KR102429850B1 - 차나무 뿌리 추출물을 포함하는 피부장벽 강화용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 명세서에는 차나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서, 피부장벽 약화를 일으키는 자극원에 의해 발현량이 영향을 받는 피부 세포 내 유전자인 S100A7(NM_002963), IL-36G(NM_019618) 및 LCE3D(NM_032563)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량을 정상 수준으로 조절하는 피부장벽 강화용 조성물이 개시된다.

Description

차나무 뿌리 추출물을 포함하는 피부장벽 강화용 조성물{Composition comprising camellia sinensis L. root extract for Enhancing Skin Barrier}

본 명세서에는 피부장벽 강화용 조성물이 개시된다. 보다 상세하게, 정상 상태의 피부 세포와 비교하여 피부장벽의 약화에 의해 발현 정도가 변화되는 피부 세포 유전자인 바이오마커 등을 유의미하게 변화시켜서 피부장벽을 강화시키는, 차나무 뿌리 추출물을 포함하는 조성물이 개시된다.

피부의 구성층 중 표피는 인체 내부의 수분 증발을 방지하는 중요한 역할을 한다. 표피는 외부로부터 순서대로 각질층, 과립층, 유극층, 기저층으로 구분되며, 각질층의 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하고 각질세포 사이의 세포간 지질들은 모르타르와 같은 역할로 작용하여 피부 장벽을 구성한다. 또한, 건강한 사람의 각질세포에는 고농도의 자연보습인자(Natural Moisturing Factor, NMF)가 존재하여 피부의 수분 보유를 돕는데, 예를 들면 아미노산과 같은 물질은 수용성이기 때문에 효과적으로 수분과 결합하여 피부에서 수분이 건조되는 것을 억제한다.

그러나, 요즘과 같이 환경의 변화나 생활 패턴의 변화에 따른 냉/난방의 인위적인 온도 조절, 사회 생활에서 발생되는 각종 스트레스와 환경 오염으로 인한 피부 스트레스, 화장 습관에 따른 잦은 세안 및 연령 증가에 따른 자연적인 피부 노화 등의 여러 가지 원인으로 인하여 각질층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠게 되며 피부가 푸석거리고 촉촉함을 잃어 생기가 없어 보이는 등의 현상이 발생하기 때문에 피부 보습제의 필요가 증가하고 있다. 또한 외부로부터 받는 과도한 물리적, 화학적 자극, 자외선, 스트레스 및 영양결핍 등은 피부의 정상기능을 저하시키고 탄력손실, 각질화, 주름생성 등의 현상을 촉진시키게 되는데, 특히 자외선에 의해 표피 진피 경계부는 심하게 손상을 받는다. 또한, 외부로부터 받는 과도한 물리적, 화학적 자극, 자외선 및 스트레스 등은 피부의 정상기능을 저하시키고 탄력손실, 각질화, 주름생성 등의 피부노화현상을 촉진시키게 되는데, 특히 자외선에 의해 표피 진피 경계부는 심하게 손상을 받는다.

IL-36G는 피부장벽 약화로 인하여 발생하는 건선 등에 있어서의 유용한 바이오마커라는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1 참조). 또한, S100A7 및 S100A8은 피부장벽 기능의 장애로 인한 아토피 피부염 및 건선과 관련된 지표임이 알려져 있다. 특히, S100A8의 발현량 증가는 각질형성세포의 활성화 상태와 관계된 것이고 이에 수반하는 염증에 의한 것은 아니라는 점이 개시되어 있어서(비특허문헌 2 참조) 피부에서의 염증 현상과는 구분된다.

AM D'Erme et al, "IL-36c (IL-1F9) Is a Biomarker for Psoriasis Skin Lesions", Journal of Investigative Dermatology, Volume 135, 2015. Eckert et al, "S100 Proteins in the Epidermis", J Invest Dermatol, 123(1):23-33, 2004 Jul.

이에 본 발명자는 피부장벽 약화를 일으키는 자극원이 피부에 유해한 영향을 미치며, 이러한 영향에 의하여 피부 세포 유전자의 발현에 영향을 미침으로써 피부장벽 약화를 일으키는 자극원 등과 같은 증상이 나타나게 되는데 본원의 발명에 따른 조성물이 피부장벽을 강화시키는 효능을 갖는다는 것을 발견하다.

