KR102187865B1 - Oct4의 메틸화를 억제하는 물질을 포함하는 줄기세포의 줄기세포성 억제용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 OCT4의 메틸화를 억제하는 물질을 포함하는 줄기세포의 줄기세포성 억제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 OCT4의 메틸화를 억제시키는 물질은 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화를 억제시킴으로써 다양한 줄기세포의 줄기세포성을 효과적으로 감소시킬 수 있다. 따라서, 암의 증식 억제, 암의 재발 억제, 암의 전이 억제, 암의 항암제 내성 발생 억제 등에 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 일반 줄기세포에서도 줄기세포성을 감소시킬 수 있기 때문에 배아줄기세포의 특정 세포로의 분화에 있어서 시간은 단축시키고, 효율을 증대시킬 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 OCT4의 메틸화를 억제하는 물질을 포함하는 줄기세포의 줄기세포성 억제용 조성물 등에 관한 것이다.
최근에 활발히 개발되고 항암치료에 실질적으로 사용되고 있는 항암제들의 대부분은 빠르게 증식하는 암세포를 표적으로 하는 약물들이 대부분이다. 이러한 약물들을 이용한 항암 치료 경우에 초기에는 효과적으로 암 세포가 사멸되어 암이 치료되는 것으로 보여지지만, 결국 체내에 남아있는 암 줄기세포(cancer stem cell)가 제거되지 않아 암의 재발 및/또는 전이가 활발히 일어나며, 결국 기존의 항암요법에 대한 내성을 나타내는 문제점들이 종종 발생하고 있기 때문에 최근 암 줄기세포에 대한 관심이 높아지고 있다.
암 줄기세포는 일반적인 줄기세포와 유사하게 무제한의 재생능력을 가진 암세포로서 일반적인 암세포와 상이하게 천천히 증식하며, 줄기세포 특유의 능력인 자가재생이나 분화능력을 가지고 있는 암세포로서 기존에 알려져 있는 암세포들과 다른 기작(mechanism)들을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 암 줄기세포는 다양한 암세포군으로 분화할 수 있는 잠재적 능력과 자가재생능력(self-renewal)을 보이는 특정한 소군집(subpopulation)으로 약물 및 방사선 저항성을 보이며, 이로 인해 암의 시작뿐만 아니라 암의 재발이나 전이를 일으키므로 암 줄기세포의 증식을 막는 것은 암 치료에 있어서 중요하다.
한편, 최근 활발히 연구되고 있는 줄기세포 치료제의 경우 줄기세포의 증식, 생존 등을 조절하기 어렵기 때문에 이로 인한 부작용이 발생하고 있는 상황이다. 대표적인 부작용은 치료가 완료된 후, 미분화 줄기세포가 체내에 잔류하여 암화됨으로써 발생할 수 있다.
따라서, 암 줄기세포를 포함한 줄기세포의 줄기세포성을 조절할 수 있는 방법이 있다면 다양한 줄기세포 응용 분야에 안전하게 적용이 가능할 뿐만 아니라, 암의 치료 효과를 높여 암의 재발, 전이, 내성 등을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 기대된다.
한편, POU5F1(POU domain, class 5, transcription factor 1)으로도 알려진 OCT4(octamer-binding transcription factor 4)는 종래 배아줄기세포(embryonic stem cell)에서 발현되는 전사인자(transcription factor)로서, 세포의 분화를 방지하는 역할을 담당하고, 세포의 자연적인 분화가 시작되면 사라지는 것으로, 전분화능인 배아 줄기세포에 특이적인 마커로 알려져 있다.
