KR100848666B1

KR100848666B1 - NF-k B의 발현을 억제하는 s i RNA

Info

Publication number: KR100848666B1
Application number: KR1020077006266A
Authority: KR
Inventors: 최영철; 박한오; 정소림; 김선회; 김지영; 이은주; 이미영; 김영주; 이의진; 한창환
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2006-03-17
Filing date: 2007-03-17
Publication date: 2008-07-28
Also published as: WO2007108621A1; KR20080028830A

Abstract

본 발명은 NF-kB/RelA의 발현을 억제하는 siRNA 및 전기 siRNA를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 류마티스 관절염 치료제는 세포내에서 NF-kB/RelA를 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여 NF-kB/RelA 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 류마티스 관절염 치료제는 유전자 수준에서 NF-kB/RelA의 발현을 직접적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 비정상적으로 증식하는 활막세포의 사멸을 유도할 수 있으므로, 보다 효과적인 류마티스 관절염의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

NF-k B의 발현을 억제하는 s i RNA{SIRNA FOR INHIBITING NF-KB/RELA EXPRESSION}

본 발명은 NF-kB/RelA의 발현을 억제하는 siRNA에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 NF-kB/RelA의 발현을 억제하는 siRNA 및 전기 siRNA를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 치료제에 관한 것이다.

류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis, RA)은 관절을 침범하는 만성 전신성 염증 질환으로, 병리학적으로 활막(synovial membrane)이 비후되고 염증세포가 침윤하는 특성을 나타낸다. 질환의 초기에는 면역반응에 의하여 T세포가 활성화되고 이로 인해 염증반응이 시작되지만, 질환의 말기로 갈수록 T세포의 영향력은 감소하고 활막섬유아세포(synovial fibroblast)의 비정상적인 증식 및 활성화로 인해 나타나는 연골파괴 분해효소 및 골 파괴인자의 활성화에 의해 관절이 급속하게 파괴되는 증상이 나타난다.

류마티스 관절염의 진행양상은, 초기단계에 새로운 혈관이 관절부위에서 생성(angiogenesis)되어, 여기에서 염증반응을 일으키는 세포들이 관절부위내로 침윤하고, 침윤한 세포들이 염증반응을 일으키는 싸이토카인(cytokine)들을 분비하여 활막의 세포를 활성화시키며, 활성화된 활막의 세포는 증식하고 이의 외부에 단단 한 막을 생성하여, 패너스(pannus)라는 새로운 조직을 형성한다. 상기 패너스는 다양한 싸이토카인과 단백질 분해효소를 분비하고, 대식세포(macrophage)와 파골세포(osteoclast)의 분화를 촉진시키기 때문에, 연골을 서서히 파괴하고, 이처럼 연골이 파괴됨에 따라 뼈사이의 거리가 더욱 짧아지며, 최종적으로는 패너스와 뼈가 접촉함에 의하여 뼈가 파괴되는 것으로 알려져 있다(참조: Bresnihan et al., Ann Rheum Dis., 59:506-511, 2000; Firestein, Arthritis Rheum., 39:1781-1790, 1996; Firestein et al., Arthritis Rheum., 46:298-308, 2002).

한편, NF-kB는 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터루킨(IL-1, IL-6, IL-8 등), 과립형 대식구 콜로니 자극인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), cFLIP(cellular FLICE-inhibitory protein), iNOS(inducible nitric oxide synthase), ICAM-1(intercellular adhesion molecule 1), 셀렉틴(E-selectin), MHC class I, II, RANTES(Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted), BIRC3(Baculoviral IAP repeat-containing 3) 등의 면역반응 또는 염증반응에 관여하는 단백질의 발현을 촉진하는 단백질로서, 상기 면역반응 또는 염증반응에 관여하는 단백질에 의하여 일부가 활성화되는 것으로 알려져 있다(참조: Voraberger et al., J. Immunol., 147:2777-2786, 1991).

NF-kB는 p50/p105(NF-kB1), p52/p100(NF-kB2), c-Rel, RelB 및 p65(RelA)의 다섯 종류의 하위 그룹으로 분류된다. 이러한 NF-kB는 세포내에서 여러 형태의 상동 이량체(homo-dimer) 또는 이형 이량체(hetero-dimer)를 형성하며, 상기 이량체 들은 핵으로 이동하여 상기 단백질의 발현을 촉진시키는데, 외부자극이 없을 때에는 세포질에서 IkB(inhihitor kB) 단백질과 결합되어 불활성화된다. 만일, 외부자극에 의한 세포내 신호전달에 의하여, 상기 IkB가 IkB 키나아제(IkB kinase, IKK)에 의하여 인산화되고 불활성화되면, IkB와 분리된 NF-kB는 핵으로 이동하여 상술한 면역반응 또는 염증반응에 관여하는 단백질의 발현을 촉진시키게 된다(참조: Rothwarf et al., Nature, 395:297-300, 1998; Yamaoka et al., Cell, 93:1231-1240, 1998).

상기 면역반응 또는 염증반응에 관여하는 단백질들은 류마티스 관절염의 시작과 진행에 중요한 역할을 수행하므로, NF-kB가 류마티스 관절염에 있어서 중심적인 역할을 하게 되며, NF-kB의 활성조절은 만성 및 급성 염증질환의 치료에 밀접하게 관련된다. 실제로, NF-kB의 일종인 p65(RelA)(이하, 'NF-kB/RelA'라 함)가 류마티스 관절염의 발병에 주요한 역할을 수행하고, NF-kB/RelA가 관절염 환자의 섬유아세포 유사 활막세포(fibroblast-like synoviocyte, FLS)에서 활성화되며, 현재 임상에서 사용되고 있는 몇가지 항관절염 약들이 NF-kB/RelA의 활성화를 억제하는 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

예를 들어, 글루코코르티코이드(glucocorticoid)는 IkB의 생성을 증가시켜서 NF-kB의 활성을 억제시키고(참조: Auphan et al., Science, 270:286-290, 1995), 아스피린(aspirin), 소듐 살리실산염(sodium salicylate), 금화합물(gold compound), 설파살라진(sulfasalazine), 메토트렉세이트(methotrexate) 등은 IKK의 활성을 억제하고 IkB의 분해를 방지하며 NF-kB의 활성을 억제하고(참조: Yin et al., Nature, 396:77-80, 1998; Jeon et al., J. Immunol., 164:5981-5989, 2000; Wahl et al., J. Clin. Invest., 101:1163-1174, 1998; Majumdar et al., J. Immunol., 167:2911-2920, 2001; Tak et al, Arthritis Rheum., 44:1897-1907, 2001); IKK의 억제제인 IMD-0560은 FLS에 처리하였을 때 IL-6, IL-8 등의 싸이토카인의 생성을 감소시키고, NF-kB/RelA 활성을 억제시킴으로써, 관절염이 완화시킬 수 있음이 보고되었다(참조: Okazaki et al., J. Rheumatol., 32:1440-1447, 2005).

이와 같은 결과들은, 다수의 항관절염 의약들이 류마티스 관절염이 발생한 부위에서 NF-kB/RelA의 활성을 억제함으로써, 상기 질환을 치료할 수 있다는 것을 시사하고 있다. 현재까지 사용되고 있는 항관절염 의약은 대부분 NF-kB/RelA를 단백질 수준에서 불활성화시키거나 또는 IkB의 분해를 억제하는 방식으로 NF-kB/RelA의 활성을 억제시켜서 그 약효를 발휘하고 있다. 그러나, NF-kB/RelA를 단백질 수준에서 불활성화시키는 의약을 관절염 환자에게 투여할 경우, NF-kB/RelA 이외의 다른 단백질까지도 불활성화시켜서 환자의 세포대사를 저해시키는 부작용을 나타내고, IkB의 분해를 억제하는 의약을 관절염 환자에게 투여할 경우, 한 가지 작용기작에 의한 IkB의 분해는 억제할 수 있었으나, 그 외의 다양한 작용기작에 의한 IkB의 분해는 억제할 수 없었기 때문에, 단순히 IkB의 분해를 지체시켜서 관절염의 악화를 지체시키는 효과만을 나타낸다는 단점이 노출되었다.