따라서, 일 측면에서 본 발명은 피부장벽 강화용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 일 측면에서, 본 발명은 차나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서, 피부장벽 약화를 일으키는 자극원에 의해 발현량이 영향을 받는 피부 세포 내 유전자인 IL-36G(NM_019618), S100A7(NM_002963), 및 S100A8(NM_002964)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량을 정상 수준으로 조절하는 피부장벽 강화용 조성물을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 피부장벽 강화용 조성물을 이용함으로써, 피부장벽 약화를 일으키는 자극원에 의해 변화되는 유전자 발현량을 정상 수준으로 되돌려 피부 세포의 손상을 저하시킬 수 있다.

도 1은 자극원 처리에 의한 세포생존율을 나타낸 것이며, 여기에서 ADSP는 아시아 먼지 바람 입자(Asian dust storm particle)로서 황사를 나타내고, PM10(Particulate matter 10)은 입자크기가 10㎛인 미세먼지를 나타내며, PM2.5(Particulate matter 2.5)는 입자크기가 2.5㎛인 미세먼지를 나타낸다.
도 2a는 피부장벽 약화를 일으키는 자극이 가해진 피부 세포에서 변화한 IL-36G 유전자의 발현량이 차나무 뿌리 추출물의 처리에 의해 정상 수준으로 되돌아감을 나타낸 것이다.
도 2b는 피부장벽 약화를 일으키는 자극이 가해진 피부 세포에서 변화한 S100A7 유전자의 발현량이 차나무 뿌리 추출물의 처리에 의해 정상 수준으로 되돌아감을 나타낸 것이다.
도 2c는 피부장벽 약화를 일으키는 자극이 가해진 피부 세포에서 변화한 S100A8 유전자의 발현량이 차나무 뿌리 추출물의 처리에 의해 정상 수준으로 되돌아감을 나타낸 것이다.
도면에서, "녹뿌1"은 차나무 뿌리 에탄올 추출물(실시예 1)을 1 ppm 처리한 것, "녹뿌5"는 차나무 뿌리 에탄올 추출물(실시예 1)을 5 ppm 처리한 것, "녹사1"은 차나무 뿌리 에탄올 추출물의 부탄올 분획물(실시예 2)을 1 ppm 처리한 것, "녹사5"는 차나무 뿌리 에탄올 추출물의 부탄올 분획물(실시예 2)을 5 ppm 처리한 것, "NT"는 미세먼지 처리하지 않은 것, "cont1" 및 "cont2"는 각각의 대조군을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 조성물은 차나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.

차나무(Camellia sinensis)는　차나무과(theaceae)에 속하는 다년생 상록식물로서 열대, 아열대, 온대지방에 분포되고　차나무의 주요성분으로는 카테킨, 사포닌, 카페인, 아미노산, 비타민 및 무기질 등이 있으며, 이들 화학성분들은 여러 가지 생리활성과 약리효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다. 오늘날 건강에 기여하는 생리활성물질로서 활발한 연구가 되고 있다.

일 측면에서, 상기 차나무 뿌리 추출물은 사포닌을 포함하는 추출물일 수 있다.

일 측면에서, 상기 차나무 뿌리 추출물은 상기 추출물 총 중량에 대하여 사포닌을 30 내지 70 중량%로 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 차나무 뿌리 추출물은 상기 추출물 총 중량에 대하여 사포닌을 50 내지 60 중량%로 포함할 수 있다. 사포닌이 상기 함량 범위인 경우, 차나무 뿌리 추출물에 의한 항노화 및 항염 효과가 우수하였다.

