KR101770717B1

KR101770717B1 - 알레르기 반응을 조절하는 miR-122

Info

Publication number: KR101770717B1
Application number: KR1020160002623A
Authority: KR
Inventors: 정두일; 김영미; 노경아
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2016-01-08
Filing date: 2016-01-08
Publication date: 2017-08-23
Also published as: KR20170083313A

Abstract

본 발명은 알레르기 반응을 조절하는 miR-122에 관한 것으로, 구체적으로 알레르기 질환 또는 암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 miR-122의 발현수준을 측정하는 방법, miR-122 또는 miR-122의 효현제를 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환 또는 암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물, 및 세포에 피검화합물을 처리하고 miR-122의 발현수준을 측정하는 알레르기 질환 치료제 또는 항암제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 miR-122의 발현수준을 측정하는 방법을 통해 알레르기 질환 또는 암의 진단에 필요한 정보를 효과적으로 제공할 수 있으며, miR-122 또는 이의 효현제를 함유하는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 사용하면 알레르기 질환 도는 암을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 또한 miR-122의 발현을 증가시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 통해 알레르기 질환 치료제 또는 항암제를 효과적으로 탐색할 수 있어, 앞으로 새롭고 보다 효과적인 알레르기 질환 치료제 또는 항암제의 개발에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

알레르기 반응을 조절하는 miR-122{miR-122 regulates allergic reactions}

본 발명은 알레르기 반응을 조절하는 miR-122에 관한 것으로, 구체적으로 알레르기 질환 또는 암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 miR-122의 발현수준을 측정하는 방법, miR-122 또는 miR-122의 효현제를 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환 또는 암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물, 및 세포에 피검화합물을 처리하고 miR-122의 발현수준을 측정하는 알레르기 질환 치료제 또는 항암제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

SOCS1(suppressor of cytokine signaling-1)은 사이토카인 신호전달을 음성적으로 조절함이 여러 연구자들을 통해 밝혀진 바 있다. 또한 SOCS1 단백질은 원래 Src 상동성 2-영역을 포함하는 단백질로 보고된 바 있다(Yoshimura et al., 1995). SOC1 결손 쥐가 생후 3주 이내에 과도한 염증에 따른 다 기관 결함에 의해 죽는다는 결과로 볼 때 SOCS1은 사이토카인 신호전달을 억제한다는 것을 알 수 있다(Starr eta l., 1998). SOCS1은 암 세포의 암 전이력을 음성적으로 조절하며(Baba et al., 2015), JAK/STAT 경로를 음성적으로 조절하는 것으로 보고되었고(Woo et al., 2015), ataxia telangiectasia와 Rad-3 관련 단백질과의 결합을 통해 세포 주기 관련 단백질에 영향을 미쳐서 세포 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다(Natatsuka et al., 2015).

SOCS1과 p21단백질은 miR-572의 직접적인 표적으로 밝혀졌다(Zhang et al., 2015). miR-572는 난소암 세포의 증식과 세포 주기 이행을 촉진하고 난소암 세포의 종양생성력을 촉진하며(Zhang et al., 2015), SOC1은 아나필락시스 쇼크를 조절하는 것으로 알려져 있다(Li et al., 2013). SOCS1은 LPS로 자극된 대식세포에서 인터류킨-6 생성을 음성적으로 조절하며(Kang et al., 2015), 분비되는 SOCS1은 항염증 효과를 보이는 것으로 조사되었다(Bourdonnay et al., 2015). SOCS1은 MET에 결합하여 MET 수용체의 전환을 촉진함으로써 하위 신호전달 경로를 방해하여 종양억제 기능을 수행하는 것으로도 알려져 있다(Gui et al., 2015). Resveratrol의 신경보호 효과는 SOCS1의 발현 유도와 이에 따른 염증 억제에 기인하며(Lofromento et al., 2014), 천식과정에서 발현이 증가하는 miR-19는 SOCS1을 표적으로 하여 Th2 사이토카인 생성을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Simpson et al., 2015).

여러 보고들에 따르면 SOC1은 알레르기 염증 반응에 관여하는 것으로 보인다. SOCS1은 TGF-β에 의해 유도되는 COX-2 발현과 PG(prostaglandin) 생성을 촉진하며 이는 Smad3 인산화와 COX-2 프로모터에의 Snail 결합을 촉진함으로써 이루어지는 것으로 조사되었다(Cho et al., 2015). COX-2는 알레르기 염증 반응을 매개하고 알레르기 반응에 따른 암전이력 증가를 매개하며(Eom et al., 2014), SOCS1 발현은 천식의 기도 상피조직에서 증가하는 것으로 알려져 있다(Gielen et al., 2015). SOCS1 모방 펩티드들은 안구 염증질환을 억제하며(He et al., 2015), 염증 완화의 지질 매개물인 AT-RvD1는 SOCS1의 발현을 감소시킴으로써 천식의 주요 증상들을 완화시키는 것으로 알려져 있다(de Oliveira et al., 2015).

많은 결과들에서 마이크로 RNA들이 염증반응에 관련함이 밝혀지고 있다. miR-384-HDAC3 feedback loop는 알레르기 반응과 알레르기 반응이 촉진하는 종양생성력 증가와 암전이력 증가를 조절하며(Eom et al., 2014), miR-155 감소는 SOCS1 발현을 증가시킴으로써 항염증 효과를 유도하는 것으로 알려져 있다(Lv et al., 2015). miR-155는 SOCS1을 표적으로 하여 STAT3와 NF-kB 신호전달을 증가시킴으로써 동맥경화에 따른 염증반응을 증가시키며(Yang et al., 2015), 전신성 홍반성낭창에서 감소하는 miR-155는 SOCS1의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Rasmussen et al., 2015). miR-155는 SOCS1을 표적으로 하여 장 염증을 증가시키며(Pathak et al., 2015), SOCS1의 발현을 억제하여 혈관신생을 억제하는 것으로 조사되었다(Pankratz et al., 2015 ). 바이러스에 의한 중추신경계의 염증은 뇌세포에서의 SOCS1 mRNA 발현 증가에 기인하는 것으로 알려져 있다(Steffensen et al., 2014).

본 발명에서는 세포 및 동물 수준에서 SOCS1이 알레르기 염증 반응을 매개한다는 것을 규명하였으며, miR-122-SOCS1 feedback loop가 알레르기 염증 반응을 조절한다는 것을 규명하였다. 또한 miR-122는 SOCS1 발현을 조절함으로써 알레르기 반응에 따른 암세포-비반세포 상호작용을 조절하고, SOCS1은 알레르기 반응에 따른 암 세포의 종양생성력 증가와 암 전이력 증가를 매개하며, miR-122-SOCS1 feedback loop가 항 알레르기 및 항암 치료제 개발의 표적임을 규명하고 본 발명을 완성하게 되었다.

J Biol Chem. 2014 Apr 25;289(17):12126-44. Cell Physiol Biochem. 2015;35(4):1276-88.

