KR101520533B1 - 스피룰리나 맥시마 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

스피룰리나 맥시마 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 LDAVNR 또는 MMLDF의 아미노산 서열을 갖는 스피룰리나 맥시마 유래의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드는 죽상동맥경화증 등과 같은 심혈관 질환의 발병 및 진행을 유도하는 다양한 사이토카인, 세포부착분자, 화학주성인자, 신호전달경로의 단백질 및 활성산소종의 생성을 억제하는바 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용 가능하고, 특히 스피룰리나 맥시마라는 천연 유래 물질의 특성상 독성 및 부작용이 없어 장기간 안심하고 사용할 수 있으므로 건강기능식품으로도 유용하게 사용 가능할 것이다.

Description

스피룰리나 맥시마 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition containing peptides from spirulina maxima for prevention or treatment of Cardiovascular disorders}
본 발명은 스피룰리나 맥시마 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 스피룰리나 맥시마를 트립신, α-키모트립신, 펩신으로 이루어진 군에서 하나 이상의 효소를 선택하여 가수분해한 후 이를 정제한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
최근 들어 해양 자원으로부터 유래된 신규한 생활성 물질을 다양한 건강 기능식품이나 약학적 조성물로 활용하는 예가 많다. 해양 생물들은 카로티노이드, 테르페노이드, 크산토필, 클로로필, 비타민, 포화 지방산, 아미노산, 단백질, 아세토게닌, 폴리페놀, 알칼로이드, 폴리사카라이드 등의 물질을 생합성하는 것으로 알려져 있으며, 해양 환경은 1차 또는 2차 대사물질을 생산할 수 있는 자원의 보고라 할 수 있다. 지난 수십년 간 수많은 신규한 조성물들이 해양 생물로부터 분리되었으며 이들의 뛰어난 생물학적 활성에 대해 연구되어 왔다. 특히, 해양 조류의 경우 가장 훌륭한 바이오매스(biomass) 생산자로 알려져 있는데, 해양 조류로부터 생산된 다양한 천연의 생활성 물질은 항응집, 항바이러스, 항산화, 항알러지, 항암, 항염, 항비만 효과 등을 나타낸다고 보고되고 있다.
이 중에서도 해양 펩타이드의 구조, 조성, 서열 특성에 대한 정보가 알려지기 시작하면서 이들을 생활성 물질로 활용하려는 시도가 집중되고 있다. 해양 펩타이드는 크게 용매 추출, 효소 가수분해, 미생물 발효 등의 방법으로 생산이 가능하고, 대개 3 내지 20개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 펩타이드를 구성하는 아미노산의 조성 및 서열에 따라 이들의 생활성 기능이 정해지는 것으로 알려져 있다. 현재까지 해양 펩타이드를 추출하기 위해 사용된 해양 생물로는 오징어, 홍합, 굴, 참치, 대구, 고등어, 명태, 장어, 조류 등이 있으며, 추출된 해양 펩타드는 항고혈압 또는 항미생물 활성 등을 나타내고 심혈관 질환의 발생 가능성을 낮추어준다고 보고되고 있다. 따라서, 해양 펩타이드는 건강 기능 식품 및 약학적 조성물로 연구되어야 하는 소중한 자원이라 할 수 있다.
한편, 죽상동맥경화증(atherosclerosis)은 죽상경화증 및 동맥경화증을 혼합하여 일컫는 말로, 죽상경화증이란 혈관의 가장 안쪽을 덮고 있는 내막에 콜레스테롤이 침착하고 내피 세포의 증식이 일어난 결과 '죽종(atheroma)'이 형성되는 혈관질환으로, 죽상경화증이 발병하면, 죽종 내부는 죽처럼 묽어지고 그 주변 부위는 단단한 섬유성 막인 '경화반'으로 둘러싸이게 되며, 경화반이 불안정하게 되면 파열되어 혈관 내에 혈전이 생기고, 죽종 안으로 출혈이 일어나는 경우 혈관 내부의 지름이 급격하게 좁아지거나 혈관이 아예 막히게 되고, 그 결과 말초로의 혈액순환에 장애가 생기게 된다. 그리고, 동맥경화증은 주로 혈관의 중간층에 퇴행성 변화가 일어나서 섬유화가 진행되고 혈관의 탄성이 줄어드는 노화현상으로, 동맥경화증이 발병하면 수축기 고혈압이 초래되어 심장근육이 두꺼워지는 심장비대 현상이 발생한다.