그러나, 암의 치료법에 있어서 종래 알려진 바와 같이 OCT4를 줄기세포성을 확인하는 마커로 사용하는 것에 그치지 않고, 더 나아가 OCT4의 아미노산 서열 중 특정 아미노산 서열의 메틸화를 조절함으로써 OCT4 자체를 직접 조절하여 줄기세포성을 조절하는 것과 같은, OCT4의 메틸화와 줄기세포성 조절과의 연관성에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, OCT4의 메틸화를 억제시킴으로써 OCT4의 기능을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 등 다양한 줄기세포의 줄기세포성을 억제할 수 있는 조성물 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4)의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화를 억제하는 물질을 포함하는, 줄기세포의 줄기세포성 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 마우스 OCT4의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 인간 OCT4의 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 물질은 펩티드, 단백질, 뉴클레오티드, 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 생식세포, 및 암 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 줄기세포의 증식, 자기재생, 군집능, 또는 생존을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4)의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화를 억제하는 물질 및 세포 치료용 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 세포 치료제를 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 세포 치료제는 치료용 줄기세포의 전이, 생존, 또는 암화를 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 In vitro 상에서, 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4)의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화를 억제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, OCT4 메틸화 기능 조절을 통한 줄기세포성 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4)의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화를 억제하는 물질을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 약학적 조성물은 항암제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 약학적 조성물은 암의 증식, 생존, 전이, 재발 또는 항암제 내성을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 줄기세포의 줄기세포성 억제 물질 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4) 또는 인간 OCT4를 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화 억제 여부를 확인하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 아르기닌 또는 리신의 메틸화가 억제된 경우, 상기 후보물질을 줄기세포의 줄기세포성 억제 물질로 선택하는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 줄기세포의 줄기세포성 억제 여부 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4) 또는 인간 OCT4를 발현하는 세포로부터 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화 억제 여부를 확인하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 아르기닌 또는 리신의 메틸화가 억제된 경우, 줄기세포의 줄기세포성이 억제된 것으로 진단하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 OCT4의 메틸화를 억제시키는 물질은 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화를 억제시킴으로써 다양한 줄기세포의 줄기세포성을 효과적으로 감소시킬 수 있다. 따라서, 암의 증식 억제, 암의 재발 억제, 암의 전이 억제, 암의 항암제 내성 발생 억제 등에 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 일반 줄기세포에서도 줄기세포성을 감소시킬 수 있기 때문에 배아줄기세포의 특정 세포로의 분화에 있어서 시간은 단축시키고, 효율을 증대시킬 수 있다. 또한, 배아줄기세포를 이용한 세포 치료에 본 발명의 OCT4 메틸화 억제 물질을 이용하게 되면, 치료 이후 남아있는 미분화된 배아줄기세포를 완전히 제거할 수 있으며, 암 발생의 부작용들을 효과적으로 억제할 수 있기 때문에 배아줄기세포를 이용한 세포 치료요법의 안정성을 현저히 증대시킬 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 FLAG-OCT4가 발현되는 형질전환 배아줄기세포에서 anti-FLAG 항체를 이용하여 면역침전법으로 분리한 FLAG-OCT4를 SDS-PAGE을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 분리한 FLAG-OCT4 단백질을 질량분석기를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 마우스 OCT4의 메틸화 위치(179번째 아르기닌 및 215번째 리신)를 메틸화가 불가능하도록 돌연변이 시킨 벡터의 염기서열을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환된 세포주에서 돌연변이 OCT4가 야생형(WT)과 비슷한 양으로 발현되었음을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환된 세포주에서 OCT4 메틸화 불가 돌연변이가 줄기세포 자기재생능력에 미치는 영향을 알칼리성 인산가수분해효소 염색을 이용한 배아줄기세포의 군집 형성으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 분리한 FLAG-OCT4 단백질을 질량분석기를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 마우스 OCT4의 메틸화 위치(179번째 아르기닌 및 215번째 리신)를 메틸화가 불가능하도록 돌연변이 시킨 벡터의 염기서열을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환된 세포주에서 돌연변이 OCT4가 야생형(WT)과 비슷한 양으로 발현되었음을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환된 세포주에서 OCT4 메틸화 불가 돌연변이가 줄기세포 자기재생능력에 미치는 영향을 알칼리성 인산가수분해효소 염색을 이용한 배아줄기세포의 군집 형성으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명은 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4)의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화를 억제하는 물질을 포함하는, 줄기세포의 줄기세포성 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 마우스 OCT4의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열(NCBI Reference Sequence: NP_038661.2)로 표시될 수 있으며, 상기 인간 OCT4의 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열(NCBI Reference Sequence: NP_002692.2)로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 서열번호 3의 염기서열(NCBI Reference Sequence: NM_013633.3)에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 4의 염기서열(NCBI Reference Sequence: NM_002701.5)에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 물질은 펩티드, 단백질, 뉴클레오티드, 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 마우스 OCT4의 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 222번째 리신의 메틸화를 억제할 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "OCT4(octamer-binding transcription factor 4)"는 POU 전사인자 패밀리의 하나로서 다능성 배아 줄기 세포 및 생식 세포에서 발현된다. POU 전사인자 패밀리의 구성원들은 보존된 DNA 결합 도메인, 즉 POU 도메인을 가지고 있으며, 상기 도메인은 전사인자 중 Pit-1, Oct-1, Oct-2 및 Unc-86에서 처음으로 동정되었다. OCT4는 전사 개시 자리에 인접해서 또는 거리를 두고 위치하고 있는 옥타머 (octamer) 모티프를 통하여 전사를 활성화한다.
