JP2009276245A - 持続性皮膚炎症性疾患の改善剤をスクリーニングする方法及びその改善剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤のスクリーニング方法及びその改善剤の提供を課題とする。
【解決手段】ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｋｉｎａｓｅ）、ｐ３８及びＮＦ−κＢ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ−κＢ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのシグナル伝達分子を指標とした、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤をスクリーニングする方法。
【選択図】図２
【解決手段】ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｋｉｎａｓｅ）、ｐ３８及びＮＦ−κＢ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ−κＢ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのシグナル伝達分子を指標とした、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤をスクリーニングする方法。
【選択図】図２
Description
本発明はＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤を提供する。
過剰増殖や乾癬においてアップレギュレーションされるタンパク質として１００Ａ８およびＳ１００Ａ９が知られる。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、２０を超えるメンバーから構成されるＥＦ−ハンドカルシウム結合Ｓ１００タンパク質ファミリーに属する（非特許文献１：Marenholz I et al., Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111-1122）。どちらのタンパク質も好中球、活性化単球、およびマクロファージによって分泌され、それらの細胞の化学走性分子として機能し、炎症性細胞の漸増に関する正のフィードバックループに関与する（非特許文献２：Roth J et al., Trends Immunol (2003) 24:155-158）。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９陽性骨髄細胞は、炎症領域内に浸潤する最初の細胞である（非特許文献３：Odink K et al., Nature (1987) 330:80-82）。慢性関節リウマチ（非特許文献４：Liao H et al., Arthritis Rheum (2004） 50:3792-3803）、多発性硬化症（非特許文献５：Bogumil T et al., Neurosci Lett (1998) 247:195-197）、クローン病（非特許文献６：Lugering N, et al., Digestion (1995) 56:406-414）、および結合組織疾患（非特許文献７：Kuruto R, et al., J Biochem (Tokyo) (1990) 108:650-653）を含む多数のヒト炎症性疾患で高いＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９血清レベルが観察されている。従って、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、炎症の誘導および伝播に重要な役割を担うと考えられている。
上皮細胞中でＳ１００Ａ８と１００Ａ９が果たす生物学的機能について、本発明者は以前、外因性Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９が複合体（Ｓ１００Ａ８／Ａ９）を形成することで正常表皮角化細胞（ＮＨＫ）を刺激して乾癬性病変などにおいて発現亢進される炎症性サイトカインを産生させ、さらにＳ１００Ａ８／Ａ９誘導性サイトカインがＮＨＫ中でのＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の産生および分泌を刺激することを明らかにした（非特許文献８：J Cell Biochem. 2007 Nov 28, Epub ahead of print)。さらに、Ｓ１００Ａ８／Ａ９自体がＮＨＫの増殖を増強することも見出した。これらの結果は、主要メディエーターとしてＳ１００Ａ８／Ａ９が関与するＮＨＫの増殖と炎症の正のフィードバック機構の存在を明らかにした。即ち、Ｓ１００Ａ８／Ａ９が炎症性サイトカインの産生を誘導して炎症性疾患を惹起し、その炎症が細胞増殖を誘導し、さらには細胞増殖が炎症を誘導するといったスパイラルを形成し、増殖・炎症が連鎖する持続性皮膚炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎や乾癬などの原因となることが示唆された。
Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111-1122
Trends Immunol (2003) 24:155-158
Nature (1987) 330:80-82
Arthritis Rheum (2004） 50:3792-3803
Neurosci Lett (1998) 247:195-197
Digestion (1995) 56:406-414
