WO2022034833A1 - Ｉｌ－８抑制剤、皮膚抗老化剤、およびそれを用いて皮膚老化を抑制する方法 - Google Patents

Ｉｌ－８抑制剤、皮膚抗老化剤、およびそれを用いて皮膚老化を抑制する方法 Download PDF

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aging
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cells
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俊介 入山
淑江 樋口
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株式会社 資生堂
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Definitions

  • the present invention relates to an IL-8 inhibitor, a skin anti-aging agent, and a method for suppressing skin aging using the same.
  • SASP seenescence-associated secretory phenotype
  • cytokines such as IL-8 and IL-6 are known as SASP factors (Non-Patent Documents 1-3). Therefore, it is expected that skin aging can be suppressed by a substance that suppresses IL-8.
  • Patent Document 1 includes a step of applying a pressure load to epidermal cells from the lateral direction, and using the activity of an inflammatory factor such as IL-8 released by the epidermal cells as an index, an anti-wrinkle formation inhibitor and / or an anti-inflammatory agent. Disclose how to screen.
  • Patent Document 2 discloses a gel-forming polysaccharide that can be obtained from microalgae cells derived from the order Prasinococcus.
  • Patent Document 3 is used to reduce the expression of pro-inflammatory genes such as IL-8, and is used for the treatment or prevention of inflammatory disorders such as atopic dermatitis and / or autoimmune disorders and / or allergic disorders.
  • a composition comprising Bacteroides thetaiotaomicron or a bioform thereof for use.
  • An object of the present invention is to provide an IL-8 inhibitor, a skin anti-aging agent, and a method for suppressing skin aging using the same.
  • the present application includes the following inventions: (1) An IL-8 inhibitor containing at least one of Ibukijakou extract, Fennel extract, Rose extract, Marjoram extract, and Seiyo rose extract as an active ingredient. (2) An IL-8 translation inhibitor containing at least one of Ibukijakou extract, Fennel extract, Rose extract, Marjoram extract, and Seiyo rose extract as an active ingredient. (3) A skin anti-aging agent containing the agent according to (1) or (2). (4) The skin anti-aging agent according to (3), wherein skin anti-aging is achieved by promoting the proliferation of skin stem cells. (5) The skin anti-aging agent according to (3) or (4), wherein skin anti-aging is achieved by suppressing the increase of skin aging cells.
  • an agent and a method effective for suppressing skin aging are provided by applying an IL-8 inhibitor.
  • FIG. 1 shows the results of Experiment 1 and shows the amount of IL-8 (pg / 100 ⁇ g protein) in skin cells obtained from subjects of each age.
  • FIG. 2 shows the results of Experiment 2. Shows skin cell colonies formed with IL-8 not added (cont: left), IL-8 added (IL-8: center), and IL-8 and SB225002 added (IL-8 + SB225002: right). It is a photograph (upper figure) and a graph counting the number of colonies (lower figure).
  • FIG. 3 shows the results of Experiment 3.
  • FIG. 4 shows the results of Experiment 4. Photographs of SA- ⁇ -Gal-stained epidermal keratinized cells without IL-8 (cont: left) and with IL-8 (IL-8: right) (upper figure), and SA- ⁇ -Gal-positive cells It is a graph (lower figure) which shows the ratio (%) of.
  • FIG. 5 is the result of Experiment 5 and is a graph showing the number of epidermal keratinocytes (%) and the area of lymphatic vessels (%).
  • FIG. 6 shows the results of Experiment 7, which shows the IL-8 / B2M value (upper left), the amount of IL-8 protein (pg / mL) (upper right), and the IL-8 translation rate (IL-8 translation) of the Ibukijakou extract. ) (%) (Lower left).
  • FIG. 7 shows the results of Experiment 7, and the IL-8 / B2M value (upper left), IL-8 protein amount (pg / mL) (upper right), and IL-8 translation rate (IL-8 translation) of the fennel extract. (%) (Lower left) is shown.
  • FIG. 7 shows the results of Experiment 7, and the IL-8 / B2M value (upper left), IL-8 protein amount (pg / mL) (upper right), and IL-8 translation rate (IL-8 translation) of the fennel extract. (%) (Lower left) is shown.
  • FIG. 7 shows the results of Experiment 7, and the IL-8 / B2M
  • FIG. 8 shows the results of Experiment 7, and the IL-8 / B2M value (upper left), IL-8 protein amount (pg / mL) (upper right), and IL-8 translation rate (IL-8 translation) of the rose extract. (%) (Lower left) is shown.
  • FIG. 9 shows the results of Experiment 7, and the IL-8 / B2M value (upper left), IL-8 protein amount (pg / mL) (upper right), and IL-8 translation rate (IL-8 translation) of the marjoram extract. (%) (Lower left) is shown.
  • FIG. 9 shows the results of Experiment 7, and the IL-8 / B2M value (upper left), IL-8 protein amount (pg / mL) (upper right), and IL-8 translation rate (IL-8 translation) of the marjoram extract. (%) (Lower left) is shown.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Documents 1 to 3 it is expected that a substance that suppresses IL-8 can suppress skin aging.
  • the present inventors actually increase the amount of IL-8 with aging, IL-8 reduces the expression of skin stem cell genes and increases skin senescent cells, and IL-8 increases the proliferation ability of skin cells. However, it was confirmed that inhibition of IL-8 restores proliferative capacity.
  • the present inventors have come up with the idea that skin aging is suppressed by suppressing IL-8, especially by suppressing the translation of IL-8, and have searched for a novel substance having an IL-8 inhibitory effect.
  • the present inventors have found that fennel extract, fennel extract, rose extract, marjoram extract, and rose extract have a high IL-8 inhibitory effect.
  • the present invention relates to an IL-8 inhibitor, an IL-8 translation inhibitor, and a skin anti-aging agent (hereinafter, these may be collectively referred to as "the agent of the present invention"), and an application thereof.
  • the agent of the present invention a skin anti-aging agent
  • the method of the present invention may be a method for the purpose of cosmetology and may not be treated by a doctor or a medical professional.
  • IL-8 suppression refers to translation suppression of the IL-8 gene.
  • the translational repression of the IL-8 gene is, for example, IL- produced by the expression of the IL-8 gene when the agent of the present invention is given, as compared with the state (control) where the agent of the present invention is not given.
  • 8 Protein concentration or amount or translation rate (the ratio of IL-8 protein concentration or amount to control / the ratio of IL-8 gene expression to control x 100 (%)) is statistical, for example, with a significance level of 5%.
  • Decreasing with a significant difference eg, Student's t-test, etc.
  • IL-8 suppression may include suppression of IL-8 gene expression.
  • the expression of the IL-8 gene is at a significant level, for example, when the agent of the present invention is given, as compared with the state (control) in which the agent of the present invention is not given. Decreased with a statistically significant difference of 5% (eg, Student's t-test, etc.), or, for example, 5% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50%. It can mean that it is reduced by 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 100%.
  • the expression level of the IL-8 gene may be measured using, for example, a quantitative PCR method as in the examples, or may be measured using a commercially available kit, but the expression level is not limited thereto. Any known technique can be used.
  • the IL-8 protein concentration or amount may be measured, for example, by staining with an antibody, or may be measured using a commercially available kit, but is not limited thereto, and any known technique can be used. ..