OCT4 mRNA는 난자 (oocytes), 초기-분할-단계 배아 및 포자낭포의 내세포괴 (inner cell mass)를 포함하여 장배 형성 전기 배아(pregastrulation embryo)의 전능성 (totipotent) 및 다능성 줄기 세포에서 일반적으로 발견된다. 또한, 상기 유전자의 발현은 분화과정에서 하향 조절되며, 이는 OCT4가 포유류의 발달에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
또한, 마우스에서 OCT4 유전자를 녹아웃 (knocking out)시키면 내세포괴 형성 결핍에 의한 초기 치사가 유발되며, 이는 배아 줄기 세포의 자가재생(self-renewal)에 있어서, OCT4의 중요한 작용을 나타낸다. 인간 발달과정에서 OCT4의 발현은 적어도 포배기 단계까지 확인되며, OCT4는 유전자 발현 조절에 관여한다.
본 발명에서 용어 "줄기세포(stem cell)"는 여러 종류의 조직 세포로 분화할 수 있는 능력, 즉, 줄기세포성(stemness)을 가진 미분화 세포를 총칭하는 광의의 개념을 말한다. 이러한 줄기세포는 크게 배아를 이용하여 제조할 수 있는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 생식세포(gamete), 암 줄기세포(cancer stem cell) 등으로 나뉘며, 배아줄기세포는 수정 후 14일이 안된 상태의 구체적 장기를 형성하기 이전의 세포 덩어리 단계를 말하며, 최근에는 역분화를 통하여 정상세포로부터 배아줄기세포를 제조하기도 한다. 따라서, 신체를 이루는 모든 세포와 조직으로 분화할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다. 성체줄기세포는 제대혈, 골수, 혈액 등으로부터 추출해 낸 것으로서 뼈, 간, 혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 생식세포란, 생식을 통해서 유전 정보를 다음 세대로 전달하는 세포로서, 인간에게는 정자와 난자가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 줄기세포는 클론을 형성하여 세포의 군집을 이루는 과정에서 자기 복제를 하여 군집 내에 새로운 하나의 줄기세포를 유지할 수 있으며, 분화를 통해 한 가지 이상의 특징적인 세포 형태를 형성할 수 있는 능력이 있는 세포이다.
본 발명에서 용어 "줄기세포성(stemness)"은 줄기세포가 가지는 특유의 능력을 의미하는 것으로, 신경, 혈액, 연골 등 생물체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency) 뿐만 아니라 다분화능(multipotency), 단일분화능(unipotency)을 모두 포함하며, 이와 함께 자기 복제 내지 자기재생능력(self-renewal)을 가지는 것을 모두 포함한다. 또한, 이러한 자기 복제 내지 자기재생능력을 통해 군집 형성능을 가지는 것을 의미한다. 이 때, 상기 줄기세포성에는 수정란으로부터 발생한 배아로부터 얻는 배아줄기세포가 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력이 포함될 수 있으며, 기능적인 면에서 차이는 있지만 성인이 된 몸의 각 신체조직에 간직되어 있는 성체줄기세포가 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력 또한 포함될 수 있다.
