KR20220042944A

KR20220042944A - 종양미세환경을 이용한 뇌종양 치료 또는 치료제의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20220042944A
Application number: KR1020200126401A
Authority: KR
Inventors: 이수재; 김승모
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2022-04-05

Abstract

본 발명은 종양미세환경을 이용한 뇌종양 치료 또는 치료제의 스크리닝 방법 에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 CD40L-CD40의 상호작용 억제제를 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 스크리닝 방법 등에 관한 것이다. 본 발명에 개시된 CD40L-CD40 상호작용 억제제를 포함하는 조성물은, 기존 암세포를 표적으로 하는 항암제와 더불어 사용 시 LOX의 발현이 감소하고 이에 따라 뇌종양세포의 이동성과 침윤성을 저해시킬 수 있으므로, 효과적으로 뇌종양을 치료할 수 있을 것으로 사료된다.

Description

종양미세환경을 이용한 뇌종양 치료 또는 치료제의 스크리닝 방법{Treatment or Screening methods for Glioblastoma multiformes(GBMs) using tumor microenvironment}

본 발명은 종양미세환경을 이용한 뇌종양 치료 또는 치료제의 스크리닝 방법 에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 CD40L-CD40의 상호작용 억제제를 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 스크리닝 방법 등에 관한 것이다.

인체 조직을 구성하는 세포들은 서로 긴밀한 상호작용을 통해서 서로의 항상성을 유지하고 있다. 이러한 관계는 정상세포뿐만 아니라 암세포에서도 나타나는 것으로 알려져 있다.

현재 항암치료의 초점은 대부분이 암세포에 초점을 맞추어 진행되지만, 여전히 재발이 일어나며 더욱 악성화 된 상태로 다른 부위로 전이가 일어나고 있다. 이에 따라 최근에는 암세포 스스로 뿐 만 아니라 종양미세환경이 암의 악성화에 미치는 영향에 대한 연구와 이를 표적으로 하는 치료에 관심이 높아지고 있다.

세포의 외부형태를 유지하는데 중요한 세포외기질은 종양미세환경에서 일반 세포외기질과는 다르게 비정상적으로 변해 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 간엽줄기세포 (Mesenchymal stem cell, MSC)는 다분화성 (multipotent) 미분화 세포로 뼈, 근육 그리고 지방세포와 같은 타입의 세포로 분화 할 수 있는 줄기세포이다. 세포외기질 및 종양조직에 존재하는 여러 세포들이 종양의증식과 침윤, 전이 등의 각 단계에 특이적인 종양 미세환경 형성을 위해 사이토카인과 같은 몇몇 분비인자들을 통해 이를 유도하는 것으로 보고되었다(Cell. 2011. 147(5):992-1009). 하지만 각각의 특이적 단계에 맞는 암세포와 종양미세환경사이의 상호작용에 대한 연구는 아직 미미하다.

특히, 뇌종양 환자의 종양미세환경에서 MSC와 비슷한 형태를 가지는 세포인 간엽줄기유사세포(mesenchymal stem like cell, MSLC)가 존재하는데, MSLC가 종양미세환경으로 집적된 환자는 생존율이 더욱 낮게 나타나는 것으로 알려져있다.

그러나, 뇌종양 환자와 MSLC에서 어떠한 상호작용에 의해서 암세포의 악성화 및 상호작용을 유지하고 있는지에 대해서는 알려진 바가 없어 이에 대한 연구가 필요한 실정이다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 뇌종양에서 분비된 CD40L이 간엽줄기유사세포에서 분비되는 CD40의 집적 및 활성화를 유도함으로써 간엽줄기유사세포에서 분비되는 LOX(lysyl oxidase)가 세포외기질을 변형시키고 뇌종양의 침윤능을 촉진한다는 결과를 통해 CD40L-CD40 상호작용을 억제하는 경우 뇌종양의 치료에 도움이 될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 CD40L-CD40 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는, 뇌종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 뇌종양 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다:

(a) In vitro 상에서 세포에 후보 물질을 처리하는 단계;