  • skin anti-aging means that the aging of skin cells such as keratinocytes and fibroblasts is suppressed by suppressing IL-8.
  • skin anti-aging is achieved by promoting the proliferation of skin stem cells and / or suppressing the increase of skin senescent cells.
  • the inventors of the present application also found that IL-8 promotes aging of skin stem cells such as epidermal stem cells (data not shown). Therefore, in one embodiment, skin anti-aging is achieved by suppressing the aging of skin stem cells by IL-8.
  • Promotion of skin stem cell proliferation can be determined by counting the number of stem cells, measuring the expression level of stem cell markers such as Lrig1 and integer ⁇ 1, evaluating the proliferation ability of skin cells, for example, counting the number of colonies formed by skin cells.
  • Suppression of the increase of skin senescent cells can be determined by counting the number of senescent cells, measuring the expression level of senescent cell markers such as SA- ⁇ -gal and X-gal, and the like.
  • the aging of skin stem cells can be determined by a combination of the above-mentioned evaluation criteria of stem cells and senescent cells such as double staining of the markers. It has become clear that senescent cells lose their proliferative capacity and release factors that suppress the differentiation of other epidermal cells.
  • the present inventors have found that the number of skin stem cells and lymphatic vessels decrease with aging, and that there is a correlation between the number of skin stem cells and the lymphatic vessel area.
  • IL-8 which could not be recovered by lymphatic vessels, accelerates the aging of skin cells
  • IL-8 adversely affects lymphatic vessel cells, resulting in a decrease in lymphatic vessel cells.
  • various waste products that could not be recovered by the lymphatic vessels accelerate the aging of skin cells, or both. Therefore, skin aging is due to the deterioration of the drainage efficiency of waste products due to the deterioration of functions such as the decrease of lymphatic vessels due to the increase of IL-8.
  • the present invention also provides an IL-8 inhibitor for improving skin lymphatic dysfunction, and a skin anti-aging agent that achieves skin anti-aging by improving skin lymphatic dysfunction.
  • the cutaneous lymphatic vessel function can be measured by measuring the expression level using, for example, immunostaining with markers such as LYVE-1 and MCSP, and measuring the lymphatic vessel area by image analysis.
  • the agent of the present invention may consist of a fennel extract, a fennel extract, a rose extract, a marjoram extract, and / or a rose extract, or may be contained as an active ingredient.
  • the agent of the present invention may contain any one of the above active ingredients alone, or may contain two or more of them in any combination and ratio.
  • Breckland thyme (scientific name: Thymus Serpyllum, also known as wild thyme, Breckland thyme, Breckland thyme, English name: Creeping Thyme, Wild Thyme) is a perennial plant of the Labiatae family. It has been reported that the Juniperus chinensis extract has a profilaggrin, a filaggrin production promoting action, a barrier function improving action and the like. As the extract of musk, the above-ground extract of musk is preferable, but since the root, flower, fruit, pericarp, seed, etc. of musk also contain the active ingredient, any one or two of them is used. The above extracts can also be used.
  • Fennels (scientific name: Foeniculum vulgare, also known as Fennel, English name: Fennel) is a perennial plant of the Umbelliferae family. It has been reported that it acts as a healthy stomach, sputum, carminative, and analgesic.
  • the fennel extract is preferably an extract of fennel fruit, but since the roots, leaves, stems, flowers, seeds, etc. of fennel also contain active ingredients, one or more of these are extracted. You can also use things.
  • the rose extract refers to the extract of canina rose.
  • Canina rose (scientific name: Rosa canina, also known as rose rose, dog rose, rose hip, English name: Dog Rose, Brier Bush, Rose Hip) is a deciduous shrub of the rose family.
  • Canina roses are rich in vitamin C, and have been reported to improve spots and produce collagen.
  • the rose extract is preferably an extract of canina rose fruit, but since the root, leaves, stems, flowers, pericarp, seeds, etc. of canina rose also contain the active ingredient, one or more of these are used. Extracts can also be used.
  • Marjoram (scientific name: Origanum majorana, Majorana hortensis, also known as mayonara, oregano, marjoram, English name: Sweet Marjoram) is a perennial plant of the Labiatae family. Marjoram contains flavanone, flavones, tannins, etc., and has been reported to have an epidermal hyaluronic acid production promoting effect, a type I collagen production promoting effect, a phospholipase A2 production inhibitory effect, and the like.
  • the marjoram extract is preferably an extract of marjoram leaves, but since the roots, stems, flowers, fruits, peels, seeds, etc. of marjoram also contain active ingredients, one or more of these are used. Extracts can also be used.
  • Rosa centifolia also known as rose, Sentifolia rose, English name: Cabbage Rose, Provance Rose
  • the extract of roses is preferably an extract of flowers of roses, but since the roots, stems, leaves, fruits, peels, seeds, etc. of roses also contain active ingredients, one of these or one of them is preferable. Two or more extracts can also be used.
  • the above-mentioned various extracts may be commercially available as cosmetic raw materials or health food materials, or may be obtained by a conventional method.
  • the extraction method is not particularly limited, and examples thereof include an extraction method using a solvent.
  • the raw material can be obtained by immersing or refluxing the raw material at room temperature or by heating with an extraction solvent, filtering the raw material, and concentrating the raw material.
  • the raw material can be used as it is, it is possible to extract the active ingredient in a short time with high extraction efficiency under mild conditions by pulverizing it into granules or powder and using it for extraction.
  • the extraction temperature is not particularly limited, and may be appropriately set according to the particle size of the pulverized product, the type of solvent, and the like.
  • the extraction time is not particularly limited, and may be appropriately set according to the particle size of the pulverized product, the type of solvent, the extraction temperature, and the like. Further, at the time of extraction, stirring may be performed, the mixture may be allowed to stand without stirring, or ultrasonic waves may be applied.
  • any solvent can be used as long as it is a solvent usually used for extraction.
  • an aqueous solvent such as water, physiological saline, a phosphate buffer, a borate buffer, or an organic solvent such as ethanol can be used.
  • Various alcohols such as lower alcohols such as propylene glycol, 1,3-butylene glycol and glycerin or their hydrous alcohols, chloroform, dichloroethane, carbon tetrachloride, acetone, ethyl acetate, hexane and the like, alone or in combination, for example.
  • the active ingredient is extracted and dissolved in the solvent.
  • the solvent containing the extract may be used as it is, or may be used after being subjected to conventional purification treatments such as sterilization, washing, filtration, decolorization, and deodorization. Further, if necessary, it may be concentrated by freeze-drying or diluted with an arbitrary solvent before use. Further, the solvent may be completely volatilized to form a solid (dried product) before use, or the dried product may be redissolved in an arbitrary solvent before use.
  • the squeezed liquid obtained by squeezing the raw material contains the same active ingredient as the extract, the squeezed liquid can be used instead of the extract.
  • the present application also provides a composition containing the agent of the present invention.
  • the composition of the present invention may be a cosmetic composition or a food composition.
  • the composition of the present invention promotes the proliferation of skin stem cells and / or suppresses the increase of skin senescent cells and / or suppresses the aging of skin stem cells by IL-8 and / or the lymphatic function, for example, through the inhibitory action of IL-8. It may be a composition which suppresses skin aging by improving the decrease.