암 줄기세포란 줄기세포 특유의 능력인 줄기세포성인 자가재생이나 분화능력을 가지는 포괄적인 의미의 암세포를 의미한다. 암 줄기세포는 일반적으로 정상적인 종양생장 조건(세포 성장에 필요한 영양분(포도당)이 충분하고 종양미세환경의 생장여건이 풍족하여 세포 스트레스가 없는 상태를 지칭)에서 일반적인 암세포와 상이하게 느린 속도로 증식하거나 휴지기(dormant state) 상태를 유지하여 항암제에 대한 저항성을 가지고 있을 수 있으며, 예를 들어, PGC-1α 등의 전사조절인자의 발현이 정상적인 종양세포와 달리 통제되어 주요 대사조절물질의 기능이 일반 암세포와 비교하여 상이할 수 있다. 이러한 상이한 대사조절 능력과 이에 기전적으로 연계된 세포신호전달계의 조절을 통해 영양 결핍 상태에서 세포 사멸(apoptosis)에 대하여 저항성을 획득한, 침윤 및 전이능이 있는 세포를 포괄적으로 지칭한다. 그러나 일반적인 암 세포로 분화할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 생식세포, 및 암 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, OCT4 단백질이 발현되는 줄기세포의 종류라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 줄기세포의 줄기세포성을 억제하여 줄기세포의 증식, 자가재생, 군집능, 생존 등을 억제할 수 있으며, 이를 통하여 줄기세포를 사용하는 모든 분야에서 줄기세포를 조절할 수 있는 방법으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4)의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화를 억제하는 물질 및 세포 치료용 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 세포 치료제를 제공한다.
본 발명에서 용어 "세포 치료제"는 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 기타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 방법을 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 치료제는 치료용 줄기세포의 전이, 생존을 억제하여 줄기세포를 조절할 수도 있고, 치료 후 남아있는 치료용 줄기세포가 암화되어 암이 발생하는 것을 억제할 수도 있으나, OCT4의 기능을 억제함으로써 유도되는 효과라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 In vitro 상에서, 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4)의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화를 억제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, OCT4 메틸화 기능 조절을 통한 줄기세포성 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4)의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화를 억제하는 물질을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에서 용어 "암"은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다.
암 사망의 주원인은 암 전이와 치료내성으로, 그 근본 원인이 줄기세포성을 띤 암 세포라는 사실이 최근 들어 엄밀히 증명되고 있다. 그래서 암 세포의 줄기세포성을 감소시키는 항암전략을 통해 암으로 인한 사망을 실질적으로 줄일 수 있을 것으로 기대한다.
암 세포가 줄기세포성을 획득하는 경로는 크게 두 가지로 요약할 수 있는데, 하나는 정상 줄기세포가 암세포화 된 경우이며, 또 다른 하나는 암세포가 역분화를 통해 줄기세포성을 획득한 경우이다. 암 환자에서는 특히 배아줄기세포 핵심인자들이 암세포의 줄기세포성 유지에 중요한 역할을 하고 있으며, 암의 악성화가 진행될수록 정상 조직줄기세포 관련 유전자가 아닌 배아줄기세포 관련 유전자군의 발현이 증가하는 것으로 보고되었다.
본 발명에서 용어 "메틸화"는 크게 DNA 메틸화와 히스톤(histone) 메틸화가 있다. DNA 메틸화는 뉴크레오티드(nucletotide) 5'-CpG-3'의 시토신 염기(cytosine base)의 5번 탄소에 메틸기가 붙는 것인데, 이때 효소(enzyme)로 DNA 메틸화효소(DNA methyltransferase)가 기능한다. 한편, 히스톤 메틸화는 히스톤 H3와 히스톤 H4의 아르기닌(Arginine; R)과 리신(Lysine; K) 아미노산 잔기에 메틸기가 붙는 것이다. 히스톤 메틸화는 아르기닌 또는 리신의 몇 번째 잔기에 메틸화가 일어나는지에 따라서 전사 억제 또는 전사 활성(transcriptional activation)적인 기능을 한다. 아르기닌 잔기는 펩티딜아르기닌메틸전달효소(Peptidylarginine methyltransferase;PRMT)에 의해 단일메틸아르기닌(monomethylarginine) 또는 2메틸아르기닌(Dimethylarginine)으로 메틸화 될 수 있으며 이중 2메틸아르기닌은 하나의 질소원자에 2개의 메틸기가 결합된 비대칭구조(Asymmetric) 또는 두 개의 질소원자에 각각 메틸기가 결합된 대칭구조(Symmetric)를 형성할 수 있다. 