따라서, 종래의 항관절염 의약의 이러한 단점을 개선시키기 위하여, FLS와 같은 류마티스 관절염을 유발시키는 원인세포에서 NF-kB/RelA를 유전자 수준에서 불활성화시켜서, 류마티스 관절염을 근본적으로 치료하는 유전자 치료제를 개발하는 연구가 진행되었으나, 이처럼 개발된 유전자 치료제는 생체에 필수적인 단백질인 NF-kB/RelA의 유전자를 FLS에서만 특이적으로 불활성화시키지 못하고, 다른 정상적인 조직에도 영향을 미치는 등 그의 부작용으로 인하여, 실용화되지 못하고 있는 실정이다.

따라서, 유전자 수준에서 NF-kB/RelA를 불활성화시킬 수 있는 류마티스 관절염의 치료제를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

기술적 과제

이에, 본 발명자들은 유전자 수준에서 NF-kB/RelA를 불활성화시킬 수 있는 류마티스 관절염의 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, NF-kB/RelA를 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 전기 mRNA를 불활성화시킬 수 있는 siRNA를 설계하여 화학적으로 합성하고, 이를 직접 활막섬유아세포에 도입시켜서, 이 세포내에서 NF-kB/RelA의 발현을 억제시킬 경우, 관절염을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

기술적 해결방법

결국, 본 발명의 주된 목적은 NF-kB/RelA 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, NF-kB/RelA 의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 siRNA를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 치료제를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 30개의 siRNA를 이용하여 형질전환시킨 세포주(HeLa)에서 발현되는 NF-kB/RelA mRNA의 수준을 나타내는 그래프이다.

도 2는 서열번호 17의 siRNA에 의하여 형질전환된 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)내에서 NF-kB/RelA의 mRNA 수준을 나타내는 그래프이다.

도 3은 서열번호 17의 siRNA에 의하여 형질전환된 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)에서 NF-kB/RelA의 mRNA 수준을 나타내는 노던 블럿 결과를 나타내는 사진이다.

도 4는 서열번호 17의 siRNA에 의하여 형질전환된 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)내에서 NF-kB/RelA의 단백질 수준을 나타내는 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.

도 5는 본 발명의 서열번호 17의 siRNA를 이용하여, 형질전환시킨 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)에서 TNF-α 처리에 의해 발현되는 단백질(RelA, IL-1β, IL-6, IL-8, RANTES, BIRC3)들의 mRNA 수준을 실시간 PCR로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6은 서열번호 17의 siRNA에 의하여 형질전환된 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)에서 TNF-α에 의한 IL-6 및 IL-8 발현정도를 나타내는 ELISA 분석결과를 나타내는 그래프이다.

도 7은 서열번호 17, 30, 19, 6의 siRNA 또는 이들의 변형체의 시간의 경과에 따른 혈청내에서의 안정성 감소정도를 나타내는 전기영동사진이다.

도 8은 본 발명의 siRNA 및 이의 변형체를 주사한 마우스의 혈청에서 인터페론-α의 생성정도를 비교한 그래프이다.

도 9는 서열번호 17과 51의 siRNA에 의하여 형질전환된 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)에서 TNF-α에 의한 IL-6, IL-8, cFLIP 및 BIRC3의 mRNA 수준을 실시간 PCR로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 10은 서열번호 17의 siRNA, 서열번호 51의 siRNA 및 서열번호 17과 51의 siRNA에 의하여 각각 형질전환된 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)에서 TNF-α에 의한 세포사멸 정도를 나타내는 현미경 사진이다.

도 11은 서열번호 17의 siRNA, 서열번호 51의 siRNA 및 서열번호 17과 51의 siRNA에 의하여 각각 형질전환된 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)에서 TNF-α에 의한 세포사멸 정도를 나타내는 형광현미경 사진이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

"작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)"라고 알려진 20-25bp 정도의 이중가닥 RNA 단편은 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상을 유발시켜서, 단백질의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이와 같이, siRNA가 단백질의 발현을 억제하는 기작에 대하여는, 세포내에 존재하는 이중가닥 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)가 RNA 절단효소인 다이서(dicer)에 의하여 절단되거나 또는 인공적으로 화학합성된 siRNA가 세포내에서 단백질과 결합하여 RISC(RNA-induced silencing complex) 복합체를 형성하고, 이 복합체가 세포내에서 상기 siRNA에 상보적인 염기서열을 갖는 mRNA와 특이적으로 결합한 다음, 결합된 mRNA를 분해하거나 또는 불활 성화시키는 것으로 알려져 있디. 일반적으로, 이중가닥 RNA 형태인 siRNA가 단일가닥 RNA(single-stranded RNA, ssRNA) 형태인 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 이유는, 상기 RISC 복합체에서 siRNA가 ssRNA 형태로 존재하기 때문인 것으로 보고되었다(참조: Hamilton ＆ Baulcumbe, Science, 286:950-952, 1999; Novina ＆ Sharp, Nature, 430:161-164, 2004).

한편, 상술한 siRNA를 이용하여 세포에서 유전자의 발현을 억제시킴으로써, 특정 세포에서의 특정 유전자의 기능을 규명할 수 있을 뿐만 아니라, 감염성 바이러스 또는 암세포 등에서는 해당 유전자와 연관된 질병을 치료하는 방법을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다(참조: McCaffrey et al., Nature Biotechnology, 21:639-644, 2003; Giladi et al., Molecular Therapy, 8:769-776, 2003; konishi et al., Hepatology, 38:842-850, 2003).

이에, 본 발명자들은 류마티스 관절염의 발병원인인 NF-kB/RelA의 발현을 억제하기 위하여 다양한 연구를 수행하였는 바, siRNA를 이용하여 NF-kB/RelA 단백질의 발현을 억제할 수 있음에 주목하고, NF-kB/RelA를 암호화하는 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있도록 설계한 siRNA를 목적하는 세포에 도입시켜서, 상기 단백질의 발현을 억제시키고자 하였다.

우선, 본 발명자들은 GenBank에서 검색된 NF-kB/RelA mRNA 서열(NM_021975)(서열번호 53)에 근거하여, 하기의 서열번호 1 내지 30의 염기서열을 갖는 siRNA를 각각 설계하고, 이를 화학적으로 합성하였다.

5'-cgaauggcucgucuguagu-3'(서열번호 1),

5'-ggagcacagauaccaccaa-3'(서열번호 2),

5'-gcauccagaccaacaacaa-3'(서열번호 3),

5'-ccuuccaaguuccuauaga-3'(서열번호4),

5'-ggacuacgaccugaaugcu-3'(서열번호 5),

5'-ucugcuuccaggugacagu-3'(서열번호 6),

5'-guccuuccucaucccaucu-3'(서열번호7),

5'-cucaucccaucuuugacaa-3'(서열번호 8),

5'-caucccaucuuugacaauc-3'(서열번호 9),

5'-ucuuccuacugugugacaa-3'(서열번호 10),

5'-cuccuuuucgcaagcugau-3'(서열번호 11),

5'-cugaugugcaccgacaagu-3'(서열번호 12),

5'-cucagugagcccauggaau-3'(서열번호 13),

5'-ccauggaauuccaguaccu-3'(서열번호 14),

5'-gucaccggauugaggagaa-3'(서열번호 15),

5'-ggauugaggagaaacguaa-3'(서열번호 16),

5'-gauugaggagaaacguaaa-3'(서열번호 17),

5'-aggacauaugagaccuuca-3'(서열번호 18),

5'-ggacauaugagaccuucaa-3'(서열번호 19),

5'-ccuucaagagcaucaugaa-3'(서열번호 20),

5'-ccugagcaccaucaacuau-3'(서열번호 21),

5'-guuucccaccaugguguuu-3'(서열번호 22),

5'-ucccaccaugguguuuccu-3'(서열번호 23),

5'-caccaugguguuuccuucu-3'(서열번호 24),

5'-gcagcugcaguuugaugau-3'(서열번호 25),

5'-ggaguacccugaggcuaua-3'(서열번호 26),

5'-gaguacccugaggcuauaa-3'(서열번호 27),

5'-guacccugaggcuauaacu-3'(서열번호 28),

5'-ugagucagaucagcuccua-3'(서열번호 29),

5'-gagucagaucagcuccuaa-3'(서열번호 30),

상기 합성된 각각의 siRNA를 종양세포에 형질도입시킨 결과, 종양세포내에서 NF-kB/RelA를 암호화하는 mRNA의 수준이 저하되었고, 특히 서열번호 2, 3, 8, 9, 14, 16, 17, 26, 27, 28 및 30으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 가지는 siRNA를 사용함이 바람직하며, 서열번호 17의 siRNA을 사용함이 가장 바람직한 결과를 나타냄을 알 수 있었다.

