KR20160013401A

KR20160013401A - Ell3 단백질을 이용한 항염증제의 스크리닝 방법 및 상기 ell3 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 항염 조성물

Info

Publication number: KR20160013401A
Application number: KR1020140094671A
Authority: KR
Inventors: 김근필; 박경순; 안희진
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-25
Filing date: 2014-07-25
Publication date: 2016-02-04
Also published as: KR101755076B1

Abstract

본 발명은 항염증제의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 ELL3 단백질을 이용한 항염증제의 스크리닝 방법 및 상기 ELL3 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 항염 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, Ell3라는 transcription elongation factor의 억제는 염증유발에 관여하는 인터루킨-20(Interleukin-20)의 발현을 억제하여 항염증효과를 나타낼 수 있는바, Ell3의 발현을 억제하는 항염증제를 스크리닝하는 데에 유용하게 이용할 수 있다.
또한, Ell3 발현 또는 활성 억제제는 염증성 질환을 치료하는 약학적 조성물의 유효성분으로서도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

ELL3 단백질을 이용한 항염증제의 스크리닝 방법 및 상기 ELL3 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 항염 조성물{Screening method of anti-inflammatory agent using ELL3, and anti-inflammation composition containing the inhibitors of ELL3 expression or activity}

본 발명은 항염증제의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 ELL3 단백질을 이용한 항염증제의 스크리닝 방법 및 상기 ELL3 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 항염 조성물에 관한 것이다.

염증은 세포나 조직이 어떠한 원인에 의해 손상을 받으면 그 반응을 최소화하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키려는 일련의 방어 반응이다. 염증을 유발하는 원인에는 외상, 화상, 동상, 방사능 등에 의한 물리적 요인과 산(acid)과 같은 화학물질에 의한 화학적 요인 및 항체반응에 의한 면역학적 요인들이 있다. 염증의 발생기전은 매우 복잡하나 사이토카인 네트워크를 통하여 조절되며, 이러한 네트워크를 구성하는 사이토카인(cytokine)에는 많은 종류가 있다.

Interleukin-20 (IL-20)은 IL-10 family에 속하며 IL-10과 18%~25%의 아미노산 염기서열 유사성을 가진다. IL-20는 monocytes, epithelial cells, endothelial cells 등에서 발현되며 IL-20R1/IL-20R2 또는 IL-22R1/IL20R2를 통해 다양한 작용을 한다. 특히, psoriasis, rheumatoid arthritis, atherosclerosis, renal failure 등의 다양한 염증성 질환에 관여한다. 또한, IL-20은 암의 발생과정에서 혈관생성을 촉진하는 기능을 가지고 있다.

한편, Ell 유전자군은 transcription elongation factor로 알려져 있으며 유전정보의 유사성에 따라 Ell, Ell2, Ell3 세가지 isoform으로 구성되어 있다. 이 isoform들은 모두 RNA polymerase II의 transcription elongation catalytic rate을 높이는 activity를 가지고 있다. 이중 Ell은 세포의 증식과 생존에 관여하는 것으로 그 기능이 규명되면서 종양발생과의 연관 가능성이 제시되었다 (Johnstone, Gerber et al. 2001). 그러나 Ell2와 Ell3의 기능에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 Ell3 과발현 세포주에서 IL-20의 발현량이 현저히 높음을 확인하고, Ell3의 발현을 억제하였을 때, Ell3의 발현과 함께 IL-20의 발현량이 감소됨을 확인하고, 이를 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 Ell3을 이용하여 항염증제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 Ell3 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항염 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 항염증제의 스크리닝 방법을 제공한다:

(1) Ell3 단백질의 발현 세포주에 시험물질을 처리하는 단계;

(2) 상기 세포주에서 Ell3 단백질 발현 정도를 측정하는 단계; 및

(3) 상기 Ell3 단백질의 발현 정도가 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 시험물질을 선별하는 단계.

본 발명의 일 구현예로, 상기 단계 (2)에서, 상기 Ell3 단백질의 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 Ell3 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항염 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 Ell3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 인터루킨-20 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 조성물을 염증성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 Ell3 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 조성물의 염증성 질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명에 따르면, Ell3라는 transcription elongation factor의 억제는 염증유발에 관여하는 인터루킨-20(Interleukin-20)의 발현을 억제하여 항염증효과를 나타낼 수 있는바, Ell3의 발현을 억제하는 항염증제를 스크리닝하는 데에 유용하게 이용할 수 있다.

