아노이키스 (anoikis)-저항성 확인
1.Τρ12 억제의 세포 신호 경로에 대한 영향 확인.
Τρ12 의 결실의 효과를 확인하기 위하여, Τρ12 의 일차 기능은 인터루킨 -1 자 극에 반웅하여, ΜΑΡΚ 하위단계 (downstream)를 활성화 시킴을 이용하여， ERK, JN 및 p38을 포함하는 MAPK의 인산화를 측정하였다.
보다 구체적으로, caki-l-sh-Con, caki-l-sh-Tpl2 세포 또는 일반 Caki-1 세포에 Tpl2 억제제를 처리한 후, 항 -ERK, 항 -p-ERK, 항 p-JNK, 항- JNK, 항 -P38 및 항 -P-P38 ，항 -GAPDH 및 항 -a-투불린 항체를 이용하여, 실시예 2와 같이 웨스턴 블롯을 수행하였다.
상기 웨스턴 블롯 결과를 도 5 에 나타내었고， 100ng/ml 의 IL-Ιβ를 처리한 후, 웨스턴 블롯 결과를 도 6에 나타내었다.
도 5 에 나타난 바와 같이, caki-l-sh-Tpl2 세포 또는 Tpl2 키나아제억제제를 처리한 경우， Τρ12-매게 ΜΑΡΚ 하위단계 신호경로의 활성화를 억제함을 확인하였다.
도 6 에 나타난 바와 같이， Caki-1 세포에서 IL-Ιβ-유도한 후， ERK, JNK 및 p38 MAPK의 경우， caki-l_sh-Tpl2또는 Tpl2 억제제를 처리한 경우， ERK 활성이 억제됨을 확인하였으나， JNK 및 ρ38 의 인산화는 영향을 받지 않음을 확인하였다.
2. Τρ12 억제의 종양세포의 증식능에 대한 영향 확인
(1)증식능 확인
증식능을 확인하기 위하여， caki-l-sh-Tpl2 또는 caki-1-sh—Con 세포를 96-웰 플래이트에 lOOyL의 10% FBS/RPMI와 함께 1X105 cell/ml의 농도로 접종하였다. 이 후, 1 시간， 24 시간， 48 시간 또는 72 시간 후의, 세포의 생존성을 제조사의 메뉴얼에 따라 EZ-Cytox 세포 생존성어세이 키트 (Daeil Lab Service, Seoul , Korea)를 이용하여 결정하였다.
또한， 일반 Caki-1 세포에 72 시간 동안 Tpl2 키나아제억제제인 4-
(3-클로르 -4-플루오로페닐아미노) -6— (피리딘 -3-일-메틸아미노) -3-시아노- 1 , 7-나프틸리딘 [ 4- ( 3-ch 1 or -4— f 1 uoropheny lamino)-6-(Pyr idin-3-yl- me t hy 1 am i no ) -3-cy ano- 1 , 7-napht hy r i d i ne； Calbiochem, San Diego, CA, USA]를 ΙμΜ, 2.5μΜ, 5μΜ 또는 10μΜ 로 처리한 후， 세포 생존성을 측정하였다.
상기의 결과를 도 7(caki-l-sh-Tpl2) 및 도 8(Tpl2 키나아제억제제 처리)에 나타내었다. .
도 7에 나타난 바와 같이, caki-l-sh-T l2 세포의 증식이 caki-1-sh- Con과 비교하여 유의적으로 감소함을 확인하였다. 도 8 에 나타난 바와 같이， Tpl2 키나아제 억제제를 처리하는 경우， Τρ12 억제제의 농도 의존적으로 증식력이 억제됨을 확인하였다 (2.5μΜ 에서 Ρ=0.021; 5μΜ에서 Ρ=0.0004; 및 ΙΟμΜ에서 Ρ=0.0002).