J Biochem (Tokyo) (1990) 108:650-653
J Cell Biochem. 2007 Nov 28, Epub ahead of print
Hum Genet (2002) 111:310-313
本発明は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤のスクリーニング方法及びその改善剤の提供を課題とする。
本発明者は、正常表皮角化細胞（ＮＨＫ）においてＳ１００Ａ８／Ａ９により活性化されるシグナル伝達経路の同定を試みた。ヒトホスホ−ＭＡＰＫアレイ及びウェスタンブロットを用い、細胞増殖を誘導する様々なシグナル伝達分子の活性化をそのリン酸化を介して調べたところ、組換Ｓ１００Ａ８／Ａ９の添加により３０分以内において二つのストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＳＰＡＫ）ｐ３８及びＪＮＫが活性化（リン酸化）されることを見出した。一方、Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢ）やＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）といった細胞増殖因子の活性化は認められなかった。また、免疫染色法によってシグナル伝達分子の活性化を調べたところ、組換Ｓ１００Ａ８／Ａ９の存在下でＮＦ−κＢの活性化も認められた。
従って、Ｓ１００Ａ８／Ａ９によるこれら特定のシグナル伝達分子の活性化を抑制できれば、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患を予防・治療できることが見出され、本発明を完成するに至った。
従って、Ｓ１００Ａ８／Ａ９によるこれら特定のシグナル伝達分子の活性化を抑制できれば、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患を予防・治療できることが見出され、本発明を完成するに至った。
従って、本願は以下の発明を包含する：
（１）ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｋｉｎａｓｅ）、ｐ３８及びＮＦ−κＢ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ−κＢ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのシグナル伝達分子を指標とした、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤をスクリーニングする方法。
（２）表皮角化細胞にＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９の存在下で候補薬剤を作用させ、前記表皮角化細胞のＪＮＫ、ｐ３８及びＮＦ−κＢからなる群から選ばれる少なくとも１つのシグナル伝達分子の活性化を有意に抑制する候補薬剤をＳ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤として選択する（１）の方法。
（３）ＪＮＫ、ｐ３８及びＮＦ−κＢの全てを指標とした、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ローズアップルリーフエキス、イブキジャコウエキス、ＭＯＰＳ、Ｄ−プシコース並びに抗Ｓ１００Ａ８中和抗体及び抗Ｓ１００Ａ９中和抗体からなる群からばれる１種又は複数種の薬剤又は抗体を含有することからなる、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤。
（１）ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｋｉｎａｓｅ）、ｐ３８及びＮＦ−κＢ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ−κＢ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのシグナル伝達分子を指標とした、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤をスクリーニングする方法。
（２）表皮角化細胞にＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９の存在下で候補薬剤を作用させ、前記表皮角化細胞のＪＮＫ、ｐ３８及びＮＦ−κＢからなる群から選ばれる少なくとも１つのシグナル伝達分子の活性化を有意に抑制する候補薬剤をＳ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤として選択する（１）の方法。
（３）ＪＮＫ、ｐ３８及びＮＦ−κＢの全てを指標とした、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ローズアップルリーフエキス、イブキジャコウエキス、ＭＯＰＳ、Ｄ−プシコース並びに抗Ｓ１００Ａ８中和抗体及び抗Ｓ１００Ａ９中和抗体からなる群からばれる１種又は複数種の薬剤又は抗体を含有することからなる、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤。
本発明により、乾癬やアトピー性皮膚炎といった持続性炎症皮膚疾患の有効な治療薬の提供が可能となる。従来、アトピー性皮膚炎などの持続性炎症皮膚疾患の治療に有効とされているのはステロイド系薬剤や免疫抑制剤が主なものであるが、継続使用に問題があり、またその効果も限定的であった。その点で、本発明は持続性皮膚炎症性疾患に有効な画期的な薬剤の探索の実現を可能にする。