뿐만 아니라, 상기 서열번호 17의 siRNA를 섬유아세포 유사 활막세포(fibroblast-like synoviocyte, FLS)에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체에 NF-kB/RelA를 활성화시킬 수 있는 TNF-α를 처리할 경우, IL-6, IL-8, IL-1β, BIRC3, RANTES 등의 NF-kB/RelA에 의하여 조절되는 단백질들의 발현유도 정도가 감소하고 세포배양 배지로 분비된 IL-6와 IL-8의 양이 크게 증가하지 않음을 확인할 수 있었다.

아울러, FLS에 서열번호 17의 siRNA를 도입하여 수득한 형질전환체에 TNF-α를 처리할 경우, 형질전환체가 사멸함을 현미경적 방법으로 확인하였다. 상기 수득한 형질전환체는 비정상적으로 비후된 활막의 세포와 동일한 것으로 간주될 수 있으므로, 형질전환체가 사멸한다는 실험결과로부터, 서열번호 17의 siRNA가 NF-kB/RelA에 의하여 유발된 관절염을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

이에 따라, 본 발명의 류마티스 관절염 치료제는 세포내에서 NF-kB/RelA를 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, NF-kB/RelA 발현을 억제하는 서열번호 1 내지 30 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 siRNA를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 이때, 각 siRNA의 염기에 2'-O-메틸기(2'-O-methyl) 또는 포스포로티오에이트기(phosphorothioate)를 도입하여 제조한 변형체 siRNA는 변형되지 않은 siRNA에 비하여, NF-kB/RelA의 발현을 동등한 수준으로 감소시키면서도, 혈청내에서 현저하게 우수한 안정성을 나타내었을 뿐만 아니라, siRNA의 접종으로 인하여 발생하는 생체내에서의 면역반응을 억제시킬 수 있었으므로, 상기 염기서열의 각 염기에 2'-O-메틸기 또는 포스포로티오에이트기가 추가로 도입될 수도 있다. 또한, 상기 염기서열의 3'-말단에 1 또는 2개의 비결합(unpaired) 뉴클레오타이드를 갖는 3' 오버행(overhang)을 추가로 포함할 수도 있다.

한편, NF-kB/RelA의 발현을 억제하는 siRNA와 또 다른 그룹의 유사 단백질인 NF-kB1의 발현을 억제하는 siRNA를 이용하여, 상기 두 가지 단백질을 동시에 억제하였을 경우, 보다 효과적으로 관절염 증상을 치료할 수 있음을 알 수 있었다. 실 제로, NF-kB/RelA의 발현을 억제하는 siRNA(서열번호 17)와 NF-kB1의 발현을 억제하는 siRNA(서열번호 51)을 동시에 처리한 FLS에서는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고, 비정상적으로 증식하는 FLS의 세포사멸을 유도하여, 보다 효과적으로 관절염 증상을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

이에 따라, 본 발명의 류마티스 관절염 치료제는 제 1항에 개시된 서열번호 1 내지 30 중 어느 하나의 염기서열을 가지고, NF-kB/RelA의 발현을 억제하는 siRNA 및 서열번호 51의 염기서열을 가지고, NF-kB1의 발현을 억제하는 siRNA를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

상기 류마티스 관절염 치료제는 세포내에서 NF-kB/RelA를 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합할 수 있는 siRNA를 리포솜 또는 폴리머등의 약물전달체와 나노 크기의 입자를 형성 후 주사용 조성물과 혼합하여 염증이 발생한 부위에 주사형태로 투여하거나, 겔 조성물 또는 경피흡수용 점착 조성물과 혼합하여, 직접 환부에 바르거나 붙여서 투여할 수 있도록 구현함이 바람직하다: 이때, 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 전기 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제)를 함유하며, 겔 조성물은 카르복시메틸 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 아크릴산 중합체, 카르보폴(carbopol) 등의 젤 제제와 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유하며, 경피 흡수용 점착제제는 유효성분층이 점착제층, 피지흡수를 위한 흡착층 및 치료약물층을 포함하고, 치료 약물층은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유한다.

siRNA의 유효량

본 발명의 류마티스 관절염 치료제의 유효성분인 siRNA의 투여량은, 환자의 연령, 성별, 증상, 투여방법 또는 예방목적에 따라, 체중 kg 당 0.5 내지 2.5mg을 1일 1회 내지 3회로 나누어 비경구 투여할 수 있다. 특이 증상을 나타내는 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 등에 따라 당업자가 투여량을 변화시킬 수도 있다.

siRNA의 급성독성

6 내지 7주령 된 비설치류 비글견(beagle)을 대상으로 본 발명의 siRNA를 비경구투여하여 24시간내의 개체사망율을 조사하였으며, 이때 암컷은 6 내지 8kg인 개체를, 수컷은 7 내지 9kg인 개체를 각각 8마리 사용하였다. 그 결과, 50mg/kg 까지 죽은 개체가 발생하지 않았는 바, 본 발명의 본 발명의 류마티스 관절염 치료제의 유효성분인 siRNA는 kg당 50mg까지도 급성독성을 관찰할 수 없을 만큼 안전하므로, 생체내에 안전하게 투여할 수 있다.

본 발명의 류마티스 관절염 치료제는 유전자 수준에서 NF-kB/RelA의 발현을 직접적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 비정상적으로 증식하는 활막세포의 사멸을 유도할 수 있으므로, 보다 효과적인 류마티스 관절염의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: NF-kB/RelA mRNA와 결합하는 siRNA의 제조

GenBank에서 검색된 NF-kB/RelA mRNA 서열(NM_021975)(서열번호 53)을 이용하여 siRNA가 결합할 수 있는 목표 염기서열을 디자인하고, 전기 목표 염기서열과 결합할 수 있는 siRNA를 제조하였다.

먼저, Turbo si-Designer siRNA 디자인 프로그램(바이오니아, 한국)을 사용하여, GenBank에서 검색된 NF-kB/RelA mRNA 서열(NM_021975)에서 siRNA가 결합할 수 있는 목표 염기서열을 디자인하였다. 이어, β-시아노에틸 포스포라미다이트(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 DNA 구조의 골격을 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해가는 방법을 사용하여(참조: Sinha et al., Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984), 전기 디자인된 NF-kB/RelA mRNA와 결합할 수 있는 30종의 siRNA(서열번호 1 내지 30)를 각각 합성하였다.

구체적으로, 서열번호 1 내지 30의 RNA 서열(센스 RNA) 및 이들의 상보적인 RNA 서열(안티센스 RNA)을 각각 설계하고, RNA 합성기(Perseptive Biosystems 8909, PE Biosystems, USA)를 사용하여, 뉴클레오티드가 부착된 고형지지체 상에서, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캐핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여, 상기 설계된 센스 RNA 및 안티센스 RNA를 포함하는 반응물을 수득하였다. 그런 다음, 전기 반응물을 Daisogel C18컬럼(Daiso, Japan)을 구비한 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)에 적용하 여 각각의 RNA를 분리하고, 이를 MALDI-TOF 질량 흡광분석기(Shimadzu, Japan)에 적용하여, 합성하고자 하는 각각의 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 이어, 동량의 각각의 센스 RNA 및 안티센스 RNA를 결합 완충용액(30mM HEPES-KOH(pH 7.4), 100mM potassium acetate, 2mM magnesium acetate)에 가하고, 90℃에서 2분 및 37℃에서 1시간 동안 반응시켜서, 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합된 이중가닥의 siRNA(서열번호 1 내지 30)를 각각 제조하였다.