본 발명의 주된 목적은 알레르기 질환 또는 암의 진단에 필요한 정보를 효과적으로 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 알레르기 질환 또는 암을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 알레르기 질환 치료제 또는 항암제를 효과적으로 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 검사대상의 알레르기 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검체로부터 miR-122(마이크로RNA-122, microRNA-122, miRNA-122)의 발현수준을 측정하는 방법을 제공한다. 측정된 miR-122의 발현수준이 대조군에 비해 낮을 경우 알레르기 질환의 위험성이 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 알레르기 질환은 그 종류가 제한되지는 않으나 특히 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 중에서 선택된 질환의 진단에 필요한 정보를 보다 효과적으로 제공할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 검체는 miR-122의 발현수준을 측정할 수 있는 것이라면 어떠한 생물학적 검체도 사용할 수 있다. 예를 들어, 검사대상의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 복수 등을 검체로 사용할 수 있으며, 이중에서도 조직이나 세포를 사용하면 보다 효과적으로 miR-122의 발현수준을 측정할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, miR-122의 발현수준은 정량적 실시간 PCR(quentitative real-time PCR)을 수행하여 측정할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니며 통상의 마이크로RNA의 발현수준을 측정할 수 있는 방법이라면 어떠한 방법이라도 이용할 수 있다. 예를 들어, 정량적 실시간 PCR을 포함하여, 마이크로어레이 발현 프로파일링(microarray expression profiling), PCR, 역전사 PCR(RT-PCR), 역전사 실시간 PCR, 노던블롯(northern blot), 질량분석법, 핵산시퀀싱 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miR-122 또는 miR-122의 효현제(agonist)를 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 miR-122의 효현제는 a) 성숙한 miR-122의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드; b) miR-122의 pre-miRNA(전구체) 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드; c) 성숙한 miR-122를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 함유하여 동물의 세포 내에서 성숙한 miR-122을 발현하는 벡터; 및 d) miR-122의 pre-miRNA를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 함유하여 동물의 세포 내에서 miR-122의 pre-miRNA를 발현하는 벡터;일 수 있다. 상기 벡터는 조직 또는 세포에 투여되어 성숙한 miR-122 또는 pre-miRNA가 안정적으로 발현될 수 있도록 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 알레르기 질환은 그 종류가 제한되지는 않으나 특히 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 중에서 선택된 질환의 예방 및 치료에 효과적이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 a) miR-122를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; b) 피검화합물이 처리된 세포에서 miR-122의 발현수준을 측정하는 단계; 및 c) 대조군과 비교하여 발현수준이 증가된 시험군의 피검화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 알레르기 질환 치료제 스크리닝(screening) 방법을 제공한다. miR-122의 발현수준을 증가시키는 피검화합물은 알레르기 질환을 예방 및 치료할 수 있는 효과가 있을 가능성이 높고, 따라서 새로운 알레르기 질환 치료제로 개발될 가능성이 높다.

본 발명의 알레르기 질환 치료제 스크리닝 방법에 있어서, 상기 세포는 인간 또는 쥐의 비반세포(mast cell)인 것이 바람직하다. 이에 따르면 보다 효과적으로 알레르기 질환 치료제를 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 알레르기 질환 치료제 스크리닝 방법에 있어서, 상기 알레르기 질환은 그 종류가 제한되지는 않으나 특히 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 중에서 선택된 질환에 대한 치료제를 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 검사대상의 암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검체로부터 miR-122의 발현수준을 측정하는 방법을 제공한다. 측정된 miR-122의 발현수준이 대조군에 비해 낮을 경우 암의 위험성이 높은 것으로 판단할 수 있다. 특히 암 환자를 검사대상으로 할 경우 miR-122의 발현수준이 대조군에 비해 낮으면 암의 발전 또는 전이 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 암은 그 종류가 제한되지는 않으나 특히 흑색종(melanoma)의 진단에 필요한 정보를 보다 효과적으로 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miR-122 또는 miR-122의 효현제(agonist)를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 miR-122의 효현제는 a) 성숙한 miR-122의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드; b) miR-122의 pre-miRNA(전구체) 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드; c) 성숙한 miR-122를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 함유하여 동물의 세포 내에서 성숙한 miR-122을 발현하는 벡터; 및 d) miR-122의 pre-miRNA를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 함유하여 동물의 세포 내에서 miR-122의 pre-miRNA를 발현하는 벡터;일 수 있다. 상기 벡터는 조직 또는 세포에 투여되어 성숙한 miR-122 또는 pre-miRNA가 안정적으로 발현될 수 있도록 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 암은 그 종류가 제한되지는 않으나 특히 흑색종(melanoma)의 예방 및 치료에 효과적이다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 a) miR-122를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; b) 피검화합물이 처리된 세포에서 miR-122의 발현수준을 측정하는 단계; 및 c) 대조군과 비교하여 발현수준이 증가된 시험군의 피검화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다. miR-122의 발현수준을 증가시키는 피검화합물은 암을 예방 및 치료할 수 있는 효과가 있을 가능성이 높고, 따라서 새로운 항암제로 개발될 가능성이 높다.

본 발명의 항암제 스크리닝 방법에 있어서, 상기 세포는 인간 또는 쥐의 비반세포(mast cell)인 것이 바람직하다. 이에 따르면 보다 효과적으로 항암제를 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 항암제 스크리닝 방법에 있어서, 상기 암은 그 종류가 제한되지는 않으나 특히 흑색종에 대한 항암제를 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

miR-122(hsa-miR-122)는 작은 크기의 RNA 분자로, 마이크로RNA 데이터베이스인 miRBase(http://www.mirbase.org) 등을 통해 잘 알려져 있다. 인간(Homo sapiens)의 경우, pre-miRNA 서열(스템-루프 서열, stem-loop sequence)은 서열번호 1과 같으며, 서열번호 2의 has-miR-122-3p와 서열번호 3의 hsa-miR-122-5p의 두 가지 성숙한 형태가 존재한다. 생쥐(Mus musculus)의 경우 pre-miRNA 서열은 서열번호 4와 같으며, 서열번호 5의 mmu-miR-122-3p와 서열번호 6의 mmu-miR-122-5p의 두 가지 성숙한 형태가 존재한다.

본 발명자들은 이러한 miR-122가 알레르기 질환과 암에 관여한다는 것을 연구를 통해 확인하였다. 본 발명은 이러한 연구결과에 따른 것으로, 연구결과를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

1) 호염기성 백혈병 세포(basophilic leukemia cell)에서 사이토카인 신호전달 억제분자인 SOCS1(suppressor of cytokine signaling-1)의 발현이 증가하며, SOCS1은 알레르기 반응을 매개하는 수용체인 FcεRI과 결합한다. 이때 상기 세포는 통상적으로 알레르기 반응 연구에 사용되는 세포이다.

2) RNA 간섭에 의한 SOCS1의 발현감소는 세포 수준에서의 알레르기 반응을 억제한다.

3) SOCS1은 아나필락시스 동물 모델에서 수동적 전신성 아나필락시스 반응을 매개한다.

4) SOCS1은 아나필락시스 동물 모델에서 수동적 피하 아나필락시스 반응을 매개한다.

5) 호염기성 백혈병 세포에 알레르기 반응을 유도할 경우 miR-122의 발현이 감소한다.

6) miR-122는 SOCS1의 3'-UTR(untranslated region; 비 번역 영역)에 결합하며, miR-122는 SOCS1 발현을 직접적으로 조절한다.

7) miR-122 모방체(mimic)를 이용한 miR-122의 과발현은 호염기성 백혈병 세포에서 항원 자극에 의한 알레르기 반응 유도를 억제한다.

8) SOCS1은 miR-122 프로모터에 결합한다.

9) miR-122 억제 분자(miR-122 inhibitor)에 의한 miR-122 발현 감소는 항원 비의존적으로 세포 수준에서의 알레르기 반응을 유도하고 SOCS1의 발현을 증가시킨다.

10) miR-122 억제 분자에 의한 miR-122 발현 감소는 항원 비의존적으로 수동적 피하 아나필락시스 반응을 유도한다.

11) RNA 간섭에 의한 SOCS1 발현 감소는 알레르기 반응 유도에 의한 암 세포의 종양생성력 증가를 억제한다.

12) RNA 간섭에 의한 SOCS1 발현 감소는 알레르기 반응 유도에 의한 암 세포의 암 전이력 증가를 억제한다.

13) miR-122의 과발현은 암 세포의 조건배지에 의한 호염기성 백혈병 세포의 활성 증가를 유도한다.

14) miR-122의 과발현은 알레르기 반응유도에 의한 암 세포의 침윤성, 이동성을 억제한다.