炎症に関与するインターロイキン遺伝子やシクロオキシゲナーゼー２遺伝子の発現誘導には、２つの転写因子が中心的な役割をしており、その一つがＮＦ−κＢである。もう一つの転写因子はＡＰ−１であり、常にＤＮＡに結合しており、リン酸化されることによって活性化される。ＪＮＫとＰ３８はこのリン酸化を担うシグナル伝達分子である。このようにＮＦ−κＢ、ＪＮＫ及びＰ３８はいずれも炎症性疾患との関与について知られており、それらの活性化を抑制できれば一過性の皮膚炎症性疾患を改善し得ることは当業者であれば容易類推し得ようが、それがＳ１００Ａ８／Ａ９のような持続性を有することを特徴とする皮膚炎症性疾患の原因となる因子により活性化されることは本発明者が今般はじめて見出したものである。従って、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、Ｐ３８の活性化を抑制できれば持続性皮膚炎症性疾患を改善し得ることは驚くべき事実である。
本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、例えばＳ１００Ａ８／Ａ９の存在下で表皮角化細胞を候補薬剤とインキュベーションすることで表皮角化細胞に候補薬剤を作用させ、前記表皮角化細胞のＪＮＫ、ｐ３８及びＮＦ−κＢからなる群から選ばれる少なくとも１つのシグナル伝達分子、より好ましくはＪＮＫ、ｐ３８及びＮＦ−κＢの全ての活性化を、かかるシグナル伝達分子を作用させていないコントロールに比べ、有意に抑制する候補薬剤をＳ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤として選択する、ことからなる。その評価基準として、例えば表皮角化細胞中のＪＮＫ、ｐ３８及びＮＦ−κＢの各々の活性化がコントロール中のそれらと比べ10％以上、又は20％以上、又は30％以上、又は50％以上、又は70％以上、又は100％抑制していたなら「有意に抑制する」、と判断してよい。
ＪＮＫやｐ３８の活性化を検出する手段は特に限定されるわけではないが、例えばそのリン酸化をウェスタンブロティング法で検出することで、あるいは免疫染色法により核への移行を観察することで検出することができる。また、ＮＦ−κＢの活性化を検出する手段は特に限定されるわけではないが、例えば免疫染色法により核への移行を観察することで検出することができる。
培養表皮角化細胞は動物の表皮由来の表皮角化細胞を適当な培地、例えばEpiLife (クラボウ)中において培養されたものを用いることができる。細胞は、ヒトに限らず、マウス、ラット、ブタ等の表皮由来の細胞でも良いが、好ましくはヒト由来細胞を利用する。
Ｓ１００Ａ８およびＡ９
Ｓ１００Ａ８およびＡ９のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列は例えばHum Genet (2002) 111:310-313（非特許文献９）に公開されている。本発明において使用できるＳ１００Ａ８およびＡ９は、通常ヒト由来の天然型、あるいは組み換えタンパク質であるが、活性を有すれば改変型、異種由来、もしくは非精製品を用いることができる。Ｓ１００Ａ８およびＡ９の組換タンパク質は、当業界周知の方法に従い、例えば単離したまたはＰＣＲにより合成したＳ１００Ａ８又はＡ９遺伝子（ｃＤＮＡ)を例えばプラスミド、ウィルス等に挿入して発現ベクターを調製し、これを宿主細胞、例えば微生物、動物細胞又は植物細胞等の培養細胞に導入し、発現させることにより、大量調製することが可能である。
Ｓ１００Ａ８およびＡ９のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列は例えばHum Genet (2002) 111:310-313（非特許文献９）に公開されている。本発明において使用できるＳ１００Ａ８およびＡ９は、通常ヒト由来の天然型、あるいは組み換えタンパク質であるが、活性を有すれば改変型、異種由来、もしくは非精製品を用いることができる。Ｓ１００Ａ８およびＡ９の組換タンパク質は、当業界周知の方法に従い、例えば単離したまたはＰＣＲにより合成したＳ１００Ａ８又はＡ９遺伝子（ｃＤＮＡ)を例えばプラスミド、ウィルス等に挿入して発現ベクターを調製し、これを宿主細胞、例えば微生物、動物細胞又は植物細胞等の培養細胞に導入し、発現させることにより、大量調製することが可能である。
Ｓ１００Ａ８およびＡ９は表皮角化細胞と同種であることが好ましいが、異種であっても炎症性サイトカインを誘導し、表皮角化細胞を増殖可能であれば、使用することができる。Ｓ１００Ａ８および／またはＡ９は、水や培地、例えば表皮角化細胞の培養に適当な培地、例えば上記EpiLife（登録商標）培地に溶解し、培養系に添加する。添加量は、一概には規定できないが１ｎｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ程度、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ程度の濃度とする。Ｓ１００Ａ８および／またはＡ９の添加は、好ましくは塩化カルシウムの存在下で行う。Ｓ１００Ａ８および／またはＡ９の存在下でのインキュベーション時間、インキュベーション温度といった培養条件は特に制限されることはなく、好ましくは３０〜３７℃で１〜１４時間、より好ましくは３４〜３７℃で２〜７時間、好ましくはＣＯ2５％の下でインキュベーションを行う。
本発明はさらに、ローズアップルリーフエキス、イブキジャコウエキス、ＭＯＰＳ及びＤ−プシコースからなる群から選ばれる１種又は複数種の薬剤を含有することからなる、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤を提供する。