(b) 상기 후보 물질 처리 후 CD40L-CD40의 결합 수준을 측정하는 단계; 및

(c) 후보물질 비처리군에 비해 CD40L-CD40의 결합 수준을 억제시키는 물질을 뇌종양 치료제로 결정하는 단계.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CD40L-CD40 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는, 뇌종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 CD40L-CD40 상호작용 억제제는 CD40L 또는 CD40 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA) 또는 shRNA(short haripin RNA)일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 CD40L-CD40 상호작용 억제제는 CD40L 또는 CD40 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 CD40L-CD40 상호작용 억제제는 세포외기질의 가교결합을 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 CD40L-CD40 상호작용 억제제는 LOX의 발현을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 뇌종양 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) In vitro 상에서 세포에 후보 물질을 처리하는 단계;

본 발명의 일 구현예에서, 상기 (b) 단계의 결합 수준은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 면역조직화학분석법(immunohistochemical analysis), RealTime-PCR, qRT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting), 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명에 개시된 CD40L-CD40 상호작용 억제제를 포함하는 조성물은, 기존 암세포를 표적으로 하는 항암제와 더불어 사용 시 LOX의 발현이 감소하고 이에 따라 뇌종양세포의 이동성과 침윤성을 저해시킬 수 있으므로, 뇌종양을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 뇌종양세포와 간엽줄기유사세포간의 상호작용을 나타낸 것으로, 도 1a는 뇌종양 세포와 간엽줄기유사세포를 공배양했을 때 Col1a1의 발현을 확인한 것이고, 도 1b는 뇌종양세포와 간엽줄기유사세포를 공배양했을 때 LOX의 발현이 증가함을 확인한 것이고, 도 1c는 Rembrandt 데이터베이스를 통해 LOX 및 Col1a1의 발현이 높은 환자군의 생존율을 확인한 것이고, 도 1d 및 1e는 뇌종양세포 및 간엽줄기유사세포를 각각 배양하거나 공배양하였을 때 세포외기질의 가교결합 정도를 확인한 것이다.
도 2는 LOX에 의한 세포외기질의 변형 및 뇌종양세포의 침윤능과의 상관성을 확인한 것으로, 도 2a는 뇌종양세포와 간엽줄기유사세포를 공배양하였을 때 LOX 발현 여부에 따른 세포외기질의 가교결합 정도를 확인한 것이고, 도 2b는 LOX 발현 여부에 따른 뇌종양세포 침윤능 변화를 확인한 것이고, 도 2c는 LOX 농도에 따른 세포외기질 가교결합 정도를 확인한 것이고, 도 2d는 LOX 단백질 처리 농도에 따른 뇌종양세포의 침윤능을 확인한 것이다.
도 3은 뇌종양세포에서 발현하는 CD40L에 의한 간엽줄기유사세포의 활성화에 관한 것으로, 도 3a 및 3b는 정상세포와 비교하여 뇌종양세포에서 높게 발현하는 사이토카인을 확인한 것이고, 도 3c는 뇌종양세포에서 CD40L, IFNγ 및 CXCL12를 각각 Knockdown하고 간엽줄기유사세포와 공배양하였을 때 LOX의 발현을 확인한 것이고, 도 3d는 CD40L의 발현이 저해된 뇌종양세포와 간엽줄기유사세포를 공배양하였을 때 세포외기질 유사체의 가교결합 정도를 확인한 것이고, 도 3e는 CD40L 발현 여부에 따른 뇌종양세포의 침윤능을 확인한 것이다.
도 4는 뇌종양세포와 간엽줄기유사세포의 상호작용을 통한 LOX의 발현기전을 규명한 것으로, 도 4a는 간엽줄기세포에서 뇌종양세포의 배양액을 처리하였을 때 활성화되는 신호기전(AKT, STAT3, P38, NFκB1, NFκB2)을 확인한 것이고, 도 4b는 각 신호기전을 억제시킨 후 LOX의 발현을 확인한 것이고, 도 4c는 Immunocytochemistry를 통해 뇌종양세포에 배양액을 처리하였을 때 간엽줄기유사세포에서 NFκB2의 이동을 확인한 것이고, 도 4d는 NFκB1과 NFκB2를 siRNA로 각각 knockdown을 하고 뇌종양세포 배양액을 처리하여, LOX의 발현 수준을 확인한 것이고, 도 4e는 CHIP assay를 통해 LOX의 프로모터 부위에 NFκB2의 결합여부를 확인한 것이다.

