CN116322731A - Il-8抑制剂、皮肤抗老化剂、和使用它们来抑制皮肤老化的方法 - Google Patents
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Abstract
提供IL‑8抑制剂、皮肤抗老化剂、和使用它们来抑制皮肤老化的方法。提供包含铺地百里香提取物、茴香提取物、蔷薇提取物、甘牛至提取物、百叶蔷薇提取物中的至少任一者作为有效成分的IL‑8抑制剂、IL‑8翻译抑制剂、皮肤抗老化剂。本申请的皮肤抗老化剂经由IL‑8抑制而实现皮肤的抗老化。
Description
技术领域
本发明涉及IL-8抑制剂、皮肤抗老化剂、和使用它们来抑制皮肤老化的方法。
背景技术
为了抑制皮肤老化,研究了各种对策。报导了被称为SASP(衰老相关分泌表型,senescence-associated secretory phenotype)的现象参与老化,作为SASP因子的IL-8、IL-6这样的细胞因子是已知的(非专利文献1-3)。因此,期待可以通过抑制IL-8的物质来抑制皮肤老化。
例如,专利文献1公开了包括向表皮细胞从侧面方向施加压力负荷的工序,以该表皮细胞释放的IL-8这样的炎症因子的活性作为指标,筛选皱纹形成抑制剂和/或抗炎剂的方法。
作为抑制皮肤细胞的IL-8的物质,专利文献2公开了可以由来源于塔胞藻目(Prasinococcales)的微藻类细胞获得的凝胶形成性多糖类。专利文献3公开了被使用于使IL-8这样的炎症促进性基因的表达减少,并用于在特应性皮炎等炎症障碍和/或自身免疫障碍和/或变态反应障碍的治疗或预防中使用的、包含多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)或其生物型的组合物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2014-171441号公报
专利文献2:日本专利第6270822号公报
专利文献3:日本特开2018-90591号公报
非专利文献
非专利文献1:Juan C.Acosta,Ana Loghlen,Ana Banito,Selina Raguz&JesusGil(2008),"Control of senescence by CXCR2 and its ligands",Cell Cycle,7:19,2956-2959,DOI:10.4161/cc.7.19.6780
非专利文献2:Francis Rodier and Judith Campisi,"Four faces of cellularsenescence",J.Cell Biol.Vol.192No.4,547-556,doi/10.1083/jcb.201009094
非专利文献3:原英二,“細胞老化の新局面”,実験医学Vol.37,No.11(7月号)2019,pp1728-1734
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题是提供IL-8抑制剂、皮肤抗老化剂、和使用它们来抑制皮肤老化的方法。
用于解决课题的方法
本发明者们进行了深入研究,结果想到,探索抑制IL-8、特别是抑制IL-8的翻译的物质,通过IL-8抑制剂的应用来抑制皮肤老化,从而完成了本发明。
本申请包含下述发明:
(1)一种IL-8抑制剂,包含铺地百里香提取物、茴香提取物、蔷薇提取物、甘牛至提取物、百叶蔷薇提取物中的至少任一者作为有效成分。
(2)一种IL-8翻译抑制剂,包含铺地百里香提取物、茴香提取物、蔷薇提取物、甘牛至提取物、百叶蔷薇提取物中的至少任一者作为有效成分。
(3)一种皮肤抗老化剂,包含(1)或(2)所述的药剂。
(4)根据(3)所述的皮肤抗老化剂,皮肤抗老化通过皮肤干细胞的增殖促进来实现。
(5)根据(3)或(4)所述的皮肤抗老化剂,皮肤抗老化通过皮肤老化细胞的增加抑制来实现。
(6)根据(3)~(5)中任一项所述的皮肤抗老化剂,皮肤抗老化通过抑制由IL-8引起的皮肤干细胞的老化来实现。
(7)一种美容方法,其中,通过应用(1)~(6)中任一项所述的药剂来抑制皮肤老化。