죽상동맥경화증은 일종의 염증질환으로, 류마티즘성 활막과 같이 죽상동맥경화성 판이라는 염증성 조직을 가지고 있으며, 죽상동맥경화성 판은 혈액 유래의 염증 세포 조직으로 이동하고, 혈관 내피 세포 및 결합 조직 세포와 결합한 후, 만성적인 염증 반응을 유도한다.
본 발명자들은 이러한 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료할 수 있는 천연 물질에 초점을 맞추어 연구를 진행하던 중 스피룰리나 맥시마 유래의 펩타이드가 죽상동맥경화증과 관련된 다양한 사이토카인 및 화학주성인자, 부착분자 등의 발현을 조절함으로써 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료용 용도로 활용할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국공개특허 10-2009-0066995
따라서 본 발명의 목적은 스피룰리나 맥시마 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
이를 위하여 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 심혈관 질환은 죽상동맥경화증(atherosclerosis)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 스피룰리나 맥시마(Spirulina maxima) 유래인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 IL-6 또는 IL-8의 발현을 억제함으로써 심혈관 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 PGE2, LTB4 또는 MCP-1의 생성을 저해함으로써 심혈관 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 COX-2, 5-LO 또는 MCP-1의 발현을 억제함으로써 PGE2, LTB4 또는 MCP-1의 생성을 저해하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 P-셀렉틴(P-selectin) 또는 E-셀렉틴(E-selectin)의 생성 또는 발현을 저해함으로써 심혈관 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 TLR4의 발현을 저해시킴으로써 심혈관 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 ERK 신호전달 경로를 저해함으로써 심혈관 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 PKC의 활성화를 저해함으로써 심혈관 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 활성산소종의 생성을 억제함으로써 심혈관 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 스피룰리나 맥시마 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 사이토카인, 부착 분자, 화학주성인자, 신호전달경로의 단백질 및 활성산소종의 생성을 억제함으로써 죽상동맥경화증과 같은 심혈관 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는바, 이를 적절히 활용한다면 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 활용할 수 있을 것이다. 또한, 스피룰리나 맥시마 유래의 펩타이드는 천연 유래 물질로서, 독성 및 부작용이 없어 장기간 안심하고 사용할 수 있으므로 건강기능식품으로도 유용하게 사용 가능할 것이다.
도 1은 스피룰리나 맥시마로부터 유래된 펩타이드(P1)의 아미노산 서열을 분석한 결과이다.
도 2는 스피롤리나 맥시마로부터 유래된 또 다른 펩타이드(P2)의 아미노산 서열을 분석한 결과이다.
도 3은 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 IL-6(A) 및 IL-8(B)의 생산량을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 4는 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 PGE2(A) 및 LTB4(B)의 생산량을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 5는 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 MCP-1의 생산량을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 6은 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 IL-6 및 IL-8의 단백질 발현량 (A) 및 mRNA 발현량 (B)을 각각 웨스턴 블라팅 및 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 7은 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 COX-2 및 5-LO의 단백질 발현량 (A) 및 mRNA 발현량 (B)을 각각 웨스턴 블라팅 및 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 8은 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 MCP-1의 단백질 발현량 (A) 및 mRNA 발현량 (B)을 각각 웨스턴 블라팅 및 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 9는 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 E-selectin(A) 및 P-selectin(B) 형성에 미치는 영향을 형광현미경으로 관찰한 결과이다.
도 10은 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 E-selectin 및 P-selectin의 단백질 발현량 (A) 및 mRNA 발현량 (B)을 각각 웨스턴 블라팅 및 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 11은 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 단핵백혈구 모집 정도를 형광현미경을 이용해 관찰한 사진이다.
도 12는 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 TLR-4의 단백질 발현량 (A) 및 mRNA 발현량 (B)을 각각 웨스턴 블라팅 및 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 13은 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 Egr-1의 단백질 발현량 (A) 및 mRNA 발현량 (B)을 각각 웨스턴 블라팅 및 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 14는 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 c-fos의 단백질 발현량을 웨스턴 블라팅으로 분석한 결과이다.
도 15는 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 ERK 활성 저해제(A) 및 본 발명에 의한 펩타이드(B) 처리에 따른 MAPK의 활성 저해 효과를 웨스턴 블라팅으로 분석한 결과이다.
도 16은 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 PKC의 활성 저해 효과를 웨스턴 블라팅으로 분석한 결과이다.
도 17은 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 ROS 소거활성을 FACs(A) 및 형광이미지(B)로 관찰한 결과이다.