구체적으로, 30 중량% 이상, 31 중량% 이상, 32 중량% 이상, 33 중량% 이상, 34 중량% 이상, 35 중량% 이상, 36 중량% 이상, 37 중량% 이상, 38 중량% 이상, 39 중량% 이상, 40 중량% 이상, 41 중량% 이상, 42 중량% 이상, 43 중량% 이상, 44 중량% 이상, 45 중량% 이상, 46 중량% 이상, 47 중량% 이상, 48 중량% 이상, 49 중량% 이상, 50 중량% 이상, 51 중량% 이상, 52 중량% 이상, 53 중량% 이상, 54 중량% 이상, 또는 55 중량% 이상일 수 있고, 70 중량% 이하, 69 중량% 이하, 68 중량% 이하, 67 중량% 이하, 66 중량% 이하, 65 중량% 이하, 64 중량% 이하, 63 중량% 이하, 62 중량% 이하, 61 중량% 이하, 60 중량% 이하, 59 중량% 이하, 58 중량% 이하, 57 중량% 이하, 56 중량% 이하, 또는 55 중량% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 차나무 뿌리는 특정 추출용매로 추출되어 차나무 뿌리 추출물을 형성할 수 있다.

본 발명의 일 측면인, 상기 차나무 뿌리 추출물은 차나무 뿌리를 물 또는 유기용매인 1차 추출용매로 추출하여 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 1차 추출용매는 물, C₁ -C₆의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 디에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 추출용매일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 추출은 물, C₁ - C₆의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤 및 부틸렌글리콜을 포함하는 극성 용매 및 에틸아세테이트, 디에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름 및 헥산을 포함하는 저극성 용매 중 어느 하나 이상을 용매로 사용하는 것일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 용매는 50 - 90%의 에탄올 수용액일 수 있으며, 60 - 80% 또는 65 - 75%의 에탄올 수용액일 수 있다. 상기 용매가 50 - 90%의 에탄올 수용액인 경우, 차나무 뿌리에서 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 용매는 약 70%의 에탄올 수용액일 수 있다.

일 측면에서, 상기 차나무 뿌리 추출물은 상기 1차 추출용매로 추출하고, 2차 추출용매로 분획하여 제조될 수 있다. 구체적으로 상기 2차 추출용매는 무수 또는 함수 부탄올 일 수 있다. 상기 분획을 통하여 추출물에 포함된 특정 성분의 함량을 더 증가시킬 수 있으며, 구체적으로 상기 차나무 뿌리 추출물에 포함된 사포닌의 함량을 더 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 1차 추출용매로 추출한 차나무 뿌리 추출물보다 상기 차나무 뿌리 추출물을 2차 추출용매로 분획한 추출물의 사포닌 함량은 전체 추출물의 중량에 대하여 예를 들어, 5 중량% 이상, 6 중량% 이상, 7 중량% 이상, 8 중량% 이상, 9 중량% 이상, 10 중량% 이상, 11 중량% 이상, 12 중량% 이상, 13 중량% 이상, 14 중량% 이상, 또는 15 중량% 이상 더 증가된 것일 수 있고, 5-15 중량% 더 증가된 것일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 차나무 뿌리 추출물은 70% 에탄올을 1차 추출용매로 추출하고 부탄올을 2차 추출용매로 분획된 것이다. 예를 들어, 상기 70% 에탄올을 1차 추출 용매로 하여 추출한 차나무 뿌리 추출물의 사포닌 함량은 전체 추출물 중량에 대하여 약 55.8 중량%일 수 있고, 상기 차나무 뿌리 추출물을 부탄올을 2차 추출 용매로 하여 분획한 추출물의 사포닌 함량은 전체 추출물 중량에 대하여 약 67.6 중량%일 수 있다. 따라서, 상기 분획을 통하여 추출물의 사포닌 함량은 약 11.8 중량%가 증가될 수 있다.

일 측면에서, 상기 차나무 뿌리 추출물은 상기 추출용매로 추출된 이후에, 여과, 농축, 분리 또는 건조 과정 중 하나 이상을 추가적으로 거쳐서 얻어진 것일 수 있다. 특히, 상기 차나무 뿌리 추출물은 1회 이상의 여과 과정을 거친 것일 수 있다.

일 측면에서, 상기 추출물은 추출 후 냉각 콘덴서가 달린 증류 장치에서 적정 온도로, 구체적으로 약 50 ℃의 온도로 감압 농축될 수 있다.

다만, 본 발명에 따른 차나무 뿌리 추출물은 당해 기술 분야의 통상적인 방법으로 추출하여 얻을 수 있으며, 전술한 방법에 의하여 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점인, 조성물에 있어서, 상기 조성물은 차나무 뿌리 추출물을, 조성물 총 중량을 기준으로 0.000001 내지 40중량%로 포함할 수 있다. 상기 추출물의 함량이 0.000001 내지 40중량%인 경우, 차나무 뿌리 추출물을 포함하는 조성물에 의한 미세먼지에 의한 피부 손상 케어 효과가 우수하였다.