또한, Ell3 발현 또는 활성 억제제는 염증성 질환을 치료하는 약학적 조성물의 유효성분으로서도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 다양한 유방암 세포주에서 Ell3의 mRNA 발현량을 real-time RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 MCF-7을 이용한 Ell3 과발현 세포주에서 Ell3의 mRNA 발현량 및 Ell3 단백질양을 각각 real-time RT-PCR 및 웨스턴 블롯 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 MCF-7을 이용한 Ell3 과발현 세포주(3번)와 대조군 세포주의 유전체 발현양상의 Scatter Blot을 나타낸 것이다.
도 4는 nonspecific siRNA (siNS)를 도입한 Ell3 과발현 세포주(OE+siNS)와 대조군 세포주(C+siNS), 그리고 Ell3를 표적하는 siRNA (siEll3)를 도입한 Ell3 과발현 세포주(OE + siEll3)에 CDDP(cisplatin)을 처리한 경우와 그렇지 않은 경우에서의 IL-20의 mRNA 발현량을 real-time RT-PCR 방법을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Ell3 과발현 세포주(OE), 대조군 세포주(C) 및 siEll3을 도입한 Ell3 과발현 세포주(OE + siEll3)에서의 Ell3 mRNA 발현량을 real-time RT-PCR 방법을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 siEll3와 siIL-20을 도입한 Ell3 과발현 세포주 (OE + siEll3, OE + siIL-20)에서의 실제 배양액 내의 IL-20 단백질의 농도를 Anti-body binding 기법을 이용한 전용 kit를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 Ell3 단백질을 이용한 염증성 질환 진단 시약 개발 또는 염증성 질환 치료제 개발에 대한 개략적인 과정을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 항염증제의 스크리닝 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 상기 방법은

(1) Ell3 단백질의 발현 세포주에 시험물질을 처리하는 단계;

(3) 상기 Ell3 단백질의 발현 정도가 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 (2)의 Ell3 단백질의 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 유방암 세포주에서 Ell3의 발현량이 대조군 세포주보다 높은 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, Ell3 과발현 세포주의 유전체 발현양상을 분석한 결과, 염증을 유발하는 것으로 알려진 인터루킨-20(IL-20)이 포함됨을 확인하였고(실시예 4 참조), Ell3 과발현 세포주에서 Ell3 발현량을 낮추었을 때 IL-20의 발현량도 감소함을 확인하였다(실시예 5 참조). 따라서, Ell3의 발현을 억제하는 물질은 항염 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 염증성 장질환, 접촉 피부염, 만성 폐쇄성 폐질환, 알레르기 등의 염증성 질환을 예방, 개선, 또는 치료용도로 사용될 수 있다.

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 Ell3 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항염 조성물을 제공한다.

상기 Ell3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 Ell3 단백질은 서열번호 2로 기재되는 염기서열에 코딩되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '염증' 또는 '염증반응'은 어떤 장애성 자극에 대한 생체조직의 방어반응을 의미하며, 형태학적으로는 국소조직의 퇴행성 변화, 순환장애와 삼출(渗出), 조직증식의 세 가지를 병발하는 병변이다.

본 발명에서, 상기 Ell3 단백질의 발현 억제제는 Ell3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 상기 Ell3 단백질의 활성 억제제는 Ell3 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서, "펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)"는 Ell3 단백질의 결합 도메인을 억제하여 Ell3 단백질의 활성을 억제하는 것으로서, 상기 펩티드 미메틱스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수도 있다.

또한, 본 발명에서 "앱타머(aptamer)"는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.

더욱이, 본 발명에서 "항체"는 Ell3에 특이적이고 직접적으로 결합하여 Ell3의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 Ell3에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 Ell3에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 Ell3 항체를 구입하여 사용할 수 있다.

본 발명의 항염 조성물은 약학적 조성물의 형태로 사용될 수 있으며, 이 때 본 발명에 따른 약학적 조성물은 Ell3 단백질의 발현 또는 활성이 저해된 억제제와 함께 항염 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육 또는, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 약학적 조성물을 염증성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 분석 세포주

MCF-7은 1970년 69세의 여성 유방암 환자로부터 적출 및 1973년에 확립된 세포주로서, 확립된 기관의 이름을 딴 Michigan Cancer Foundation-7의 약자이다. 전 세계적으로 유방암에 관련된 연구에 활용되고 있으며, MCF-7 이외에 다른 유방암 세포주인 T-47-D와 MDA-MB-231과 함께 관련 분야의 75%가 넘는 연구자들이 이를 이용하여 연구를 진행하고 있다.