본 발명에 따른 miR-122 또는 miR-122의 효현제는 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학제 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있다.

miR-122 또는 miR-122의 효현제는 그 자체를 사용하거나 약제학적으로 허용이 가능한 산부가염 또는 금속 복합체, 예를 들어 아연, 철 등과 같은 염의 형태로 사용할 수 있다. 좀 더 구체적으로 산부가염은 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레산염, 아세트염, 시트로산염, 벤조산염, 숙신산염, 말린산염, 아스코로브산염, 타르탈산염을 사용할 수 있다. 그리고 miR-122, miR-122의 효현제 및 이들의 염 형태를 유효성분으로 함유하는 조성물은 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 유효성분을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제, 좌약, 페사리(pessaries), 연고, 크림 또는 에어로졸 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통한 유효성분의 투여를 의미한다.

상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1㎏ 당 0.0001 내지 100㎎을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.

본 발명에 따르면 miR-122의 발현수준을 측정하는 방법을 통해 알레르기 질환 또는 암의 진단에 필요한 정보를 효과적으로 제공할 수 있으며, miR-122 또는 이의 효현제를 함유하는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 사용하면 알레르기 질환 도는 암을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 또한 miR-122의 발현을 증가시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 통해 알레르기 질환 치료제 또는 항암제를 효과적으로 탐색할 수 있어, 앞으로 새롭고 보다 효과적인 알레르기 질환 치료제 또는 항암제의 개발에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1A는 RBL2H3 세포주에서 항원 자극에 의해 SCOS1의 발현이 증가함을 나타낸 것이다.
도 1B는 RNA 간섭에 따라 SOCS1의 발현이 감소될 경우 알레르기 반응의 지표 단백질인 HDAC3의 발현이 감소되고 알레르기 반응에 따른 FcεRI-HDAC3 결합과 FcεRI-Lyn 결합이 억제되며(상단), RNA 간섭에 따라 SOCS1의 발현이 감소될 경우 알레르기 반응의 지표 반응인 베타 헥소스아미니다제(β-hexosaminidase) 활성이 감소됨을 나타낸 것이다(하단).
도 1C는 SOCS1의 과발현이 항원 비의존적으로 FcεRI-Lyn 결합을 유도함을 나타낸 것이다.
도 1D는 SOCS1의 과발현이 β-hexosaminidase 활성을 증가시킴을 나타낸 것이다.
도 2A는 SOCS1이 BALB/C 동물을 이용한 수동적 전신성 아나필락시스를 매개함을 RNA 간섭을 통해 나타낸 것이다. 수동적 전신성 아나필락시스는 직장의 온도 를 강하시키고 SOCS1 발현감소는 이를 억제한다.
도 2B는 BALB/C 쥐의 폐 조직을 이용한 면역화학염색결과로 수동적 전신성 아나필락시스의 결과이며 SOCS1의 발현이 증가함을 나타낸 것이다.
도 2C는 폐 조직을 이용한 웨스턴 블롯 결과로 SOCS1의 발현이 감소될 경우 알레르기 반응의 지표 단백질인 HDAC3의 발현이 감소되고 알레르기 반응에 따른 FcεRI-Lyn 결합이 억제됨을 나타낸 것이다.
도 2D는 폐 조직을 이용한 효소 분석 결과로 SOCS1의 발현이 감소될 경우 알레르기 반응의 지표 반응인 β-hexosaminidase 활성이 감소됨을 나타낸 것이다.
도 2E는 폐 조직을 이용한 qRT-PCR(quantitative real-time PCR) 결과로 수동적 전신성 아나필락시스에 의해 SOCS1 전령 RNA(mRNA) 발현 수준이 증가하고 SOCS1 발현 감소는 알레르기 반응의 음성적 조절자인 마이크로 RNA-384의 발현을 증가시킴을 나타낸 것이다.
도 3A는 BALB/C 쥐를 이용한 수동적 피하 아나필락시스 모델에서 SOCS1의 발현감소는 수동적 피하 아나필락시스 유도에 따른 혈관 투과성 증가를 억제함을 나타낸 것이다.
도 3B는 수동적 피하 아나필락시스 모델에서 SOCS1의 발현감소는 β-hexosaminidase 활성 증가를 억제함을 나타낸 것이다.
도 3C는 폐 조직을 이용한 웨스턴 결과로 수동적 피하 아나필락시스에 의한 HDAC3 발현 증가는 SOCS1 의존적으로 일어남을 나타내고, 면역침강 결과 SOCS1 발현 감소는 FcεRI-Lyn 결합을 억제함을 나타낸 것이다.
도 3D는 폐 조직을 이용한 qRT-PCR(quantitative real-time PCR) 결과로 수동적 피하 아나필락시스에 의해 SOCS1 전령 RNA(mRNA) 발현 수준이 증가하고 SOCS1 발현 감소는 알레르기 반응의 음성적 조절자인 마이크로 RNA-384의 발현을 증가시킴을 나타낸 것이다.
도 4A는 마이크로 RNA 어레이 분석결과로 RBL2H3 세포주에 항원을 자극할 경우 miR-122 등의 마이크로 RNA들의 발현이 감소함을 나타낸 것이다.
도 4B는 TargetScan 분석 결과로 SOCS1 3'-UTR(untranslated region; 비 번역 영역)에 miR-122가 결합함을 나타낸 것이다.
도 4C는 RBL2H3 세포주에서 항원 자극에 의해 miR-122의 발현이 감소되고 RNA 간섭에 의한 SOCS1 발현 감소는 항원 자극에 의한 miR-122 발현 감소를 억제함을 qRT-PCR을 통해 나타낸 것이다.
도 4D는 RBL2H3 세포주에서 miR-122의 과발현이 항원 자극에 의한 SOCS1 발현 증가를 억제함을 qRT-PCR을 통해 나타낸 것이다.
도 4E는 miR-122가 SOCS1의 발현을 직접적으로 조절함을 luciferase 활성 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 4F는 RBL2H3 세포주에서 miR-122의 과발현은 알레르기 지표반응인 β-hexosaminidase 활성 증가를 억제함을 나타낸 것이다.
도 4G는 RBL2H3 세포주에서 miR-122의 과발현은 항원 자극에 의한 SOCS1 증가를 억제하고 FcεRI-Lyn 결합을 억제함을 나타낸 것이다.
도 4H는 RBL2H3 세포주에서 항원 자극에 의해 SOCS1이 miR-122 프로모터에 결합함을 나타낸 것이다.
도 5A는 알레르기 반응의 유도가 쥐 흑색종 세포주 B16F1의 종양생성력을 증가시킴을 나타낸 것이다.
도 5B는 종양조직을 이용한 웨스턴 블롯에서 SOCS1 발현 감소는 HDAC3을 포함한 알레르기 지표 단백질들의 발현을 조절하고 면역침강을 통해서는 SOCS1 발현 감소가 알레르기 지표반응인 FcεRI-Lyn 결합을 억제함을 나타낸 것이다.
도 5C는 종양조직을 이용한 qRT-PCR 분석에서 SOCS1 발현 감소는 알레르기 반응의 음성적 조절자인 miR-384, miR-122 등의 발현 수준을 복구시킴을 나타낸 것이다.
도 5D는 종양조직을 이용한 효소 활성 분석에서 SOCS1 발현 감소는 알레르기 반응의 지표반응인 β-hexosaminidase 활성 증가를 억제함을 나타낸 것이다.
도 6A는 알레르기 반응의 유도가 쥐 흑색종 세포주 B16F1의 종양생성력을 증가시킴을 나타낸 것이다.
도 6B는 종양조직을 이용한 웨스턴 블롯에서 SOCS1 발현 감소는 HDAC3을 포함한 알레르기 지표 단백질들의 발현을 조절하고 면역침강을 통해서는 SOCS1 발현 감소가 알레르기 지표반응인 FcεRI-Lyn 결합을 억제함을 나타낸 것이다.
도 6C는 종양조직을 이용한 면역화학염색에서 알레르기 반응에 의한 SOCS1의 발현 증가를 나타낸 것이다.
도 7A는 RBL2H3 세포주에서 miR-122 억제분자(miR-122 inhibitor)를 이용한 miR-122 발현 감소는 알레르기 지표 분자인 HDAC3의 발현을 증가시키고 FcεRI-Lyn 결합을 유도함을 나타낸 것이다.
도 7B는 RBL2H3 세포주에서 miR-122 억제분자(miR-122 inhibitor)를 이용한 miR-122 발현 감소는 SOCS1의 발현을 증가시킴을 qRT-PCR을 통해 나타낸 것이다.
도 7C는 RBL2H3 세포주에서 miR-122 억제분자(miR-122 inhibitor)를 이용한 miR-122의 발현 감소는 알레르기 지표반응인 β-hexosaminidase 활성 증가를 유도함을 나타낸 것이다.
도 7D는 miR-122 억제분자(miR-122 inhibitor)를 이용한 miR-122의 발현 감소는 BALB/C 쥐의 혈관 투과성을 증가시킴을 나타낸 것이다.
도 7E는 BALB/C 쥐의 귀조직을 이용한 qRT-PCR 분석에서 miR-122 inhibitor는 SOCS1의 발현을 증가시키고 β-hexosaminidase 활성 증가를 유도함을 나타낸 것이다.
도 7F는 BALB/C 쥐의 귀 조직을 이용한 웨스턴 블롯과 면역침강 분석을 통해 miR-122 inhibitor는 SOCS1의 발현을 증가시키고 FcεRI-Lyn 결합을 유도함을 나타낸 것이다.
도 8A는 악성 흑색종 암 세포주인 B16F10 세포주에서의 SOCS1 발현이 그렇지 않은 B16F1 세포주에 비해 높고 B16F10 세포주에 miR-122를 과발현할 경우 SOCS1의 발현이 감소됨을 나타낸 것이다.
도 8B는 B16F10 세포주에서 수득한 조건 배지(conditioned medium)를 RBL2H3 세포주에 처리할 경우 HDAC3 등의 발현이 증가하고 FcεRI-Lyn 결합이 유도되며, B16F10 세포주에 miR-122를 과발현한 후 수득한 조건배지는 RBL2H3 세포주에 영향을 주지 않음을 나타낸 것이다.
도 8C는 B16F10 세포주에서 수득한 조건 배지(conditioned medium)를 RBL2H3 세포주에 처리할 경우 SOCS1의 발현을 증가시킴을 qRT-PCR 분석을 통해 나타낸 것이다. B16F1 세포주 혹은 miR-122를 과발현한 후 수득한 B16F10 세포주의 조건배지는 RBL2H3 세포주에서의 SOCS1 발현에 영향을 미치지 않는다.
도 8D는 항원으로 자극된 RBL2H3 세포주에서는 SOCS1, MCP1 등의 발현이 증가하고, miR-122의 과발현은 이들 단백질의 발현 증가를 억제함을 나타낸 것이다(상단). 항원으로 자극된 RBL2H3 세포주에서 수득한 조건배지를 B16F1 세포주에 처리할 경우 HDAC3, SOCS1 등의 발현을 증가시키고 miR-122를 과발현하는 항원 자극된 RBL2H3 세포주에서 수득한 조건 배지는 B16F1 세포주에 영향을 주지 않음을 나타낸 것이다(하단).
도 8E는 항원으로 자극된 RBL2H3 세포주에서 수득한 조건배지를 B16F1 세포 주에 처리할 경우 B16F1 세포주의 세포 침윤성, 이동성을 증가시키고, miR-122를 과발현하는 항원 자극된 RBL2H3 세포주에서 수득한 조건 배지는 B16F1 세포주에 영향을 주지 않음을 나타낸 것이다.
도 8F는 항원으로 자극된 RBL2H3 세포주에서 수득한 조건배지를 B16F1 세포 주에 처리할 경우 SOCS1의 발현을 증가시키고 miR-122를 과발현하는 항원 자극된 RBL2H3 세포주에서 수득한 조건 배지는 B16F1 세포주에서 SOCS1 발현에 영향을 주지 않음을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