  • the subject to which the agent or composition of the present invention is applied is skin aging from an objective or subjective viewpoint such as inflammation, sagging skin, delayed turnover, decrease in stem cells, increase in senescent cells, and decrease in lymph vessels. It may be a subject who needs to suppress the skin aging or a subject who wants to suppress the skin aging prophylactically.
  • the agent or composition of the present invention can be applied by any route such as external administration or oral administration, but it is preferably blended with an external skin preparation that can be directly applied to the skin.
  • external administration for example, liquid, milky, creamy, solid, sheet, spray, gel, foam, powder and the like can be arbitrarily selected.
  • It may be a cosmetic composition such as a milky lotion, a cream, a beauty essence, a lotion, a facial mask, and a facial cleanser.
  • oral administration for example, tablets, supplements, beverages, powders and the like can be arbitrarily selected.
  • the agent or composition of the present invention may appropriately contain any compounding ingredients used in compositions such as cosmetics and pharmaceuticals, as long as the effects are not impaired.
  • Examples of the optional compounding components include excipients, carriers, diluents, oils, surfactants, powders, coloring materials, water, alcohols, thickeners, chelating agents, silicones, antioxidants, and ultraviolet absorbers.
  • examples include agents, moisturizers, fragrances, various medicinal ingredients, preservatives, pH regulators, neutralizers and the like. Further, for example, other medicinal ingredients that promote the activation of skin stem cells may be contained.
  • the frequency of administration is once every four weeks, once every two weeks, once a week, once every three days, once every two days, once a day, twice a day, three times a day. It can be arbitrarily selected, such as 4 times a day, 5 times a day, and each administration, but the present invention is not limited to these.
  • the possible forms of the agent or composition of the present invention are not limited to the above-mentioned dosage forms and forms.
  • the amount of the active ingredient of the Ibukijakou extract, the fennel extract, the rose extract, the marjoram extract, and the rose extract in the agent or composition of the present invention depends on the type, purpose, form, usage method, and the like. It can be decided as appropriate.
  • the blending amounts of Ibukijakou extract, Uikyo extract, Rose extract, Majorum extract, and Seiyo rose extract are 0.0001 to 100% by weight and 0.0001 to 90% by weight, based on the total weight of the agent or composition of the present invention.
  • the present application is used in the suppression of skin aging by promoting the proliferation of skin stem cells, suppressing the increase of skin aging cells, suppressing the aging of skin stem cells by IL-8, and improving the decrease in lymphatic function through IL-8 suppression.
  • IL-8 volume by ELISA assay Two days after seeding, an ELISA assay was performed on epidermal keratinized cells to measure the amount of IL-8. Epidermal keratinized cells from each age group cultured in a 6-well plate were washed with 1 mL PBS, the cells were solubilized with RIPA Buffer (Nacalai Tesque), and recovered using a scraper. The protein content was measured by BCA assay and the protein concentration of each sample was adjusted to 500 ug / mL. Samples adjusted for protein concentration were quantitatively analyzed using the Quantikine HS human IL-8 ELISA kit (R & D systems, HS800).
  • Mouse 3T3 cells were seeded in 175 cm2 flask with 2.5 ⁇ 10 5 cells / flask, 10% FBS-DMEM, and the medium was changed once every two days. After subconfluence, the medium was changed with 10 ⁇ g / mL mitomycin C medium (1 mg / mL mitomycin C / PBS 200 ⁇ L + 20 mL 10% FBS-DMEM) and incubated at 37 ° C for 3 hours. Then, the medium was exchanged with 20 mL of 10% FBS-DMEM, and the cells were collected by Trypsin after culturing overnight. The collected cells were frozen (3.0 ⁇ 10 6 cells / mL / tube) with Cerbunker II.
  • a crystal violet solution (0.2 g crystal violet, 20 mL methanol + 80 mL milliQ) was added at 1 ml / well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. After washing with PBS, it was air-dried to take a photograph, and the number of colonies and the colony size were calculated by image analysis on the win roof.
  • ⁇ Experiment 4 Aging of skin cells by IL-8> Culture of skin keratinocytes: A part of the epidermal keratinized cells cultured by the method of Experiment 3 was used for the SA- ⁇ -Gal assay for detecting senescent cells in this experiment.
  • Tissue immunostaining of human buccal skin block Skins collected from the cheeks of 4 healthy humans in their 20s and 30s (younger group) and 7 in their 70s and 80s (elderly group) were made into AMeX paraffin blocks and sliced into thin slices with a thickness of 3 ⁇ m. Was produced. The sliced sections were deparaffinized with xylene, flooded with EtOH, replaced with PBS, and then reacted with the primary antibody overnight at 4 ° C.
  • Anti-LYVE-1 antibody (Rabbit IgG, ReliaTech) and anti-MCSP antibody (Mouse IgG2a, Millipore) were used as the primary antibody.
  • the antibody was diluted 100-fold with 12% BSA / PBS and stained. After washing with PBS three times, the cells were reacted with fluorescence (Alexa488, Alexa594) -labeled secondary antibodies corresponding to the animal species of each primary antibody at room temperature for one and a half hours under light-shielded conditions.
  • the secondary antibody was diluted 200-fold with 12% BSA / PBS. After washing with PBS three times and encapsulating with a mounting agent containing DAPI, fluorescence observation was performed.
  • the number of epidermal stem cells was counted and the ratio (%) to the total number of cells was calculated.
  • the area of the stained area was measured and the ratio (%) to the total cell area was calculated.
  • the correlation between the number of epidermal stem cells and the lymphatic vessel area was determined by Pearson's product moment correlation coefficient.
  • a total of 168 types of candidate samples were prepared, including naturally derived components such as extracts of animals and plants and synthetic components.
  • Cell culture Normal human fetal-derived epidermal keratinocytes (ScienCell, Cat No. 2120) were cultured in epidermal keratinocyte culture medium (Krabou, KK-2150S). After passage, seeds were seeded on a 6-well plate to a concentration of 2.5 ⁇ 10 5 cells / well / 2 mL, and the drug was added 24 hours later. The drug was prepared in 10% by DMSO in advance and diluted 1000-fold and added to the medium to give a final concentration of 0.01%. Control added DMSO at 1000-fold dilution. The mRNA was recovered 24 hours after the addition of the drug. In the protein analysis by the ELISA method, the protein was recovered 48 hours after the addition of the drug.
  • B2M forward 5'-GTGGGATCGAGACATGTAAGCA-3' (SEQ ID NO: 1)
  • 82 substances out of 168 were selected as candidates for substances having an IL-8 expression inhibitory effect, which did not show a significantly higher IL-8 / B2M value than the control IL-8 / B2M value.
  • the cells (6 well plate) 48 hours after the drug addition were washed once with 2 mL PBS, and then the cells were lysed with RIPA Buffer (Nacalai Tesque, Cat No. 08714-04).
  • the insoluble protein was precipitated by a centrifuge, and the supernatant was collected to prepare a protein solution.
  • the amount of protein was corrected by the BCA method, and the IL-8 concentration was measured using the IL-8 ELISA kit (abcam, Cat No. ab46032).