发明的效果
根据本发明,通过应用IL-8抑制剂而提供对皮肤老化的抑制有效的制剂和方法。
附图说明
图1是实验1的结果,显示由各年龄的受检者获得的皮肤细胞中的IL-8量(pg/100μg蛋白质)。
图2显示实验2的结果。是在不添加IL-8(对照:左)、添加IL-8(IL-8:中央)、和添加IL-8和SB225002(IL-8+SB225002:右)的情况下形成的皮肤细胞集落的照片(上图)、以及对该集落数进行计数而得的图(下图)。
图3显示实验3的结果。将不添加IL-8(对照:左)和添加IL-8(IL-8:右)的情况下的皮肤角质形成细胞中的Lrig1的表达量(LRIG1/B2M)作为将不添加的情况设为100%的比例而表示。
图4显示实验4的结果。是显示不添加IL-8(对照:左)和添加IL-8(IL-8:右)的情况下的SA-β-Gal染色表皮角质形成细胞的照片(上图)、以及SA-β-Gal阳性细胞的比例(%)的图(下图)。
图5是实验5的结果,是显示表皮角质形成细胞数(%)和淋巴管的面积(%)的图。
图6是实验7的结果,显示铺地百里香提取物的IL-8/B2M值(左上)、IL-8蛋白质的量(pg/mL)(右上)、IL-8翻译率(IL-8翻译)(%)(左下)。
图7是实验7的结果,显示茴香提取物的IL-8/B2M值(左上)、IL-8蛋白质的量(pg/mL)(右上)、IL-8翻译率(IL-8翻译)(%)(左下)。
图8是实验7的结果,显示蔷薇提取物的IL-8/B2M值(左上)、IL-8蛋白质的量(pg/mL)(右上)、IL-8翻译率(IL-8翻译)(%)(左下)。
图9是实验7的结果,显示甘牛至提取物的IL-8/B2M值(左上)、IL-8蛋白质的量(pg/mL)(右上)、IL-8翻译率(IL-8翻译)(%)(左下)。
图10是实验7的结果,显示百叶蔷薇提取物的IL-8/B2M值(左上)、IL-8蛋白质的量(pg/mL)(右上)、IL-8翻译率(IL-8翻译)(%)(左下)。
具体实施方式
如专利文献1和非专利文献1~3所记载地那样,期待可以通过抑制IL-8的物质来抑制皮肤老化。本发明者们确认了随着年龄增长而实际上IL-8量增加、通过IL-8从而皮肤干细胞基因的表达减少而皮肤老化细胞增加、通过IL-8从而皮肤细胞的增殖能力减少但如果抑制IL-8则增殖能力恢复。
因此,本发明者们想到通过抑制IL-8、特别是抑制IL-8的翻译来抑制皮肤老化,探索了具有IL-8抑制作用的新的物质。深入研究的结果,本发明者们发现铺地百里香提取物、茴香提取物、蔷薇提取物、甘牛至提取物、百叶蔷薇提取物具有高的IL-8抑制作用。
本发明基于这样的认识,提供IL-8抑制剂、IL-8翻译抑制剂、和皮肤抗老化剂(以下有时将它们总称为“本发明的制剂”)、以及通过应用它们来抑制皮肤老化的方法。本发明的方法有以美容作为目的的方法的情况,有时不是由医生、医疗从业者进行的治疗。
IL-8抑制是指IL-8基因的翻译的抑制。IL-8基因的翻译的抑制可以是指,例如,与未施与本发明的制剂的状态(对照)相比,在施与了本发明的制剂的情况下,通过IL-8基因的表达而产生的IL-8蛋白浓度或量、或者翻译率(IL-8蛋白质浓度或量相对于对照的比例/IL-8基因表达量相对于对照的比例×100(%))例如以显著性水平为5%的统计学显著性差异(例如,学生t检验等)减少,或者例如减少5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或100%。
在1实施方式中,IL-8抑制可以包含IL-8基因的表达的抑制。IL-8基因的表达的抑制可以是指,例如,与未施与本发明的制剂的状态(对照)相比,在施与了本发明的制剂的情况下,IL-8基因的表达例如以显著性水平为5%的统计学显著性差异(例如,学生t检验等)而减少,或者例如减少5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或100%。
IL-8基因的表达量例如可以如实施例那样使用定量PCR法而测定基因表达量,也可以使用市售的试剂盒而测定,但不限定于它们,可以使用任意的公知技术。