(2)세포 주기 분석
우선 caki-l-sh-Tpl2 또는 caki-1-sh-Con 세포를 70%의 에탄을로
4°C에서 30 분동안 고정시켰다. 이 후， RNage(100yg/mL) 및 PKpropidiumiodide; 40 μ g/mL , BD Biosciences , Flankl in Lakes , NJ , USA)에서， 37°C로 30 분 동안 염색하였고， FACS-Calibur(BD Biosciences)를 이용하여 세포 주기를 분석하여 도 9에 나타내었다.
도 9 에 나타난 바와 같이， caki-l-sh-Tpl2 세포의 경우， G1 기의 세포 비율은 (caki-1-sh-Tp 12=54.2%, caki-l-sh-Con=37.8%) 증가하였고， S 기의 세포 비율은 감소( !312=35.4%, Sh-Con=46,4%)함을 확인함으로써， 상기의 증식능이 억제됨은 세포 주기의 진행을 유의적으로 지연시키는 것과 함께 수반됨을 확인하였다.
3.Tpl2 억제의 클로니형성능에 대한 효과 확인
caki-l-sh-Con, caki-l-sh-Tpl2 세포를 300 cell/well 로 6 웰 플레이트에 접종하였고， 10%의 FBS/RPMI 를 Tpl2 키나아제억제제와 함께 (ΟμΜ, 2.5μΜ 또는 5μΜ) 웰 플레이트에 3 주 동안 처리하였다. 0.2% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)으로 염색한 후， 웰 당 생존한 클로니의 숫자를 계산하였다. 이의 결과를 도 10(caki-l-sh-Con 세포 및 caki-1-sh- Tpl2세포) 및 도 11(Τρ12 키나아제억제제 처리)에 나타내었다.
도 10 에 나타난 바와 같이， Paki-1 세포들의 클로니형성 (clonogenicity)은 caki-l-sh Tpl2(P=0.005)에서 caki-l— sh-Con 세포와 비교하여 현저히 감소함을 확인하였다.
또한， 도 11 에 나타난 바와 같이， Tpl2 키나아제 억제제를 처리한 경우 (2.5μΜ 에서 37% 감소， Ρ=0.008; 5μΜ 에서 83% 감소 Ρ=0.002), 클로니형성이 유의적으로 감소함을 확인하였다. 4. Τρ12 억제와 아노이키스 저항성 (anoikis resistance)과 관련성 확인 Tpl2 활성의 세포의 전이에 대한 역할을 밝히기 위하여， 탈부착 (detachment)후 세포 생존률을 평가하였다. 보다 구체적으로， 아노이키스에 의하여 세포사를 겪은 세포를 확인하고, 제조사의 메뉴얼에 따라 CytoSelect™ 24ᅳ웰 아노이키스어세이 키트 (anoikis Assay kit; Cell Bioloabs, San Diego, Ca, USA)를 이용하여 상기 세포를 정량화 하였고, 이의 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12 에 나타난 바와 같이， cald-1— sh— Tpl2 세포는 caki-l-Sh-Con 세포에 비하여 탈부착 24 시간 후， 유의적으로 아노이키스 저항성 (anoikis resistance)을 억제하였다.
5. TP12 억제와 세포 부착능과 관련성 확인
세포의 혈관 내 침투 (intravasation) 및 혈관 외로 유출 (extravasation)동안 암의 전이에서 요구되는 표현형인 세포 부착능을 평가하기 위하여， 96-웰-플레이트에서 각각의 웰을 10yg/mL 의 피브로넥틴 (Millipore, Billerica, MA, USA)을 코팅하였고, 1X105 의 caki-1-sh-Con 또는 caki-l_sh-Tpl2 세포를 접종한 후， 1 시간 동안 배양하였다. PBS 로 3 번 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 부착된 세포들을 0.1%의 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후， 2% SDS(150yL/well)를 이용하여 용해시킨 후， 550nm에서 흡광도를 측정하였고， 이의 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13 에 나타난 바와 같이， Tpl2 의 억제는 세포의 피브로넥틴에 대한 부착능을 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
6. 결론
상기의 결과들은 Τρ12는 ΜΑΡΚ하위 신호 경로의 활성을 조절함으로써，
RCC 세포에서 세포 주기의 진행， 세포 증식, 클로니형성， 아노이키스 저항성 및 부착능에 관여함을 나타낸다.