・ローズアップルリーフエキス（Syzygium Jambos Leaf）：フトモモ葉から採れるエキスで、高い抗酸化作用があり、紫外線や乾燥等の外的刺激から肌を保護する効果を有することで知られる。
・イブキジャコウエキス（Thymus serphyllum Linne subsp. serphyllum）：シソ科タイム属に属する植物であり、線維質コラーゲンの分解減少を抑え、ＤＮＡ断裂化抑制作用を有し、紫外線によるＤＮＡ損傷を防ぐ効果を有することで知られる。
・ローズアップルリーフエキス（Syzygium Jambos Leaf）：フトモモ葉から採れるエキスで、高い抗酸化作用があり、紫外線や乾燥等の外的刺激から肌を保護する効果を有することで知られる。
・イブキジャコウエキス（Thymus serphyllum Linne subsp. serphyllum）：シソ科タイム属に属する植物であり、線維質コラーゲンの分解減少を抑え、ＤＮＡ断裂化抑制作用を有し、紫外線によるＤＮＡ損傷を防ぐ効果を有することで知られる。
上記抽出物は常法により得ることができ、例えばその起源となる植物を抽出溶媒とともに常温又は加熱して浸漬または加熱還流した後、濾過し、濃縮して得ることができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水性溶媒、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、あるいは有機溶媒、例えばエタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン等を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。好ましくは、溶媒として水が使用される。上記溶媒で抽出して得られた抽出物をそのまま、あるいは例えば凍結乾燥などにより濃縮したエキスを使用でき、また必要であれば吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、所望の溶媒で溶出し、さらに濃縮したものも使用することができる。
・ＭＯＰＳ（２−モルホリノプロパンスルホン）：水溶性が高く、高濃度緩衝液を調製できるため、生化学の分野において広く利用される。
・Ｄ−プシコース：六炭糖およびケトースに分類される単糖であり、希少糖である。小腸α-グリコシダーゼを阻害し、ラットにおける炭水化物摂取後の血糖値上昇反応を抑制するといった効果が知られる。
・Ｄ−プシコース：六炭糖およびケトースに分類される単糖であり、希少糖である。小腸α-グリコシダーゼを阻害し、ラットにおける炭水化物摂取後の血糖値上昇反応を抑制するといった効果が知られる。
本発明の持続性皮膚炎症性疾患の改善剤は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎、乾癬などの予防、治療といった改善等に有効な医薬品又は化粧品として利用できる。
本発明の持続性皮膚炎症性疾患の改善剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の持続性皮膚炎症性疾患の改善剤の投与形態は、経口、非経口、外用等であってよい。剤型としては、例えば錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、又は注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等の外用剤を挙げることができる。
本発明の持続性皮膚炎症性疾患の改善剤の上記薬剤の配合量は、用途に応じて適宜決定できるが、一般には阻害剤全量中、乾燥物として0.0001〜20.0質量％、好ましくは0.0001〜10.0質量％である。
また、持続性皮膚炎症性疾患の改善剤中には、上記薬剤以外に、例えば、通常の食品や医薬品に使用される賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、化粧品等に通常用いられる美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
さらに、本発明の持続性皮膚炎症性疾患の改善剤を皮膚外用剤として使用する場合、皮膚外用剤に慣用の助剤、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンA類なども適宜配合することができる。
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
組換タンパク質の調製
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅させ、ｐＧＥＸ６Ｐ１（GE Healthcare Bio-Sciences社、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ: BamH1-Xho1部位）にクローニングした。ベクターのヌクレオチド配列をＤＮＡシーケンシングによって確認した。大腸菌（Escherichia coli）（BL21-Codon Plus - (DE3)-RIL; STRATAGENE社、米国、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）をこのベクター（ｐＧＥＸ６Ｐ１、ｐＧＥＸ６Ｐ１−Ｓ１００Ａ８及びｐＧＥＸ６Ｐ１−Ｓ１００Ａ９）により形質転換させた。組換ＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオン-アガロース親和性クロマトグラフィーによって精製した。ＧＳＴは、PreScissionプロテアーゼ（GE Healthcare Bio-Sciences社）で切断することで遊離させ、グルタチオン−アガロース親和性クロマトグラフィーに吸着させて除去した。