IL-8蛋白浓度或量例如可以通过使用抗体进行染色来测定,也可以使用市售的试剂盒而测定,但不限定于它们,可以使用任意的公知技术。
在本说明书中,所谓皮肤抗老化,是指通过抑制IL-8来抑制角质形成细胞、成纤维细胞这样的皮肤细胞的老化。在1实施方式中,皮肤抗老化通过皮肤干细胞的增殖促进和/或皮肤老化细胞的增加抑制来实现。此外,本申请发明者们也发现了表皮干细胞这样的皮肤干细胞的老化通过IL-8而被促进(数据未显示)。因此,在1实施方式中,皮肤抗老化通过抑制由IL-8引起的皮肤干细胞的老化来实现。
皮肤干细胞的增殖促进可以通过干细胞数的计数、Lrig1、整联蛋白β1等干细胞标志物的表达量的测定、皮肤细胞的增殖能力的评价例如皮肤细胞的形成集落数的计数等来确定。皮肤老化细胞的增加抑制可以通过老化细胞数的计数、SA-β-gal、X-gal等老化细胞标志物的表达量的测定等来确定。皮肤干细胞的老化可以通过上述标志物的双染色这样将上述干细胞和老化细胞的评价基准组合来确定。近来渐渐明确了,老化细胞失去增殖能力,此外释放抑制其它表皮细胞的分化的因子。通过促进皮肤的干细胞的增殖、抑制老化细胞的增加、和/或抑制皮肤干细胞的老化,从而期待通过更新的促进、从色素沉着这样的不期望的肌肤状态的快速恢复、上述那样的分化抑制因子的减少等从而对皮肤抗老化有效。
本发明者们发现了通过年龄增长而皮肤的干细胞数和淋巴管减少、以及皮肤的干细胞数与淋巴管面积具有相关关系。虽然理论不明确,但是可以考虑通过淋巴管而回收不完的IL-8促进皮肤细胞的老化的可能性,通过IL-8对淋巴管细胞带来不良影响从而淋巴管细胞减少由此通过淋巴管而回收不完的各种废物促进皮肤细胞的老化的可能性,或者这两者的可能性。因此,皮肤老化是因为由于由IL-8增加引起的淋巴管的减少这样的功能降低因此废物的排出效率恶化,可以通过IL-8抑制而改善淋巴管功能降低从而促进废物的排出,从而抑制皮肤老化。本发明也提供用于改善皮肤淋巴管功能降低的IL-8抑制剂、通过改善皮肤淋巴管功能降低而实现皮肤抗老化的皮肤抗老化剂。皮肤淋巴管功能例如可以通过使用了采用LYVE-1、MCSP这样的标志物的免疫染色的表达量测定、采用图像分析的淋巴管面积的测定等来测定。
本发明的制剂可以由铺地百里香提取物、茴香提取物、蔷薇提取物、甘牛至提取物、和/或百叶蔷薇提取物组成,或也可以作为有效成分而含有它们。
本发明的制剂可以单独含有上述有效成分中的任1种,也可以以任意的组合和比率含有2种以上。
铺地百里香(学名:Thymus Serpyllum,别名:野百里香、匍匐枝百里香、百里香,英名:Creeping Thyme、Wild Thyme)为唇形科的多年生草本植物。铺地百里香提取物被报导了原聚丝蛋白、聚丝蛋白产生促进作用、屏障功能改善作用等。铺地百里香提取物优选为铺地百里香的地上部的提取物,但由于在铺地百里香的根、花、果实、果皮、种子等中也包含有效成分,因此也可以使用它们之中的任1或2以上的提取物。
茴香(学名:Foeniculum vulgare,别名:甜茴香,英名:Fennel)为伞形科的多年生草本植物。被报导了作为健胃、去痰、作为驱风药、镇痛药的作用等。茴香提取物优选为茴香的果实的提取物,但由于在铺地百里香的根、叶、茎、花、种子等中也包含有效成分,因此也可以使用它们之中的任1或2以上的提取物。
在本说明书中,蔷薇提取物是指犬蔷薇的提取物。犬蔷薇(学名:Rosa canina,别名:狗蔷薇、狗牙蔷薇、野玫瑰,英名:Dog Rose、Brier Bush、Rose Hip)为蔷薇科的落叶灌木。犬蔷薇丰富地含有维生素C,被报导了斑改善、胶原生成作用等。蔷薇提取物优选为犬蔷薇的果实的提取物,但由于在犬蔷薇的根、叶、茎、花、果皮、种子等中也包含有效成分,因此也可以使用它们之中的任1或2以上的提取物。
甘牛至(学名:Origanum majorana,Majorana hortensis,别名:马郁兰、花薄荷、墨角兰,英名:Sweet Marjoram)为唇形科的多年生草本植物。甘牛至含有黄烷酮、黄酮、单宁等,被报导了表皮透明质酸产生促进作用、I型胶原产生促进作用、磷脂酶A2产生抑制作用等。甘牛至提取物优选为甘牛至的叶的提取物,但由于在甘牛至的根、茎、花、果实、果皮、种子等中也包含有效成分,因此也可以使用它们之中的任1或2以上的提取物。