MCF-10A 세포주는 암세포주인 MCF-7과의 특성 분석을 위해 대조군으로 활용한 정상 세포주로서, 유방의 유선(mammary gland)에서 분리한 상피세포(epithelial cell)이다.

다양한 종류의 암세포주는 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% peniciline/streptomycin을 포함하는 dulbecco modified Eagle medium(DMEM) 배지 내에서 5% CO₂와 100% humidity가 유지되는 37℃ 인큐베이터 안에서 계대 배양하였다. 계대 후 2-3일 간격으로 배지를 교환해 주면서 세포가 배양 접시에 70-80% 정도 찾을 때 0.05% Trypsin-EDTA를 처리하여 배양 접시로부터 분리해내는 방법을 이용하여 계대 유지하였다.

1-2. RNA 추출

세포로부터 RNA를 추출하기 위해 PBS buffer로 세척 시킨 세포를 1 ㎖의 TRIzol reagent로 용해 한 후, 200 ㎕ chloroform을 넣어 15초간 잘 섞어준 다음, 상온에서 2-3분간 반응시켰다. 이후 4℃ 에서 12,000 x g 의 속도로 15분간 원심분리해 주고, 분리된 상층액 중 500 ㎕를 새로운 tube에 옮겨준 후, RNA를 침전시키기 위해 동량의 Isopropanol을 첨가하고 10분간 상온에서 반응 시킨 후 다시 4℃, 12,000 x g 에서 10분간 원심분리하였다. 다시 상층액을 제거하고 75% cold-ethanol 1 ㎖ 을 이용하여 세척한 후 4℃, 7,500 x g 에서 5분간 원심분리 하고, ethanol을 완전히 제거해 준 후 상온에서 RNA를 5분간 건조시켜 주고, RNase가 제거된 멸균 증류수에 녹이고 농도를 측정하여 RNA를 추출하였다.

1-3. Real-time RT-PCR분석

준비된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하는 데는, Life Technology 사에서 생산되는 Superscript First-Strand Synthesis System을 이용하였으며 회사에서 제공하는 표준 방법에 준하여 합성하였다. 즉, 추출한 RNA 5 ㎍에 dNTP와 oligo(dT) 프라이머를 첨가한 후 65℃에서 5분간 반응시킨 후 25mM MgCl₂, 0.1M DTT, 5 x First strand buffer에 SuperScriptⅡ reverse transcriptase와 recombinant RNase inhibitor를 넣고 42℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 70℃에서 15분간의 반응시간을 주었다. 이렇게 합성된 cDNA를 Qiagen 사에서 제조한 QuantiTect SYBR PCR kit를 이용하여 회사에서 권장하는 표준 방법에 준하여 Real-Time PCR을 수행하였다.

1-4. 마이크로 어레이

Biotinylated RNA 합성은 Ambion사에서 구입한 Illumina TotalPrep RNA amplification kit를 이용하여 회사에서 제공하는 표준 방법에 준하여 실시하였다. RNA 550 ng은 T7 oligo(dT) 프라이머를 이용하여 역전사를 실시하였다. 합성된 cDNA는 전사과정을 통해 biotine-NTP가 표지된 cRNA를 합성하였다. Biotin-labeled cRNA 1.5 μg는 Illumina사에서 제공하는 표준 방법에 준하여 58℃에서 16~18 시간 동안 mouse-8 expression bead array에 hybridization하였다. Array signal은 GE Healthcare Bio-Sciences사에서 구입한 Amersham fluorolink streptavidin-Cy3를 이용하여 측정하였다. Arrays는 회사에서 제공하는 표준 방법에 준하여 Illumina bead array Reader confocal scanner로 스캔하였다. Array data의 분석은 Illumina BeadStudio v3.1.3 (Gene Expression Module v3.3.8)를 이용하였다.