본 발명자들은 뇌종양에서 분비된 CD40L이 간엽줄기유사세포에서 분비되는 CD40의 집적 및 활성화를 유도함으로써 간엽줄기유사세포에서 분비되는 LOX(lysyl oxidase)가 세포외기질을 변형시키고 뇌종양의 침윤능을 촉진한다는 결과를 통해 CD40L-CD40 상호작용을 억제하는 경우 뇌종양의 치료에 도움이 될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이에, CD40L-CD40 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는, 뇌종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "CD40L"은 CD154라고도 언급되며, 활성화된 T세포에서 주로 발현되는 단백질으로 TNF 패밀리의 구성원으로 알려져있다. 본 발명에서 CD40L은 뇌종양에서 분비된 것을 의미하며, MSLC를 종양미세환경으로 집적 및 활성화를 유도시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 CD40L 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 CD40L 유전자가 암호화하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 서열번호 2에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "CD40"은 항원 제시 세포(antigen-presenting cells)에서 발견되는 공동 자극 단백질으로 알려져있다. 본 발명에서 CD40은 간엽줄기유사세포에서 발현되는 것을 의미하며, 뇌종양 세포에서 분비된 CD40L에 의해 활성화될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 CD40 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 CD40 유전자가 암호화하는 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 서열번호 4에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 뇌종양을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 뇌종양에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 상기 억제제는 CD40L과 CD40의 상호작용을 저해할 수 있는 모든 물질을 포함한다. 보다 구체적으로, 길항 물질(antagonist)나 경쟁적 억제제일 수 있다.

상기 "길항 물질(antagonist)"이란, 어떤 생체작용물질(아고니스트)의 수용체로 결합에 길항적으로 작용하지만 자신은 각 수용체를 통한 생리작용을 나타내지 않는 물질일 수 있다. 바람직하게는 어떤 약물이 다른 약물과의 병용에 의하여 그 작용의 일부 또는 전부를 감쇄시키는 역할을 하는 약제를 의미할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 상호작용 억제제는 CD40L 또는 CD40 유전자의 서열, 상기 서열에 상보적인 서열 또는 상기 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpinRNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나인 것이 바람직하고, CD40L 또는 CD40 단백질에 상보적으로 결합하여 활성을 억제하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 항체, 또는 압타머 중 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 구체적인 실시예를 통해 MSLC에서 분비된 LOX(Lysyl oxidase)가 세포외기질의 변형을 유도함에 따라 뇌종양의 침윤능을 촉진한다는 것을 확인하였는바, 상기 CD40L-CD40 상호작용 억제제를 통해 LOX의 발현을 억제함으로써 뇌종양의 침윤능을 억제할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 실시예에 따르면 뇌종양세포와 간엽줄기유사세포를 공배양하는 경우 세포외기질의 가교결합이 증가하고 LOX의 발현이 높게 나타나는 것을 확인하였고(실시예 2 참조), LOX가 세포외기질의 가교결합을 유도하며 LOX의 발현이 증가되는 경우 뇌종양 세포의 침윤능이 향상된다는 것을 확인하였으며(실시예 3 참조),

정상세포에 비해 뇌종양세포에서 높게 발현하는 사이토카인을 규명한 결과 CD40L의 발현이 높게 나타나며, 서열번호 5 내지 8의 siRNA를 사용하여 CD40L 또는 CD40을 knockdown시켰을 때 간엽줄기유사세포에서 LOX의 발현이 증가되지 않음을 확인하므로써 CD40L 또는 CD40의 발현이 억제되면 뇌종양 세포의 침윤능이 억제될 수 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).