[실시예 4]
RCC 세포의 이동 (migration) 및 침윤 (invasion)에서 Tpl2 의 역할 확인. 1.상처 치료 어세이 (Wound heal ing assay)를 통한 RCC 세포의 이동능 확인
암의 전이에서 세포의 증식과 비의존적으로， 세포의 증가된 이동능 및 침윤능은 국소적 침윤， 혈관내 침투， 혈관 외 유출과정에서 요구된다. 따라서, 암세포의 이동능과 Tpl2 의 관련성을 확인하기 위하여， 상처 치료 어세이 (wound healing assay)를 수행하였다.
보다 구체적으로, caki-l-sh-Tpl2, caki-1-sh-Con 세포 또는 일반 Caki-1 세포를 10% FBS/RPMI 가 포함된 24-웰 플레이트에서 배양하였다. 콘플루엔트 세포 단일층 (confluent cell monolayer)에 20으 pipette tip 을 이용하여 상처를 내었다. 상처 라인의 넓이를 24 시간 동안 사진을 찍어 확인하였다. 이의 결과를 도 14 및 도 15(Tpl2 키나아제억제제 투여한 경우)에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이， caki-l-sh-Tpl2 세포의 경우， caki-1— sh_ Con 세포와 비교하여， 상처의 봉합 (wound closure)비율이 현저히 낮음을 확인하였다.
또한, 도 15 에 나타난 바와 같이， Tpl2 키나아제 억제제를 처리하는 경우， 상처 봉합 비율이 처리하지 않은 경우와 비교하여 현저히 낮음을 확인하였다.
따라서， Τρ12 가 억제된 세포에서는 대조군 세포에 비하여， 세포의 이동이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.
2.트랜스-웰 이동 (trans-well migration) 및 침윤 어세이를 통한 RCC 세포의 이동능과침윤능 확인
트랜스—웰 이동 및 침윤 어세이를 수행하기 위하여, 300μί 의 세륨ᅳ 결핍 RPMI 배지 내의 1X105 의 caki-l-sh-Tpl2 또는 caki-1-sh-Con 세포를 24-웰 미소화학유인물질 챔버 (24-well microchemotaxis chamber； Costar, Corning, NY, USA)의 상부 투입구 (top insert)에 로딩하였다. 이 후， 200ng/ml 의 CXCL12 가 첨가된 세륨 -결핍 RPMI 또는 10%의 FBS/RPMI 를 화학유인물질 (chemoattractant)로 하부 챔버 (bottom chamber)에 가하였다. 상기 세포들을 8-μπι 공극의폴리카르보네이트 필터를 통하여 24 시간 동안 이동시켰고, lOOyg 의 마트리젤 (BD Bioscience)로 코팅된 필터를 통하여 48 시간 동안 침투시켰다. 필터 막을 H&E 로 염색시켰고， 막의 윗부분을 스크랩하여, 이동 또는 침윤하지 않은 세포를 면봉 (cotton swab)으로 제거하였다. 세포 이동 및 침윤의 정도를 각각의 웰의 세포 수를 카운트하여 측정하였다.
이의 결과를 도 16(caki-l-sh-Tpl2) 및 도 Γ7(Τρ12 키나아제억제제 투여 세포)에 나타내었다.
도 16 에 나타난 바와 같이， Τρ12 을 침묵시킨 세포에서, 대조세포에 비하여， 코팅되지 않은 막으로 이동 또는 마트리젤로 코팅된 막으로의 이동 및 침윤이 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다 (도 4Β Ρ=0.0005).
도 17 에 나타난 바와 같이， Τρ12 키나아제 억제제를 Caki— 1 세포에 가하는 경우， 농도 의존적으로 이동 및 침윤능력을 감소시킴을 확인하였다. 그러므로， Tpl2 의 억제는 RCC 세포의 이동 및 침윤능력을 억제함을 알 수 있다. [실시예 5]
Caki-1 세포를 3차원 배양하는 경우， Tpl2 침묵의 효과 확인 신세포암에서 Τρ12 의 종양 형성 및 전이능에 대한 효과를 확인하기 위하여， 세포 증식， 구형성, 및 침윤능을 3 차원 배양 시스템에서 평가하였다.