구체적으로, 0.0000001 중량% 이상, 0.0000005 중량% 이상, 0.0000007 중량% 이상, 0.0000009 중량% 이상, 0.000001 중량% 이상, 0.000002 중량% 이상, 0.000004 중량% 이상, 0.000006 중량% 이상, 0.000008 중량% 이상, 0.00001 중량% 이상, 0.00003 중량% 이상, 0.00005 중량% 이상, 0.00007 중량% 이상, 0.00009 중량% 이상, 0.0001 중량% 이상, 0.0003 중량% 이상, 0.0005 중량% 이상, 0.0007 중량% 이상, 0.0009 중량% 이상, 0.001 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 1 중량% 이상, 3 중량% 이상, 5 중량% 이상, 7 중량% 이상, 9 중량% 이상, 10 중량% 이상, 13 중량% 이상, 15 중량% 이상, 17 중량% 이상, 19 중량% 이상, 21 중량% 이상, 23 중량% 이상, 25 중량% 이상, 27 중량% 이상, 29 중량% 이상, 30 중량% 이상, 31 중량% 이상, 32 중량% 이상, 33 중량% 이상, 34 중량% 이상, 35 중량% 이상, 36 중량% 이상, 37 중량% 이상, 38 중량% 이상, 또는 39 중량% 이상 일 수 있고, 40 중량% 이하, 39 중량% 이하, 38 중량% 이하, 37 중량% 이하, 36 중량% 이하, 35 중량% 이하, 34 중량% 이하, 33 중량% 이하, 32 중량% 이하, 31 중량% 이하, 30 중량% 이하, 29 중량% 이하, 28 중량% 이하, 26 중량% 이하, 24 중량% 이하, 22 중량% 이하, 20 중량% 이하, 18 중량% 이하, 16 중량% 이하, 14 중량% 이하, 12 중량% 이하, 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 6 중량% 이하, 4 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1 중량% 이하, 0.1 중량% 이하, 0.09 중량% 이하, 0.04 중량% 이하, 0.01 중량% 이하, 0.006 중량% 이하, 0.001 중량% 이하, 0.0009 중량% 이하, 0.0007 중량% 이하, 0.00005 중량% 이하, 0.00003 중량% 이하, 0.00001 중량% 이하, 0.000009 중량% 이하, 0.000007 중량% 이하, 0.000005 중량% 이하, 0.000003 중량% 이하, 0.000001 중량% 이하, 0.0000009 중량% 이하, 0.0000007 중량% 이하, 0.0000005 중량% 이하, 0.0000003 중량% 이하, 0.0000002 중량% 이하, 0.0000001 중량% 이하, 또는 0.00000009 중량% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면은, 본 발명의 조성물의 피부장벽 강화 용도를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 차나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 강화용 조성물일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 피부장벽 약화를 일으키는 자극에 의해 손상된 피부 세포에서 특정 유전자의 발현량을 정상 수준으로 조절함으로써, 피부장벽을 강화시키는 조성물을 제공한다.

일 측면에서 구체적으로, 본 발명에서 피부장벽 약화를 일으키는 자극에 의해 발현량이 영향을 받는 피부 세포 내 유전자로는 IL-36G(NM_019618), S100A7(NM_002963) 및 S100A8(NM_002964) 등을 포함한다. 상기 IL-36G(NM_019618), S100A7(NM_002963) 및 S100A8(NM_002964)는 피부장벽 약화를 일으키는 자극에 의해 발현량이 증가하는 유전자이므로, 이들 유전자의 발현량을 억제하여 정상 수준으로 조절함으로써 피부장벽을 강화시킬 수 있다.

일 측면에서, 본 발명에서 사용되는 피부장벽 약화를 일으키는 자극에 의해 발현량이 증가되는 유전자는 [표 1]에 제시되어 있다. 표에서 Name은 NCBI의 genebank accession ID를 의미하는 것이고, Gene Symbol은 공식 유전자 심볼을 의미하며, Gene title은 각 유전자의 이름을 의미한다.