< 용어설명 >

RBL2H3(rat basophilic leukemia) 세포주 : 비반 세포 대용으로 사용되며 in vitro 알레르기 반응 연구에 사용됨

비반 세포 : 과립을 포합하는 면역세포의 일종으로 히스타민을 분비하여 알레르기 반응을 매개함

HDAC3(histone deacetyalse 3) : 히스톤 탈 아세틸화 효소의 일종으로 알레르기 반응 시 그 발현이 증가함

아나필락시스 : 알레르기의 일종으로 히스타민 분비, 직장 온도 강하, 혈압강하, 혈관 투과성 증가 등을 수반함

수동적 면역(passive immunity) : 이미 생성된 항체를 이용하는 면역의 일종

DNP-HSA(2,4-dinitrophenyl human serum albumin) : 항원으로 in vitro, in vivo 알레르기 반응을 매개함

qRT-PCR(quantitative real time PCR) : PCR 방법의 일종으로 RNA 발현 수준을 실시간으로 측정함

웨스턴 블롯 : 항체를 이용하여 단백질 발현수준을 측정하는 방법

면역침강(immunoprecipitation) : 항체를 이용하여 단백질간의 결합을 측정하는 방법

크로마틴면역침강(chromatin immunoprecipitation) : 표적유전자의 프로모터에 특정 단백질이 결합하는지의 여부를 알아보는 방법으로 immunoprecipitation과 PCR이 결합된 방법

MCP1(monocyte chemoattractant protein 1) : 케모카인의 일종으로 알레르기 반응을 매개함

B16F1 세포주 : 쥐 흑색종 세포로 악성화(malignant)가 덜 이루어진 세포

B16F10 세포주 : 쥐 흑색종 세포로 악성화된 세포

PCR(poymerase chain reaction) : DNA 증폭 방법

Negative feedback loop(음성적 되먹임 제어 고리) : 두 개의 서로 다른 유전자가 서로의 발현을 음성적으로 조절함

miR-384 : 마이크로 RNA의 일종으로 알레르기 지표 단백질인 HDAC3의 발현을 음성적으로 조절함

β-hexoaminidase : 효소의 일종으로 알레르기 반응 시에 그 활성이 증가하는 알레르기 반응의 지표 효소

SiRNA(small interfering RNA) : 작은 크기의 RNA로 표적 RNA에 100% 결합하여 단백질 발현을 억제함

Scrambled RNA : siRNA의 일종으로 단백질 발현 억제 기능이 없음

Intravital microscopy : 혈관 신생정도를 알아보는 방법으로 FITC(fluorescein isothiocyanate-dextran)를 쥐의 꼬리 정맥에 주사함

IgE : in vtiro, in vivo 알레르기 반응을 유도하는 항체로 본 발명의 실시예에서는 DNP 특이적 IgE 항체를 사용함

TGaseII(transglutaminase II) : 알레르기 반응의 지표 단백질로 항원 자극에 의해 발현이 증가함

COX-2(cyclooxygenase-2) : 알레르기 반응의 지표 단백질로 항원 자극에 의해 발현이 증가함

UTR(untranslated region) : 유전자 말단의 영역으로 번역이 되지 않고 마이크로 RNA 등이 결합함

< 실시예에 사용된 방법 >

항원 자극에 의해 발현이 변하는 마이크로 RNA 유전자들의 발굴은 microRNA array분석을 통해 수행하였다.

세포주에서의 알레르기 반응 유도는 기지의 방법에 따라 이루어졌다. 항체는 DNP(2,4-dinotrophenyl) 특이적 IgE 항체를 사용하고 항원은 DNP(2,4- dinotrophenyl)-HSA(huamn serum albumin)을 사용하였다.