  • 16 products were selected from 82 products as candidates for substances having an IL-8 translation inhibitory effect.
  • Ibukijakou extract, Fennel extract, Rose extract, Marjoram extract, and Seiyo rose extract are effective in suppressing IL-8, especially IL-8 translation. .. IL-8 increases with aging, but by suppressing IL-8, it is effective in promoting the proliferation of skin stem cells, suppressing the increase of skin aging cells, suppressing the aging of skin stem cells, and eventually suppressing the aging of the skin. It is also suggested that the increase in IL-8 with aging is associated with skin cell aging and lymphatic vessel depletion.

Abstract

IL-8抑制剤、皮膚抗老化剤、およびそれを用いて皮膚老化を抑制する方法の提供。　イブキジャコウ抽出物、ウイキョウ抽出物、バラ抽出物、マジョラム抽出物、セイヨウバラ抽出物の少なくともいずれかを有効成分として含む、IL-8抑制剤、IL-8翻訳抑制剤、皮膚抗老化剤を提供する。本願の皮膚抗老化剤は、IL-8抑制を介して皮膚の抗老化を達成される。

Description

ＩＬ－８抑制剤、皮膚抗老化剤、およびそれを用いて皮膚老化を抑制する方法
　本発明は、IL-8抑制剤、皮膚抗老化剤、およびそれを用いて皮膚老化を抑制する方法に関する。
　皮膚老化を抑制するために様々な方策が検討されている。老化にはSASP（senescence-associated secretory phenotype）と称される現象が関与することが報告されており、SASP因子としてIL-8,IL-6といったサイトカインが知られている（非特許文献1-3）。よって、IL-8を抑制する物質により皮膚老化を抑制できることが期待されている。
　例えば、特許文献１は、表皮細胞に側面方向から圧力負荷を加える工程を含み、該表皮細胞が放出するIL-8といった炎症性因子の活性を指標として、シワ形成抑制剤及び／又は抗炎症剤をスクリーニングする方法を開示する。
　皮膚細胞のIL-8を抑制する物質として、特許文献２は、プラシノコッカス目由来の微細藻類細胞から得ることができるゲル形成性多糖類を開示する。特許文献３は、IL-8といった炎症促進性遺伝子の発現を低減させるのに使用され、アトピー性皮膚炎等の炎症性障害及び／又は自己免疫障害及び／又はアレルギー障害の治療又は予防に使用するための、バクテロイデス・テタイオタオミクロン又はその生物型を含む組成物を開示する。
特開2014-171441号公報 特許第6270822号公報 特開2018-90591号公報
Juan C. Acosta, Ana Loghlen, Ana Banito, Selina Raguz & Jesus Gil (2008), "Control of senescence by CXCR2 and its ligands" , Cell Cycle, 7:19, 2956-2959, DOI: 10.4161/cc.7.19.6780 Francis Rodier and Judith Campisi, "Four faces of cellular senescence", J. Cell Biol. Vol. 192 No. 4, 547-556, doi/10.1083/jcb.201009094 原 英二, 「細胞老化の新局面」, 実験医学 Vol.37, No.11 (7月号) 2019, pp1728-1734
　本発明の課題は、IL-8抑制剤、皮膚抗老化剤、およびそれを用いて皮膚老化を抑制する方法を提供することにある。
　本発明者らは、鋭意検討の結果、IL-8を抑制、とりわけIL-8の翻訳を抑制する物質を探索し、IL-8抑制剤の適用により皮膚老化を抑制することに想到し、本発明を為すに至った。
　本願は下記の発明を包含する：
（１）　イブキジャコウ抽出物、ウイキョウ抽出物、バラ抽出物、マジョラム抽出物、セイヨウバラ抽出物の少なくともいずれかを有効成分として含む、IL-8抑制剤。
（２）　イブキジャコウ抽出物、ウイキョウ抽出物、バラ抽出物、マジョラム抽出物、セイヨウバラ抽出物の少なくともいずれかを有効成分として含む、IL-8翻訳抑制剤。
（３）　（１）又は（２）に記載の薬剤を含む、皮膚抗老化剤。
（４）　皮膚抗老化は皮膚幹細胞の増殖促進により達成される、（３）に記載の皮膚抗老化剤。
（５）　皮膚抗老化は皮膚老化細胞の増加抑制により達成される、（３）又は（４）に記載の皮膚抗老化剤。
（６）　皮膚抗老化はIL-8による皮膚幹細胞の老化抑制により達成される、（３）～（５）のいずれか１項に記載の皮膚抗老化剤。
（７）　（１）～（６）のいずれか１項に記載の薬剤の適用により皮膚老化を抑制する美容方法。
　本発明によれば、IL-8抑制剤の適用により皮膚老化の抑制に有効な剤および方法が提供される。
図１は、実験１の結果であり、各年齢の被験者から得た皮膚細胞におけるIL-8量（pg/100μg protein）を示す。 図２は、実験２の結果を示す。IL-8無添加（cont：左）、IL-8添加(IL-8：中央)、及びIL-8及びSB225002添加（IL-8+SB225002：右）の場合に形成された皮膚細胞コロニーを示す写真（上図）、並びにそのコロニー数をカウントしたグラフ（下図）である。 図３は、実験３の結果を示す。IL-8無添加（control：左）及びIL-8添加(IL-8：右）の場合の皮膚角化細胞におけるLrig1の発現量（LRIG1/B2M）を無添加の場合を100％とした割合として示す。 図４は、実験４の結果を示す。IL-8無添加（cont：左）及びIL-8添加(IL-8：右）の場合のSA-β-Gal染色表皮角化細胞の写真(上図）、並びにSA-β-Gal陽性細胞の割合(%)を示すグラフ（下図）である。 図５は、実験５の結果であり、表皮角化細胞数(%)とリンパ管の面積(%)を示すグラフである。 図６は、実験７の結果であり、イブキジャコウ抽出物のIL-8/B2M値（左上）、IL-8タンパク質量（pg/mL）（右上）、IL-8翻訳率（IL-8 translation）(%)（左下）を示す。 図７は、実験７の結果であり、ウイキョウ抽出物のIL-8/B2M値（左上）、IL-8タンパク質量（pg/mL）（右上）、IL-8翻訳率（IL-8 translation）(%)（左下）を示す。 図８は、実験７の結果であり、バラ抽出物のIL-8/B2M値（左上）、IL-8タンパク質量（pg/mL）（右上）、IL-8翻訳率（IL-8 translation）(%)（左下）を示す。 図９は、実験７の結果であり、マジョラム抽出物のIL-8/B2M値（左上）、IL-8タンパク質量（pg/mL）（右上）、IL-8翻訳率（IL-8 translation）(%)（左下）を示す。 図１０は、実験７の結果であり、セイヨウバラ抽出物のIL-8/B2M値（左上）、IL-8タンパク質量（pg/mL）（右上）、IL-8翻訳率（IL-8 translation）(%)（左下）を示す。