증가유전자
Name	Gene Symbol	Gene title
NM_019618	IL36G	interleukin 36, gamma
NM_002963	S100A7	S100 calcium binding protein A7
NM_002964	S100A8	S100 calcium binding protein A8

상기 유전자 또는 단백질의 발현량 분석은 마이크로어레이, PCR, NGS(Nest Generation Sequencing; 차세대 염기서열분석), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 등 당업계에 공지된 다양한 분석 방법을 이용하여 분석될 수 있다.

본 발명의 일 관점인, 상기 조성물은, 화장료 조성물일 수 있고, 약학적 조성물일 수 있으며, 건강기능식품 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물은, 예컨대, 각종 크림, 로션 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품 류와 클렌징, 세안제, 비누, 미용액 등이 있다.

일 측면에서, 본 발명의 상기 차나무 뿌리 추출물을 함유하는 조성물이 첨가된 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

즉, 본 발명의 일 측면인 화장료는 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 젤, 파우더, 메이크업 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 패취, 미용액, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징워터, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 샴푸, 린스, 바디세정제, 비누, 염모제, 분무제 등과 같은 제형을 들 수 있다.

각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기 차나무 뿌리 추출물 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 측면인 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.

일 측면에서, 본 발명의 차나무 뿌리 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

그 제형으로는, 상기 차나무 뿌리 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 정제, 캡슐, 산제 또는 시럽 등의 경구제, 또는 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제 등의 외용제 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용할 수 있다.

일반적으로 상기 약학적 조성물에 의해 투여되는 유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로 유효성분의 투여량은 0.0001mg/kg/일 내지 3000mg/kg/일, 예를 들어 10 mg/kg/일 내지 500mg/kg/일 일 수 있다.

본 발명의 일 관점인 건강 기능식품 조성물에서, 건강식품은, 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분(기능성원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 건강식품은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조, 가공될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 법률에 따라 어떤 형태로든지 제조, 가공될 수 있다.

구체적으로, 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드 폴리사카라이드, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

일반적으로 상기 건강 기능식품 조성물에 의해 투여되는 유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로 유효성분의 투여량은 0.0001mg/kg/일 내지 1000mg/kg/일, 예를 들어 0.02 mg/kg/일 내지 6mg/kg/일 일 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 차나무 뿌리 에탄올 추출물의 제조

제주 오설록 목장에서 입수한 차나무(Camellia sinensis L.) 뿌리를 정제수로 세척하고 건조시킨 다음 세말화하여 얻어진 차나무 뿌리 가루 100g을 70% 에탄올 수용액 1L에 넣고 상온에서 12시간 이상 교반하여 추출한 후, 와트만 2번 여과지로 여과시켰다. 이렇게 얻어진 추출액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 50℃로 감압 농축하고 건조하여 차나무 뿌리 70% 에탄올 추출물(건조중량 21.05g)을 얻었다. 상기 과정으로 얻은 차뿌리 70% 에탄올 추출물의 사포닌 함량은 추출물 전체 중량에 대하여 약 55.8 중량% 였다.

[실시예 2] 차나무 뿌리 에탄올 추출물의 부탄올 분획물 제조

실시예 1에서 얻어진 추출물 10g을 증류수 200mL에 녹여 1L들이 분액 깔대기에 넣은 후, 부탄올 200mL를 가하고 흔들어서 잘 섞어준 다음 두 층으로 완전히 분리되면 상층(부탄올 층)을 취하였다. 하층(물 층)은 분액 깔대기를 이용하여 상기와 같은 과정을 두 번 더 반복하여 추출한다. 각각의 추출 과정에서 분리된 상층을 모두 합한 뒤, 냉각 콘덴서가 달린 증류 장치를 이용하여 50℃로 감압 농축하고 건조하여 차나무 뿌리 에탄올 추출물의 부탄올 분획물(건조중량 4.83g)을 얻었다. 상기 과정으로 얻은 차나무 뿌리 에탄올 추출물의 부탄올 분획물의 사포닌 함량은 추출물 전체 중량에 대하여 약 67.6 중량% 였다.