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅させ、ｐＧＥＸ６Ｐ１（GE Healthcare Bio-Sciences社、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ: BamH1-Xho1部位）にクローニングした。ベクターのヌクレオチド配列をＤＮＡシーケンシングによって確認した。大腸菌（Escherichia coli）（BL21-Codon Plus - (DE3)-RIL; STRATAGENE社、米国、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）をこのベクター（ｐＧＥＸ６Ｐ１、ｐＧＥＸ６Ｐ１−Ｓ１００Ａ８及びｐＧＥＸ６Ｐ１−Ｓ１００Ａ９）により形質転換させた。組換ＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオン-アガロース親和性クロマトグラフィーによって精製した。ＧＳＴは、PreScissionプロテアーゼ（GE Healthcare Bio-Sciences社）で切断することで遊離させ、グルタチオン−アガロース親和性クロマトグラフィーに吸着させて除去した。
抗Ｓ１００Ａ８中和抗体、抗Ｓ１００Ａ９中和抗体
リコンビナントＳ１００Ａ８又はＳ１００Ａ９を用いて、常法に従いウサギに免疫し、抗Ｓ１００Ａ８中和抗体、抗Ｓ１００Ａ９中和抗体を作製した。IgG分画をProteinGカラムにて精製し、以下の実験に用いた。
リコンビナントＳ１００Ａ８又はＳ１００Ａ９を用いて、常法に従いウサギに免疫し、抗Ｓ１００Ａ８中和抗体、抗Ｓ１００Ａ９中和抗体を作製した。IgG分画をProteinGカラムにて精製し、以下の実験に用いた。
ヒトホスホ−ＭＡＰＫアレイ
ヒトホスホ−ＭＡＰＫアレイキット（ARY002, R&D Systems, Inc)を用いて、Ｓ１００Ａ８／Ａ９により活性化される分子を網羅的に探索した。
正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をEpiLife（登録商標）-KG2培地（M-EPI-2150,KURABO）中、恒湿、CO2 5%、37℃において培養した。終密度70〜80%の細胞をEpiLife（登録商標）培地（M-EPI-500-CA, KURABO）に置換した。20時間後にＳ１００Ａ８／Ａ９のリコンビナントタンパク質を10ug/ml添加し、恒湿、CO2 5%、37℃において培養した。30分後に、ヒトホスホ−ＭＡＰＫアレイキットに付属のLysisバッファーに溶解させ、不溶性画分を14,000rpmにて15分、4℃での遠心分離操作により除去した。可溶性画分中の総タンパク質量を定量後、300ugを用い、添付の説明書に従ってアレイ実験を行った。その結果を図１に示す。
ヒトホスホ−ＭＡＰＫアレイキット（ARY002, R&D Systems, Inc)を用いて、Ｓ１００Ａ８／Ａ９により活性化される分子を網羅的に探索した。
正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をEpiLife（登録商標）-KG2培地（M-EPI-2150,KURABO）中、恒湿、CO2 5%、37℃において培養した。終密度70〜80%の細胞をEpiLife（登録商標）培地（M-EPI-500-CA, KURABO）に置換した。20時間後にＳ１００Ａ８／Ａ９のリコンビナントタンパク質を10ug/ml添加し、恒湿、CO2 5%、37℃において培養した。30分後に、ヒトホスホ−ＭＡＰＫアレイキットに付属のLysisバッファーに溶解させ、不溶性画分を14,000rpmにて15分、4℃での遠心分離操作により除去した。可溶性画分中の総タンパク質量を定量後、300ugを用い、添付の説明書に従ってアレイ実験を行った。その結果を図１に示す。
図の表中、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の添加によりリン酸化強度が変化しない又は減少したものを「−」、若干上昇したものを「＋」、有意に上昇ものを「＋＋」と表記した。この表から、ｐ３８のサブユニットであるｐ３８α（＋＋）、ｐ３８β（＋）、ｐ３８δ（＋）のリン酸化が認められた。その他のシグナル分子でリン酸化の上昇が認められたものはなかった。
シグナル伝達分子の活性化状態の確認
Ｓ１００Ａ８／Ａ９により活性化される分子をウェスタンブロット法により検証した。ＪＮＫに関しては検出成度の点から、ＪＮＫの下流のｃ−Ｊｕｎのリン酸化を指標としてＪＮＫの活性化状態を評価した。
正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をEpiLife（登録商標）-KG2培地（M-EPI-2150,KURABO）中、恒湿、CO2 5%、37℃において培養した。終密度70〜80%の細胞をEpiLife（登録商標）培地（M-EPI-500-CA, KURABO）に置換した。20時間後にＳ１００Ａ８／Ａ９のリコンビナントタンパク質を10ug/ml添加し、恒湿、CO2 5%、37℃において培養した。15分後、30分後に、50mM Hepes(pH 7.5)、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EGTA、10% Glycerol、1% Triton-X-100、10mM NaF、1mM Na3VO4、1mM PMSFを含有する抽出バッファーに溶解させ、不溶性画分を14,000rpmにて15分、4℃での遠心分離操作により除去した。可溶性画分中の総タンパク質量を定量し、すべてのサンプルの総タンパク質量を同程度にそろえた。