　特許文献１および非特許文献１～３に記載のように、IL-8を抑制する物質により皮膚老化を抑制できることが期待されている。本発明者らは、加齢に伴い実際にIL-8量が増加すること、IL-8により皮膚幹細胞遺伝子の発現が減少し皮膚老化細胞が増加すること、IL-8により皮膚細胞の増殖能が低減するがIL-8を阻害すると増殖能力は回復することを確認した。
　そこで、本発明者らは、IL-8を抑制、とりわけIL-8の翻訳を抑制することにより皮膚老化が抑制されることに想到し、IL-8抑制作用を有する新規物質を探索した。鋭意研究の結果、本発明者らは、イブキジャコウ抽出物、ウイキョウ抽出物、バラ抽出物、マジョラム抽出物、セイヨウバラ抽出物には高いIL-8抑制作用があることを発見した。
　本発明はかかる知見に基づき、IL-8抑制剤、IL-8翻訳抑制剤、および皮膚抗老化剤（以降これらを総称して「本発明の剤」という場合がある。）、並びにそれを適用することにより皮膚老化を抑制する方法を提供する。本発明の方法は、美容を目的とする方法の場合があり、医師や医療従事者による治療ではないことがある。
　IL-8抑制は、IL-8遺伝子の翻訳抑制を指す。IL-8遺伝子の翻訳抑制は、例えば、本発明の剤を付与していない状態（コントロール）に比べて、本発明の剤を付与した場合に、IL-8遺伝子の発現により産生されるIL-8タンパク濃度又は量あるいは翻訳率（コントロールに対するIL-8タンパク質濃度又は量の割合／コントロールに対するIL-8遺伝子発現量の割合×100（％））が、例えば有意水準を5%とした統計学的有意差（例えば、Studentのt検定等）をもって減少していること、あるいは、例えば5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、又は100％減少していることを意味し得る。
　１実施形態では、IL-8抑制は、IL-8遺伝子の発現抑制を含んでもよい。IL-8遺伝子の発現抑制は、例えば、本発明の剤を付与していない状態（コントロール）に比べて、本発明の剤を付与した場合に、IL-8遺伝子の発現が、例えば有意水準を5%とした統計学的有意差（例えば、Studentのt検定等）をもって減少していること、あるいは、例えば5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、又は100％減少していることを意味し得る。
　IL-8遺伝子の発現量は、例えば、実施例のように定量PCR法を用いて遺伝子発現量を測定してもよく、市販のキットを用いて測定してもよいがこれらに限定されず、任意の公知技術が使用できる。
　IL-8タンパク濃度又は量は、例えば、抗体を用いて染色することにより測定してもよく、市販のキットを用いて測定してもよいがこれらに限定されず、任意の公知技術が使用できる。
　本明細書において、皮膚抗老化とは、IL-8が抑制されることにより角化細胞や線維芽細胞といった皮膚細胞の老化が抑制されることを指す。１実施形態では、皮膚抗老化は、皮膚幹細胞の増殖促進及び／又は皮膚老化細胞の増加抑制により達成される。また、本願発明者らは表皮幹細胞といった皮膚幹細胞の老化がIL-8により促進されることも発見した（データ示さず）。したがって、１実施形態では、皮膚抗老化は、IL-8による皮膚幹細胞の老化の抑制により達成される。
　皮膚幹細胞の増殖促進は、幹細胞数の計数、Lrig1、integrin β1等の幹細胞マーカーの発現量の測定、皮膚細胞の増殖能の評価、例えば、皮膚細胞の形成コロニー数の計数等によって決定できる。皮膚老化細胞の増加抑制は、老化細胞数の計数、SA-β-gal、X-gal等の老化細胞マーカーの発現量の測定、等によって決定できる。皮膚幹細胞の老化は、上記マーカーの二重染色といった上述の幹細胞及び老化細胞の評価基準を組み合わせにより決定できる。老化細胞は、増殖能力を失い、また他の表皮細胞の分化を抑制する因子を放出していることが明らかとなってきている。皮膚の幹細胞の増殖が促進される、老化細胞の増加が抑制される、及び／又は皮膚幹細胞の老化が抑制されることにより、ターンオーバーの促進、色素沈着といった好ましくない肌状態からの早期回復、上述のような分化抑制因子の低減等により皮膚抗老化に有効であることが期待される。
　本発明者らは、加齢により皮膚の幹細胞数およびリンパ管が減少すること、並びに皮膚の幹細胞数とリンパ管面積には相関関係があることを見出した。理論は明確ではないものの、リンパ管により回収しきれなかったIL-8が皮膚細胞の老化を促進している可能性、IL-8がリンパ管細胞に悪影響を及ぼすことによりリンパ管細胞が減少しそれによりリンパ管により回収しきれなかった各種老廃物が皮膚細胞の老化を促進している、あるいはその両方の可能性が考えられる。よって、皮膚老化は、IL-8増加によるリンパ管の減少といった機能低下のため老廃物の排出効率が悪化することによるものであり、IL-8抑制によりリンパ管機能低下が改善されることにより老廃物の排出が促進されることにより皮膚老化が抑制されるものであってもよい。本発明は、皮膚リンパ管機能低下を改善するためのIL-8抑制剤、皮膚リンパ管機能低下を改善することにより皮膚抗老化を達成する皮膚抗老化剤も提供する。皮膚リンパ管機能は、例えばLYVE-1やMCSPといったマーカーによる免疫染色を用いた発現量測定、画像解析によるリンパ管面積の測定等によって測定できる。
　本発明の剤は、イブキジャコウ抽出物、ウイキョウ抽出物、バラ抽出物、マジョラム抽出物、及び／又はセイヨウバラ抽出物からなってもよく、又は有効成分として含有してもよい。
　本発明の剤は、上記の有効成分の何れか1種を単独で含有してもよく、2種類以上を任意の組み合わせ及び比率で含有してもよい。
　イブキジャコウ（学名：Thymus Serpyllum、別名：ワイルドタイム、ヨウシュイブキジャコウソウ、百里花、英名：Creeping Thyme、Wild Thyme）は、シソ科の多年草である。イブキジャコウ抽出物は、プロフィラグリン、フィラグリン産生促進作用、バリア機能改善作用等が報告されている。イブキジャコウ抽出物は、イブキジャコウの地上部の抽出物が好ましいが、イブキジャコウの根、花、果実、果皮、種子等にも有効成分が含まれているので、これらのうちいずれか1又は2以上の抽出物を使用することもできる。
　ウイキョウ（学名：Foeniculum vulgare、別名：フェンネル、英名：Fennel）は、セリ科の多年草である。健胃、去痰、駆風薬、鎮痛薬としての作用等が報告されている。ウイキョウ抽出物は、ウイキョウの果実の抽出物が好ましいが、イブキジャコウの根、葉、茎、花、種子等にも有効成分が含まれているので、これらのうちいずれか1又は2以上の抽出物を使用することもできる。
　本明細書において、バラ抽出物は、カニナバラの抽出物を指す。カニナバラ（学名：Rosa canina、別名：狗薔薇、イヌバラ、ローズヒップ、英名：Dog Rose、Brier Bush、Rose Hip）は、バラ科の落葉低木である。カニナバラは、ビタミンCを豊富に含有し、シミ改善、コラーゲン生成作用等が報告されている。バラ抽出物は、カニナバラの果実の抽出物が好ましいが、カニナバラの根、葉、茎、花、果皮、種子等にも有効成分が含まれているので、これらのうちいずれか1又は2以上の抽出物を使用することもできる。