1-5. 웨스턴 블롯 분석(Western blot)

세포로부터 protein을 분리하기 위해 Cell signaling 사에서 구입한 Cell lysis buffer에 protein degradation inhibitor를 넣은 시약을 이용하여 4℃에서 약 20분간 세포를 용해하였다. 이후 4℃에서 12,000 x g 의 속도로 10분간 원심분리해 주고, 분리된 상층액을 새로운 tube에 옮겨준 후, Thermo 사의 BCA protein assay reagent를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 모든 실험군의 농도를 동일하게 맞춰준 후 10% SDS-PAGE Gel을 이용하여 단백질들을 나열하였다. 나열된 단백질을 포함한 Gel을 PVDF membrane으로 transfer 한 후 , non-specific protein binding을 방지하기 위해 5% skim milk buffer에서 반응시켜 주었다. 이후, 확인하고자 하는 protein antibody를 처리하여 4℃에서 16시간 동안 반응 시켜준 후, second antibody를 상온에서 1시간 동안 처리하고 protein detection 기기를 이용하여 protein band를 확인하였다.

1-6. 배양액 내 IL-20 단백질 농도 측정

배양액 내의 IL-20 단백질 농도 측정은 R & D 사에서 제공하는 표준 방법에 준하여 실시하였다. 즉, R & D 사의 Human IL-20 Immunoassay kit (DL200) kit를 사용하여 각 실험군 세포 배양액 내의 IL-20 단백질을 IL-20 항체를 이용하여 결합을 유도한 후, 두 단백질 간의 결합을 발색 정도로 나타낼 수 있는 시약을 처리하여 흡광도를 측정함으로써 실험군 간의 IL-20 단백질 농도를 비교하였다.

실시예 2. Ell3 과발현 세포주 제작

Ell3 과발현 plasmid를 제작하기 위해 pcDNA3.1-EF1α vector (ampicillin/neomycin 저항성)를 기본 구조로 하여 여기에 Ell3을 삽입시켜 준 후, E. coli를 이용하여 증폭시키는 과정에서 ampicillin을 처리하여 정상적인 구조를 갖는 plasmid만을 선별 추출하고, 이를 전문 업체에 의뢰하여 plasmid의 주요 부분에 대한 DNA sequence 분석을 통해 완전한 염기서열을 이루고 있는지 여부를 확인하였다. 확인된 DNA plasmid를 배양접시에 부착되어 있는 세포에 Invitrogen 사에서 생산하는 Lipofectamine 2000 reagent와 함께 반응시켜 plasmid가 vesicle형태로 세포 내로 유입(transfection) 될 수 있도록 하였으며 실험은 Invitrogen 사에서 제공하는 방법에 준하여 수행하였다. Plasmid DNA 2 ㎍과 Lipofectamine 2000 4㎕를 transfection buffer인 OPTI-MEM에서 섞어준 후, 배양기 내에서 20분간 반응시켜 vesicle이 형성되도록 유도하였다. 반응한 OPTI-MEM을 배양액이 제거된 세포에 5시간 동안 처리한 후, 일반 배양액을 첨가하여 실험 과정에 의한 독성을 제거해 주고 다음날 배양액을 교환해 주었다. 해당 Plasmid 유입 후 48시간 뒤에 plasmid가 유입되지 않은 세포를 제거하기 위해 neomycin을 처리해 주어 세포의 사멸을 유도하고, neomycin 저항성을 갖고 있어 정상적인 생존이 가능한 세포만을 선택적으로 골라냄으로써 안정적으로 plasmid가 삽입되어 Ell3가 과발현되고 있는 세포주(stable cell line)를 확립하였다.

한편, 이에 대한 대조군으로, 동일한 plasmid 기본 구조에 Ell3 유전자를 넣지 않은 empty vector를 상기에서 서술한 방법과 동일한 방법으로 추출 및 sequencing 분석 후, 마찬가지로 Lipofectamine 2000을 이용하여 세포 내로 유입시켜 준 후, neomycin selection을 통해 대조군 세포주를 확립하였다.