리신 잔기에는 리신메틸전달효소(Lysine methyltransferase)에 의해 메틸기가 3개까지 결합할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 OCT4의 새로운 메틸화 위치를 확인하기 위해 마우스 배아줄기세포에서 OCT4 단백질 분리 정제 후 질량분석기를 이용하여 분석을 진행한 결과, 기존에 밝혀지지 않은 마우스 OCT4의 179번째 아르기닌 위치(인간 OCT4의 186번째 아르기닌 위치)와 마우스 OCT4의 215번째 리신 위치(인간 OCT4의 222번째 리신 위치)에서 새로운 메틸화가 일어난다는 것을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 OCT4 메틸화와 OCT4 활성의 연관 관계를 확인한 결과, OCT4 메틸화 저해 돌연변이 세포주(R179K 및 K215R)는 야생형과 비교하였을 때 군집이 형성되는 배아줄기세포의 수가 감소하는 것을 확인하여, 마우스 179번째 아르기닌(인간 OCT4의 186번째 아르기닌) 또는 마우스 OCT4의 215번째 리신(인간 OCT4의 222번째 리신) 의 메틸화가 억제될 경우 줄기세포성이 감소됨을 확인하였으며(실시예 2 참조), 상기 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화를 억제시키는 물질은 OCT4의 기능을 저해하고, 이로 인해 정상줄기세포는 줄기세포성을 잃고 분화하게 되며, 암세포는 줄기세포성을 잃어 장기 생존이 불가능해지고, 항암 치료 후 재발하지 못하게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 바람직하게는 갑상선암, 자궁경부암, 뇌암, 폐암, 난소암, 간암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 혀암, 유방암, 자궁암, 위암, 직장암, 대장암, 혈액암 등으로 이루어질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 위암, 대장암, 폐암, 간암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 자궁경부암, 난소암 등이나, OCT4와 연관된 암이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암 등의 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암 등의 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하여 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 용어 "약학적 조성물"은 암의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 피부 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 이 때, 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항암제를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 항암제는 바람직하게는 독소루비신, 시스플라틴, 젬시타빈, 옥살리플라틴, 5-FU 등일 수 있으나, 항암제로 사용되고 있는 화합물이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 암 줄기세포의 줄기세포성을 억제하며, 이를 통하여 암의 증식, 생존, 전이, 재발 또는 항암제 내성 발생 등을 억제할 수 있으나, 암 줄기세포의 줄기세포성을 억제함으로써 발생할 수 있는 효과라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 줄기세포의 줄기세포성 억제 물질 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 마우스 OCT4 또는 인간 OCT4를 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화 억제 여부를 확인하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 아르기닌 또는 리신의 메틸화가 억제된 경우, 상기 후보물질을 줄기세포의 줄기세포성 억제 물질로 선택하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 뉴클레오티드, DNA, RNA, 아미노산, 압타머, 단백질, 화합물, 천연물, 천연추출물 등일 수 있으며, 줄기세포의 줄기세포성 억제용으로 사용가능한 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 줄기세포의 줄기세포성 억제 여부 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 마우스 OCT4 또는 인간 OCT4를 발현하는 세포로부터 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화 억제 여부를 확인하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 아르기닌 또는 리신의 메틸화가 억제된 경우, 줄기세포의 줄기세포성이 억제된 것으로 진단하는 단계.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
:
OCT4
단백질의 메틸화와
OCT4
활성 연관성 확인
실시예
1. 마우스 배아줄기세포에서
OCT4의
메틸화 동정
OCT4(octamer-binding transcription factor 4)의 새로운 메틸화 위치를 확인 하기 위하여, 마우스 배아줄기세포에서 OCT4 단백질 분리 정제 후 질량분석기를 이용하여 분석을 진행하였다.
우선, OCT4 단백질을 동정하기 위하여, 내인성 OCT4 대신에 FLAG 퓨전 OCT4 단백질이 내인성 OCT4와 동량으로 발현되는 마우스 배아줄기세포주를 제작하였다. 그 다음, 상기 세포주에서 anti-FLAG 단백질 항체를 이용하여 면역침전법(Immunoprecipitation)을 이용하여 OCT4 단백질만을 동정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
이후, 이를 질량분석기를 이용하여 분석한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 기존에 밝혀지지 않은 마우스 OCT4의 179번째 아르기닌 위치(인간 OCT4의 186번째 아르기닌 위치)와 마우스 OCT4의 215번째 리신 위치(인간 OCT4의 222번째 리신 위치)에서 새로운 메틸화가 일어난다는 것을 확인하였다.