　マジョラム（学名：Origanum majorana、Majorana hortensis、別名：マヨナラ、ハナハッカ、マージョラム、英名：Sweet Marjoram）は、シソ科の多年草である。マジョラムは、フラバノンやフラボン、タンニン等を含有し、表皮ヒアルロン酸産生促進作用、Ｉ型コラーゲン産生促進作用、ホスホリパーゼA2産生抑制作用等が報告されている。マジョラム抽出物は、マジョラムの葉の抽出物が好ましいが、マジョラムの根、茎、花、果実、果皮、種子等にも有効成分が含まれているので、これらのうちいずれか1又は2以上の抽出物を使用することもできる。
　セイヨウバラ（学名：Rosa centifolia、別名：バラ、センティフォリアバラ、英名：Cabbage Rose、Provance Rose）は、バラ科の品種である。セイヨウバラは、抗菌、消臭、抗ウイルス作用等が報告されている。セイヨウバラ抽出物は、セイヨウバラの花の抽出物が好ましいが、セイヨウバラの根、茎、葉、果実、果皮、種子等にも有効成分が含まれているので、これらのうちいずれか1又は2以上の抽出物を使用することもできる。
　上述の各種抽出物は、化粧品原料や健康食品材料として市販のものを使用してもよく、常法により得てもよい。抽出方法は特に限定されるものではないが、溶媒を用いた抽出法が挙げられる。抽出を行う際には、原料を抽出溶媒とともに常温又は加熱して浸漬または加熱還流した後、濾過し、濃縮して得ることができる。原料をそのまま使用することもできるが、顆粒状や粉末状に粉砕して抽出に供した方が、穏和な条件で短時間に高い抽出効率で有効成分の抽出を行うことができる。抽出温度は特に限定されるものではなく、粉砕物の粒径や溶媒の種類等に応じて適宜設定すればよい。通常は、室温から溶媒の沸点までの範囲内で設定される。また、抽出時間も特に限定されるものではなく、粉砕物の粒径、溶媒の種類、抽出温度等に応じて適宜設定すればよい。さらに、抽出時には、撹拌を行ってもよいし、撹拌せず静置してもよいし、超音波を加えてもよい。
　抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水性溶媒、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、あるいは有機溶媒、例えばエタノール、プロピレングリコール、1，3-ブチレングリコール、グリセリン等の低級アルコール類といった各種アルコール類又はそれらの含水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン等を、単独あるいは組み合わせて、例えば、水と1，3-ブチレングリコールとの混合溶媒として用いることができる。
　このような抽出操作により、有効成分が抽出され、溶媒に溶け込む。抽出物を含む溶媒は、そのまま使用してもよいが、滅菌、洗浄、濾過、脱色、脱臭等の慣用の精製処理を加えてから使用してもよい。また、必要により凍結乾燥などにより濃縮あるいは任意の溶媒で希釈してから使用してもよい。さらに、溶媒を全て揮発させて固体状（乾燥物）としてから使用してもよいし、該乾燥物を任意の溶媒に再溶解してから使用してもよい。
　また、原料を圧搾することにより得られる圧搾液にも抽出物と同様の有効成分が含まれているので、抽出物の代わりに圧搾液を使用することもできる。
　また、本願は、本発明の剤を含む組成物も提供する。本発明の組成物は、化粧品組成物又は食品組成物であってもよい。本発明の組成物は、例えば、IL-8を抑制作用を介して皮膚幹細胞の増殖促進及び／又は皮膚老化細胞の増加抑制及び／又はIL-8による皮膚幹細胞の老化抑制及び／又はリンパ管機能低下を改善することにより皮膚老化を抑制する組成物であってもよい。
　本発明の剤又は組成物を適用する対象は、例えば、炎症、肌のたるみ、ターンオーバーの滞り、幹細胞の減少、老化細胞の増加、リンパ管の減少といった客観的又は主観的な観点から皮膚老化の抑制が必要である対象であっても、予防的に皮膚老化の抑制を希望する対象であってもよい。
　本発明の剤又は組成物は、外用投与または経口投与など任意の経路により適用できるが、皮膚に直接適用することができる皮膚外用剤に配合することが好ましい。外用投与の形態としては、例えば、液状、乳液状、クリーム状、固形状、シート状、スプレー状、ゲル状、泡状、パウダー状等任意に選択することができる。乳液、クリーム、美容液、ローション、パック、洗顔料等の化粧品組成物であってもよい。経口投与の形態としては、例えば、錠剤、サプリメント、飲料、粉末など任意に選択することができる。本発明の剤又は組成物は、その効果を損なわない範囲で、化粧品や医薬品等の組成物に用いられる任意配合成分を、必要に応じて適宜配合することができる。前記任意配合成分としては、例えば、賦形剤、担体、希釈剤、油分、界面活性剤、粉末、色材、水、アルコール類、増粘剤、キレート剤、シリコーン類、酸化防止剤、紫外線吸収剤、保湿剤、香料、各種薬効成分、防腐剤、pH調整剤、中和剤などが挙げられる。さらに、例えば、皮膚幹細胞の活性化を促進する他の薬効成分などが含まれていてもよい。
　また、投与頻度は、４週間に１回、２週間に１回、１週間に１回、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、都度投与等任意に選択できるがこれらに限定されない。
　しかしながら、本発明の剤や組成物の採り得る形態は、上述の剤型や形態に限定されるものではない。
　本発明の剤又は組成物におけるイブキジャコウ抽出物、ウイキョウ抽出物、バラ抽出物、マジョラム抽出物、セイヨウバラ抽出物の有効成分の配合量は、種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。例えば、イブキジャコウ抽出物、ウイキョウ抽出物、バラ抽出物、マジョラム抽出物、セイヨウバラ抽出物の配合量は、本発明剤又は組成物の総重量当たり0.0001～100重量％、0.0001～90重量％、0.001～50重量％、0.001～5.0重量％、0.001～1.0重量％、0.01～1.0重量％、0.001～0.1重量％、0.01～0.1重量％、等とすることができるが、本発明の効果が発揮されれば限定されない。
　また、本願は、IL-8抑制を介して、皮膚幹細胞の増殖促進、皮膚老化細胞の増加抑制、IL-8による皮膚幹細胞の老化抑制、リンパ管機能低下の改善等による皮膚老化抑制における使用のためのイブキジャコウ抽出物、ウイキョウ抽出物、バラ抽出物、マジョラム抽出物、セイヨウバラ抽出物も提供する。
　次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
　＜実験１:加齢による皮膚細胞IL-8量の変化＞
　各年齢由来の表皮角化細胞の調製：
　KAC社から購入した0歳、21歳、62歳の皮膚由来表皮角化細胞は、primeria 75cm2 flaskへ50万cells/flask/20mLで播種し、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地(HuMedia-KB2, KURABOU)を用いて培養した。サブコンフレントになるまで2日に1回培地交換を行い、トリプシンを用いて継代後、6well plateへ25万cells/wellで播種した。
　ELISAアッセイによるIL-8量の測定：
播種から2日後に表皮角化細胞におけるELISAアッセイを行いIL-8量を測定した。6well plateで培養した各年齢由来の表皮角化細胞を、1mL PBSで洗浄し、RIPA Buffer（ナカライ社）で細胞を可溶化し、スクレイパーを用いて回収した。BCAアッセイにてタンパク質量を測定し、各サンプルのタンパク質濃度を500ug/mLに調整した。タンパク質濃度調整したサンプルは、Quantikine HS human IL-8 ELISA kit (R&D systems, HS800)を用いて定量解析した。