百叶蔷薇(学名:Rosa centifolia,别名:千叶玫瑰、洋蔷薇,英名:Cabbage Rose、Provance Rose)为蔷薇科的品种。百叶蔷薇被报导了抗菌、除臭、抗病毒作用等。百叶蔷薇提取物优选为百叶蔷薇的花的提取物,但由于在百叶蔷薇的根、茎、叶、果实、果皮、种子等中也包含有效成分,因此也可以使用它们之中的任1或2以上的提取物。
上述各种提取物可以使用作为化妆品原料、健康食品材料而市售的,也可以通过常规方法获得。提取方法没有特别限定,可举出使用了溶剂的提取法。在进行提取时,可以将原料与提取溶剂一起在常温下或加热进行了浸渍或加热回流后,过滤、浓缩而获得。也可以将原料直接使用,但粉碎为颗粒状、粉末状而供于提取可以在温和的条件下在短时间以高提取效率进行有效成分的提取。提取温度没有特别限定,只要根据粉碎物的粒径、溶剂的种类等来适当设定即可。通常,在从室温到溶剂的沸点的范围内设定。此外,提取时间也没有特别限定,只要根据粉碎物的粒径、溶剂的种类、提取温度等来适当设定即可。进一步,在提取时,可以进行搅拌,也可以不搅拌而静置,也可以施加超声波。
作为提取溶剂,只要是通常提取所使用的溶剂,就可以任意地使用,例如,可以将水性溶剂例如水、生理盐水、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、或有机溶剂例如乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇、甘油等低级醇类这样的各种醇类或它们的含水醇类、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯、己烷等单独或组合,例如作为水与1,3-丁二醇的混合溶剂而使用。
通过这样的提取操作来提取有效成分,溶解于溶剂。包含提取物的溶剂可以直接使用,但也可以施加灭菌、洗涤、过滤、脱色、脱臭等惯用的精制处理后使用。此外,可以根据需要通过冷冻干燥等进行浓缩或用任意的溶剂稀释后使用。进一步,可以使溶剂全部挥发而形成固体状(干燥物)后使用,也可以将该干燥物再溶解于任意的溶剂后使用。
此外,由于在通过压榨原料而获得的压榨液中也包含与提取物同样的有效成分,因此代替提取物也可以使用压榨液。
此外,本申请也提供包含本发明的制剂的组合物。本发明的组合物可以为化妆品组合物或食品组合物。本发明的组合物例如可以为经由抑制IL-8的作用而通过促进皮肤干细胞的增殖和/或抑制皮肤老化细胞的增加和/或抑制由IL-8引起的皮肤干细胞的老化和/或改善淋巴管功能降低来抑制皮肤老化的组合物。
应用本发明的制剂或组合物的对象例如可以为从炎症、肌肤的松弛、更新的迟延、干细胞的减少、老化细胞的增加、淋巴管的减少这样的客观或主观观点考虑需要抑制皮肤老化的对象,也可以为预防地希望抑制皮肤老化的对象。
本发明的制剂或组合物可以通过外用施与或经口施与等任意的途径来应用,但优选混配于可以直接应用于皮肤的皮肤外用剂。作为外用施与的形态,例如,可以任意选择液状、乳液状、霜状、固体状、片状、喷雾状、凝胶状、泡状、粉末状等。可以为乳液、霜、美容液、化妆水、面膜、洗面奶等化妆品组合物。作为经口施与的形态,例如,可以任意选择片剂、膳食补充剂、饮料、粉末等。本发明的制剂或组合物在不损害其效果的范围,可以根据需要适当混配在化妆品、药品等组合物中使用的任意混配成分。作为上述任意混配成分,可举出例如,赋形剂、载体、稀释剂、油分、表面活性剂、粉末、色料、水、醇类、增稠剂、螯合剂、有机硅类、抗氧化剂、紫外线吸收剂、保湿剂、香料、各种药效成分、防腐剂、pH调节剂、中和剂等。进一步,例如,可以包含促进皮肤干细胞的活化的其它药效成分等。
此外,施与频率可以任意地选择4周1次、2周1次、1周1次、3天1次、2天1次、1天1次、1天2次、1天3次、1天4次、1天5次、按需施与等,但不限定于这些。
然而,本发明的制剂、组合物的能够采用的形态不限定于上述剂型、形态。