알레르기 반응에서 SOCS1 등의 발현을 조사하기 위해 기지의 웨스턴 블롯을 이용하였다.

miR-122 등 마이크로 RNA 발현을 조사하기 위해 기지의 qRT-PCR(quantitative real-time PCR) 방법을 이용하였다.

단백질 간의 결합을 조사하기 위하여 기지의 면역침강법(immunoprecipitation)을 이용하였다.

단백질간의 공동 위치(co-localization)를 조사하기 위해 기지의 면역형광염색법(immunofluorescnce)을 이용하였다.

In vivo 수준에서 miR-122, SOCS1 등의 역할을 규명하기 위해 기지의 방법에 따라 수동적 전신성 아나필락시스(passive systemic anaphylaxis), 수동적 피하 아나필락시스(passive cutaneous anaphylaxis)를 유도하였다.

알레르기 반응이 종양생성력에 미치는 영향을 조사하기 위해 쥐 흑색종 B16F1 세포주를 BALB/C 쥐의 피하(측복부)에 주사하였다. 종양 볼륨은 기지의 방법에 따라 측정하였다.

알레르기 반응이 암 전이력에 미치는 영향을 조사하기 위하여 쥐 흑색종 B16F1 세포주를 BALB/C 쥐의 피하 꼬리정맥에 주사하였다. 암 전이정도는 기지의 염색법을 이용하여 측정하였다.

세포 수준에서의 알레르기 반응 유도여부는 기지의 방법에 따라 β-hexosaminidase 활성을 측정하여 확인하였다.

실시예 1. SOCS1에 의한 알레르기 반응 매개

DNP(dinitropheny)-특이적 IgE 항체로 감작된 RBL2H3(rat basophilic leukmia) 세포주에 항원(DNP-HSA, 100ng/㎖; DNP-human serum albumin)을 1시간 처리 후 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 항원 자극에 의해 TGaseII(transglutaminase II), HDAC3(histone deacetylase 3), HDAC6(histone deacetylase 6) 등의 알레르기 반응의 지표 단백질들의 발현이 증가하고 SOCS1(suppressor of cytokine signaling 1)의 발현도 증가하는 것으로 나타났으며(도 1A 상단), 상기 항원(DNP-HSA)을 상기 세포주(RBL2H3)에 처리할 경우 시간 의존적으로 SOCS1 발현이 증가하는 것으로 나타났다(도 1A 하단). IgE 항체는 100ng/㎖의 농도로 24시간 동안 처리하여 RBL2H3 세포주를 감작시켰다.

RBL2H3 세포주에 scrambled siRNA(10nM) 혹은 SiSOCS1(10nM)을 처리하고 다음날 DNP-특이적 IgE 항체로 24시간 감작한 후 상기 항원(DNP-HSA)으로 1시간 후에 웨스턴 블롯과 면역침강법(immunoprecipitation)을 수행하였다. 이의 결과, SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현 감소는 항원 자극에 의한 HDAC3 발현 증가를 억제하고 항원 자극에 의한 FcεRI-Lyn 결합을 억제하는 것으로 나타났으며(도 1B 상단), SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현 감소는 항원 자극에 의한 β-hexosaminidase 활성증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 1B 하단).

β-hexosaminidase 활성은 기지의 발표된 논문들의 방법을 이용하여 수행하였고 그 활성정도는 발색반응의 정도를 스펙트로포토미터를 통해 측정하였다. RBL2H3 세포주에 SOCS1 발현 벡터를 트랜스팩션(transfection, 1㎍)하여 SOCS1을 과발현하는 경우 항원 비의존적으로 FcεRI-Lyn 결합을 유도하는 것으로 나타났다(도 1C). SOCS1 발현 벡터는 RBL2H3 세포주에 48시간 동안 trnasfection하였다. FcεRI은 수용체의 일종으로서 알레르기 반응을 매개하며 Lyn은 키나제(kinase)의 일종으로서 FcεRI과 결합하는 단백질로서 널리 알려져 있다. SOCS1 발현 벡터는 PCR로 증폭된 SOCS1 유전자를 기지의 방법에 따라 기존의 pcDNA 벡터에 클로닝하여 제조하였다.

RBL2H3 세포주에 SOCS1 벡터를 트랜스팩션(1㎍)하여 SOCS1을 과발현하는 경우 항원 비의존적으로 β-hexosaminidase 활성증가를 유도하는 것으로 나타났다(도 1D). SOCS1 발현 벡터는 RBL2H3 세포주에 48시간 동안 트랜스팩션하였다.

이상의 결과들로 볼 때, SOCS1은 in vitro 알레르기 반응을 매개한다는 것을 알 수 있다.

실시예 2. SOCS1에 의한 수동적 전신성 아나필락시스 매개

수동성 전신성 아나필락시스(passive systemic anaphylaxis)를 기지의 방법을 사용하여 유도하였다. 구체적으로, DNP-특이적 IgE 항체(0.5㎍/kg 쥐)를 BALB/C 쥐의 꼬리 정맥에 주사하고 24시간 후에 항원인 DNP-HSA(250㎍/kg 쥐)를 BALB/C 쥐의 꼬리 정맥에 주사하여 아나필락시스를 유도하였다. 유도 후 직장 온도(rectal temperature)는 기지의 digital gauge를 이용하여 측정하였고, 조직으로부터 용출물을 기지의 방법에 따라 수득하여 웨스턴 블롯, 면역침강, qRT-PCR 분석, 효소 활성 측정 등을 수행하였다. 기지의 방법에 따라 아나필락시스를 유도할 경우 직장의 온도가 강하된다(도 2A).

SiSOCS1(100nM)에 의한 SOCS1 발현 감소는 아나필락시스에 의한 직장온도 강하를 억제하는 것으로 나타났다(도 2A). BALB/C 쥐의 폐 조직을 이용한 면역조직화학 염색 결과 아나필락시스 유도는 SOCS1 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 2B). 이때 면역조직화학염색은 기지의 방법에 따라 수행하였다. 구체적으로, 면역조직화학 염색은 Vecta stain ABC Elite 키트(Vector Laboratories)을 사용하여 수행하였다. 염색에 사용한 종양조직은 xylene을 통해 파라핀(paraffine)을 제거하였고 내생적인 퍼옥시다제(peroxidase) 활성은 과산화수소(H₂O₂)를 통해 차단하였다. SOCS1 항체(Santa Cruz Company)는 1:100의 비율로 희석하여 염색을 수행하였다. 종양조직은 4㎛ 두께로 하여 염색을 수행하였다. 조직에서의 핵 염색을 위하여 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)을 사용하였다.

BALB/C 쥐의 폐 조직을 이용한 웨스턴 블롯 결과 아나필락시스 유도는 SOCS1 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 2C). 이때 폐 조직에서의 단백질은 액체 질소를 사용하여 powder 형태로 만든 후에 기지의 완충용액을 사용하여 추출하였다. 웨스턴 블롯에서 각 레인에는 20㎍의 단백질을 로딩하였다. SiSOCS1(100nM)에 의한 SOCS1 발현 감소는 아나필락시스에 의한 HDAC3 발현 증가를 억제하는 것으로 나타났으며(도 2C), SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현 감소는 아나필락시스에 의한 FcεRI-Lyn 결합을 억제하는 것으로 나타났다(도 2C 하단).

BALB/C 쥐의 폐 조직을 이용한 효소활성 측정 결과 아나필락시스 유도는 β-hexosaminidase 활성을 증가시키고 SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현 감소는 이의 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 2D). β-hexosaminidase 활성은 알레르기 반응 시 그 활성이 증가하는 대표적인 효소이다.