　結果：
　結果を図１に示す。年齢が高いほどにより皮膚細胞におけるIL-8量は高くなっていた。この結果により加齢により皮膚細胞におけるIL-8量は増加することが示唆される。
　＜実験２：IL-8による皮膚細胞増殖への影響＞
　表皮角化細胞の調製：
　ScienCell社から購入したHuman Epidermal Keratinocytes-fetalは、iMatrix-511でコートしたフラスコで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地(HuMedia-KB2, KURABOU)を用いて培養した。一度継代した細胞にIL-8（15ng/ml）を添加し、IL-8暴露下で三継代行った。IL-8無添加の場合、並びにIL-8（15ng/ml）と共にIL-8阻害剤（SB225002：40nM）を添加した場合をコントロールとした。継代後、下記のコロニー形性能評価に用いた。
　Feeder layerの作成：
　Mouse 3T3細胞を175cm2 flaskに2.5×105cells/flask, 10%FBS-DMEMで播種し、2日に1回培地交換した。サブコンフルエント後に、10μg/mL mitomycin C medium (1mg/mL mitomycin C/PBS 200μL + 20mL 10%FBS-DMEM)で培地交換し、37度で3時間インキュベートした。その後20mLの10%FBS-DMEMで培地交換し一晩培養後にTrypsinで回収した。回収した細胞はセルバンカーIIで細胞凍結（3.0×106cells/mL/tube）した。
　コロニー形性能の評価：
　Mitomycin C処理3T3細胞(3.0×106cells/mL/tube)を、6well plateに、5×105cells/wellで播種し、10%FBS-DMEMで一晩培養した。その後、上記の方法で継代した表皮角化細胞を1.0×103cells/wellで播種し、Humedia-KG2で培養した、2日おきに培地交換した。培養14日後に、マイルドホルム(10%ホルマリン)、室温、10分固定した。洗浄後、クリスタルバイオレット溶液（0.2g クリスタルバイオレット, 20mL メタノール＋80mL milliQ）を1ml/wellで加え、室温で30分静置させた。PBSで洗浄後、風乾させて写真を撮影し、win roofでコロニー数およびコロニーサイズを画像解析にて算出した。
　結果：
　結果を図２に示す。IL-8を添加した場合は無添加の場合に比べてコロニー数が有意に減少したが、IL-8阻害剤を加えるとコロニー数の減少は抑制されていた。この結果によりIL-8により皮膚細胞の増殖能が減少するが、IL-8を阻害すると回復することが示唆される。
　＜実験３：IL-8による表皮幹細胞遺伝子発現への影響＞
　表皮角化細胞の調製：
　実験2と同様、ScienCell社から購入したHuman Epidermal Keratinocytes-fetalは、iMatrix-511でコートしたフラスコで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地(HuMedia-KB2, KURABOU)を用いて培養した。一度継代した細胞にIL-8（15ng/ml）を添加し、IL-8暴露下で三継代行った。IL-8無添加の場合をコントロールとした。継体後、RNase Easy mini kitを用いてmRNAを抽出し、Super script VILO cDNA synthesis kitを用いてcDNAを調製しqPCR用サンプルとした。
　qPCR：
　上記の方法で調製したqPCR用サンプルを用い、StepOne（Applied Bioscience）にて、Platinum SYBER Green qPCR SuperMix-UDG（Invitrogen）と下記のプライマーを用いて定量解析を実施することにより幹細胞遺伝子であるLrig1の発現解析を行った。
　B2M forward： 5’-GTGGGATCGAGACATGTAAGCA-3’　（配列番号１）
　B2M reverse： 5’-CAATCCAAATGCGGCATCT-3’ 　（配列番号２）
　LRIG1 forward： 5’-CTTGACCTGGGTTCTGGGTA-3’, 　（配列番号３）
　LRIG1 reverse： 5’-GGCCAAAGGAACATTTGAAG-3’, 　（配列番号４）
　結果：
　結果を図３に示す。IL-8を添加すると表皮角化細胞におけるLrig1の発現量が有意に低減していた。この結果によりIL-8は皮膚幹細胞の増殖能を低減させる作用があることが示唆される。
　＜実験４：IL-8による皮膚細胞の老化＞
　皮膚角化細胞の培養：
　実験３の方法で培養した表皮角化細胞の一部を、本実験における老化細胞を検出するためのSA-β-Gal assayに用いた。
　SA-β-Gal assay：
　Senescence Detection Kit (ab65351,abcam)を用いて実施した。上記細胞をPBS 1mlで洗浄したのち、Fixative Solutionを加え15分RTでインキュベートした。Fixative solutionを除き、Staining solution mixを500μl加えて37℃で一晩インキュベートした。核はヘキストで染色し、全細胞数およびSA-β-Gal陽性細胞数をカウントし、全細胞数当たりのSA-β-Gal陽性細胞の割合（＝（SA-β-Gal陽性細胞数/全細胞数）×100）を算出した。
　結果：
　結果を図４に示す。IL-8を添加するとSA-β-Gal陽性細胞の数および割合が増加していた。この結果によりIL-8は皮膚細胞の老化を促進する作用があることが示唆される。
　＜実験５：加齢による表皮角化幹細胞と皮膚リンパ管への影響＞
　ヒト頬皮膚ブロックの組織免疫染色：
　健康な4名の20-30代（若齢群）および7名の70-80代（高齢群）のヒト頬から採取した皮膚はAMeXパラフィンブロックにしたものを用い、厚さ3μmの薄切切片を作製した。薄切切片は、キシレンによる脱パラフィン化し、EtOH による浸水処理、PBS 置換後、4℃にて一晩、一次抗体の反応を行った。一次抗体には、抗LYVE-1抗体（Rabbit IgG, ReliaTech）および抗MCSP抗体（Mouse IgG2a, Millipore）を使用した。また、抗体は12%BSA/PBSで100倍希釈し、染色を行った。PBSで3回洗浄後、各一次抗体の動物種に対応した蛍光（Alexa488、Alexa594）標識した二次抗体にて室温、一時間半、遮光条件にて反応させた。二次抗体は12%BSA/PBSで200倍希釈した。PBSで3回洗浄後、DAPI入り封入剤にて封入後に、蛍光観察を行った。表皮幹細胞は数を計数し全細胞数における割合(%)を算出した。リンパ管は染色された部位の面積を測定し全細胞面積における割合(%)を算出した。表皮幹細胞数とリンパ管面積の相関性をピアソンの積率相関係数により求めた。
　結果：