따라서, 상기 실시예 결과로부터 본 발명의 조성물이 뇌종양세포에서 발현되는 CD40L와 간엽줄기유사세포에서 발현되는 CD40의 활성화 신호기전을 억제하므로써 LOX의 발현을 억제시켜 종양미세환경을 이용하여 세포외기질의 외형을 변경함으로써 뇌종양 세포의 침윤능을 억제시킬 수 있는 약학적 조성물로 활용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 CD40L 또는 CD40 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 상보적으로 결합하는 CD40L-CD40 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 다른 양태로써 본 발명은 CD40L-CD40 상호작용 억제제를 통해 LOX의 발현을 저감시킴으로써 뇌종양의 침윤능을 억제할 수 있음을 확인하였는바, 미지의 물질들 중에서 CD40L-CD40의 결합 수준을 억제시키는 물질을 뇌종양 치료제로 결정할 수 있다.

이에, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 뇌종양 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다 : (a) In vitro 상에서 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보 물질 처리 후 CD40L-CD40의 결합 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 후보물질 비처리군에 비해 CD40L-CD40의 결합 수준을 억제시키는 물질을 뇌종양 치료제로 결정하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 세포는 암 세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 뇌종양 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 결합 수준은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학분석법(immunohistochemical analysis), RealTime-PCR, qRT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting), 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 LOX의 발현수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있으며, LOX의 발현수준을 억제시키는 물질을 뇌종양 치료제로 결정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 CD40L-CD40 상호작용 억제제를 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 뇌종양의 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 뇌종양 치료 용도를 제공한다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험방법

1-1. qRCR

Glioblastoma multiformes(GBMs) 환자에서 분리한 뇌종양세포인 X01과 뇌종양세포 주위에 집적된 간엽줄기유사세포를 분리하여 공배양을 하여 간엽줄기유사세포에서 세포외기질 변형 효소 및 구성단백질의 발현을 qPCR을 통해 확인하였다. 보다 구체적으로 각 세포를 trizol을 통해서 RNA를 추출하고 cDNA를 합성한 후, Rotor Gene Q(Quiagen, Seoul, Korea) 기기를 이용해 PCR을 진행하였다. β-actin을 이용해 normalize하여 상대적 비교를 진행하였다.

1-2. 데이터 베이스

뇌종양 환자를 분석한 REMBRANDT database를 이용하였고 각각의 LOX와 Col1a1의 발현양에 따른 환자의 생존율을 분석하였다(http://www.betastasis.com/glioma/rembrandt, accessed May 2018).

1-3. 3D ECM remodeling analysis

Collagen type 1, matrigel을 일정 비율로 혼합한 세포외기질 유사체를 형성하고 세포와 같이 37℃ incubation 후 5일후 puromycin을 이용해 세포외기질 유사체에 feeding하고 있는 세포를 모두 사멸시킨 후 종양세포를 다시 seeding하고 4일 후 수득하였다. 이후 seeding을 한 세포외기질 유사체를 paraffin embedding하고 sirius red 염색을 하고 편광현미경을 통해 세포외 기질의 가교 결합을 확인하고 H&E 염색을 통해 세포 침윤을 확인하였다.

1-4. 웨스턴 블랏 (Western blot analysis)

세포를 용해하여 protein을 추출하고 SDS-PAGE를 통해 분획하고 nitrocellulose membrane에 이동 후 5% nonfat dry milk in phosphate buffered saline with 0.001% Tween20을 이용해 blocking하고 1차 항체를 4℃에 overnight하고 peroxidase-conjugated secondary 항체를 붙인 후 X-ray film으로 검출하였다.

1-5. 면역화학분석 (Immunocytochemistry)

세포를 4% paraformaldehyde with 0.1% Tween20 in PBS를 통해 fix와 permeabilize하고 1차 항체를 4℃에서 overnight하고 Alexa Fluor conjugated secondary 항체를 상온에서 2시간 붙인 후 confocal microscopy를 통해 확인하였다. 핵은 DAPI를 통해 염색하여 확인하였다.