可溶性画分をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、抗リン酸化ERK抗体（44-680G, BIOSOURCE、希釈率1/1000）、抗ERK抗体（AB3053, CHEMICON、希釈率1/2000）、抗リン酸化p38抗体（#9211、Cell Signaling Technology, Inc., 希釈率1/500）、抗p38抗体（#05-454、UPSTATE、希釈率1/400）、抗リン酸化c-Jun抗体（#9261、Cell Signaling Technology, Inc., 希釈率1/1000）、抗c-Jun抗体（#9165、Cell Signaling Technology, Inc., 希釈率1/1000）、抗リン酸化Akt抗体（#9271、Cell Signaling Technology, Inc., 希釈率1/1000）、抗Akt抗体（#9272、Cell Signaling Technology, Inc., 希釈率1/1000）で標識した。二次抗体には、抗ウサギHRP標識二次抗体（NA9340, GEヘルスケアバイオサイエンス、1/10000）、または、抗マウスHRP標識二次抗体（NA9310, GEヘルスケアバイオサイエンス、1/5000）を用いた。検出には、ECL Plus ウェスタンブロット検出試薬（RPN2132、 GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いた。
Ｓ１００Ａ８／Ａ９により活性化される分子をウェスタンブロット法により検証した。ＪＮＫに関しては検出成度の点から、ＪＮＫの下流のｃ−Ｊｕｎのリン酸化を指標としてＪＮＫの活性化状態を評価した。
正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をEpiLife（登録商標）-KG2培地（M-EPI-2150,KURABO）中、恒湿、CO2 5%、37℃において培養した。終密度70〜80%の細胞をEpiLife（登録商標）培地（M-EPI-500-CA, KURABO）に置換した。20時間後にＳ１００Ａ８／Ａ９のリコンビナントタンパク質を10ug/ml添加し、恒湿、CO2 5%、37℃において培養した。15分後、30分後に、50mM Hepes(pH 7.5)、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EGTA、10% Glycerol、1% Triton-X-100、10mM NaF、1mM Na3VO4、1mM PMSFを含有する抽出バッファーに溶解させ、不溶性画分を14,000rpmにて15分、4℃での遠心分離操作により除去した。可溶性画分中の総タンパク質量を定量し、すべてのサンプルの総タンパク質量を同程度にそろえた。可溶性画分をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、抗リン酸化ERK抗体（44-680G, BIOSOURCE、希釈率1/1000）、抗ERK抗体（AB3053, CHEMICON、希釈率1/2000）、抗リン酸化p38抗体（#9211、Cell Signaling Technology, Inc., 希釈率1/500）、抗p38抗体（#05-454、UPSTATE、希釈率1/400）、抗リン酸化c-Jun抗体（#9261、Cell Signaling Technology, Inc., 希釈率1/1000）、抗c-Jun抗体（#9165、Cell Signaling Technology, Inc., 希釈率1/1000）、抗リン酸化Akt抗体（#9271、Cell Signaling Technology, Inc., 希釈率1/1000）、抗Akt抗体（#9272、Cell Signaling Technology, Inc., 希釈率1/1000）で標識した。二次抗体には、抗ウサギHRP標識二次抗体（NA9340, GEヘルスケアバイオサイエンス、1/10000）、または、抗マウスHRP標識二次抗体（NA9310, GEヘルスケアバイオサイエンス、1/5000）を用いた。検出には、ECL Plus ウェスタンブロット検出試薬（RPN2132、 GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いた。
図２および図３がそれぞれ示すとおり、Ｓ１００Ａ８／Ａ９によるｐ３８及びＪＮＫの活性化が確認された。
ＪＮＫ1及びＮＦ-κＢ（P50）の免疫染色
正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をEpiLife（登録商標）-KG2培地（M-EPI-2150,KURABO）中、恒湿、CO2 5%、37℃において培養した。終密度70〜80%の細胞をEpiLife（登録商標）培地（M-EPI-500-CA, KURABO）に置換した。24時間後、Ｓ１００Ａ８／Ａ９を終濃度10ug/mlになるように培地に添加し、1時間インキュベートした。PBSで2回洗浄後、冷メタノール（-20度C）で20分間固定した。PBSで洗浄後、3%過酸化水素水中で20分間振とうし、内在性のペルオキシダーゼをブロック、水、PBSで２回洗浄後、ブロッキング試薬で細胞を覆い、30分室温でインキュベートした。PBSで1回洗浄後、抗JNK1抗体（サンタクルーズ社）、もしくは抗ＮＦ-κＢ(P50)(サンタクルーズ社)抗体で一晩インキュベートした。PBSで3回洗浄後、AlexaFluor488抗ウサギIgG抗体を用い、室温で1時間インキュベートし、PBSで3回洗浄後、核染色剤DAPIを含むVecta Shieldを用いて封入し蛍光顕微鏡で観察した。