실시예 3. 유방암 세포주에서의 Ell3 발현 확인

다양한 유방암 세포주에서의 Ell3 발현을 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

즉, 4종의 내강형(luminal) 유방암 세포주인 MCF-7, BT-474, SKBr-3 및 T-47-D와 2종의 기저형(basal) 유방암 세포주 MD-AMB231및 BT-20 세포주의 총 6종의 유방암 세포주에서, Ell3의 mRNA 발현량을 실시예 1-3의 real-time RT-PCR로 분석하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, 유방암 세포주에서의 RNA 수준을 비교하기 위한 대조군으로는 유방상피세포주인 MCF-10A를 사용하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 대조군인 MCF-10A에 비하여 MCF-7, BT-474, SKBr-3, T-47-D 세포주에서 Ell3의 발현량이 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. Ell3 과발현 세포주에서 Ell3 발현 확인

실시예 2를 통해 Ell3을 발현하는 plasmid를 MCF-7에 transfection하고 약제 저항성을 나타내는 세포주 colony를 13종 선별한 후, Ell3의 발현 정도를 실시예 1-3의 real-time RT-PCR 방법과 실시예 1-5의 western blot 방법으로 분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, Ell3 과발현 MCF-7 세포주에서 전체적으로 Ell3 이 과발현됨을 확인할 수 있었다.

한편, 이하 실험에서는, 상기 선별된 세포주 중 3번과 6번을 최종 선별하여 사용하였다.

실시예 5. Ell3 과발현 세포주의 마이크로 어레이 분석

실시예 4에 의해 최종 선별된 Ell3 과발현 세포주(3번)와 대조군의 유전체 발현양상을 실시예 1-4의 마이크로 어레이 방법을 통해 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

마이크로 어레이 분석을 통해 Ell3 과발현 세포주에서 발현이 증가한 유전자에는 염증을 유발한다고 알려진 Interleukin-20이 포함됨을 확인할 수 있었고, 그 발현 증가의 정도는 2번 반복 분석 결과 각각 17.60배와 7.42배였다(표 1 참조).

Description	Genbank Accession ID	OE /C intensity	p- value
interleukin 20	NM_018724	17.60	0.00
interleukin 20	NM_018724	7.42	0.01

실시예 6. Ell3 과발현 세포주에서의 인터루킨-20( IL -20) 발현 증가 확인

Ell3 과발현 세포주(3번)에서 염증을 유발하는 사이토카인(cytokine)인 인터루킨-20(interleukin-20)의 발현이 실제로 증가하였는지 여부를 확인하기 위해, 하기와 같이 실험을 수행하였다.

즉, nonspecific siRNA (siNS)를 도입한 Ell3 과발현 세포주(OE+siNS)와 대조군 세포주(C+siNS), 그리고 Ell3을 표적하는 siRNA (siEll3)를 도입한 Ell3 과발현 세포주(OE + siEll3)에 CDDP(cisplatin)를 처리한 경우와 그렇지 않은 경우에서의 IL-20의 mRNA 발현량을 실시예 1-3의 real-time RT-PCR 방법을 통해 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 한편, 이때 사용된 siRNA의 구체적인 정보는 하기와 같다.

ELL3 siRNA 1 : 5'- GGAAGCAGUACCCAAGUUA - 3'(서열번호 3)

ELL3 siRNA 2 : 5'- GGACAUGGACCCCAGAUUA - 3'(서열번호 4)

ELL3 siRNA 3 : 5'- GGGAGCGCCUCAUUAUUUG - 3'(서열번호 5)

ELL3 siRNA 4 : 5'- GGACACAACCUGACUGAAG - 3'(서열번호 6)

추가적으로, 상기 Ell3 과발현 세포주(OE), 대조군 세포주(C) 및 siEll3을 도입한 Ell3 과발현 세포주(OE + siEll3)에서의 Ell3 mRNA 발현량도 실시예 1-3의 real-time RT-PCR 방법을 통해 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, CDDP(cisplatin) 약제 처리여부와 상관없이, 대조군 세포주(C)의 경우보다 Ell3 과발현 세포주에서 IL-20의 mRNA 발현량이 12배 이상 높게 발현됨을 확인할 수 있었다. 또한, Ell3 과발현세포주에 siEll3를 도입하여 Ell3 발현량을 낮추었을 때 (OE + siEll3), Ell3 발현량 감소(도 5 참조)와 더불어 IL-20의 발현량도 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 배양액 내 IL-20 단백질 농도 확인

Ell3에 의해 mRNA 수준에서 IL-20 과발현이 유도 된 세포주와 siIL-20에 의해 mRNA 수준에서 발현을 억제시킨 세포주에서 분비되는 IL-20 단백질의 농도를 측측정하여 도 6에 나타내었다. 실험을 위해 도입한 siEll3는 실시예 6에서 제시한 것과 동일하며 siRNA IL-20의 구체적인 정보는 하기와 같다.