도 18은 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 본 발명에 의한 펩타이드 처리에 따른 히스타민 수용체의 블로킹 효과를 FACs를 이용해 관찰한 결과이다.
히스타민이 그 수용체에 결합하면 내피세포로부터 IL-6, IL-8, p-selectin, VCAM-1, ICAM-1과 같은 전염증성 사이토카인의 생산이 유도되고, 내피세포에서 유도되는 이들 인자의 생산 및 발현은 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 초기 반응을 유도할 수 있다고 보고되고 있다. 따라서, 이러한 인자들의 생산 및 발현을 저해할 수 있는 물질은 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료의 용도로 활용이 가능할 것이다.
본 발명자들은 스피룰리나 맥시마의 효소 가수분해물 유래의 펩타이드(P1, P2)가 EA.hy926 내피세포에서 히스타민에 의해 유도된 IL-6 및 IL-8의 생산을 효과적으로 억제한다는 것을 확인할 수 있었고, 따라서 본 발명자들은 상기 펩타이드(P1, P2)가 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료의 용도로 활용될 수 있다고 예상하고, 그 기전을 확인하기 위하여 추가 실험을 진행하였다.
프로스타글란딘 E2(PGE2), 루코트리엔 B4(LTB4)는 COX-2 및 5-LO 효소에 의해 생산되는 단백질로 죽상동맥경화증으로 진행하는데 중요한 기능을 담당하는 것으로 알려져 있다. PGE2는 동맥경화성 플라크의 불안정성에 관련되어 있다고 알려져 있고, LTB4는 단핵백혈구, 호중성 과립구, T 림프구의 잠재적 화학주성인자로 내피세포층에 백혈구의 부착을 촉진시키고, 혈관투과성을 증대시키며, 혈관 평활근 세포(VSMCs)의 증식 및 이동을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 단핵구 화학주성인자 단백질-1(MCP-1)은 우회 혈관재생 환자의 죽상경화 동맥의 내피세포, 대식세포, 혈관 평활근 세포에서 감지되고, 내피 하부의 세포층으로 단핵구를 모집함으로써 죽상동맥경화증의 악화에 기여한다고 알려져 있다.
따라서, 상기와 같은 분자들은 죽상동맥경화증의 진행을 감소시킬 수 있는 치료용 표적으로 간주되어 왔는데, 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드(P1, P2)가 이러한 분자들의 생산을 저해할 수 있는지 확인해 본 결과, 내피세포에서 본 발명에 따른 펩타이드가 농도 의존적으로 히스타민에 의해 유도된 상기 PGE2, LTB4, MCP-1의 생산을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이와 같은 현상은 COX-2, 5-LO, MCP-1의 발현을 mRNA 및 단백질 수준에서 하강 조절함으로써 이루어짐을 추가적으로 확인할 수 있었다. 그러므로 본 발명에 따른 펩타이드는 COX-2, 5-LO, MCP-1의 발현을 억제함으로써 PGE2, LTB4, MCP-1의 생산을 감소시키고 그 결과 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료용 용도로 활용할 수 있음을 알 수 있었다.
한편, 혈관 부착 분자들은 죽상동맥경화증의 발달과 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진바, 이들 부착 분자들의 생산을 저해한다면 죽상동맥경화증의 진행을 막을 수 있을 것이다. 이러한 관점에서 본 발명자들은 히스타민에 의해 자극된 내피세포에서 P-selectin 및 E-selectin의 생산 및 발현에 있어서 본 발명에 따른 펩타이드가 미치는 영향을 관찰해 본 결과, 이들 펩타이드가 P-selectin 및 E-selectin의 발현을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었고, 이에 따라 단핵구가 히스타민에 의해 자극된 내피세포로 부착하는 것을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.
한편, TLR4의 발현 증가도 죽상동맥경화증의 발달을 증가시키는 요소로 알려져 있는바, 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드(P1, P2)가 히스타민에 의해 자극된 내피 세포에서 TLR4의 발현에 어떠한 영향을 미치는지에 대해 확인해 본 결과, EA. Hy926 세포에서 히스타민에 의해 증가된 TLR4의 발현이 본 발명에 따른 펩타이드에 의해 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
Egr-1(Eraly grwoth respons factor 1)은 죽상동맥경화증의 발달에 있어서 주요 조절자로 알려져 있다. 즉, 징크 핑거 단백질인 Egr-1은 전사인자로써 혈전증과 재협착증, 죽상동맥경화증의 발병에 관여하는 다양한 유전자의 조절 인자로 작용한다. 본 발명자들은 내피 세포에서 히스타민에 의해 증가된 Egr-1의 발현이 본 발명에 따른 펩타이드(P1, P2)에 의해 효과적으로 억제됨을 추가적으로 확인할 수 있었는데, 이는 본 발명에 따른 펩타이드가 Egr-1 발현을 조절하는 전사인자인 c-fos의 단백질 발현을 억제시킴으로써 Egr-1의 발현이 억제됨을 확인하였다.