本发明的制剂或组合物中的铺地百里香提取物、茴香提取物、蔷薇提取物、甘牛至提取物、百叶蔷薇提取物的有效成分的混配量可以根据种类、目的、形态、利用方法等来适当确定。例如,铺地百里香提取物、茴香提取物、蔷薇提取物、甘牛至提取物、百叶蔷薇提取物的混配量可以相对于本发明制剂或组合物的总重量为0.0001~100重量%、0.0001~90重量%、0.001~50重量%、0.001~5.0重量%、0.001~1.0重量%、0.01~1.0重量%、0.001~0.1重量%、0.01~0.1重量%等,但只要发挥本发明的效果就没有限定。
此外,本申请也提供经由IL-8抑制而在用于皮肤干细胞的增殖促进、皮肤老化细胞的增加抑制、由IL-8引起的皮肤干细胞的老化的抑制、通过由淋巴管功能降低的改善等进行的皮肤老化抑制中使用的铺地百里香提取物、茴香提取物、蔷薇提取物、甘牛至提取物、百叶蔷薇提取物。
实施例
接下来通过实施例进一步详细地说明本发明。另外,本发明不限定于此。
<实验1:由年龄增长引起的皮肤细胞IL-8量的变化>
各年龄来源的表皮角质形成细胞的调制:
从KAC社购入了的0岁、21岁、62岁的来源于皮肤的表皮角质形成细胞向primeria75cm2烧瓶以50万细胞/烧瓶/20mL接种,使用正常人表皮角质形成细胞增殖用培养基(HuMedia-KB2,KURABOU)进行了培养。直到变为亚汇合为止2天1次进行培养基交换,使用胰蛋白酶传代后,向6孔板以25万细胞/孔接种。
采用ELISA测定法的IL-8量的测定:
在从接种起2天后进行表皮角质形成细胞中的ELISA测定,测定了IL-8量。将用6孔板进行了培养的各年龄来源的表皮角质形成细胞用1mL PBS洗涤,用RIPA缓冲液(ナカライ社)使细胞溶解,使用刮刀而回收。利用BCA测定法测定蛋白质的量,将各样品的蛋白质浓度调整为500ug/mL。进行了蛋白质浓度调整的样品使用Quantikine HS human IL-8ELISAkit(R&D systems,HS800)进行了定量分析。
结果:
将结果示于图1中。随着年龄越高,皮肤细胞中的IL-8量越变高。该结果提示通过年龄增长从而皮肤细胞中的IL-8量增加。
<实验2:IL-8对皮肤细胞增殖的影响>
表皮角质形成细胞的调制:
从ScienCell社购入了的人表皮角质细胞-胎儿(Human EpidermalKeratinocytes-fetal)在用iMatrix-511涂覆了的烧瓶中,使用正常人表皮角质形成细胞增殖用培养基(HuMedia-KB2,KURABOU)进行了培养。在一次传代了的细胞中添加IL-8(15ng/ml),在IL-8暴露下进行了三次传代。将在不添加IL-8的情况、以及与IL-8(15ng/ml)一起添加了IL-8抑制剂(SB225002:40nM)的情况设为对照。在传代后,用于下述集落形性能评价。
饲养层(Feeder layer)的制作:
将Mouse 3T3细胞在175cm2烧瓶中以2.5×105细胞/烧瓶、10%FBS-DMEM接种,2天1次进行了培养基交换。在亚汇合后,以10μg/mL丝裂霉素C培养基(mitomycin C medium)(1mg/mL丝裂霉素C/PBS 200μL+20mL 10%FBS-DMEM)进行培养基交换,在37度下孵育3小时。然后用20mL的10%FBS-DMEM进行培养基交换而培养一晚后用胰蛋白酶(Trypsin)回收。回收了的细胞用セルバンカーII进行了细胞冷冻(3.0×106细胞/mL/管)。
集落形性能的评价:
将丝裂霉素C处理3T3细胞(3.0×106细胞/mL/管)在6孔板中以5×105细胞/孔接种,用10%FBS-DMEM培养一晚。然后,将通过上述方法传代了的表皮角质形成细胞以1.0×103细胞/孔接种,用Humedia-KG2进行了培养,每2天进行了培养基交换。在培养14天后,以マイルドホルム(10%福尔马林)在室温固定10分钟。在洗涤后,将结晶紫溶液(0.2g结晶紫,20mL甲醇+80mL milliQ)以1ml/孔加入,在室温下使其静置30分钟。用PBS洗涤后,使其风干而拍摄照片,用win roof将集落数和集落尺寸利用图像分析而算出。
结果:
将结果示于图2中。添加了IL-8的情况与不添加的情况相比集落数显著减少了,但如果加入IL-8抑制剂则集落数的减少被抑制了。该结果提示通过IL-8从而皮肤细胞的增殖能力减少,但如果抑制IL-8则恢复。
<实验3:IL-8对表皮干细胞基因表达的影响>
表皮角质形成细胞的调制:
与实验2同样地,从ScienCell社购入了的人表皮角质细胞-胎儿(HumanEpidermal Keratinocytes-fetal),在用iMatrix-511涂覆了的烧瓶中,使用正常人表皮角质形成细胞增殖用培养基(HuMedia-KB2,KURABOU)进行了培养。在一次传代了的细胞中添加IL-8(15ng/ml),在IL-8暴露下进行了三次传代。将不添加IL-8的情况设为对照。在传代后,使用RNase Easy mini kit提取mRNA,使用Super script VILO cDNA synthesis kit调制cDNA而设为qPCR用样品。
qPCR:
使用通过上述方法调制的qPCR用样品,利用StepOne(Applied Bioscience),使用Platinum SYBER Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen)和下述引物而实施定量分析从而进行了干细胞基因Lrig1的表达分析。
B2M正向:5’-GTGGGATCGAGACATGTAAGCA-3’(序列号1)
B2M反向:5’-CAATCCAAATGCGGCATCT-3’(序列号2)
LRIG1正向:5’-CTTGACCTGGGTTCTGGGTA-3’,(序列号3)
LRIG1反向:5’-GGCCAAAGGAACATTTGAAG-3’,(序列号4)
结果:
将结果示于图3中。如果添加IL-8则表皮角质形成细胞中的Lrig1的表达量显著减少了。该结果提示IL-8具有使皮肤干细胞的增殖能力减少的作用。
<实验4:由IL-8引起的皮肤细胞的老化>
皮肤角质形成细胞的培养:
将通过实验3的方法培养了的表皮角质形成细胞的一部分在本实验中的用于检测老化细胞的SA-β-Gal测定法中使用。
SA-β-Gal测定法:
使用衰老检测试剂盒(Senescence Detection Kit)(ab65351,abcam)实施。将上述细胞用PBS 1ml洗涤后,加入固定液(Fixative Solution)用RT孵育15分钟。除去固定液(Fixative solution),加入染色混合液(Staining solution mix)500μl在37℃下孵育一晚。核用Hoechst染色,计数总细胞数和SA-β-Gal阳性细胞数,算出相对于总细胞数的SA-β-Gal阳性细胞的比例(=(SA-β-Gal阳性细胞数/总细胞数)×100)。
结果:
将结果示于图4中。如果添加IL-8则SA-β-Gal阳性细胞的数和比例增加了。该结果提示IL-8具有促进皮肤细胞的老化的作用。
<实验5:年龄增长对表皮角化干细胞和皮肤淋巴管的影响>
人脸颊皮肤块的组织免疫染色:
从健康的4名20-30多岁(年轻组)和7名70-80多岁(老年组)的人脸颊采取的皮肤使用制成了AMeX石蜡块的样品,制作出厚度3μm的薄切切片。薄切切片用二甲苯脱石蜡化,在采用EtOH的浸水处理、PBS置换后,在4℃下进行了一抗的反应一晚。一抗使用了抗LYVE-1抗体(Rabbit IgG,ReliaTech)和抗MCSP抗体(Mouse IgG2a,Millipore)。此外,抗体用12%BSA/PBS进行100倍稀释,进行了染色。用PBS洗涤3次后,利用与各一抗的动物种类对应的进行了荧光(Alexa488,Alexa594)标记的二抗在室温、遮光条件下使其反应一个半小时。二抗用12%BSA/PBS进行了200倍稀释。用PBS洗涤3次后,利用加有DAPI的封入剂封入后,进行了荧光观察。对于表皮干细胞,计数其数而算出在总细胞数中的比例(%)。对于淋巴管,测定被染色了的部位的面积而算出在总细胞面积中的比例(%)。通过皮尔逊的积矩相关系数而求出表皮干细胞数和淋巴管面积的相关性。
结果:
老年组的表皮干细胞数和淋巴管面积都比年轻组的低(数据未显示)。进一步可知表皮干细胞数与淋巴管面积具有相关关系(图5)。该结果提示通过年龄增长从而表皮干细胞减少而淋巴管功能衰退。此外,也提示通过年龄增长从而IL-8增加,以及皮肤细胞的老化与淋巴管的减少具有某种关系。理论虽然不明确,但是可以考虑通过淋巴管而回收不完的IL-8促进皮肤细胞的老化的可能性,或通过IL-8对淋巴管细胞带来不良影响而淋巴管功能恶化从而通过淋巴管而回收不完的废物促进皮肤细胞的老化的可能性。
根据实验1-5的结果,推导出通过年龄增长从而IL-8增加,通过IL-8的增加而皮肤细胞的老化被加速。因此,期待可以通过抑制IL-8来实现皮肤细胞的抗老化。因此,通过以下实验探索了抑制IL-8的物质。
<实验6:IL-8抑制物质的探索>
试样的调制:
作为IL-8抑制作用的评价对象试样,使用了以下。
表1
包含其它动植物的提取物这样的天然来源成分、合成成分,调制出合计168种候选试样。
细胞培养:
将来源于正常人胎儿的表皮角质形成细胞(ScienCell社,Cat No.2120)利用表皮角质形成细胞培养培养基(クラボウ社,KK-2150S)进行了培养。在传代后以成为2.5×105细胞/孔/2mL的方式向6孔板接种,在24小时后添加了药剂。将药剂预先利用DMSO形成10%的物质以1000倍稀释加入到培养基中,制成最终浓度0.01%。对照将DMSO以1000倍稀释而添加。在将药剂添加24小时后回收了mRNA。此外在采用ELISA法的蛋白质分析中在药剂添加48小时后回收了蛋白质。
1.基于基因表达分析的具有IL-8表达抑制作用的物质的一次筛选:
RNA从药剂添加24小时后的细胞的回收使用Quiagen Rneasy mini Kit(Quiagen社),cDNA的合成利用SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Thermo FisherScientific社)进行。IL-8和B2M的基因表达量使用Platinum SYBR Green qPCR superMix-UDG(Invitrogen Japan,Tokyo,Japan)利用Syber Green法进行。所使用的引物如以下那样。
B2M正向:5’-GTGGGATCGAGACATGTAAGCA-3’(序列号1)
B2M反向:5’-CAATCCAAATGCGGCATCT-3’(序列号2)
IL-8正向:5’-GGGTACCCAGTTAAATTTTCATTTC-3’(序列号5)
IL-8反向:5’-CAAGTTTCAACCAGCAAATTACT-3’(序列号6)
一次筛选以N=1、药剂浓度0.01%进行。对于一次筛选,将与对照的IL-8/B2M值相比不显示显著高的IL-8/B2M值的物质作为具有IL-8表达抑制作用的物质的候选而从168种选定了82种。
2.基于蛋白质的量分析的具有IL-8翻译抑制作用的物质的二次筛选:
对于通过一次筛选而选定的82种,以药剂浓度0.01%、N=3,基于IL-8蛋白质的量进行了二次筛选。
将药剂添加48小时的细胞(6孔板)用2mL PBS洗涤1次后,利用RIPA缓冲液(ナカライ社,Cat No.08714-04)将细胞溶解了。用离心机使不溶解蛋白质沉淀,回收上清液,制成蛋白质溶液。利用BCA法而校正蛋白质的量,使用IL-8ELISA kit(abcam社,CatNo.ab46032)测定了IL-8浓度。
基于二次筛选的结果的蛋白质表达抑制效果,作为具有IL-8翻译抑制作用的物质的候选而从82种选定了16种。
3.根据药剂浓度差异基于蛋白质的量的分析的三次筛选:
对于通过二次筛选而选定的16种,除了以药剂浓度0.001%、0.01%、0.1%、各N=3进行以外,通过与一次、二次筛选同样的方法而测定了基因表达量IL-8/B2M和IL-8蛋白质浓度(pg/mL)。对于基因表达量IL-8/B2M,将对照设为100%而算出各药剂添加组相对于对照的表达量(对照的%)。同样地对于蛋白质浓度也算出相对于对照的比例(对照的%)。按照以下式子算出翻译率,进行了基于IL-8翻译率的三次筛选。
翻译率(%)=(IL-8蛋白浓度相对于对照的比例/IL-8基因表达量相对于对照的比例)×100