IL-20 siRNA 1 : 5' - GGACUGAAGACACUCAAUU - 3' (서열번호 7)

IL-20 siRNA 2 : 5' - CAGAAUAGGAGGAAAGUGA - 3' (서열번호 8)

IL-20 siRNA 3 : 5' - AGCCAAAGAUGGAAACAUU- 3' (서열번호 9)

IL-20 siRNA 4 : 5' - ACACAAAGCCUGCGAAUCG - 3' (서열번호 10)

Ell3 과발현 세포주에 상기의 siEll3와 siIL-20을 도입한 후 24시간 뒤에 각각의 배양액을 수거하여 배양액 내의 IL-20 단백질 농도를 측정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, siEll3와 siIL-20을 도입한 실험군에서 IL-20 단백질의 농도가 상대적으로 낮은 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, Ell3가 직접적 또는 간접적으로 IL-20의 transcription 효율을 조절하고 그에 따라 세포에서 분비해 내는 IL-20 단백질의 양 또한 조절함을 알 수 있었다.

결과적으로, Ell3라는 transcription elongation factor의 억제는 염증유발에 관여하는 인터루킨-20(Interleukin-20)의 발현을 억제하여 항염증효과를 나타낼 수 있는바, Ell3의 발현을 억제하는 항염증제를 스크리닝하는 데에 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, Ell3 과발현 세포주에서의 인터루킨-20(IL-20) mRNA와 단백질 발현이 증가하였는바, Ell3의 과발현 여부를 이용하여 염증성 질환 진단 시약을 개발하는 것도 가능함을 알 수 있었다(도 7 참조).