[실시예 3] 피부장벽 약화 자극원의 준비

미세먼지의 포집은 로우 볼륨 에어 샘플러(Sensidyne, Gillian, Low Volume Air Sampler, FL, U.S.A.)를 이용하였고, Filter pack은 매 측정일 오전 10시 전후에 필터와 디누더를 교체하여 약 24시간 동안 시료를 채취하였다. 28일간 서울의 풍하지역(경기도 용인시 처인구 소재, 한국외국어대학교 외국학 종합연구센터 생활관 6층 옥상)에서 매일 미세먼지를 포집하였으며, 측정시간은 진공펌프를 켜면서 타이머를 작동시키고 진공펌프를 끌 때 타이머의 시간을 기록하였다. 채취 유량은 16.7L/min으로 하여 측정 시작시 유량계(Model 4143, TSI Inc.)로 유량을 측정하고 측정이 끝날 때 다시 유량을 측정하였다. 필터팩(filter pack)에 들어가는 Teflon 필터는 시료 채취 전과 후에 무게를 측정하였다. Teflon 필터의 무게를 측정하기 전 24 시간 동안 상대습도 40%의 데시케이터(NIKKO, Japan)에 항량시킨 후 소수점 5자리가 표시되는 전자저울(DVG215CD, Ohaus)에 무게를 두 번 측정하여 평균값을 기록하였다. 시료를 채취한 후에도 무게를 측정하기 전에 데시케이터에서 24시간 항량시킨 후 무게를 두 번 측정하여 채취 전에 측정한 무게와 비교하여 질량농도를 산출하였다. 미세먼지의 추출은 Teflon 필터를 1mL의 에탄올에 적신 후 14mL의 DW를 넣어 필터의 에어로졸 포집면이 수면에 닿도록 한 상태에서 뚜껑을 닫은 후 초음파 세척기로 30분간 초음파를 주어 실행하였다. 여과단계에서 수분에 의한 오차를 최소화하기 위하여 건조기(decicator)에서 48시간 동안 필터의 수분을 완전히 제거한 후, 0.1mg까지 측정할 수 있는 초정밀저울계(Mettler Toledo Company 社)를 이용하여 필터의 무게를 칭량하여 필터의 추출 전, 후 무게를 칭량하였다.

[실시예 4] (정상사람)각질형성세포주의 배양

(정상사람)각질형성세포주(Human normal epidermal keratinocytes)는 론자 社(Lonza, Inc. 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재)에서 구입하여 계대배양한 후 CO2 배양기(CO2 incubator)에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 세포 배양액은 론자 社의 지침서에 따랐다. 500ml의 KBM-2(KBMTM-2, CC-3103) 배지에 KGM-2 불렛 키트 CC-4152(KGM TM-2 Bullet kit, CC-4152)(성분: BPE(Bovine pituitary extract)), 인간표피 성장인자(human epidermal growth factor, hEGF), 인슐린(Insulin), 하이드로코티손(Hydrocortisone), 트랜스페린(Transferrin), 에피네프린(Epinephrine), 및 젠타마이신 설페이트 + 암포페리신-B(Gentamycin Suflate + Amphofericin-B: GA-1000))를 첨가한 KGM-2 불렛키트 CC-3107(KGM TM-2 Bullet Kit, CC-3107)을 사용하였다.

[실시예 5] (정상사람)각질형성세포주에 자극원의 처리 및 세포독성 측정

미세먼지 처리를 통한 세포독성 여부 확인을 위하여, Mossman 등(J.Immunol. Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 (정상사람)각질형성세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다.

구체적으로, 24-웰 플레이트를 사용하고 상기 실시예 3의 채취하여 얻은 직경이 2.5㎛인 미세먼지를 정제수에 분산시켜서 미세먼지 분산액을 제조한 다음, 실시예 4의 세포배양조건으로 2.5 × 10⁵ 웰 세포수인 조건에서 배양한 세포에 상기 미세먼지 분산액을 처리하여 24시간 동안 배양한 후, MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5㎎/㎖을 혼합하여 37℃에서 3시간 동안 추가 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500㎕에 용해하였다. 그 용해물을 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540nm에서 OD값을 측정하였다. 측정 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 세포주에서 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지를 분산시킨 분산액에 의한 세포독성에 대하여 80% 생존율을 보이는 농도(IC20)값은 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 수용성 추출액의 경우 12.5㎍/㎖ 이었다.