根据三次筛选的结果,作为浓度依赖地具有IL-8翻译抑制作用的物质,选定了铺地百里香提取物、茴香提取物、蔷薇提取物、甘牛至提取物、百叶蔷薇提取物这5种。
<实验7:选择药剂对皮肤细胞中的IL-8翻译的影响>
对于通过实验6而选定的5种,确认了对表皮角质形成细胞的IL-8抑制效果的再现性。
将用6孔板培养了的各年代来源的表皮角质形成细胞用1mL PBS洗涤,用RIPA缓冲液(ナカライ社)使细胞溶解,使用刮刀进行了回收。利用BCA测定法而测定蛋白质的量,将各样品的蛋白质浓度调整为500μg/mL。蛋白质浓度调整了的样品使用Quantikine HShuman IL-8ELISA kit(R&Dsystems,HS800)进行定量分析,通过与实验6相同方法算出IL-8量(pg/mL)和IL-8翻译率(IL-8翻译)(%)。
结果:
将结果示于图6-10中。铺地百里香提取物、茴香提取物、蔷薇提取物、甘牛至提取物、百叶蔷薇提取物的IL-8蛋白质浓度和翻译率降低了,IL-8翻译抑制效果具有再现性地显示。
通过以上结果,可知铺地百里香提取物、茴香提取物、蔷薇提取物、甘牛至提取物、百叶蔷薇提取物对于IL-8的抑制、特别是IL-8的翻译抑制是有效的。通过年龄增长而IL-8增加,但通过抑制IL-8,从而对于皮肤干细胞的增殖促进、皮肤老化细胞的增加抑制、皮肤干细胞的老化抑制、进而皮肤的老化抑制是有效的。另外,也提示年龄增长中的IL-8的增加与皮肤细胞老化与淋巴管减少的相关。
序列表
<110> 株式会社资生堂
<120> IL-8抑制剂、皮肤抗老化剂、和使用它们来抑制皮肤老化的方法
<130> P210262WO
<150> JP2020-135851
<151> 2020/08/11
<160> 6
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> B2M正向
<223> 引物
<400> 1
gtgggatcga gacatgtaag ca 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> B2M反向
<223> 引物
<400> 2
caatccaaat gcggcatct 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> LRIG1正向
<223> 引物
<400> 3
cttgacctgg gttctgggta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> LRIG1反向
<223> 引物
<400> 4
ggccaaagga acatttgaag 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> IL-8正向
<223> 引物
<400> 5
gggtacccag ttaaattttc atttc 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> IL-8反向
<223> 引物
<400> 6
caagtttcaa ccagcaaatt act 23
Claims (6)
1.一种IL-8抑制剂,包含铺地百里香提取物、茴香提取物、蔷薇提取物、甘牛至提取物、百叶蔷薇提取物中的至少任一者作为有效成分。
2.一种IL-8翻译抑制剂,包含铺地百里香提取物、茴香提取物、蔷薇提取物、甘牛至提取物、百叶蔷薇提取物中的至少任一者作为有效成分。
3.一种皮肤抗老化剂,包含权利要求1或2所述的药剂。
4.根据权利要求3所述的皮肤抗老化剂,皮肤抗老化通过促进皮肤干细胞的增殖来实现。
5.根据权利要求3或4所述的皮肤抗老化剂,皮肤抗老化通过抑制皮肤老化细胞的增加来实现。
6.根据权利要求3~5中任一项所述的皮肤抗老化剂,皮肤抗老化通过抑制由IL-8引起的皮肤干细胞的老化来实现。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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