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Screening method of anti-inflammatory agent using ELL3, and anti-inflammation composition containing the inhibitors of ELL3 expression or activity <130> PB14-11957 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 397 <212> PRT <213> Homo sapiens ELL3 <400> 1 Met Glu Glu Leu Gln Glu Pro Leu Arg Gly Gln Leu Arg Leu Cys Phe 1 5 10 15 Thr Gln Ala Ala Arg Thr Ser Leu Leu Leu Leu Arg Leu Asn Asp Ala 20 25 30 Ala Leu Arg Ala Leu Gln Glu Cys Gln Arg Gln Gln Val Arg Pro Val 35 40 45 Ile Ala Phe Gln Gly His Arg Gly Tyr Leu Arg Leu Pro Gly Pro Gly 50 55 60 Trp Ser Cys Leu Phe Ser Phe Ile Val Ser Gln Cys Cys Gln Glu Gly 65 70 75 80 Ala Gly Gly Ser Leu Asp Leu Val Cys Gln Arg Phe Leu Arg Ser Gly 85 90 95 Pro Asn Ser Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Arg Glu Arg Leu Ile Ile 100 105 110 Trp Ala Ala Met Asp Ser Ile Pro Ala Pro Ser Ser Val Gln Gly His 115 120 125 Asn Leu Thr Glu Asp Ala Arg His Pro Glu Ser Trp Gln Asn Thr Gly 130 135 140 Gly Tyr Ser Glu Gly Asp Ala Val Ser Gln Pro Gln Met Ala Leu Glu 145 150 155 160 Glu Val Ser Val Ser Asp Pro Leu Ala Ser Asn Gln Gly Gln Ser Leu 165 170 175 Pro Gly Ser Ser Arg Glu His Met Ala Gln Trp Glu Val Arg Ser Gln 180 185 190 Thr His Val Pro Asn Arg Glu Pro Val Gln Ala Leu Pro Ser Ser Ala 195 200 205 Ser Arg Lys Arg Leu Asp Lys Lys Arg Ser Val Pro Val Ala Thr Val 210 215 220 Glu Leu Glu Glu Lys Arg Phe Arg Thr Leu Pro Leu Val Pro Ser Pro 225 230 235 240 Leu Gln Gly Leu Thr Asn Gln Asp Leu Gln Glu Gly Glu Asp Trp Glu 245 250 255 Gln Glu Asp Glu Asp Met Asp Pro Arg Leu Glu His Ser Ser Ser Val 260 265 270 Gln Glu Asp Ser Glu Ser Pro Ser Pro Glu Asp Ile Pro Asp Tyr Leu 275 280 285 Leu Gln Tyr Arg Ala Ile His Ser Ala Glu Gln Gln His Ala Tyr Glu 290 295 300 Gln Asp Phe Glu Thr Asp Tyr Ala Glu Tyr Arg Ile Leu His Ala Arg 305 310 315 320 Val Gly Thr Ala Ser Gln Arg Phe Ile Glu Leu Gly Ala Glu Ile Lys 325 330 335 Arg Val Arg Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Lys Val Leu Glu Asp Lys Ile 340 345 350 Ile Gln Glu Tyr Lys Lys Phe Arg Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Arg Glu 355 360 365 Glu Lys Arg Arg Cys Glu Tyr Leu His Gln Lys Leu Ser His Ile Lys 370 375 380 Gly Leu Ile Leu Glu Phe Glu Glu Lys Asn Arg Gly Ser 385 390 395 <210> 2 <211> 1194 <212> DNA <213> Homo sapiens ELL3 <400> 2 atggaggagc tccaggagcc tctgagagga cagctccggc tctgcttcac gcaagctgcc 60 cggactagcc tcttactgct caggctcaac gacgctgccc tgcgggcgct gcaagagtgt 120 cagcggcaac aggtacggcc ggtgattgct ttccaaggcc accgagggta tctgagactc 180 ccaggccctg gttggtcctg cctcttctcc ttcatagtgt cccagtgttg tcaggagggc 240 gctggtggta gcttggacct tgtgtgccaa cgcttcctca ggtctgggcc taacagcctc 300 cactgcctgg gctcactcag ggagcgcctc attatttggg cagccatgga ttctatccca 360 gccccatcat cagttcaggg acacaacctg actgaagatg ccagacatcc tgagagttgg 420 cagaacacag gaggctattc tgaaggagat gcagtatcac agccacagat ggcactagag 480 gaggtgtcag tgtcagatcc actggcaagc aaccaaggac agtcactccc aggatcctca 540 agggagcaca tggcacagtg ggaagtgaga agccagaccc atgttccaaa cagagaacct 600 gttcaggcac tgccttcctc tgccagccgg aaacgtctgg acaagaaacg ttcagtgcct 660 gtagccactg tagaactgga agaaaagagg ttcagaactc tgcctttagt gccaagcccc 720 ctacaaggcc tgaccaatca ggatttacaa gagggagaag attgggagca agaagatgag 780 gacatggacc ccagattaga acacagttcc tcagttcaag aagattctga atccccaagt 840 cctgaagata taccagacta cctcctgcaa tacagggcca tccacagtgc agaacagcaa 900 catgcctatg agcaggactt tgagacagat tatgctgaat accgcatcct gcatgcccgt 960 gttgggactg caagccaaag gttcatagag ctgggagcag agattaaaag agttcggcga 1020 ggaactccag aatacaaggt cctggaagac aagataatcc aggaatataa aaagttcagg 1080 aagcagtacc caagttacag agaagaaaag cgtcgctgtg agtaccttca ccagaaattg 1140 tcccacatta aaggtctcat cctggagttt gaggaaaaga acaggggcag ctga 1194 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELL3 siRNA 1 <400> 3 ggaagcagua cccaaguua 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELL3 siRNA 2 <400> 4 ggacauggac cccagauua 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELL3 siRNA 3 <400> 5 gggagcgccu cauuauuug 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELL3 siRNA 4 <400> 6 ggacacaacc ugacugaag 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-20 siRNA 1 <400> 7 ggacugaaga cacucaauu 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-20 siRNA 2 <400> 8 cagaauagga ggaaaguga 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-20 siRNA 3 <400> 9 agccaaagau ggaaacauu 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-20 siRNA 4 <400> 10 acacaaagcc ugcgaaucg 19

Claims

하기 단계를 포함하는 항염증제의 스크리닝 방법:
(1) Ell3 단백질의 발현 세포주에 시험물질을 처리하는 단계;
(2) 상기 세포주에서 Ell3 단백질 발현 정도를 측정하는 단계; 및
(3) 상기 Ell3 단백질의 발현 정도가 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 시험물질을 선별하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 상기 Ell3 단백질의 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
Ell3 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항염 조성물.
제3항에 있어서, 상기 Ell3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 조성물은 인터루킨-20 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.