また、ＮＦ-κＢ(P50)の核移行（活性化）阻害剤であるパルセノリドを予め添加しておくことにより、Ｓ１００Ａ８／Ａ９による活性化が影響を受けるかどうかを検討した。
正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をEpiLife（登録商標）-KG2培地（M-EPI-2150,KURABO）中、恒湿、CO2 5%、37℃において培養した。終密度70〜80%の細胞をEpiLife（登録商標）培地（M-EPI-500-CA, KURABO）に置換した。24時間後、Ｓ１００Ａ８／Ａ９を終濃度10ug/mlになるように培地に添加し、1時間インキュベートした。PBSで2回洗浄後、冷メタノール（-20度C）で20分間固定した。PBSで洗浄後、3%過酸化水素水中で20分間振とうし、内在性のペルオキシダーゼをブロック、水、PBSで２回洗浄後、ブロッキング試薬で細胞を覆い、30分室温でインキュベートした。PBSで1回洗浄後、抗JNK1抗体（サンタクルーズ社）、もしくは抗ＮＦ-κＢ(P50)(サンタクルーズ社)抗体で一晩インキュベートした。PBSで3回洗浄後、AlexaFluor488抗ウサギIgG抗体を用い、室温で1時間インキュベートし、PBSで3回洗浄後、核染色剤DAPIを含むVecta Shieldを用いて封入し蛍光顕微鏡で観察した。
また、ＮＦ-κＢ(P50)の核移行（活性化）阻害剤であるパルセノリドを予め添加しておくことにより、Ｓ１００Ａ８／Ａ９による活性化が影響を受けるかどうかを検討した。
図４はＪＮＫ１のＳ１００Ａ８／Ａ９による活性化を示す。免疫染色されたＪＮＫ１は当初は散在して観察されたが、期間が経過するにつれ小さいスポットに集中することが観察され、JNK1が活性化されて核に移行しているのが認められた。
図５はＮＦ-κＢ(P50)のＳ１００Ａ８／Ａ９による活性化を示す。一時間において、免疫染色されたＮＦ-κＢ(P50)は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の不在下のコントロールでは散在していたが、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の存在下では小さいスポットに集中することが観察され、ＮＦ-κＢが活性化されて核に移行しているのが認められた。なお、この活性化（核移行）はＮＦ-κＢの阻害剤であるパルセニリドにより抑制されるのが観察された。
図５はＮＦ-κＢ(P50)のＳ１００Ａ８／Ａ９による活性化を示す。一時間において、免疫染色されたＮＦ-κＢ(P50)は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の不在下のコントロールでは散在していたが、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の存在下では小さいスポットに集中することが観察され、ＮＦ-κＢが活性化されて核に移行しているのが認められた。なお、この活性化（核移行）はＮＦ-κＢの阻害剤であるパルセニリドにより抑制されるのが観察された。
薬剤添加実験
Ｓ１００Ａ８／Ａ９によるシグナル伝達を阻害する薬剤や抗体の探索するため、薬剤や抗体添加時のＳ１００Ａ８／Ａ９によるサイトカイン産生能を検証した。
正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をEpiLife-KG2培地（M-EPI-2150,KURABO）中、恒湿、CO2 5%、37℃において培養した。終密度70〜80%の細胞をEpiLife（登録商標）培地（M-EPI-500-CA, KURABO）に置換した。20時間後に、薬剤又は抗体を含むEpiLife（登録商標）培地に置換し、さらに１時間後に薬剤又は抗体とＳ１００Ａ８／Ａ９を含むEpiLife（登録商標）培地に置換した。用いた薬剤は、リポ酸（終濃度0.1%）、ローズアップルリーフエキス（終濃度0.1%）、イブキジャコウエキス（終濃度0.1%）、ＭＯＰＳ（終濃度0.01%）、Ｄ−プシコース（終濃度0.01%）、Ｄ−フルクトース（終濃度0.01%）。また、抗体は、方法（２）に記載した抗Ｓ１００Ａ８中和抗体（終濃度10ug/ml）、抗Ｓ１００Ａ９中和抗体（終濃度10ug/ml）を用いた。
Ｓ１００Ａ８／Ａ９によるシグナル伝達を阻害する薬剤や抗体の探索するため、薬剤や抗体添加時のＳ１００Ａ８／Ａ９によるサイトカイン産生能を検証した。
正常ヒト表皮角化細胞（KK-4009, KURABO）をEpiLife-KG2培地（M-EPI-2150,KURABO）中、恒湿、CO2 5%、37℃において培養した。終密度70〜80%の細胞をEpiLife（登録商標）培地（M-EPI-500-CA, KURABO）に置換した。20時間後に、薬剤又は抗体を含むEpiLife（登録商標）培地に置換し、さらに１時間後に薬剤又は抗体とＳ１００Ａ８／Ａ９を含むEpiLife（登録商標）培地に置換した。用いた薬剤は、リポ酸（終濃度0.1%）、ローズアップルリーフエキス（終濃度0.1%）、イブキジャコウエキス（終濃度0.1%）、ＭＯＰＳ（終濃度0.01%）、Ｄ−プシコース（終濃度0.01%）、Ｄ−フルクトース（終濃度0.01%）。また、抗体は、方法（２）に記載した抗Ｓ１００Ａ８中和抗体（終濃度10ug/ml）、抗Ｓ１００Ａ９中和抗体（終濃度10ug/ml）を用いた。
サイトカイン産生能については、下記の方法に準じて行った。
薬剤又は抗体とＳ１００Ａ８／Ａ９を含むEpiLife（登録商標）培地に置換し、3時間後に、PBSで2回洗浄し、その後、ISOGEN（311-02501、ニッポンジーン）を用い、RNAを単離した。SuperScript（登録商標） II Reverse Transcriptase （18064-014、Invitrogen）を用い、cDNAに逆転写した。Quantitect SYBR Green PCR Kit（204143、QIAGEN）を用いて、ライトサイクラーソフトウェア（Roche）によりIL8とG3PDHのcDNA量を定量した。用いたプライマーの配列は以下のとおりである。