실시예
2.
OCT4
메틸화와
OCT4
활성 연관 관계 확인
OCT4의 메틸화와 OCT4 활성 연관 관계는 배아줄기세포 유지를 평가하는 방법으로 확인할 수 있다. 이를 수행하기 위하여, 우선 도 3에 나타낸 바와 같이 OCT4 179번째 아르기닌을 리신으로 치환 혹은 215번째 리신을 아르기닌으로 치환한 메틸화 저해 돌연변이체인 R179K와 K215R을 site-directed mutatgenesis를 통해 제작하였다. 이후 배아줄기세포에 내재된 OCT4를 제거하고 새로 OCT4 정상 혹은 돌연변이체들을 발현하는 세포주를 제작하였다. 세포 제작을 위하여, pMSCV-Flag-puro 벡터에 OCT4 야생형(wild type) 및 퓨로마이신(puromycine) 내성 유전자, 또는 OCT4의 메틸화 저해형인 R179A, K215A로 치환된 OCT4 및 퓨로마이신 내성 유전자를 발현시키는 레트로바이러스를 제작하여 독시사이클린을 처리하고 내인성 OCT4의 발현을 저해시킬 수 있는 마우스 배아줄기세포주 ZHBTc4에 형질 감염시켰다. 그리고 난 다음, 배지에 퓨로마이신을 처리하여 정상적으로 형질 감염된 세포주를 분리하였고, 분리된 세포주에 독시사이클린을 처리하여 내인성 OCT4의 발현이 저해되고 치환된 외인성 OCT4 단백질이 발현되도록 하였다. 이후 동일한 용량의 레트로바이러스로 형질감염시켰는지를 확인하기 위하여 OCT4가 발현되지 않는 마우스 섬유아세포주인 NIH3T3에 같이 감염시켰다. 단백질 발현은 OCT4 항체 (SantaCruz)로 웨스턴 블롯팅을 통하여 확인하였으며, 대조군으로는 ACTB 항체(Abcam)을 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 NIH3T3 세포주에서 메틸화 저해형인 R179A, K215A로 치환된 OCT4가 야생형(WT)과 비슷한 양으로 발현되는 것을 확인하였다.
또한, 독시사이클린을 처리하기 전에 세포주를 인산염완충용액(phosphate buffered saline: PBS)을 이용하여 세척하고, TE(Trypsin-EDTA)를 이용하여 세포의 군집을 단일 세포들로 분리한 후에 최종 세포 용해액의 부피가 1ml이 되도록 세포 배양 배지를 넣어주었다. 이후, 6-웰 플레이트에 각 웰당 1/10의 볼륨인 100ul의 세포용해액을 분주하고 독시사이클린과 퓨로마이신을 처리하면서, 37℃, 5% CO2 조건에서 5일 내지 7일 배양하였다. 배양된 세포는 알칼리성 인산가수분해효소 분석 키트(Alkaline phosphatase assay kit, Medsource Ozone Biomedicals)를 이용하여 염색을 진행하고, 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, OCT4의 메틸화 저해 돌연변이 세포주의 경우에는 대조군인 야생형 세포주와 비교하였을 때 군집이 형성되는 배아줄기세포의 수가 감소하는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 결과를 통해 mouse OCT4의 179번째 아르기닌(human 186번째 아르기닌) 또는 mouse OCT4의 215번째 리신(human 222번째 리신)의 메틸화가 억제될 경우 줄기세포의 줄기세포성이 억제됨을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
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material for inhibiting methylation of OCT4
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(352)
<223> POU domain, class 5, transcription factor 1 isoform 1
<400> 1
Met Ala Gly His Leu Ala Ser Asp Phe Ala Phe Ser Pro Pro Pro Gly
1 5 10 15
Gly Gly Asp Gly Ser Ala Gly Leu Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro Arg
20 25 30
Thr Trp Leu Ser Phe Gln Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ile Gly Pro
35 40 45
Gly Ser Glu Val Leu Gly Ile Ser Pro Cys Pro Pro Ala Tyr Glu Phe
50 55 60
Cys Gly Gly Met Ala Tyr Cys Gly Pro Gln Val Gly Leu Gly Leu Val
65 70 75 80
Pro Gln Val Gly Val Glu Thr Leu Gln Pro Glu Gly Gln Ala Gly Ala
85 90 95
Arg Val Glu Ser Asn Ser Glu Gly Thr Ser Ser Glu Pro Cys Ala Asp
100 105 110
Arg Pro Asn Ala Val Lys Leu Glu Lys Val Glu Pro Thr Pro Glu Glu
115 120 125
Ser Gln Asp Met Lys Ala Leu Gln Lys Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys
130 135 140
Leu Leu Lys Gln Lys Arg Ile Thr Leu Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val
145 150 155 160
Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Phe Gly Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr
165 170 175
Ile Cys Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu Ser Leu Lys Asn Met Cys Lys
180 185 190
Leu Arg Pro Leu Leu Glu Lys Trp Val Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu
195 200 205
Asn Leu Gln Glu Ile Cys Lys Ser Glu Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys
210 215 220
Arg Lys Arg Thr Ser Ile Glu Asn Arg Val Arg Trp Ser Leu Glu Thr
225 230 235 240
Met Phe Leu Lys Cys Pro Lys Pro Ser Leu Gln Gln Ile Thr His Ile
245 250 255
Ala Asn Gln Leu Gly Leu Glu Lys Asp Val Val Arg Val Trp Phe Cys
260 265 270
Asn Arg Arg Gln Lys Gly Lys Arg Ser Ser Ile Glu Tyr Ser Gln Arg
275 280 285
Glu Glu Tyr Glu Ala Thr Gly Thr Pro Phe Pro Gly Gly Ala Val Ser
290 295 300