실시예 2: 종양 세포주(HeLa)에서의 NF-kB/RelA의 발현을 억제하는 siRNA의 선별

전기 실시예 1에서 제조한 각각의 siRNA를 이용하여, 종양 세포주인 인간 자궁암 세포(HeLa)를 형질전환시키고, 전기 형질전환된 종양 세포주에서 NF-kB/RelA의 발현양상을 측정하여, 낮은 수준의 NF-kB/RelA mRNA를 나타낼 수 있는 siRNA를 선별하였다.

실시예 2-1: 인간 자궁암 세포(HeLa)의 배양

미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 자궁암 세포(HeLa, CCL-2)를 RPMI 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10％(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100units/ml 및 스트렙토마이신 100㎍/ml)에서 37℃, 5％(v/v) CO₂ 의 조건하에 배양하였다.

실시예 2-2: siRNA를 이용한 인간 자궁암 세포(HeLa)의 형질전환

전기 실시예 2-1에서 배양된 인간 자궁암 세포주(HeLa, CCL-2) 2.5 X 10⁵세 포를 6-웰 플레이트에서 각각 전기 실시예 2-1 의 조건으로 24시간 동안 배양하고, Opti-MEM 배지(GIBCO/Invitrogen, USA)로 세척한 다음, 각 웰당 500㎕의 Opti-MEM 배지를 분주하였다.

한편, 전기 배양된 세포주를 형질전환시키기 위한 형질전환용 용액은 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000, Invitrogen, USA) 3.5㎕와 Opti-MEM 배지 250㎕를 혼합하고, 실온에서 5분간 반응시킨 1차 용액 및 전기 실시예 1에서 제조한 각각의 siRNA를 최종 농도가 200pM(200fmol/ml)로 되도록 Opti-MEM 배지 250㎕에 첨가한 2차 용액을 각각 준비한 다음, 상기 1차 용액과 2차 용액을 혼합하고, 다시 실온에서 20분간 반응시켜서, 형질전환용 용액 500㎕를 제조하였다.

이어, 전기 Opti-MEM이 500㎕씩 분주된 종양 세포주의 각 웰에 형질전환용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고, 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하고, 각 종양 세포주에 RPMI 배양배지 2.0㎖를 각 웰에 분주한 다음, 24시간 동안 37℃, 5％(v/v) CO₂ 의 조건하에 배양하였다.

실시예 2-3: NF-kB/RelA mRNA의 정량분석

RNA 추출키트(RNeasy mini kit, Qiagen, Germany)를 이용하여, 전기 실시예 2-2에서 배양된 형질전환된 종양 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 전체 RNA 중 NF-kB/RelA mRNA의 양을 실시간 PCR(Real-time PCR) 방법을 사용하여, 다음과 같은 방법으로 정량하였다.

즉, 각 시료의 전체 RNA 2㎍을 oligo-dT (500ng/㎕) 0.5㎕ 및 dNTP(각 2.5mM) 3.2㎕와 같이 혼합하고, 70℃에서 5분간 반응시킨 다음, 얼음에서 1분간 냉각시키고, 역전사효소(Superscript II(200U/㎕), Invitrogen) 1㎕, 5X 반응완충액 4㎕ 및 적량의 멸균수를 혼합하여, 전체 부피를 20㎕로 맞춘 후, 42℃에서 1시간 반응시키고, 70℃에서 15분동안 반응시켜서 각각의 cDNA를 수득하였다. 이어, 각각의 cDNA 0.5㎕, 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems Prism 7900 Sequence Detection System, Applied Biosystems, USA)의 SYBR Green Master Mix 10㎕, NF-kB/RelA 및 표준곡선 작성시 사용하기 위한 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)에 특이적인 각각의 센스 프라이머(10pmol/㎕) 0.5㎕ 및 안티센스 프라이머(10pmol/μl) 0.5㎕을 혼합한 다음, 실시간 PCR을 수행하였다(50℃에서 2분, 95℃에서 10분 초기 반응 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 40회 반복).

이때, 사용된 센스 프라이머와 안티센스 프라이머의 서열은 다음과 같다:

NF-kB/RelA 특이적인 센스 프라이머: 5'-ctgcagtttgatgatgaaga-3'(서열번호 31),

NF-kB/RelA 특이적인 안티센스 프라이머: 5'-taggcgagttatagcctcag-3'(서열번호 32),

GAPDH 특이적인 센스 프라이머: 5'-tgcaccaccaactgcttagc-3'(서열번호 33)

GAPDH 특이적인 안티센스 프라이머: 5'-ggcatggactgtggtcatgag-3'(서열번호 34).

PCR이 종료된 후, cDNA 표준곡선을 사용하여, 각각의 수득한 NF-kB/RelA PCR 산물의 양 및 GAPDH PCR 산물의 양을 측정하고, NF-kB/RelA의 측정값을 GAPDH의 측정값으로 나누어, NF-kB/RelA 상대적 발현량을 산출하고, 이로부터 NF-kB/RelA mRNA의 발현감소율을 비교하였다(참조: 도 1).

도 1은 본 발명의 30개의 siRNA를 이용하여 형질전환시킨 세포주(HeLa)에서 발현되는 NF-kB/RelA mRNA의 수준을 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 서열번호 1 내지 30의 siRNA가 처리된 각각의 세포주에서 NF-kB/RelA mRNA의 수준이 각각 상이하였는 바, 처리된 각각의 siRNA에 의하여 세포주에서의 NF-kB/RelA mRNA 수준이 변화될 수 있음을 확인하였다. 또한, 서열번호 2, 3, 8, 9, 14, 16, 17, 26, 27, 28 및 30의 siRNA를 이용할 경우, 세포주에서 상대적으로 낮은 수준으로 NF-kB/RelA mRNA가 발현됨을 확인할 수 있었다.

실시예 3: siRNA를 이용한 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)에서의 NF-kB/RelA의 발현억제

전기 실시예 2에서 조사한 각각의 siRNA중 NF-kB/RelA mRNA의 발현억제 효과가 가장 뛰어난 siRNA중 하나인 서열번호 17의 siRNA를 사용하여, 활막섬유아세포를 형질전환시키고, 전기 형질전환된 활막섬유아세포에서 NF-kB/RelA의 발현양상 및 TNF-α 처리에 의한 타겟 유전자들의 발현유도 억제정도를 측정하였다.

실시예 3-1: 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)의 배양

관절치환수술을 받은 관절염 환자로부터 채취한 활막(synovial membrane)을 2∼3mm의 크기로 세절하고 PBS 9ml에 침지한 다음, 콜라겐분해효소(1％ type II collagenase, Sigma Chem. Co., USA)로 37℃, 5％(v/v) CO₂ 의 조건에서 4시간 동안 반응시켰다. 이어, DMEM 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10％(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100units/ml 및 스트렙토마이신 100㎍/ml) 5ml을 넣어 콜라겐분해효소의 활성을 억제한 후, 원심분리하여 세포를 분리하였다. 전기 분리된 세포를 DMEM 배양배지 15ml에 가하고, 37℃, 5％(v/v) CO₂ 의 조건하에서 하룻밤동안 배양시킨 후, 배양용기의 바닥에 부착된 세포만을 선별한 다음, 이를 DMEM 배양배지에서 동일한 조건으로 다시 배양하였다. 이후, 계대배양을 거듭하여 3 내지 6기(passage 3-6)의 섬유아세포 유사 활막세포(fibroblast-like synoviocyte, FLS)을 수득하였다.

실시예 3-2: siRNA를 이용한 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)의 형질전환

전기 실시예 3-1에서 배양된 FLS 2.5 X 10⁵세포를 6-웰 플레이트에서 전기 실시예 3-1의 조건으로 24시간 동안 배양하고, Opti-MEM 배지(GIBCO/Invitrogen, USA)로 세척한 다음, 각 웰당 500㎕의 Opti-MEM 배지를 분주하였다.