　高齢群の表皮幹細胞数及びリンパ管面積のいずれもが若年群のものよりも低かった（データ示さず）。更に表皮幹細胞数とリンパ管面積は相関関係にあることが分かった（図５）。この結果により加齢により表皮幹細胞が減少しリンパ管機能が衰えることが示唆される。また、加齢によりIL-8が増加することと、皮膚細胞の老化とリンパ管の減少が何らかの関係があることも示唆される。理論は明確ではないものの、リンパ管により回収しきれなかったIL-8が皮膚細胞の老化を促進している可能性、あるいはIL-8がリンパ管細胞に悪影響を及ぼすことによりリンパ管機能が悪化することによりリンパ管により回収しきれなかった老廃物が皮膚細胞の老化を促進している可能性が考えられる。
　実験１-５の結果により、加齢によりIL-8が増加し、IL-8の増加により皮膚細胞の老化が加速されることが導かれる。したがって、IL-8を抑制することにより皮膚細胞の抗老化が達成できることが期待される。よって、以下の実験によりIL-8を抑制する物質を探索した。
　＜実験６:IL-8抑制物質の探索＞
　試料の調製：
　IL-8抑制作用の評価対象試料として以下を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　その他動植物の抽出物といった天然由来成分や合成成分を含め、合計168種類の候補試料を調製した。
　細胞培養：
　正常ヒト胎児由来表皮角化細胞（ScienCell社、Cat No.2120）を表皮角化細胞培養培地（クラボウ社、KK-2150S）にて培養した。継代後に2.5×105 cells/well/2mLになるように6well plateへ播種し、24時間後に薬剤を添加した。薬剤はあらかじめDMSOにて10%にしたものを1000倍希釈で培地に加え最終濃度0.01%とした。コントロールはDMSOを1000倍希釈で添加した。薬剤を添加24時間後にmRNAを回収した。またELISA法によるタンパク質解析では薬剤添加48時間後にタンパク質を回収した。
　１．遺伝子発現解析に基づくIL-8発現抑制作用を有する物質の一次スクリーニング：
　薬剤添加24時間後の細胞からRNAの回収は、Quiagen Rneasy mini Kit（Quiagen社）を用い、cDNAの合成はSuperScript VILO cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific社）にて行った。IL-8およびB2Mの遺伝子発現量は、Platinum SYBR Green qPCR superMix-UDG (Invitrogen Japan, Tokyo, Japan)を用いてSyber Green法にて行った。使用したプライマーは以下の通りである。
　B2M forward： 5’-GTGGGATCGAGACATGTAAGCA-3’　（配列番号１）
　B2M reverse： 5’-CAATCCAAATGCGGCATCT-3’　（配列番号２）
　IL-8 forward： 5’-GGGTACCCAGTTAAATTTTCATTTC-3’　（配列番号５）
　IL-8 reverse： 5’-CAAGTTTCAACCAGCAAATTACT-3’　（配列番号６）
　一次スクリーニングはN=1、薬剤濃度0.01％で行った。一次スクリーニングでは、コントロールのIL-8/B2M値よりも有意に高いIL-8/B2M値を示さない物質をIL-8発現抑制作用を有する物質の候補として168品から82品選定した。
　２．タンパク質量解析に基づくIL-8翻訳抑制作用を有する物質の二次スクリーニング：
　一次スクリーニングで選定された82品につき、薬剤濃度0.01％でN=3でIL-8タンパク質量に基づき、二次スクリーニングを行った。
　薬剤添加48時間の細胞（6well plate）を2mL PBSで1回洗浄後、RIPA Buffer（ナカライ社、Cat No.08714-04）にて細胞を溶解した。遠心機で不溶解タンパク質を沈殿させ、上清を回収し、タンパク質溶液とした。BCA法にてタンパク質量を補正し、IL-8 ELISA kit（abcam社、Cat No.ab46032）を用いて、IL-8濃度を測定した。
　二次スクリーニングの結果のタンパク質発現抑制効果に基づきIL-8翻訳抑制作用を有する物質の候補として82品から16品選定した。
　３．薬剤濃度の違いによるタンパク質量の解析に基づく三次スクリーニング：
　二次スクリーニングで選定された16品につき、薬剤濃度0.001％、0.01％、0.1％、各N=3で行った以外は一次、二次スクリーニングと同様の方法により遺伝子発現量IL-8/B2MおよびIL-8タンパク質濃度（pg/mL）を測定した。遺伝子発現量IL-8/B2Mにつき、コントロールを100％としてコントロールに対する各薬剤添加群の発現量（% of control）を算出した。同様にタンパク質濃度についてもコントロールに対する割合（% of control）を算出した。翻訳率を以下の式に従って算出しIL-8翻訳率に基づく三次スクリーニングを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　三次スクリーニングの結果より濃度依存的にIL-8翻訳抑制作用を有する物質としてイブキジャコウ抽出物、ウイキョウ抽出物、バラ抽出物、マジョラム抽出物、セイヨウバラ抽出物の5品を選定した。
　＜実験７: 選択薬剤による皮膚細胞におけるIL-8翻訳への影響＞
　実験６で選定された5品について表皮角化細胞に対するIL-8抑制効果の再現性を確認した。
　6well plateで培養した各年代由来の表皮角化細胞を、1mL PBSで洗浄し、RIPA Buffer（ナカライ社）で細胞を可溶化し、スクレイパーを用いて回収した。BCAアッセイにてタンパク質量を測定し、各サンプルのタンパク質濃度を500μg/mLに調整した。タンパク質濃度調整したサンプルは、Quantikine HS human IL-8 ELISA kit (R&D systems, HS800)を用いて定量解析し、IL-8量（pg/mL）及びIL-8翻訳率（IL-8 translation）(%)を実験６と同じ方法で算出した。
　結果：
　結果を図６－１０に示す。イブキジャコウ抽出物、ウイキョウ抽出物、バラ抽出物、マジョラム抽出物、セイヨウバラ抽出物のIL-8タンパク質濃度および翻訳率が低下しており、IL-8翻訳抑制効果が再現性をもって示された。
　以上の結果により、イブキジャコウ抽出物、ウイキョウ抽出物、バラ抽出物、マジョラム抽出物、セイヨウバラ抽出物には、IL-8の抑制、とりわけIL-8の翻訳抑制に有効であることがわかった。加齢によりIL-8は増加するが、IL-8を抑制することにより、皮膚幹細胞の増殖促進、皮膚老化細胞の増加抑制、皮膚幹細胞の老化抑制、ひいては皮膚の老化抑制に有効である。又、加齢におけるIL-8の増加と皮膚細胞老化とリンパ管減少との関連も示唆される。

Claims (6)

  1. 　イブキジャコウ抽出物、ウイキョウ抽出物、バラ抽出物、マジョラム抽出物、セイヨウバラ抽出物の少なくともいずれかを有効成分として含む、IL-8抑制剤。
  2. 　イブキジャコウ抽出物、ウイキョウ抽出物、バラ抽出物、マジョラム抽出物、セイヨウバラ抽出物の少なくともいずれかを有効成分として含む、IL-8翻訳抑制剤。
  3. 　請求項１又は２に記載の薬剤を含む、皮膚抗老化剤。
  4. 　皮膚抗老化は皮膚幹細胞の増殖促進により達成される、請求項３に記載の皮膚抗老化剤。
  5. 　皮膚抗老化は皮膚老化細胞の増加抑制により達成される、請求項３又は４に記載の皮膚抗老化剤。
  6. 　皮膚抗老化はIL-8による皮膚幹細胞の老化抑制により達成される、請求項３～５のいずれか１項に記載の皮膚抗老化剤。
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