Phe Pro Leu Pro Pro Gly Pro His Phe Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser
305 310 315 320
Pro His Phe Thr Thr Leu Tyr Ser Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu Ala
325 330 335
Phe Pro Ser Val Pro Val Thr Ala Leu Gly Ser Pro Met His Ser Asn
340 345 350
<210> 2
<211> 360
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(360)
<223> POU domain, class 5, transcription factor 1 isoform 1
<400> 2
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Gly Gly Gly Asp Gly Pro Gly Gly Pro Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro
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Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Phe Gly
165 170 175
Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile Cys Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu
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195 200 205
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210 215 220
Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys Arg Lys Arg Thr Ser Ile Glu Asn Arg
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260 265 270
Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Arg Arg Gln Lys Gly Lys Arg Ser
275 280 285
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305 310 315 320
Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro His Phe Thr Ala Leu Tyr Ser Ser
325 330 335
Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu Ala Phe Pro Pro Val Ser Val Thr Thr
340 345 350
Leu Gly Ser Pro Met His Ser Asn
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<210> 3
<211> 1353
<212> RNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1353)
<223> POU domain, class 5, transcription factor 1 (Pou5f1), transcript
variant 1, mRNA
<400> 3
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ccttccccat ggctggacac ctggcttcag acttcgcctt ctcaccccca ccaggtgggg 120
gtgatgggtc agcagggctg gagccgggct gggtggatcc tcgaacctgg ctaagcttcc 180
aagggcctcc aggtgggcct ggaatcggac caggctcaga ggtattgggg atctccccat 240
gtccgcccgc atacgagttc tgcggaggga tggcatactg tggacctcag gttggactgg 300
gcctagtccc ccaagttggc gtggagactt tgcagcctga gggccaggca ggagcacgag 360
tggaaagcaa ctcagaggga acctcctctg agccctgtgc cgaccgcccc aatgccgtga 420
agttggagaa ggtggaacca actcccgagg agtcccagga catgaaagcc ctgcagaagg 480
agctagaaca gtttgccaag ctgctgaagc agaagaggat caccttgggg tacacccagg 540
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gtcgcttcga ggccttgcag ctcagcctta agaacatgtg taagctgcgg cccctgctgg 660
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ccctggtgca ggcccggaag agaaagcgaa ctagcattga gaaccgtgtg aggtggagtc 780
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gcaaaagatc aagtattgag tattcccaac gagaagagta tgaggctaca gggacacctt 960
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atggaagccc ccacttcacc acactctact cagtcccttt tcctgagggc gaggcctttc 1080
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<211> 1430
<212> RNA
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<220>
<221> gene
<222> (1)..(1430)
<223> POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), transcript variant 1, mRNA
<400> 4
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gggcgaagca ggagtcgggg tggagagcaa ctccgatggg gcctccccgg agccctgcac 420
cgtcacccct ggtgccgtga agctggagaa ggagaagctg gagcaaaacc cggaggagtc 480
ccaggacatc aaagctctgc agaaagaact cgagcaattt gccaagctcc tgaagcagaa 540
gaggatcacc ctgggatata cacaggccga tgtggggctc accctggggg ttctatttgg 600
gaaggtattc agccaaacga ccatctgccg ctttgaggct ctgcagctta gcttcaagaa 660
catgtgtaag ctgcggccct tgctgcagaa gtgggtggag gaagctgaca acaatgaaaa 720
tcttcaggag atatgcaaag cagaaaccct cgtgcaggcc cgaaagagaa agcgaaccag 780