전기 배양된 FLS를 형질전환시키기 위한 형질전환용 용액은 전기 실시예 2-2의 방법으로 제조하고, 상기 형질전환 용액에서 FLS를 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하고, DMEM 배양배지 2.0㎖를 각 웰에 분주한 다음, 37℃, 5％(v/v) CO₂ 의 조건하에 다시 배양하여, 형질전환된 FLS를 수득하였다.

실시예 3-3: NF-kB/RelA mRNA의 정량분석

RNA 추출키트(RNeasy mini kit, Qiagen, Germany)를 이용하여, 전기 실시예 3-2에서 배양된 형질전환된 FLS로부터 형질전환 24시간 경과 후 전체 RNA를 추출하 고, 추출된 전체 RNA 중 NF-kB/RelA mRNA의 양을 실시간 PCR 방법을 사용하여, 전기 실시예 2-3과 같은 방법으로 정량하였다. 이때, 사용된 NF-kB/RelA와 GAPDH 특이적인 센스 및 안티센스 프라이머 서열들은 전기 실시예 2-3과 동일하였다(참조: 도 2). 도 2는 서열번호 17의 siRNA에 의하여 형질전환된 FLS내에서 NF-kB/RelA의 mRNA 수준을 나타내는 그래프이다. 도 2에서 보듯이, 서열번호 17의 siRNA로 형질전환된 FLS에서는 NF-kB/RelA mRNA의 수준이 현저히 감소됨을 알 수 있었다.

실시예 3-4: NF-kB/RelA mRNA의 노던 블럿(Northern blot) 분석

전기 실시예 3-2에서 배양된 형질전환된 FLS를 대상으로 하고, NF-kB/RelA 유전자의 일부서열을 갖는 프로브를 이용하여, 노던 블럿을 수행하였다.

즉, RNA 추출키트(RNeasy mini kit, Qiagen, Germany)를 이용하여, 전기 실시예 3-2에서 배양된 형질전환된 FLS로부터 형질전환 24시간 후 전체 RNA를 추출하고, 추출된 전체 RNA 10㎍을 1％ 아가로스/포름알데히드 젤 상에서 전기영동하고, Hybond-N+나일론 막(Amersham, USA)에 전이시킨 다음, UV 크로스링커(Amersham, USA)를 사용하여 막에 UV-가교결합(crosslinking)시켰다. 이어, RNA가 가교결합된 나일론 막을 혼성화 용액에 침지하고, 65℃에서 30분간 예비 잡종화시켰다(참조: Church ＆ Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:1991-1995, 1984). 그런 다음, 열-변성된 방사성 NF-kB/RelA 프로브를 첨가하여 65℃에서 20시간동안 혼성화시켰다.

이때, 열-변성된 방사성 NF-kB/RelA 프로브는 네스티드(nested) PCR 방법과 라벨링 키트를 사용하여, 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 먼저, NF-kB/RelA cDNA를 주형으로 하고, 하기의 센스 프라이머(서열번호 35)와 안티센스 프라이머(서열번호 36)를 이용하여, PCR을 수행하여 PCR 절편을 수득하였다. 상기 수득한 PCR 절편을 주형으로 하고, 하기의 센스 프라이머(서열번호 37)와 안티센스 프라이머(서열번호 36)를 사용한 PCR을 수행하여 NF-kB/RelA 유전자의 염기서열 611번에서 1582번을 포함하는 972bp의 DNA 단편을 작제하였다. 이후, 전기 작제된 DNA 단편과 α-³²P을 라벨링 키트(Prime-It II random primer, Stratagene, USA)에 적용하여 열-변성된 방사성 프로브를 제조하였다.

센스 프라이머 5'-gactacgacctgaatgctgt-3'(사열번호 35)

안티센스 프라이머: 5'-ctaggcgagttatagcctca-3'(서열번호 36)

센스 프라이머: 5'-ctcatcccatctttgacaat-3'(서열번호 37)

안티센스 프라이머: 5'-ctaggcgagttatagcctca-3'(서열번호 36)

또한, 비교실험군으로서 β-액틴 mRNA를 이용하였는데, 이를 위한 프로브는 β-액틴(NM_001101) cDNA를 주형으로 하고, 하기 센스 프라이머(서열번호 38)와 안티센스 프라이머(서열번호 39)를 이용하여, PCR을 수행한 다음, 수득한 PCR 절편을 주형으로 하고, 하기 센스 프라이머(서열번호 38)와 안티센스 프라이머(서열번호40)를 사용한 PCR을 수행하여 β-액틴 유전자의 염기서열 433번에서 1220번까지를 포함하는 788bp의 DNA 단편을 작제하였다. 전기 작제된 DNA 단편과 α-³²P을 라벨링 키트에 적용하여 대조군에 대한 방사성 프로브를 제조하였다.

센스 프라이머 5'-ccagatcatgtttgagacct-3'(서열번호 38)

안티센스 프라이머: 5'-aaacaacaatgtgcaatcaa-3'(서열번호 39)

센스 프라이머· 5'-ccagatcatgtttgagacct-3'(서열번호 38)

안티센스 프라이머: 5'-caactaagtcatagtccgcc-3'(서열번호40)

NF-kB/RelA 프로브로 혼성화가 종료된 나일론 막을 세척하고, X-선 필름에 3일 동안 감광시킨 다음, 인화하였다. 이어, 나일론 막을 액틴 프로브로 혼성화 및 세척하고, X-선 필름에 1시간동안 감광시킨 다음, 인화하고, 인화된 각 필름을 비교하였다(참조: 도 3). 이때, 대조군으로는 NF-kB/RelA의 발현을 억제시키지 못하는 NC siRNA(5'-ccuacgccaccaauuucgu-3', 서열번호 52)로 형질전환된 FLS를 이용하였다.

도 3는 서열번호 17의 siRNA에 의하여 형질전환된 FLS내에서 NF-kB/RelA의 mRNA 수준을 나타내는 노던 블럿 사진으로서, NC는 대조군을 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 본 발명의 siRNA를 처리하면, NF-kB/RelA의 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준이 감소됨을 알 수 있는 바, 이로부터 본 발명의 siRNA가 NF-kB/RelA의 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3-5: NF-kB/RelA 단백질의 웨스턴 블럿(Western blot) 분석

전기 실시예 3-2에서 배양된 형질전환된 FLS를 대상으로 하고, NF-kB/RelA 단백질에 대한 항체를 이용하여, 웨스턴 블럿을 수행하였다.

구체적으로, 형질전환 후 72시간이 경과한 전기 실시예 3-2에서 배양된 형질전환된 FLS에 50ng/ml의 농도로 TNF-α(Sigma Chem. Co., USA)를 처리하고 1시간 동안 배양한 다음, 단백질 추출키트(Protein Purifying kit, IntroBioTechnology, 대한민국)를 이용하여, 전체 세포내 단백질을 추출하였다. 추출된 전체 단백질 40㎍을 SDS 샘플 완충용액(Santa Cruz Biotechnology, USA)으로 처리한 후, 4-20％ SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE)에 적용하였다. 그런 다음, 1차 항체로는 항-NF-kB/RelA 단일클론 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 사용하고, 2차 항체로는 고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 항-마우스항체(Pierce, USA)를 사용한 웨스턴 블롯을 수행하였다(참조: 도 4). 이때, 대조군으로는 NC siRNA(서열번호 52)로 형질전환된 FLS를 이용하였다.

도 4는 서열번호 17의 siRNA에 의하여 형질전환된 FLS내에서 NF-kB/RelA의 단백질 수준을 나타내는 웨스턴 블럿 사진으로서, NC는 대조군을 나타낸다.그 결과, 도 4에서 보듯이 서열번호 17의 siRNA를 처리한 경우 NF-kB/RelA 단백질의 발현량이 현저히 감소된 것을 알 수 있었다.