이와 관련하여, 최근 논문들은 c-fos 및 Egr-1의 발현은 ERK 신호전달 경로에 의해 조절받는다고 발표하고 있는바, 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드(P1, P2)가 ERK 신호전달에 미치는 영향에 대해서도 실험해 보았다. 그 결과, 본 발명에 따른 펩타이드(P1, P2)는 ERK의 인산화를 저해하고, p38 및 JNK의 인산화도 저해하는 것을 확인할 수 있었다. ERK 인산화는 PKC(protein kinase C)의 활성화에 의해 이루어지는바, 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드가 PKC의 활성화에 미치는 영향을 추가적으로 확인해 보았는데, 본 발명에 따른 펩타이드(P1, P2)를 처리한 경우 PKC의 인산화도 효과적으로 저해되는 것을 알 수 있었다.
한편, 활성산소종(ROS)은 죽상동맥경과증과 관련하여 내피세포의 병리학적 징후와 연계된 중요한 요소로 알려져 있는바, 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드가 활성산소종 생산을 저해할 수 있는지 확인해 보았다. 그 결과, 본 발명에 따른 펩타이드는 히스타민에 의해 자극된 내피세포에서 활성산소종의 생산을 효과적으로 차단함을 알 수 있었다.
마지막으로, 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드가 히스타민 수용체의 발현에 미치는 영향을 확인해 보았다. 이는 히스타민은 그 수용체와 함께 내피세포에서 사이토카인, 지질 대사물질, 화학주성인자, 부착 분자 등의 유전자 발현을 유도하는 것으로 알려져 있고, 이들 유전자 발현은 염증 반응 및 죽상동맥경화증을 촉진시키는 것으로 알려져 있기 때문이다. 실험 결과, 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드가 히스타민 수용체인 H1을 효과적으로 차단함으로써 이후의 신호전달 경로의 활성을 방해하는 것을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 실험 결과들을 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드(P1, P2)가 죽상동맥경화증을 포함하는 심혈관 질환에 있어서 효과 좋은 예방 또는 치료용 조성물로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
따라서 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 "치료하는"이란 용어는 "치료"가 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
따라서 포유동물에 있어서 심혈관 관련 질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 심혈관 관련 질환의 발달을 저지시킴,
(2) 심혈관 관련 질환의 확산을 예방함,
(3) 심혈관 관련 질환을 경감시킴,
(4) 심혈관 관련 질환의 재발을 예방함 및
(5) 심혈관 관련 질환의 증상을 완화함(palliating)
본 발명에 따른 스피룰리나 맥시마에서 정제된 펩타이드는 당업계에 공지된 가수분해, 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 가수분해, 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 추출이란 적절한 용매를 이용하여 추출한 것이며, 예를 들어, 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 그러나, 스피룰리나 맥시마에서 추출하지 않은 합성된 펩타이드도 항산화 효과를 가지는 기능성 물질로 활용할 수 있고 별도의 용매를 사용하지 않고 분리 정제한 펩타이드도 본 발명의 기능성 물질로 활용할 수 있을 것이다.