tatcgagaac cgagtgagag gcaacctgga gaatttgttc ctgcagtgcc cgaaacccac 840
actgcagcag atcagccaca tcgcccagca gcttgggctc gagaaggatg tggtccgagt 900
gtggttctgt aaccggcgcc agaagggcaa gcgatcaagc agcgactatg cacaacgaga 960
ggattttgag gctgctgggt ctcctttctc agggggacca gtgtcctttc ctctggcccc 1020
agggccccat tttggtaccc caggctatgg gagccctcac ttcactgcac tgtactcctc 1080
ggtccctttc cctgaggggg aagcctttcc ccctgtctcc gtcaccactc tgggctctcc 1140
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Claims (15)
- 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터를 포함하는, 줄기세포의 줄기세포성 억제용 배지 조성물로서,
상기 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4)의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌; 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신; 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화가 저해되는 것에 특징이 있는 OCT4의 암호화 유전자로서,
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌이 리신으로 치환되거나; 또는
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신이 아르기닌으로 치환된 OCT4의 암호화 유전자인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 줄기세포성 억제용 배지 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 배아줄기세포, 생식세포, 및 암 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 줄기세포성 억제용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 줄기세포의 증식, 자기재생, 군집능, 또는 생존을 억제하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 줄기세포성 억제용 배지 조성물.
- 제1항의 조성물 및 세포 치료용 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 세포 치료제.
- 삭제
- 제7항에 있어서,
상기 세포 치료제는 치료용 줄기세포의 전이, 생존, 또는 암화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 세포 치료제.
- In vitro 상에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4)의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌; 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신; 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화를 억제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, OCT4 메틸화 기능 조절을 통한 줄기세포의 줄기세포성 억제 방법으로서,
상기 메틸화를 억제하는 단계는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌을 리신으로 치환하는 단계; 또는
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신을 아르기닌으로 치환하는 단계인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 하기 단계를 포함하는, 줄기세포의 줄기세포성 억제 물질 스크리닝 방법:
(a) In vitro 상에서 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4) 또는 인간 OCT4를 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화 억제 여부를 확인하는 단계로서,
상기 메틸화 억제 여부를 확인하는 단계는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌의 리신으로의 치환 여부를 확인하는 단계; 또는
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 아르기닌으로의 치환 여부를 확인하는 단계인 것을 특징으로 하는, 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 아르기닌 또는 리신의 메틸화가 억제된 경우, 상기 후보물질을 줄기세포의 줄기세포성 억제 물질로 선택하는 단계.
- 하기 단계를 포함하는, 줄기세포의 줄기세포성 억제 여부 진단을 위한 정보제공방법:
(a) In vitro 상에서 마우스 OCT4(octamer-binding transcription factor 4) 또는 인간 OCT4를 발현하는 세포로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 메틸화 억제 여부를 확인하는 단계로서,
상기 메틸화 억제 여부를 확인하는 단계는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 179번째 아르기닌 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 186번째 아르기닌의 리신으로의 치환 여부를 확인하는 단계; 또는
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마우스 OCT4의 아미노산 서열에서 215번째 리신 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 OCT4의 아미노산 서열에서 222번째 리신의 아르기닌으로의 치환 여부를 확인하는 단계인 것을 특징으로 하는, 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 아르기닌 또는 리신의 메틸화가 억제된 경우, 줄기세포의 줄기세포성이 억제된 것으로 진단하는 단계.
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Non-Patent Citations (3)
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|---|
| Development & Reproduction. 2013. Vol.17, N0.1, pp.9-16.* |
| Scientific Research. 2016. Vol.6, Article 20818* |
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