보다 구체적으로, 3D 배양은 Eiraku M, Takata N, Ishibashi H, et al . Self-organizing opticᅳ cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature 2011 ;472 :51-6.에서 제시한 방법으로 수행하였다. 간략히， caki-1-sh-Con 또는 Caki-l-sh_Tpl2 세포 (2x103 cell Ave 11)를 10% FBS/RPMI 내의 지질-기반의 낮은 -세포ᅳ부착 96-웰 플레이트 (Lipidure, N0F Corporation, Tokyo, Japan)에 접종하였다. 이 후， 0, 1， 3， 6 및 9일 후의 구형성을 관찰하였고， 상기 구형을 Accumax 완층액 (Mi 11 ipore)을 이용하여 단일 세포로 분리시켰다. 이 후， 세포를 카운트하였다， 구형세포 카운팅어세이 (spheroid cell counting assay)를 위하여， 3 일 후, 배양배지를 10% FBS/RPMI 배지를 포함하는 2%의 마트리젤 (BD Bioscience)로 교체하였다. 2 차 구형성의 숫자를 9 일 후， 카운트하였다. 또한， 웨스턴 블롯을 통하여 ERK의 활성을 관찰하였다. 2 차원 세포 증식 어세이 결과를 도 18 에 나타내었고， 3 차원 배양시스템에서 배양 결과를 도 19 및 20 에 나타내었고， 3 차원 배양에 따른 ERK 활성의 정도를 도 21에 나타내었다.
도 18 에 나타난 바와 같이， 2 차원 배양 시스템에서는 Tpl2 침묵은 Caki-1 세포 증식에 유의적인 효과가 없음을 확인하였다.
도 19 에 나타난 바와 같이， 3 차원 배양 시스템에서 caki-1-sh-Con 세포와 caki-l-sh-Tpl2 세포는 방사형 (branching structures)구조 없이 구를 형성하였다. 이 후， caki-1-sh-Con 세포는 순차적으로 형태적 변화가 일어나고, 방사형 구조가 형성되거나， 구에서 세포가 탈부착됨을 확인하였다.
이에 반해, caki-l-sh-Tpl2 세포는 구에서 세포의 탈부착이 거의 일어나지 않고， 상기 탈부착이 지연됨을 확인하였다.
도 20 에 나타난 바와 같이， caki-l-sh-TP12 세포가 탈부착 후， 이차 구형성이 억제됨을 확인하였다.
도 21 에 나타난 바와 같이， ERK 활성의 증가는 이차 구형성을 유발하고, 상기 ERK 활성이 억제됨으로써， 2 차 구형성이 억제됨을 확인하였다.
[실시예 6]
Tpl2 침묵의 CXCL12 에 의하여 유도된 신호 경로 및 화학주성 (chemotaxis)/화학침윤 (chemoinvasion)에 대한 영향 확인
CXCL12-CXCR4 신호는 RCC의 진행과정에서 밀접히 연관되어 있으므로， CXCR4-매개 하향 신호 경로에서 , c'aki-l-sh-Tpl2 또는 caki-1-sh-Con 세포에서 CXCL4 를 처리한 경우 효과를 실시예 2 와 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 통해 확인하여 도 22에 나타내었고， Tpl2 키나아제 억제제의 효과를 도 23 에 나타내었다. 또한, 상기 세포에 CXCL12 처리 후， 실시예 5 와 같은 방법으로 세포의 이동 및 잠재적인 침윤능력을 확인하여， 이의 결과를 도 24에 나타내었다. '
도 22 및 도 23 에 나타난 바와 같이， CXCR4 리간드인 CXCL12(100ng/ml)에 의하여 유도된 ERK1/2 및 AKT의 활성은 caki-l_sh-Tpl2 세포 또는 Caki-1 세포에 TP12 키나아제억제제를 처리하는 경우, 현저히 감소하였다.