IL-8 Forward primer：TCAGAGACAGCAGAGCACACA（配列番号１）
IL-8 Reverse primer：AATCAGGAAGGCTGCCAA（配列番号２）
G3PDH Forward primer：GGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG（配列番号３）
G3PDH Reverse primer：TATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTGAGG（配列番号４）
IL8 ｃDNA量をG3PDH ｃDNA量で除したものをIL8発現量とした。
薬剤又は抗体とＳ１００Ａ８／Ａ９を含むEpiLife（登録商標）培地に置換し、3時間後に、PBSで2回洗浄し、その後、ISOGEN（311-02501、ニッポンジーン）を用い、RNAを単離した。SuperScript（登録商標） II Reverse Transcriptase （18064-014、Invitrogen）を用い、cDNAに逆転写した。Quantitect SYBR Green PCR Kit（204143、QIAGEN）を用いて、ライトサイクラーソフトウェア（Roche）によりIL8とG3PDHのcDNA量を定量した。用いたプライマーの配列は以下のとおりである。
IL-8 Forward primer：TCAGAGACAGCAGAGCACACA（配列番号１）
IL-8 Reverse primer：AATCAGGAAGGCTGCCAA（配列番号２）
G3PDH Forward primer：GGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG（配列番号３）
G3PDH Reverse primer：TATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTGAGG（配列番号４）
IL8 ｃDNA量をG3PDH ｃDNA量で除したものをIL8発現量とした。
その結果を図６、７及び８に示す。
図６に示すとおり、コントロール（試験薬剤不在下）に比べ、ローズアップルリーフエキス又はイブキジャコウエキスの存在下では、Ｓ１００Ａ８／Ａ９によるサイトカイン産生が抑制されることが認められた。なお、抗酸化剤効果を有することで知られるリポ酸にはそのような効果は認められなかった。
図７は、コントロールに比べ、ＭＯＰＳやＤ−プシコースの存在下で、Ｓ１００Ａ８／Ａ９によるサイトカイン産生が抑制されることを示す。なお、抗酸化剤効果を有することで知られるＤ−フルクトースにはそのような効果は認められなかった。
図８には、コントロールに比べ、抗Ｓ１００Ａ８中和抗体の存在下で、Ｓ１００Ａ８／Ａ９によるサイトカイン産生が抑制されることを示す。
図６に示すとおり、コントロール（試験薬剤不在下）に比べ、ローズアップルリーフエキス又はイブキジャコウエキスの存在下では、Ｓ１００Ａ８／Ａ９によるサイトカイン産生が抑制されることが認められた。なお、抗酸化剤効果を有することで知られるリポ酸にはそのような効果は認められなかった。
図７は、コントロールに比べ、ＭＯＰＳやＤ−プシコースの存在下で、Ｓ１００Ａ８／Ａ９によるサイトカイン産生が抑制されることを示す。なお、抗酸化剤効果を有することで知られるＤ−フルクトースにはそのような効果は認められなかった。
図８には、コントロールに比べ、抗Ｓ１００Ａ８中和抗体の存在下で、Ｓ１００Ａ８／Ａ９によるサイトカイン産生が抑制されることを示す。
Claims (4)
- ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｋｉｎａｓｅ）、ｐ３８及びＮＦ−κＢ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ−κＢ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのシグナル伝達分子を指標とした、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤をスクリーニングする方法。
- 表皮角化細胞にＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９の存在下で候補薬剤を作用させ、前記表皮角化細胞のＪＮＫ、ｐ３８及びＮＦ−κＢからなる群から選ばれる少なくとも１つのシグナル伝達分子の活性化を有意に抑制する候補薬剤をＳ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤として選択する、請求項１記載の方法。
- ＪＮＫ、ｐ３８及びＮＦ−κＢの全てを指標とした、請求項１又は２に記載の方法。
- ローズアップルリーフエキス（Syzygium Jambos Leaf）、イブキジャコウエキス（Thymus serphyllum Linne subsp. serphyllum）、ＭＯＰＳ（２−モルホリノプロパンスルホン）、Ｄ−プシコース並びに抗Ｓ１００Ａ８中和抗体及び抗Ｓ１００Ａ９中和抗体からなる群から選ばれる１種又は複数種の薬剤又は抗体を含有することからなる、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患の改善剤。
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