실시예 3-6: NF-kB/RelA에 의해 발현이 유도되는 단백질의 mRNA 정량분석

NF-kB/RelA의 발현이 억제된 세포에서 NF-kB/RelA에 의해 발현이 촉진되는 면역반응 또는 염증반응에 관여하는 단백질들인 IL-1β, IL-6, IL-8, RANTES(Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted) 및 BIRC3(Baculoviral IAP repeat-containing 3)의 mRNA 수준을 측정하였다.

구체적으로, 형질전환후 72시간이 경과한 전기 실시예 3-2에서 배양된 형질전환된 FLS에 50ng/ml의 농도로 TNF-α(Sigma Chem. Co., USA)를 처리하고 12시간 동안 배양한 다음, RNA 추출키트(RNeasy mini kit, Qiagen, Germany)를 이용하여, 전체 RNA를 추출하였다.

추출된 전체 RNA중 IL-Iβ, IL-6, IL-8, RANTES, 및 BIRC3의 mRNA의 양을 실시간 PCR 방법을 사용하여, 전기 실시예 2-3과 같은 방법으로 정량하고, 비교하였다(참조: 도 5). 이때, 이때, 대조군으로는 NC siRNA(서열번호 52)로 형질전환된 FLS를 이용하고, 사용된 특이적인 센스 및 안티센스 프라이머 서열들은 다음과 같다:

IL-Iβ 특이적인 센스 프라이머 5'-cccaactggtacatcagcac-3'(서열번호 41),

IL-Iβ 특이적인 안티센스 프라이머 5'-ggaagacacaaattgcatgg-3'(서열번호 42),

IL-6 특이적인 센스 프라이머 5'-ggcacctcagattgttgttg-3'(서열번호 43),

IL-6 특이적인 안티센스 프라이머 5'-taagttctgtgcccagtgga-3'(서열번호 44),

RANTES 특이적인 센스 프라이머 5'-gggttcgggagtacatcaac-3'(서열번호 45),

RANTES 특이적인 안티센스 프라이머 5'-cctcccaagctaggacaaga-3'(서열번호 46),

BIRC3 특이적인 센스 프라이머 5'-cctagctgcagattcgttca-3'(서열번호 47),

BIRC3 특이적인 안티센스 프라이머 5'-gagccacggaaatatccact-3'(서열번호 48),

IL-8 특이적인 센스 프라이머 5'-gcagagggttgtggagaagt-3'(서열번호 49),

IL-8 특이적인 안티센스 프라이머 5'-ccctacaacagacccacaca-3'(서열번호 50).

도 5은 본 발명의 서열번호 17의 siRNA를 이용하여, 형질전환시킨 FLS에서 TNF-α 처리에 의해 발현되는 단백질(RelA, IL-1β, IL-6, IL-8, RANTES 및 BIRC3)들의 mRNA 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프로서 NC는 대조군을 나타낸다. 도 5에서 보듯이, 대조군에서는 TNF-α 처리에 의해 상기 모든 단백질들의 mRNA 수준이 증가하였으나, 서열번호 17의 siRNA로 형질전환된 FLS에서는 TNF-α를 처리하더라도, 상기 모든 단백질들의 mRNA 수준이 특별히 증가되지 않았다. 이로부터, 본 발명의 siRNA가 NF-kB/RelA의 활성을 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3-7: 효소면역분석법(ELISA)에 의한 분석

전기 실시예 3-2에서 배양된 형질전환된 FLS를 대상으로 하고, IL-6 와 IL-8 단백질에 대한 항체를 이용한 ELISA 키트(Quantikine HIGH sensitivity human IL-6 와 IL-8 kit, R＆D Systems, USA)를 이용하여 배양액으로 분비된 IL-6 및 IL-8의 양을 측정하기 위한 효소면역분석법(ELISA)을 수행하였다.

즉, 형질전환 후 72시간이 경과된 전기 실시예 3-2에서 배양된 형질전환된 FLS에 50ng/ml의 농도로 TNF-α를 처리하고 12시간동안 배양한 다음, 배양액을 수득하고, 이를 1/5000로 희석하여 시료를 준비하였다. 또한, 표준시약은 상기 ELISA 키트에 포함된 IL-6 또는 IL-8표준시약에 상기 키트에 포함된 검량희석액(Calibrator Diluent RD6-11)을 넣어 각각 0pg/ml, 0.156pg/ml, 0.312pg/ml, 0.625pg/ml, 1.25pg/ml, 2.5pg/ml, 5pg/ml 및 10pg/ml로 희석하여 준비하였다.

상기 키트에 포함된 IL-6 또는 IL-8에 대한 쥐 단클론항체가 코팅된 96-웰 플레이트에 상기 키트에 포함된 분석시약(Assay Diluent RD1-75)을 각 웰당 100㎕ 씩 넣고, 상기 준비된 시료와 각각의 희석된 IL-6 또는 IL-8 표준시약을 각 웰당 100㎕씩 넣어 하룻밤동안 반응시킨 다음, 상기 키트에 포함된 세척액으로 각 웰을 반복하여 세척하였다. 이어, 각 웰에 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)가 결합된 IL-6 또는 IL-8 다클론항체를 200㎕씩 넣고 교반기 위에서 450rpm으로 2시간 동안 반응시킨 다음, 상기 세척액을 사용하여 다시 반복하여 세척하였다. 그런 다음, 무균 실험대 안에서 기질 용액을 각 웰당 50㎕씩 넣고 60분 동안 반응시킨 후, 증폭용액을 각 웰당 50㎕씩 넣고 30분을 반응시켰다. 이어, 정지액을 각 웰당50㎕씩 넣고 30분 이내에 플레이트 리더(SPECTRAmaxPLUS384, Molecular Devices, USA)를 사용하여 흡광도 690nm에서 측정하였다(참조: 도 6). 이때, 대조군은 NF-kB/RelA의 발현을 억제시키지 못하는 NC siRNA(5'-ccuacgccaccaauuucgu-3', 서열번호 52)로 형질전환된 FLS를 사용하였다.

도 6는 서열번호 17의 siRNA에 의하여 형질전환된 FLS에서 TNF-α 에 의한 IL-6 및 IL-8 발현정도를 나타내는 ELISA 분석결과를 나타내는 그래프로서, NC는 대조군을 나타내고, (□)는 IL-6를 나타내며, (■)는 IL-8을 각각 나타낸다. 도 6에서 보듯이, 대조군의 경우 TNF-α로 처리하면 세포배양액내의 IL-6와 IL-8 양이 크게 증가하지만, 서열번호 17의 siRNA로 처리한 경우 TNF-α를 처리하여도 IL-6와 IL-8의 양이 크게 변화되지 않았다. 이로부터, 본 발명의 siRNA는 NF-kB/RelA에 의한 IL-6 또는IL-8의 발현 및 세포외부로의 분비를 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: 변형된 siRNA의 제조 및 효과검증

실시예 4-1: 변형된 siRNA의 제조

RNA의 안정성을 증가시키는 것으로 알려진, 2'-O-메틸기(2'-O-methyl)와 포스포로티오에이트기(phosphorothioate)가 도입된 염기(Dharmacon, Lafayette, Co., USA)를 사용하는 것을 제외하고는, 서열번호 17, 30, 19 및 6의 siRNA를 실시예 1과 동일한 방법으로 각각의 변형체를 제조하였다(참조: 표 1).

표 1

서열번호 17, 30, 19, 6의 siRNA의 변형체에 있어서, 변형된 위치와 수식

상기 표 1에서, 센스 염기서열에 표시된 밑줄친 염기 는 각 염기에 메틸기(2'-O-methyl)가 부가된 변형을 나타내고, 안티센스 염기서열에 표시된 밑줄친 염기는 각 염기에 포스포로티오에이트기가 부가된 변형을 의미한다.