BALB/C 쥐의 폐 조직을 이용한 qRT-PCR 분석 결과 아나필락시스 유도는 SOCS1 mRNA 발현을 증가시키고 알레르기 반응의 음성적 조절자인 miR-384의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다(도 2E). SOCS1, miR-384의 발현 수준은 기지의 qRT-PCR(quantitative real time PCR) 분석을 통해 측정하였다. SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현 감소는 miR-384의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. miR-384(microRNA-384)는 miRNA의 일종으로서 알레르기 반응 시에 그 발현이 감소되며 알레르기 반응을 매개하는 HDAC3을 음성적으로 조절하는 것으로 이전 연구를 통해 보고된 바 있다.

이상의 결과들로 볼 때 SOCS1은 수동적 전신성 아나필락시스를 매개한다는 것을 알 수 있다.

실시예 3. SOCS1에 의한 수동적 피하 아나필락시스 매개

수동성 피하 아나필락시스(passive cutaneous anaphylaxis)를 기지의 방법에 따라 유도하였다. 구체적으로, DNP-특이적 IgE 항체(0.5㎍/kg 쥐)를 BALB/C 쥐의 귀에 주사하고 24시간 후에 항원인 DNP-HSA(250㎍/kg 쥐)와 에반스 용액(evans blue solution)을 포함한 PBS(phosphate buffered saline)를 상기 BALB/C 쥐의 꼬리 정맥에 주사하여 아나필락시스를 유도하였다. 항원 자극 30분 후에 쥐의 귀를 잘라서 포름아마이드 용액에 담구어 에반스 용액을 용출하고 용출정도를 광학밀도(optical density) 측정을 통해 아나필락시스 정도를 측정하였다. 기지의 방법에 따라 수동적 피하 아나필락시스를 유도한 결과 에반스 용액이 용출되고, SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현 감소는 이의 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 3A). 에반스 용액의 용출정도는 혈관 투과성 정도를 나타내는 것이다.

귀 조직을 이용한 효소활성 측정 결과, 아나필락시스 유도는 β-hexosaminidase 활성을 증가시키고 SiSOCS1(100nM)에 의한 SOCS1 발현 감소는 이의 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 3B). β-hexosaminidase 활성은 알레르기 반응 시 그 활성이 증가하는 대표적인 효소이다.

BALB/C 쥐의 귀 조직을 이용한 웨스턴 블롯 결과 아나필락시스 유도는 SOCS1, HDAC3 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 3C). 귀 조직에서의 단백질은 액체 질소를 사용하여 기지의 방법에 따라 추출하였다. SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현 감소는 수동적 피하 아나필락시스에 의한 HDAC3 발현 증가를 억제하는 것으로 나타났고(도 3C), SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현 감소는 아나필락시스에 의한 FcεRI-Lyn 결합을 억제하는 것으로 나타났다(도 3C 하단).

BALB/C 쥐의 귀 조직을 이용한 qRT-PCR 분석 결과, 아나필락시스 유도는 SOCS1 mRNA 발현을 증가시키고 알레르기 반응의 음성적 조절자인 miR-384의 발현을 감소시키는 것으로 나타났으며, SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현 감소는 miR-384의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 3D).

이상의 결과들로 볼 때 SOCS1은 수동적 피하 아나필락시스를 매개한다는 것을 알 수 있다.

실시예 4. miR-122-SOCS1 feedback loop에 의한 알레르기 반응 조절

SOCS1 발현을 음성적으로 조절하는 마이크로 RNA 유전자들을 다수 발굴하기 위하여 기지의 방법에 따라 마이크로 RNA 어레이(micro RNA array) 분석을 수행하였다. 마이크로 RNA 어레이는 판매 회사로부터 구입하였으며 다양한 종류의 miRNA들이 막(membrane)에 고착된 상태로 존재한다. IgE 항체(DNP 특이적 IgE 항체)로 감작된 RBL2H3 세포주에 기지의 항원(DNP-HSA, 100ng/㎖)을 처리하고 1시간 후에 분석을 수행하였다.

항원 자극에 따라 발현 수준에 변화를 보이는 다수의 miRNA 유전자들을 발굴하였으며(도 4A), TargetScan 분석결과 miR-122는 SOCS1의 3'-UTR에 결합하는 것으로 예측되었다(도 4B). TargetScan 분석법은 특정 유전자의 3'-UTR에 결합할 수 있는 miRNA 유전자들을 발굴하는 방법으로서 널리 사용되어지고 있다.

qRT-PCR(quantitative real time PCR) 분석 결과, 항원 자극은 SOCS1 mRNA 발현을 증가시키고 miR-122의 발현을 감소시키며(도 4C), SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현 감소는 항원 자극에 의한 miR-122 발현 감소를 억제하는 것으로 나타났다(도 4C). 도 4C에서 RBL2H3 세포주는 scrambled siRNA(10nM) 또는 SOCS1 siRNA(10nM)로 트랜스팩션하였다. 다음날, RBL2H3 세포주를 DNP 특이적 IgE 항체로(100ng/㎖) 24 시간 동안 감작하고, 항원(DNP-HSA, 100ng/㎖)으로 1시간 동안 자극하였다.

RBL2H3 세포주에 miR-122 벡터를 트랜스팩션(1㎍)하여 miR-122를 과발현하는 경우 항원 자극에 의한 SOCS1 mRNA 발현 증가가 억제되는 것으로 나타났다(도 4D). 도 4D에서 miR-122 발현 벡터 트랜스팩션 48시간 후에 qRT-PCR을 수행하였다.

RBL2H3 세포주에 miR-122 벡터를 트랜스팩션(1㎍) 하여 miR-122를 과발현하는 경우 항원 자극에 의한 SOCS1 연관 luciferase 활성 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 4E). 도 4E에서 luciferase 활성은 transfection 48시간 후에 측정하였다. SOCS1 연관 luciferase라 함은 SOCS1 3'-UTR(untranslated region)이 luciferase 벡터에 클로닝을 통해 연결된 것이다.

RBL2H3 세포주에 miR-122 벡터를 트랜스팩션(1㎍)하여 miR-122를 과발현하는 경우 항원 자극에 의한 β-hexosaminidase 활성 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 4F). β-hexosaminidase 활성은 트랜스팩션 48시간 후에 측정하였다.

RBL2H3 세포주에 miR-122 벡터를 트랜스팩션(1㎍)하여 miR-122를 과발현하는 경우 항원 자극(DNP-HSA)에 의한 SOCS1 발현증가를 억제하고 항원 자극에 의한 FcεRI-Lyn 결합 유도를 억제하는 것으로 나타났다(도 4G).

크로마틴 면역침강 실험 결과 RBL2H3 세포주에서 항원 자극은 SOCS1의 miR-122 프로모터 결합을 유도하는 것으로 나타났다(도 4H). 이는 SOCS1이 역으로 miR-122 발현을 조절함을 의미한다.

이상의 결과들로 볼 때 miR-122-SOCS1 feedback loop가 알레르기 반응을 조절함을 알 수 있다.

실시예 5. SOCS1은 알레르기 반응에 의한 종양생성력 증가를 매개

우선 알레르기 반응이 암 세포의 종양생성력 증가를 유도하는 지의 여부를 조사하였다. 동물로는 BALB/C 쥐를 사용하였다. 쥐의 종양 볼륨은 기지의 확립된 방법을 통해 측정하였다. 구체적으로, DNP-특이적 IgE 항체(0.5㎍/kg 쥐)를 BALB/C 쥐의 꼬리 정맥에 주사하고 24시간 후에 항원인 DNP-HSA(250㎍/kg 쥐)를 BALB/C 쥐의 꼬리 정맥에 주사하였다. 항원 주사 후 2일 후에 쥐 흑색종 세포주 B16F1 세포 주를 측복부에 주사하여 종양생성을 유도하였다. 세포주 주사 후에 scrambled siRNA(100nM) 혹은 SiSOCS1(100nM)을 5회에 걸쳐 꼬리정맥에 주사하여 SOCS1이 알레르기 반응에 의한 종양생성력 증가에 미치는 영향을 조사하였다.