1-6. 염색질면역침전 분석 (Chromatin immunoprecipitation assay)

세포를 formaldehyde를 통해 고정하고 sonicator를 통해 세포와 chromatin을 부순 후 1차 항체와 protein G Agarose bead와 함께 넣고 4℃에서 1시간 incubation하여 conjugation 시킨 후 bead를 침전시킨 후 상층액은 버리고 bead에서 antibody와 타겟 protein DNA 복합체를 분리시키고 PCR을 통해 확인하였다.

실시예 2. 뇌종양세포와 간엽줄기유사세포의 상호작용 확인

뇌종양세포와 간엽줄기유사세포를 공배양했을 때 발현하는 세포외기질 단백질 유전자의 발현을 확인한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 간엽줄기유사세포에서 Col1a1의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 도 1b에 나타낸 바와 같이 간엽줄기 유사세포에서 LOX의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

이에 더하여, Rembrandt 데이터베이스를 통해 LOX와 Col1a1의 발현과 환자군의 생존율을 상관관계를 확인한 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이 LOX 및 Col1a1의 발현이 높은 환자군의 생존율이 낮게 나타나는 것을 확인하였다.

나아가, 세포외기질 유사체에 뇌종양세포와 간엽줄기세포를 각각 배양한 경우와 공배양한 경우를 비교한 결과 도 1d에 나타낸 바와 같이 각각배양한 때보다 공배양한 경우에 세포외기질의 가교결합이 증가하는 것을 확인하였으며, 가교결합의 양을 분석한 결과 도 1e에 나타낸 바와 같이 공배양한 샘플에서 세포외기질의 가교결합이 증가함을 확인하였다.

상기 결과로부터 뇌종양세포와 간엽줄기유사세포를 공배양하는 경우 세포외기질의 가교결합이 증가하고 LOX 및 Col1a1의 발현이 높게 나타나는 것을 확인하였으며, 이를 기반으로 뇌종양세포에서 발현하는 분비인자가 간엽줄기유사세포를 활성화시킬 수 있음을 유추할 수 있다.

실시예 3. LOX 발현에 따른 세포외기질 변형 및 뇌종양세포의 침윤능 상관성 확인

LOX에 의한 세포외기질 변형과 뇌종양세포의 침윤능의 상관성을 확인하기 위해 뇌종양세포와 간엽줄기유사세포를 공배양한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 세포외기질의 가교결합이 증가하지만, LOX의 발현을 저해한 간엽줄기세포외 공배양 할 경우에는 세포외기질의 가교결합이 증가하지 않는 것을 확인하였다. 또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이 간엽줄기유사세포와 공배양한 세포외기질 유사체에서 뇌종양세포의 침윤능이 증가하였고, LOX의 발현을 저해한 간엽줄기세포와 공배양한 세포외기질 유사체에서는 뇌종양세포의 침윤능이 변화가 없음을 확인하였다.

이에 더하여, LOX가 세포외기질의 가교결합을 유도하는지 확인하기 위해 활성화된 LOX 단백질을 농도별로 세포외기질 유사체에 처리한 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 농도가 증가함에 따라 가교결합이 증가함을 확인하였으며, 도 2d에 나타낸 바와 같이 활성화된 재조합 LOX 단백질을 처리한 농도가 증가함에 따라 뇌종양세포의 침윤능이 증가함을 확인하였다.

상기 결과로부터 LOX가 세포외기질의 가교결합을 유도하며, LOX의 발현이 증가되는 경우 뇌종양세포의 침윤능을 향상시킨다는 것을 확인하였다.