실시예 4-2: 변형된 siRNA에 의한 NF-kB/RelA mRNA의 발현율 측정

상기 실시예 4-1에서 제조한 각 변형체를 이용하는 것을 제외하고는, 전기 2-2의 방법을 이용하여 형질전환된 인간 자궁암 세포(HeLa)를 각각 수득하였다. 그런 다음, 각 변형체로 형질전환된 인간 자궁암 세포(HeLa)를 대상으로 상기 실시예 2-3과 동일한 방법을 수행하여, 각 변형체로 형질전환된 인간 자궁암 세포(HeLa)에서 NF-kB/RelA mRNA의 발현정도를 측정하였다. 또한, NC siRNA(5'-ccuacgccaccaauuucgu-3', 서열번호 52)로 형질전환된 인간 자궁암 세포(HeLa)에서의 NF-kB/RelA mRNA의 발현정도를 100％로 하고, 이를 기준으로 하여 상기 측정된 각 NF-kB/RelA mRNA의 발현정도를 산출하였다(참조: 표 2). 이때, 대조군으로는 변형되지 않은 서열번호 17, 30, 19 및 6의 siRNA를 이용하여 형질전환된 인간 자궁암 세포(HeLa)에서 얻어진 NF-kB/RelA mRNA를사용하였다.

표 2

정상 또는 변형된 siRNA에 의하여 형질전환된 인간 자궁암 세포(HeLa)에서 NF-kB/RelA mRNA의 발현율(단위 ％)

상기 표 2에서 보듯이, 대부분의 변형체(17(FM/P), 17(FM/AS), 30(FM/P), 19(FM/P), 6(FM/P))가 변형되지 않은 siRNA와 유사하거나 또는 약간 높은 수준의 NF-kB/RelA mRNA의 발현율을 나타내었다.

실시예 4-3: 변형된 siRNA에 의한 NF-kB/RelA mRNA의 혈액내 안정성 측정

먼저, 건강한 사람의 혈액을 수득하고, 이를 상온에서 3시간 방치한 다음, 원심분리(3000rpm, 15분)하여 상층액인 혈청을 수득하였다. 상기 혈청 10％(v/v), RNA 분해효소 억제제인 디에틸피로카보네이트(diethylpyrocarbonate, DEPC)로 처리된 물을 포함하는 용액 90㎕에, 상기 실시예 4-1에서 제조한 각 변형체 9㎍을 가하고, 37℃에서 72시간 동안 방치하였다. 이때, 0, 1, 3, 6, 24, 48, 및 72시간이 경과한 시점에서 12㎕씩을 분주하여, -70℃에 즉시 얼려서 보관하고, 보관된 각각의 시간별 시료 2.5㎕를 12％ SDS 전기영동(SDS PAGE)에 적용하여, 혈청내에서 각 siRNA가 유지되는 지의 여부를 확인하였다(참조: 도 7).

도 7는 서열번호 17, 30, 19, 6의 siRNA 또는 이들의 변형체의 시간의 경과에 따른 혈청내에서의 안정성 감소정도를 나타내는 전기영동사진이다. 도 7에서 보듯이, 변형되지 않은 서열번호 17, 30, 19 및 6의 siRNA 보다는 변형체가 장기간 동안 유지됨을 확인하였다.

실시예 4-4: 변형체 siRNA의 면역반응 억제효과

본 발명의 siRNA 및 이의 변형체가 체내에서 면역반응을 유발시킬 수 있는지의 여부를 확인하였다.

구체적으로, 서열번호 17의 siRNA 및 상기 실시예 4-1에서 제조한 변형체(17(FM/P), 17(FM/AS))를 각각 인비보 메가펙틴 리포솜(in vivo Megafectin; Qbiogene, USA)에 결합시켜서 siRNA/리포솜 복합체를 수득하고, 수득한 각 복합체를 마우스의 꼬리정맥에 주사한 후, 인터페론-α 단백질에 대한 항체를 포함하는 ELISA 키트(Quantikine mousc INF-α kit, R＆D Systems, USA)에 적용하여, 혈청내의 인터페론-α의 양을 측정하였다.

이때, siRNA/리포솜 복합체는 다음과 같은 방법으로 수득하였다: 인비보 메가펙틴(in vivo Megafectin, Qbiogene, USA)을 100㎕ 완충용액(Hepes-buffered saline)에 용해시키고, 이를 50㎍ siRNA(서열번호 17), 17(FM/P) 또는 17(FM/AS)을 용해시킨 100㎕의 5％ 덱스트로스(dextrose) 용액과 혼합한 다음, 실온에서 15분간 반응시켜서 siRNA/리포솜 복합체 용액 200㎕를 수득하였다.

상기 수득한 siRNA/리포솜 복합체 용액을 5-6 주령된 SIc/ICR mice(Japan SLC Ic., Hamamatsu, Japan)의 꼬리정맥에 주사한 후, 6시간 후에 채혈하고, 이를 원심분리하여, 혈청을 수득하였다.

수득한 혈청을 상기 키트에 포함된 검량희석액으로 1/100로 희석하여 시료를 준비하고, 상기 키트에 포함된 인터페론-α 표준시약을 상기 키트에 포함된 검량희석액(dilution buffer)과 혼합하여, 각각 0pg/ml, 12.5pg/ml, 25pg/ml, 50pg/ml, 100pg/ml, 200pg/ml 및 500pg/ml로 희석된 표준시약을 준비하였다.

상기 키트에 포함된 인터페론-α에 대한 쥐 단클론항체가 코팅된 96-웰 플레이트에 상기 준비된 시료와 각각의 희석된 표준시약을 각 웰당 100㎕씩 분주하고, 실온에서 1시간 반응시킨 다음, 상기 키트에 포함된 세척액으로 각 웰을 반복하여 세척하였다. 그런 다음, 상기 키트에 포함된 검량희석액을 사용하여 1/200로 희석 한 인터페론-α 항체 용액(antibody concentrate)을 각 웰당 100㎕씩 분주하고, 실온에서 24시간 반응시킨 후, 상기 세척액으로 각 웰을 반복하여 세척하였다. 이어, 무균 실험대 안에서 상기 키트에 포함된 HRP 컨쥬게이트 희석액(HRP conjugate diluent)을 사용하여 1/300으로 희석한 HRP가 결합된 HRP 컨쥬게이트 용액(HRP conjugate concentrate)을 각 웰당 100㎕씩 분주하고, 실온에서 1시간 반응시킨 후, 상기 세척액으로 각 웰을 반복하여 세척하였다. 끝으로, 상기 키트에 포함된 발색용액(TMB substrate solution)을 각 웰당 100㎕씩 분주하고 암실에서 15분동안 반응시킨 다음, 상기 키트에 포함된 정지액을 각 웰당 100㎕씩 분주하고, 플레이트 리더를 사용하여 흡광도 650nm에서 측정하였다(참조: 도 8).

도 8은 본 발명의 siRNA 및 이의 변형체를 주사한 마우스의 혈청에서 인터페론-α의 생성정도를 비교한 그래프로서, Mega는 인비보 메가펙틴 만을 마우스에 접종한 대조군이며, Dextrose는 5％ 덱스트로스 만을 마우스에 접종한 대조군을 나타낸다. 도 8에서 보듯이, 본 발명의 siRNA(서열번호 17)를 접종한 마우스의 혈청에서는 인터페론-α양이 크게 증가하였지만, 변형체를 접종한 마우스의 혈청에서는 인터페론-α양이 증가하지 않고, 대조군과 유사한 수준을 유지하였다.

상기 결과로부터, 본 발명의 siRNA의 변형체는 siRNA의 접종으로 인하여 발생하는 면역반응을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

상기 실시예 4-2 내지 4-4의 결과를 종합하면, 서열번호 17, 30, 19, 6의 siRNA에 2'-O-메틸기(2'-O-methyl) 또는 포스포로티오에이트기(phosphorothioate)를 도입하여 제조된 변형체는 NF-kB/RelA의 발현을 효과적으로 감소시키면서도, 혈 청내에서 우수한 안정성을 나타낼 뿐만 아니라, siRNA의 접종으로 인하여 발생하는 생체내에서의 면역반응을 억제시킬 수 있으므로, 상기 변형체는 효과적인 비경구투여용 항관절염 치료제의 제조에 활용될 수 있을 것으로 분석되었다.