알레르기 반응 유도는 B16F1 세포주의 종양생성력을 증가시키는 것으로 나타났다(도 5A). 쥐의 종양 volume은 digital gauge를 사용하여 측정하였다. SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현감소는 알레르기 반응에 의한 종양생성력 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 5A).

종양조직을 이용한 웨스턴 블롯에서 알레르기 반응은 SOCS1, HDAC3, COX-2(cyclooxgenase-2), TGaseII, MCP1(monocyte chemotactic protein-1) 등 알레르기 지표 단백질들의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 5B). 종양조직의 단백질은 액체 질소를 사용하여 powder 형태로 만든 후에 기지의 완충용액을 사용하여 추출하였다. SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현감소는 알레르기 반응에 의한 이들 단백질들의 발현 증가를 억제하며, SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현감소는 알레르기 반응에 의한 FcεRI-Lyn 결합 유도를 억제하는 것으로 나타났다(도 5B). FcεRI은 알레르기 반응을 매개하는 수용체로서 kinase의 일종인 lyn과 알레르기 반응 시에 결합하는 것으로 기존 연구를 통해 잘 알려져 있다.

종양조직을 이용한 qRT-PCR 분석에서 알레르기 반응은 SOCS1 mRNA 발현을 증가시키고 miR-384, miR-122 발현을 억제하며(도 5C), SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현감소는 알레르기 반응에 의한 miR-384, miR-122 발현 억제를 음성적으로 조절하는 것으로 나타났다(도 5C).

종양조직을 이용한 효소 활성 분석에서 알레르기 반응은 β-hexosaminidase 활성을 증가시키고 SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현감소는 알레르기 반응에 의한 β-hexosaminidase 활성 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 5D).

이상의 결과들로 볼 때 SOCS1은 알레르기 반응에 의한 종양생성력 증가를 매개한다는 것을 알 수 있다.

실시예 6. SOCS1은 알레르기 반응에 의한 암 전이력 증가를 매개

우선 알레르기 반응이 암 세포의 전이력 증가를 유도하는 지의 여부를 조사하였다. 동물로는 BALB/C 쥐를 사용하였다. 구체적으로, DNP-특이적 IgE 항체(0.5㎍/kg 쥐)를 BALB/C 쥐의 꼬리 정맥에 주사하고 24시간 후에 항원인 DNP-HSA(250㎍/kg 쥐)를 BALB/C 쥐의 꼬리 정맥에 주사하였다. 항원 주사 후 2일 후에 쥐 흑색종 세포주 B16F1 세포주를 꼬리 정맥에 주사하여 폐로의 전이를 유도하였다. scrambled siRNA(100nM) 혹은 SiSOCS1(100nM)을 3회에 걸쳐 꼬리 정맥에 주사하여 SOCS1이 알레르기 반응에 의한 암 전이력 증가에 미치는 영향을 조사하였다.

알레르기 반응은 B16F1 세포주의 암 전이력을 향상시키고 SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현감소는 알레르기 반응에 의한 암 전이력 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 6A).

폐 조직를 이용한 웨스턴 블롯에서 알레르기 반응은 SICS1, HDAC3, COX-2, TGaseII, MCP1 등 알레르기 지표 단백질들의 발현을 증가시키며(도 6B), SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현감소는 알레르기 반응에 의한 이들 단백질들의 발현 증가를 억제하고, SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현감소는 알레르기 반응에 의한 FcεRI-Lyn 결합 유도를 억제하는 것으로 나타났다(도 6B).

폐 조직을 이용한 면역조직화학 염색 결과 알레르기 반응은 SOCS1의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 6C).

폐 조직을 이용한 효소 활성 분석에서 알레르기 반응은 β-hexosaminidase 활성을 증가시키고 SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현감소는 알레르기 반응에 의한 β-hexosaminidase 활성 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 6D).

종양조직을 이용한 qRT-PCR 분석에서 알레르기 반응은 SOCS1 mRNA 발현을 증가시키고 miR-122 발현을 억제하며(도 6E), SiSOCS1에 의한 SOCS1 발현감소는 알레르기 반응에 의한 miR-122 발현 감소를 억제하는 것으로 나타났다(도 6E).

이상의 결과들로 볼 때 SOCS1은 알레르기 반응에 의한 암 전이력 증가를 매개한다는 것을 알 수 있다.

실시예 7. miR-122는 항원 비 의존적으로 알레르기 반응을 조절

RBL2H3 세포주에 miR-122 inhibitor(50nM)와 siRNA(scrambled siRNA, SOCS1 siRNA, 10nM)를 트랜스팩션하여 miR-122 발현을 감소시킬 경우 SOCS1의 발현이 증가하고 항원 비의존적으로 FcεRI-Lyn 결합을 유도하는 것으로 나타났다(도 7A). SOCS1 발현은 웨스턴블롯을 통해 확인하고 FcεRI-Lyn 결합은 면역침강법(immunoprecipitation)을 통해 확인하였다. miR-122 inhibitor라 함은 miR-122와 상보적인 염기쌍을 이루어 miR-122의 발현을 감소시키는 뉴클레오티드의 일종이다.

RBL2H3 세포주에 miR-122 inhibitor를 트랜스팩션하여 miR-122 발현을 감소시킬 경우 SOCS1 mRMA 발현이 증가하는 것으로 나타났다(도 7B). SOCS1 mRNA 발현은 기지의 qRT-PCR을 통해 측정하였다.

RBL2H3 세포주에 miR-122 inhibitor를 트랜스팩션하여 miR-122 발현을 감소시킬 경우 항원 비의존적으로 β-hexosaminidase 활성이 증가하는 것으로 나타났다(도 7C). β-hexosaminidase 활성은 트랜스팩션 48시간 후에 측정하였다.

miR-122 inhibitor(10nM)를 scrambled siRNA(100nM) 혹은 SOCS1 siRNA(100nM)와 함께 BALB/C 쥐의 귀에 주사할 경우 항원 비의존적으로 혈관 투과성이 증가하고 SOCS1에 의존적인 것으로 나타났다(도 7D). 혈관 투과성은 전술한 바와 같이 에반스 블루 용액의 용출정도를 측정하여 투과정도를 결정하였다.

BALB/C 쥐의 귀 조직을 이용한 qRT-PCR 분석에서 mR-122 inhibitor는 SOCS1을 표적으로 하며(도 7E), BALB/C 쥐의 귀 조직을 이용한 효소 활성(β-hexosaminidase activity) 분석에서 mR-122 inhibitor는 SOCS1을 표적으로 하는 것으로 나타났다(도 7E).

BALB/C 쥐의 귀 조직을 이용한 웨스턴 블롯에서 miR-122 inhibihtor는 SOCS1 발현을 증가시키고 항원 비의존적으로 FcεRI-Lyn 결합을 유도하는 것으로 나타났다(도 7F).

이상의 결과들로 볼 때 miR-122는 항원 비의존적으로 알레르기 반응을 조절한다는 것을 알 수 있다.

실시예 8. miR-122에 의한 암세포-비반세포 상호작용 조절

여러 결과들에서 알레르기 반응에 따른 종양생성력증가와 암 전이력 증가에서 암세포와 비반세포 사이의 상호작용이 보고 된 바 있다. 악성 흑색종 세포주인 B16F10 세포주는 그렇지 않은 B16F1 세포주에 비해 SOCS1 발현 수준이 높으며(도 8A), B16F10 세포주에 miR-122(1㎍)를 과발현 할 경우 SOCS1 발현 수준이 감소하는 것으로 나타났다(도 8A). 도 8A에서 웨스턴 블롯은 트랜스팩션 48시간 후에 수행하였다.