도 24 에 나타난 바와 같이 CXCR4 의존적인 caki-l-sh-Tpl2 세포의 이동 및 세포의 침윤은 caki-1-sh-Con 세포와 비교하여 현저히 감소함을 확인하였다.
상기 결과는 내재적 Tpl2 는 RCC 의 잠재적인 CXCR4-의존성 전이를 조절하는 것을 나타낸다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】 '
Tpl2(tumor progression locus 2)의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는， 신세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 Tpl2 활성 억제제 또는 발현 억제제는 암세포의 증식 또는 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는， 신세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서， 상기 Τρ12 활성 억제제는 Τρ12 의 활성을 촉진하는 단백질 또는 Τρ12 에 특이적으로 결합하는 화합물， 펩티드, 펩티드모방체, 기질유사체, 앱타머， 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것올 특징으로 하는， 신세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서, 상기 Τρ12 발현억제제는, Τρ12 유전자 또는 Τρ12 의 발현을 촉진하는 유전자의 mRNA 에 상보적으로 결합하는 안티센스뉴클레오티드, siRNA, shR A 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 신세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 5】
제 3항에 있어서， 상기 Tpl2의 활성을 촉진하는 단백질 또는 Τρ12에 특이적으로 결합하는 화합물은 Τρ12 키나아제 억제제인 것을 특징으로 하는， 신세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 6】
제 5 항에 있어서， 상기 Τρ12 키나아제억제제는 4-(3-클로르 -4- 플루오로페닐아미노 )-6- (피리딘 -3-일-메틸아미노) -3—시아노 -1 , 7- 나프티리딘 [4_(3—chl or-4- f luor opheny 1 am i no )— 6— ( Pyr i d i η-3-y 1 - me t hy 1 am i no ) -3-cyano- 1 ,
7-napht hyr i d i ne ] 것을 특징으로 하는, 신세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. 【청구항 7】
제 1 항의 조성물의 치료적 유효량을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계 ;를 포함하는， 신세포암의 예방 또는 치료방법 .
【청구항 8]
제 7항에 있어서, 상기 개체는 돼지， 소, 개， 말， 고양이, 원숭이 및 양으로 이루어진 군증 선택된 .1 종 이상의 개체인 것을 특징으로 하는, 신세포암의 예방 또는 치료 방법 .
【청구항 9】
1)후보물질을 생물학적 시료에 처리하는 단계;
2)상기 제 1)단계의 생물학적 시료에서 Tpl2(acid sphingomyelinase)의 mRNA 또는 단백질의 발현양 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 신세포암의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
【청구항 10】
제 9 항에 있어서， 상기 생물학적 시료는 신세포암에 걸린 동물의 혈액， 소변， 타액, 조직으로 이루어진 군중 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는， 신세포암의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
【청구항 11】
제 9 항에 있어서， 상기 Tpl2 의 mRNA 발현양 변화는 역전사 중합효소반웅 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반웅 (Competitive RT-PCR) , 실시간 역전사 중합효소반웅 (Real time RT-PCR) , RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay) , 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군 중 선택된 1 종 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로하는， 신세포암의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
【청구항 12】
제 9항에 있어서， 상기 Tpl2 단백질의 발현양 변화는 웨스턴 블롯팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) , 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay) , 방사 면역 확산법 (radioi隱 unocli f fusion)， 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법， 로케트 (rocket) 면역전기영동， 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay) , 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩 (protein chip)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 신세포암의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
【청구항 13]
다음 단계를 포함하는 신세포암의 진단방법 :
(a) 생물학적 시료로부터 TP12 의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 1
(b) 상기 단계 (a)의 측정 결과를 분석하는 단계로서 측정된 Tpl2 의 발현양 또는 활성이 정상 대조구 시료의 것보다 높을 경우 증가된 신세포암 위험도를 갖는 것으로 판단한다.
【청구항 14】
Τρ12 에특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 신세포암 진단용 키트.
【청구항 15]
제 14 항에 있어서， 상기 키트는 면역분석 (immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
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