실시예 5: 두 종류 siRNA의 류마티스 관절염 치료효과

NF-kB군(family)에는 모두 5그룹(member)이 존재하고, 이들은 이량체(dimer)를 형성하여 작용하므로, NF-kB/RelA 이외에 또 다른 그룹의 단백질인 NF-kB1의 발현을 동시에 억제하였을 경우, NF-kB에 의하여 유발되는 류마티스 관절염의 치료에 더 효과적일 가능성이 있을 것으로 예상하였으며, 이를 확인하고자 하였다.

실시예 5-1: 두 종류의 siRNA의 처리에 의한 염증성 사이토카인과 항세포사멸인자의 mRNA 수준의 저하

서열번호 17 siRNA와 NF-kB1의 발현을 억제하도록 디자인된 siRNA(5'-gucacucuaacguaugcaa-3', 서열번호 51)를 이용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로, 서열번호 17의 siRNA로 형질전환된 FLS, 서열번호 51의 siRNA로 형질전환된 FLS 및 서열번호 17 및 51의 siRNA로 동시에 형질전환된 FLS를 각각 수득하였다. 형질전환 후 96시간이 경과된 상기 형질전환된 FLS에 50ng/ml의 농도로TNF-α를 6시간동안 처리하고, 이에 포함된 NF-kB에 의해 발현이 유도되는 염증성 사이토카인(IL-6 및 IL-8)과 항세포사멸인자(cFLIP(cellular FLICE-inhibitory protein) 및 BIRC3)의 mRNA 수준을 전기 실시예 2-3의 방법으로 측정하였다(참조: 도 9).

도 9은 서열번호 17과 51의 siRNA에 의하여 형질전환된 섬유아세포 유사 활 막세포(FLS)에서 TNF-α 에 의한 IL-6, IL-8, cFLIP 및 BIRC3의 mRNA 수준을 실시간 PCR로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 9에서 보듯이, 서열번호 17만을 처리하여 NF-kB/RelA의 발현만을 억제한 경우와 서열번호 17과 51을 동시에 처리하여 NF-kB/RelA 및 NF-kB1의 발현을 동시에 억제한 경우에, IL-6, IL-8, cFLIP 및 BIRC3의 mRNA 수준이 유사하게 감소되었다.

실시예 5-2: 두 종류의 siRNA의 처리에 의한 FLS 사멸정도의 증가

NF-kB의 활성이 감소할 경우, 해당 세포가 사멸될 가능성이 높다고 알려져 있으므로(참조: Bai et al., Arthritis Rheum., 50:3844-3855, 1988; Beg ＆ Baltimore, Science, 274:782-784, 1999), 상기 NF-kB/RelA 및 NF-kB1의 발현을 모두 억제할 경우, 세포가 사멸될 가능성이 높을 것으로 예상하였다.

이에, 상기 실시예 5-1에서 수득한 서열번호 17의 siRNA로 형질전환된 FLS, 서열번호 51의 siRNA로 형질전환된 FLS 및 서열번호 17 및 51의 siRNA로 동시에 형질전환된 FLS를 대상으로 하여, 형질전환된 FLS의 사멸정도를 측정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 5-1에서 수득한TNF-α가 처리되거나 또는 처리되지 않은 서열번호 17의 siRNA로 형질전환된 FLS, 서열번호 51의 siRNA로 형질전환된 FLS 및 서열번호 17 및 51의 siRNA로 동시에 형질전환된 FLS를 현미경하에서 세포의 형태를 관찰하거나(참조: 도 10) 또는 상기 TNF-α를 처리하거나 또는 처리하지 않고 4시간이 경과한 시점에서 각 형질전환된 FLS에 형광염료인 Alexa 568이 결합된(conjugated) Annexin V(Roche Applied Science, GB)를 처리한 다음, 이를 형광현미경으로 형광발색여부를 관찰하였다(참조: 도 11). 이때, 이때, 대조군으로는 NC siRNA(서열번호 52)로 형질전환된 FLS를 이용하였다.

정상적인 FLS는 섬유상의 형태를 갖고 있으나, 사멸된 FLS는 구형의 형태를 나타내므로, 현미경을 통한 세포의 형태를 관찰하여, FLS의 사멸여부를 확인할 수 있다. 아울러, Annexin V는 세포막에 존재하는 포스피티딜 세린(phosphatidyl serine)과 결합할 수 있는 리간드로서, 상기 포스피티딜 세린은 세포막의 내측에 노출되어 있기 때문에, 정상적인 세포의 세포막에는 결합할 수 없다. 그러나, W가 사멸하여 세포막이 파괴된 시료에 Alexa 568이 결합된Annexin V를 처리하면, 세포외부로 노출된 포스피티딜 세린과 결합하고, 결합된 위치에서 형광발색을 나타내므로, 세포가 사멸하여 세포막이 파괴되었는 지의 여부를 확인할 수 있다.

도 10는 서열번호 17의 siRNA, 서열번호 51의 siRNA 및 서열번호 17과 51의 siRNA에 의하여 각각 형질전환된 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)에서 TNF-α에 의한 세포사멸 정도를 나타내는 현미경 사진이고, 도 11는 서열번호 17의 siRNA, 서열번호 51의 siRNA 및 서열번호 17과 51의 siRNA에 의하여 각각 형질전환된 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)에서 TNF-α에 의한 세포사멸 정도를 나타내는 형광현미경 사진이며, NC는 대조군을 나타낸다.

도 10및 도 11에서 보듯이, TNF-α의 처리와는 상관없이 대조군 및 서열번호 51의 siRNA로 형질전환된 FLS에서는 세포사멸이 전혀 관찰되지 않았으나, TNF-α가 처리된 서열번호 17의 siRNA로 형질전환된 FLS에서는 세포사멸이 관찰되었고, 서열번호 17 및 51의 siRNA로 동시에 형질전환된 FLS에서는 세포사멸이 현저하게 증가됨이 관찰되었다.

따라서, 실시예 5-1 및 5-2의 결과를 종합하면, 서열번호 17과 51의 siRNA를 동시에 사용할 경우, 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고, 비정상적으로 증식하는 FLS의 세포사멸을 유도하여, 보다 효과적으로 관절염 증상을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 NF-kB/RelA의 발현을 억제하는 siRNA 및 전기 siRNA를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 치료제를 제공한다. 본 발명의 류마티스 관절염 치료제는 유전자 수준에서 NF-kB/RelA의 발현을 직접적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 비정상적으로 증식하는 활막세포의 사멸을 유도할 수 있으므로, 보다 효과적인 류마티스 관절염의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims

세포내에서 NF-kB/RelA를 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, NF-kB/RelA 발현을 억제하는 서열번호 1 내지 30 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 siRNA.
제 1항에 있어서,

상기 염기서열의 3'-말단에 1 또는 2개의 비결합(unpaired) 뉴클레오타이드를 갖는 3' 오버행(overhang)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA.
제 1항에 있어서,

상기 염기서열의 각 염기에 2'-O-메틸기 또는 포스포로티오에이트기가 추가로 도입된 것을 특징으로 하는 siRNA.
제 1항에 있어서,

서열번호 2, 3, 8, 9, 14, 16, 17, 26, 27, 28 및 30으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 siRNA.
제 4항에 있어서,

서열번호 17의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 siRNA.
제 1항에 개시된 서열번호 1 내지 30 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 siRNA를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 류마티스 관절염 치료제.
제 6항에 있어서,

상기 염기서열의 3'-말단에 1 또는 2개의 비결합(unpaired) 뉴클레오타이드를 갖는 3' 오버행(overhang)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 치료제.
제 6항에 있어서,

상기 염기서열의 각 염기에 2'-O-메틸기 또는 포스포로티오에이트기가 추가로 도입된 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 치료제.
서열번호 17의 염기서열을 가지는 siRNA를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 류마티스 관절염 치료제.
서열번호 1 내지 30 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 siRNA 및 서열번호 51의 염기서열을 가지는 siRNA를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 류마티스 관절염 치료제.
서열번호 17의 염기서열을 가지는 siRNA 및 서열번호 51의 염기서열을 가지는 siRNA를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 류마티스 관절염 치료제.