B16F10 세포주에서 수득한 조건배지(conditioned medium)을 RBL2H3 세포주에 처리할 경우 RBL2H3 세포주에서의 HDAC3, SOCS1, SNAIL 등의 발현이 증가하는 것으로 나타났다(도 8B). B16F10 세포주의 조건배지는 2㎖을 RBL2H3 세포주에 처리하였다. SNAIL은 발암 관련 단백질로서 세포의 침윤, 이동성 증가를 매개하는 단백질이다. 그러나, B16F1 세포주에서 수득한 조건배지(conditioned medium)를 RBL2H3 세포주에 처리 할 경우 RBL2H3 세포주에서의 HDAC3, SOCS1, SNAIL 등의 발현에는 변화가 없는 것으로 나타났다(도 8B). B16F1 세포주는 B16F10 세포주에 비해 악성화 정도가 나은 세포주이다. B16F10 세포주에서 수득한 조건배지(conditioned medium) 2㎖를 RBL2H3 세포주에 처리할 경우 RBL2H3 세포주에서의 FcεRI-Lyn 결합을 유도하는 것으로 나타났다(도 8B). 그러나 B16F1 세포주에서 수득한 조건배지(conditioned medium)를 RBL2H3 세포주에 처리할 경우 RBL2H3 세포주에서의 FcεRI-Lyn 결합을 유도하지 않는 것으로 나타났다(도 8B). B16F10 세포주에 miR-122를 과 발현한 후에 수득한 조건 배지를 RBL2H3 세포주에 처리할 경우 RBL2H3 세포주에서의 HDAC3, SOCS1, SNAIL 등의 발현에는 변화가 없고, FcεRI-Lyn 결합을 유도하지 않는 것으로 나타났다(도 8B). 상기에서 조건 배지는 트랜스팩션 48시간 후에 수득하였다.

B16F10 세포주에서 수득한 조건배지(conditioned medium)를 RBL2H3 세포주에 처리할 경우 RBL2H3 세포주에서의 SOCS1 mRNA 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 8C). 그러나 B16F1 세포주에서 수득한 조건배지(conditioned medium)를 RBL2H3 세포주에 처리할 경우 RBL2H3 세포주에서의 SOCS1 mRNA 발현에 영향을 주지 않는 것을 qRT-PCR을 통해 확인하였다(도 8C). B16F10 세포주에 miR-122(1㎍)를 과발현한 후에 수득한 조건 배지(48시간 후에 수득) 2㎖를 RBL2H3 세포주에 처리할 경우 SOCS1 mRNA 발현에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 8C). B16F10 세포주에서 수득한 조건배지(conditioned medium)를 RBL2H3 세포주에 처리할 경우 RBL2H3 세포주에서의 β-hexosamindase 활성을 증가시키는 것으로 나타났다(도 8C). 그러나 B16F1 세포주에서 수득한 조건배지(conditioned medium)를 RBL2H3 세포주에 처리할 경우 RBL2H3 세포주에서의 β-hexosamindase 활성에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 8C). B16F10 세포주에 miR-122를 과발현한 후에 수득한 조건 배지를 RBL2H3 세포주에 처리할 경우 β-hexosamindase 활성에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 8C).

IgE(DNP 특이적 IgE 항체)로 감작된 RBL2H3 세포주에 항원 (DNP-HSA)을 처리할 경우 SOCS1 발현이 증가하는 것으로 나타났다(도 8D).

항원으로 자극된 RBL2H3 세포주에서 수득한 조건 배지는 B16F1 세포주에 처리할 경우 B16F1 세포주에서의 HDAC3, SOCS1, TGaseII, COX-2 등의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 8D). 그러나 miR-122를 과발현시킨 항원 자극된 RBL2H3 세포주에서 수득한 조건배지는 B16F1 세포주에서의 HDAC3, SOCS1, TGaseII, COX-2 등의 발현에는 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 8D).

항원으로 자극된 RBL2H3 세포주에서 수득한 조건 배지는 B16F1 세포주에 처리할 경우 B16F1 세포주의 침윤성(invasion), 이동성(migration)을 증가시키는 것으로 나타났다(도 8E). 그러나 miR-122를 과발현시킨 항원 자극된 RBL2H3 세포주에서 수득한 조건배지는 B16F1 세포주의 침윤성, 이동성에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 8E).

항원으로 자극된 RBL2H3 세포주에서 수득한 조건 배지는 B16F1 세포주에 처리할 경우 B16F1 세포주에서의 SOCS1 mRNA 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 8F). 그러나 miR-122를 과발현시킨 항원 자극된 RBL2H3 세포주에서 수득한 조건배지는 B16F1 세포주에서의 SOCS1 mRNA 발현에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 8F).

이상의 결과들로 볼 때 miR-122는 알레르기 반응에 수반되는 암세포-비반세포 상호작용을 조절한다는 것을 알 수 있다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> miR-122 regulates allergic reactions <130> PA-D15314 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 85 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 ccuuagcaga gcuguggagu gugacaaugg uguuuguguc uaaacuauca aacgccauua 60 ucacacuaaa uagcuacugc uaggc 85 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 aacgccauua ucacacuaaa ua 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 4 <211> 66 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 4 agcuguggag ugugacaaug guguuugugu ccaaaccauc aaacgccauu aucacacuaa 60 auagcu 66 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 5 aaacgccauu aucacacuaa 20 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 6 uggaguguga caaugguguu ug 22

Claims

검사대상의 알레르기 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검체로부터 miR-122의 발현수준을 측정하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 알레르기 질환은 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 검체는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 및 복수 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 측정은 miR-122에 대한 정량적 실시간 PCR을 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
miR-122 또는 miR-122의 효현제(agonist)를 유효성분으로 함유하되,
상기 miR-122의 효현제는
a) 성숙한 miR-122의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드;
b) miR-122의 pre-miRNA(전구체) 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드;
c) 성숙한 miR-122를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 함유하여 동물의 세포 내에서 성숙한 miR-122을 발현하는 벡터; 및
d) miR-122의 pre-miRNA를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 함유하여 동물의 세포 내에서 miR-122의 pre-miRNA를 발현하는 벡터; 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
삭제
제 5항에 있어서,
상기 알레르기 질환은 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
a) miR-122를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
b) 피검화합물이 처리된 분리된 세포에서 miR-122의 발현수준을 측정하는 단계; 및
c) 대조군과 비교하여 발현수준이 증가된 시험군의 피검화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 알레르기 질환 치료제 스크리닝 방법.
제 8항에 있어서,
상기 세포는 인간 또는 쥐의 비반세포(mast cell)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 8항에 있어서,
상기 알레르기 질환은 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
검사대상의 흑색종의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검체로부터 miR-122의 발현수준을 측정하는 방법.
삭제
제 11항에 있어서,
상기 검체는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 및 복수 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서,
상기 측정은 miR-122에 대한 정량적 실시간 PCR을 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
miR-122 또는 miR-122의 효현제(agonist)를 유효성분으로 함유하되,
상기 miR-122의 효현제는
a) 성숙한 miR-122의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드;
b) miR-122의 pre-miRNA(전구체) 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드;
c) 성숙한 miR-122를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 함유하여 동물의 세포 내에서 성숙한 miR-122을 발현하는 벡터; 및
d) miR-122의 pre-miRNA를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 함유하여 동물의 세포 내에서 miR-122의 pre-miRNA를 발현하는 벡터; 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 흑색종의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
삭제
삭제
a) miR-122를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
b) 피검화합물이 처리된 분리된 세포에서 miR-122의 발현수준을 측정하는 단계; 및
c) 대조군과 비교하여 발현수준이 증가된 시험군의 피검화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 흑색종에 대한 항암제 스크리닝 방법.
제 18항에 있어서,
상기 세포는 인간 또는 쥐의 비반세포(mast cell)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
삭제