[실시예 6] 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing)을 통한 피부장벽 약화를 일으키는 자극에 의한 세포 유전자 변화 확인

RNA-염기서열 데이터 처리 및 분석을 위해, Trapnell et al.(2012)에 의해 개발된 일반적인 분석 단계를 참조하였다. FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)를 사용하여 RNA-seq 데이터 품질을 확인하였고, FASTX(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)를 사용하여, 정확도가 떨어지는 베이스 및 어탭터 서열을 제거하였다. 이후 Tophat(Trapnell et al., 2009)과 인간 유전체(hg19)를 사용하여 얼라인먼트를 수행하였고, 각 샘플의 데이터량을 RSeQC로 재명명된 EVER-seq을 사용하여 확인하였다(Wang et al., 2012). 또한, Cufflinks를 사용하여 전사체(transcript)의 발현 수준을 정량하였고, 미세먼지 분산액 처리 샘플과 정상 샘플의 사이에서 전사 수준을 비교하였다(Trapnell et al., 2010). FDR adjusted p-value<0.05로, ≥2.0 fold-change의 엄격한 컷오프를 적용하여, 직경이 2.5㎛인 미세먼지의 분산액의 처리시 유의미한 발현 차이를 나타내는 유전자를 결정하였다. 측정 결과는 하기 [도 2a] 내지 [도 2c]에 나타나 있다.

[실시예 7] 실시간 RT-PCR 정량

실시예 3에서 추출한 직경이 2.5㎛인 미세먼지를 실시예 4에서 배양한 인간정상각질피부세포에 세포배양배지 1ml에 12.5㎍의 양으로 처리하고, 하기 표 2에 나타낸 유전자의 프라미어(applied biosystems TaqMan® Primers)로 상대적 mRNA 발현양을 측정하였다. 차나무 뿌리 추출물 및 부탄올 분획물은 실시예 1 및 2에서 제조한 것을 사용하였다.

Name	Gene Symbol	TaqMan® 프라이머
NM_019618	IL36G	Hs00219742_m1
NM_002963	S100A7	Hs00161488_m1
NM_032563	LCE3D	Hs00754375_s1

배지에 차나무 뿌리 추출물 및 차나무 뿌리 사포닌 추출물을 각각 1 ppm 및 5 ppm의 농도로 처리하고 24시간 경과 후, 배양액을 제거하고, 2ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트 社의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 상기 [표 2]의 프라이머를 이용한 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(Q-RT-PCR: real time-reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 정량적으로 분석하였다. 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 세포의 유전자 변화를 실시간 PCR로 평가하였으며, 그 결과를 [도 2a] 내지 [도 2c]에 나타내었다. 이용한 Q-RT-PCR과 실시간 PCR은 모두 라이프테크놀로지에서 배포하는 표준 프로토콜에 따라서 실행하였으며, 구체적으로 95℃에서 20초 동안 처리한 후, 95℃에서 3초 및 60℃에서 30초를 처리하는 공정을 40주기 진행하였다.

[도 2a] 내지 [도 2c]에 나타낸 바와 같이, 피부장벽 약화를 일으키는 자극에 의해 자극된 피부 세포에서 발현량이 증가하는 유전자가 존재하며, 차나무 뿌리 추출물의 처리에 의하여 인터류킨 36 감마(IL-36G), S100 칼슘 바인딩 프로틴 A7(S100A7), S100 칼슘 바인딩 프로틴 A8(S100A8) 유전자의 발현량이 감소됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 차나무 뿌리 추출물은 피부장벽 약화를 일으키는 자극으로 인한 피부 세포 손상으로부터 피부 세포를 효과적으로 보호하고, 상기 피부장벽 약화를 일으키는 자극에 의하여 전술한 특정 유전자의 발현량이 변화하는 것을 억제 또는 방지하여, 정상 수준의 발현량을 갖도록 할 수 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 조성물의 제형예를 설명하나, 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 건강 기능식품 조성물은 여러 가지 제형으로 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 정제

본 발명 실시예에 따른 차나무 뿌리 추출물 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

배합성분	함량(mg)
차나무 뿌리 추출물	100
락토오스	400
옥수수 전분	400
스테아린산 마그네슘	2

[제형예 2] 캡슐제

본 발명 실시예에 따른 차나무 뿌리 추출물 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

배합성분	함량(mg)
차나무 뿌리 추출물	100
락토오스	400
옥수수 전분	400
스테아린산 마그네슘	2

[제형예 3] 과립제

본 발명 실시예에 따른 차나무 뿌리 추출물 50mg, 무수결정 포도당 250mg 및 전분 550mg을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하였다.