실시예 4. 뇌종양세포에서 발현이 높게 나타나는 사이토카인 확인

정상성상세포와 비교하여 뇌종양세포에서 높게 발현하는 cytokine을 규명하기 위해 cytokine array를 진행한 결과, 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이 CD40L, IFNγ, CXCL12의 발현이 높은 것을 확인하였다. 또한 CD40L, IFNγ, CXCL12을 뇌종양세포에서 각각 knockdown하고 간엽줄기유사세포와 공배양을 진행하여 LOX의 발현을 확인한 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이 CD40L siRNA(Sense : 5' GGAUAUAAUGUUAAACAAAUU 3'(서열번호 5), Anti-sense : 5' UUUGUUUAACAUUAUAUCCUU 3'(서열번호 6)) 또는 CD40 siRNA(Sense : 5' CCAAGAAGCCAACCAAUAAUU 3'(서열번호 7), Anti-sense : 5' UUAUUGGUUGGCUUCUUGGUU 3'(서열번호 8))를 사용하여 CD40L 또는 CD40을 knockdown 시키는 경우 간엽줄기유사세포에서의 LOX발현이 증가하지 않는 것을 확인하였다.

이에 더하여, CD40L의 발현이 저해된 뇌종양세포와 간엽줄기세포를 공배양할 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이 세포외기질 유사체의 가교결합이 증가하지 않는 것을 확인하였으며, 도 3e에 나타낸 바와 같이 CD40L 발현을 억제시키는 경우 간엽줄기유사세포와 공배양에 의해 증가한 뇌종양세포의 침윤능이 감소하는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터 뇌종양세포에서 CD40L이 LOX 발현에 영향을 미치는 중요한 인자이며, CD40L에 의해 활성화된 간엽줄기유사세포의 CD40이 하위신호전달을 통해 LOX와 Col1a1의 발현이 증가되고 CD40L의 발현을 감소시키는 경우 뇌종양세포의 침윤능이 억제됨을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 뇌종양세포와 간엽줄기유사세포의 상호작용을 통한 LOX의 발현기전 확인

뇌종양세포와 간엽줄기유사세포의 상호작용을 통한 CD40의 신호전달경로 및 LOX 발현 기전 규명하기 위해 간엽줄기유사세포에서 뇌종양세포의 배양액을 처리한 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 AKT, STAT3, P38, NFκB1, NFκB2의 신호가 활성화되는 것을 확인하였다. 또한, 각각의 신호기전의 억제제를 처리한 후 LOX의 발현을 확인하였을 때, 도 4b에 나타낸 바와 같이 NFκB2가 LOX의 발현을 조절하는 것으로 관찰하였다.

이에 더하여, Immunocytochemistry를 진행하여 뇌종양세포 배양액을 처리한 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이 간엽줄기세포에서 NFκB2가 핵으로 이동하는 것을 확인하였다.

나아가, NFκB1과 NFκB2를 siRNA로 각각 knockdown을 하고 뇌종양세포 배양액을 처리했을 때, 도 4d에 나타낸 바와 같이 NFκB2가 knockdown 되었을 때 LOX의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, CHIP assay를 통해 분석한 결과 도 4e에 나타낸 바와 같이 LOX의 promotor부위에 NFκB2가 결합하는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터, NFκB2가 LOX에 결합함으로써 발현을 조절할 수 있음을 확인하였다.