배합성분	함량(mg)
차나무 뿌리 추출물	50
무수결정 포도당	250
전분	550

[제형예 4] 비누

배합성분	함량(%)
차나무 뿌리 추출물	5.00
유지	적량
수산화나트륨	적량
염화나트륨	적량
향료	적량
정제수	잔량

[제형예 5] 로션

배합성분	함량(%)
차나무 뿌리 추출물	5.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
수용성 콜라겐 (1 % 수용액)	1.00
시트르산나트륨	0.10
시트르산	0.05
감초 엑기스	0.20
1,3-부틸렌글리콜	3.00
정제수	잔량

[제형예 6] 크림

배합성분	함량(%)
차나무 뿌리 추출물	3.00
폴리에틸렌글리콜모노스테알레이트	2.00
자기유화형모노스테아르산글리세린	5.00
세틸알코올	4.00
스쿠알렌	6.00
트리2-에틸헥산산글리세릴	6.00
스핑고당지질	1.00
1.3-부틸렌글리콜	7.00
정제수	잔량

[제형예 7] 연고

배합성분	함량(%)
차나무 뿌리 추출물	5.00
폴리비닐알코올	13.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
라우로일히드록시프롤린	1.00
수용성 콜라겐 (1 % 수용액)	2.00
1,3-부틸렌글리콜	3.00
에탄올	5.00
정제수	잔량

[제형예 8] 미용액 제조

배합성분	함량(%)
차나무 뿌리 추출물	3.00
히드록시에틸렌셀룰로오스(2 % 수용액)	12.00
크산탄검(2 % 수용액)	2.00
1,3-부틸렌글리콜	6.00
진한 글리세린	4.00
히알루론산나트륨 (1 % 수용액)	2.00
정제수	잔량

[제형예 9] 건강식품

배합 성분	함량
차나무 뿌리 추출물	2mg
비타민 A 아세테이트	70μg
비타민 E	1.0mg
비타민 B1	0.13mg
비타민 B2	0.15mg
비타민 B6	0.5mg
비타민 B12	0.2μg
비타민 C	10mg
비오틴	10μg
니코틴산아미드	1.7mg
엽산	50μg
판토텐산 칼슘	0.5mg
황산 제1철	1.75mg
산화아연	0.82mg
탄산마그네슘	25.3mg
제1인산칼륨	15mg
제2인산칼슘	55mg
구연산칼륨	90mg
탄산칼슘	100mg
염화마그네슘	24.8mg

[제형예 10] 건강음료

배합성분	함량
차나무 뿌리 추출물	50mg
구연산	1000mg
올리고당	100 g
타우린	1g
정제수	잔량

Claims (12)

1. 차나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하고,
   IL-36G(NM_019618), S100A7(NM_002963) 및 S100A8(NM_002964)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현을 억제하는, 피부장벽 강화용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 차나무 뿌리 추출물은 사포닌을 포함하는 추출물인, 조성물.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 차나무 뿌리 추출물은 상기 추출물 총 중량에 대하여 사포닌을 30 내지 70 중량%로 포함하는, 조성물.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 차나무 뿌리 추출물은 물, C₁ - C₆의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 디에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 1차 추출용매로 추출되고, 무수 또는 함수 부탄올인 2차 추출용매로 분획된 것인, 조성물.
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 차나무 뿌리 추출물은 무수 또는 함수 에탄올로 1차 추출되고, 무수 또는 함수 부탄올로 2차 분획된 것인, 조성물.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 차나무 뿌리 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.000001 내지 40중량%로 포함된, 조성물.
7. 삭제
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 조성물은 각질형성세포(keratinocyte)에 적용되는, 조성물.
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 차나무 뿌리 추출물은 10 내지 500 mg/kg/일의 투여량으로 투여되는, 조성물.
10. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 화장료 조성물인, 조성물.
11. 삭제
12. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 건강 기능식품 조성물인, 조성물.

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