상기 실시예를 종합한 결과, 뇌종양세포에서 발현하는 CD40L에 의해 간엽줄기유사세포에서 활성화되는 CD40은 NFκB2의 활성화를 통해 LOX의 발현을 증가시키고, 이에 따라 세포외기질의 재배열을 통해 뇌종양세포가 침윤하기 좋은 조건을 형성함을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Treatment or Screening methods for Glioblastoma multiformes(GBMs) using tumor microenvironment <130> PD20-229 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1852 <212> RNA <213> Homo sapiens CD40 ligand (CD40L) mRNA sequence <400> 1 aatcctgagt aaggtggcca ctttgacagt cttctcatgc tgcctctgcc accttctctg 60 ccagaagata ccatttcaac tttaacacag catgatcgaa acatacaacc aaacttctcc 120 ccgatctgcg gccactggac tgcccatcag catgaaaatt tttatgtatt tacttactgt 180 ttttcttatc acccagatga ttgggtcagc actttttgct gtgtatcttc atagaaggtt 240 ggacaagata gaagatgaaa ggaatcttca tgaagatttt gtattcatga aaacgataca 300 gagatgcaac acaggagaaa gatccttatc cttactgaac tgtgaggaga ttaaaagcca 360 gtttgaaggc tttgtgaagg atataatgtt aaacaaagag gagacgaaga aagaaaacag 420 ctttgaaatg caaaaaggtg atcagaatcc tcaaattgcg gcacatgtca taagtgaggc 480 cagcagtaaa acaacatctg tgttacagtg ggctgaaaaa ggatactaca ccatgagcaa 540 caacttggta accctggaaa atgggaaaca gctgaccgtt aaaagacaag gactctatta 600 tatctatgcc caagtcacct tctgttccaa tcgggaagct tcgagtcaag ctccatttat 660 agccagcctc tgcctaaagt cccccggtag attcgagaga atcttactca gagctgcaaa 720 tacccacagt tccgccaaac cttgcgggca acaatccatt cacttgggag gagtatttga 780 attgcaacca ggtgcttcgg tgtttgtcaa tgtgactgat ccaagccaag tgagccatgg 840 cactggcttc acgtcctttg gcttactcaa actctgaaca gtgtcacctt gcaggctgtg 900 gtggagctga cgctgggagt cttcataata cagcacagcg gttaagccca ccccctgtta 960 actgcctatt tataacccta ggatcctcct tatggagaac tatttattat acactccaag 1020 gcatgtagaa ctgtaataag tgaattacag gtcacatgaa accaaaacgg gccctgctcc 1080 ataagagctt atatatctga agcagcaacc ccactgatgc agacatccag agagtcctat 1140 gaaaagacaa ggccattatg cacaggttga attctgagta aacagcagat aacttgccaa 1200 gttcagtttt gtttctttgc gtgcagtgtc tttccatgga taatgcattt gatttatcag 1260 tgaagatgca gaagggaaat ggggagcctc agctcacatt cagttatggt tgactctggg 1320 ttcctatggc cttgttggag ggggccaggc tctagaacgt ctaacacagt ggagaaccga 1380 aacccccccc ccccccccgc caccctctcg gacagttatt cattctcttt caatctctct 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Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 115 120 125 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160 Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His 210 215 220 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260 <210> 3 <211> 1682 <212> RNA <213> Homo sapiens CD40 molecule (CD40) mRNA sequence <400> 3 agtggtcctg ccgcctggtc tcacctcgct atggttcgtc tgcctctgca gtgcgtcctc 60 tggggctgct 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Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220 Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp 225 230 235 240 Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255 Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270 Val Gln Glu Arg Gln 275 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40L siRNA Sense Sequence <400> 5 ggauauaaug uuaaacaaau u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40L siRNA Anti-Sense Sequence <400> 6 uuuguuuaac auuauauccu u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 siRNA Sense Sequence <400> 7 ccaagaagcc aaccaauaau u 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 siRNA Anti-Sense Sequence <400> 8 uuauugguug gcuucuuggu u 21

Claims

CD40L-CD40 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는, 뇌종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 CD40L-CD40 상호작용 억제제는 CD40L 또는 CD40 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA) 또는 shRNA(short haripin RNA)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 CD40L-CD40 상호작용 억제제는 CD40L 또는 CD40 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 CD40L-CD40 상호작용 억제제는 세포외기질의 가교결합을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 CD40L-CD40 상호작용 억제제는 LOX의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
하기 단계를 포함하는 뇌종양 치료제의 스크리닝 방법:
(a) In vitro 상에서 세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 후보 물질 처리 후 CD40L-CD40의 결합 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군에 비해 CD40L-CD40의 결합 수준을 억제시키는 물질을 뇌종양 치료제로 결정하는 단계.
제6항에 있어서,
상기 (b) 단계의 결합 수준은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학분석법(immunohistochemical analysis), RealTime-PCR, qRT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting), 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는, 뇌종양 치료제의 스크리닝 방법.