상기 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 기능성 펩타이드는 조성물에 10 내지 200μM 농도로 포함될 수 있으며, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 95 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩타이드를 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩타이드 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 스피룰리나 맥시마 유래의 펩타이드는 천연물질로서 화학약품과 같은 부작용은 거의 없으므로 심혈관 질환의 예방 또는 치료 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명은 스피룰리나 맥시마 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관 관련 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 심혈관 관련 질환의 예방 및 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 스피룰리나 맥시마 유래의 서열번호 1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩타이드를 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩타이드를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 백운풀 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 스피룰리나 맥시마 유래의 서열번호 1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩타이드와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 스피룰리나 맥시마 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩타이드와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
또한, 본 발명은 심혈관 관련 질환의 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 스피룰리나 맥시마 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 정제 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 심혈관 관련 질환의 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 포유동물에게 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 심혈관 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 펩타이드를 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명에 따른 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
1-1. 재료 준비
스피룰리나 맥시마(Spirulina maxima)는 한국 안산에 소재하는 해양 연구소(Marine Instute)로부터 수득하였다. 프로나아제 E(Pronase E), 트립신(trypsin), 알파-키모트립신(alpha=chymotrypsin), 펩신(pepsine)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 분자량에 기초한 가수분해물의 분획을 위한 초미세여과막(ultrafiltration membrane)은 밀리포어 사(Millipore Co., Bedford, USA)에서 구입하였다. DMEM 배지, 소혈청(FBS), 항생제는 Gibco BRL(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. 사이토카인 분석을 위한 효소 면역분석용 시약은 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide), o-프타알데하이드(o-phthalaldehyde), 디니트로페닐-소 혈청알부민(DNP-BSA), 디니트로페닐-특이적 이뮤노글로블린 E(DNP-specific IgE), 3-(4,5-디메틸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT) 등 그 밖에 본 발명에서 이용된 시약들은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
BODIPY® FL 히스타민은 Invitrogen, Molecular Probe (Eugene, OR, USA)에서 구입하였고, 히스타민은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 사이토카인 분석을 위한 효소 면역분석용 시약은 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였고, Oligo (dT) 15 primer, M-MLV reverse transcriptase, GoTaq DNA polymerase는 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하였다. 웨스턴 블라팅을 위한 항원 특이적 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)와 Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. 본 실험에서 사용된 모든 프라이머는 Bioneer (서울 대전 대덕구)에서 합성하였으며, 모든 다른 시약들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
1 -2. 세포배양
인간 제대정맥혈관내피세포(EA. hy926)와 인간 단핵 백혈구 림프종 세포(U937)는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. 상기 세포들은 10% 열-불활성화된 FBS, 2mM L-글루타민, 10 mM HEPES 버퍼, 100 U/ml 페니실린 G, 100 mg/ml 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃ 습식 조건에서 배양하였다.
1-3. 통계분석
각 그룹간의 통계적 차이는 던칸의 다범위 검증을 이용하여 ANOVA 분석하였고, 차이는 p<0.05인 경우 유의성 있는 것으로 고려하였다. 통계용 소프트웨어로는 SAS v9.1(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 사용하였다.
< 실시예 2>
스피롤리나 맥시마( Spirulina maxima ) 유래 펩타이드의 제조
2-1. 효소 가수분해물의 제조
건조된 스피롤리나 맥시나(S. maxima)는 0.1M 인산 나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer)에 녹여 -20℃에서 12시간 동안 보관하였다. -20℃ 동결 및 37℃ 해동을 4번 반복한 후, 혼합액을 1시간 동안 초음파로 분해하고 70℃에서 1시간 동안 열처리하였다. 그 후, 혼합액을 3000 rpm에서 10분간 원심분리하고, 푸른색의 상청액을 회수하여 동결건조하였다. 단백질 추출물은 프로나아제 E(pronase E) 또는 위의 소화효소인 트립신, 알파-키모트립신, 펩신을 이용하여 가수분해 하였다. 프로나아제 E의 가수분해물(SM1)은 프로나아제 E를 이용하여 0.1M 인산 나트륨 버퍼에서 교반하며 50℃, pH 8의 조건에서 8시간 동안 가수분해하여 수득하였고, 위 소화효소에 의한 가수분해물(SM2)은 트립신 및 알파-키모트립신을 이용하여 0.1M 인산 나트륨 버퍼에서 교반하며 37℃, pH 8의 조건에서 4시간 동안 가수분해한 후, 37℃, pH 2의 조건에서 펩신을 이용하여 4시간 동안 교반하며 추가 가수분해하여 수득하였다. 반응은 끓는 온열 수조에서 혼합액을 10분간 열처리하여 종결시켰으며, 감압 동결건조된 가수분해물은 사용시까지 -80℃에서 보관하였다.
2-2. 효소 가수분해물의 분자량에 따른 분획
동결건조된 효소 가수분해물은 증류수에 희석하여 한외여과막 Hollow Fiber Catridge(GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Westborough, MA, USA)를 이용하여 10, 5, 3 kDa을 컷오프로 하여 분자량에 따라 분획하였다. 분획은 10kDa 막을 통과하지 못한 10kDa 이상의 가수분해물, 10kDa 막을 통과하였으나 5kDa 막을 통과하지 못한 5-10kDa의 가수분해물, 5kDa 막을 통과하였으나 3kDa 막을 통과하지 못한 3-5kDa의 가수분해물, 3kDa의 막을 통과한 3kDa 이하의 가수분해물로 분류되었으며 각 분획은 감압동결건조한 후 -20℃에서 보관하고 추가 실험을 진행하였다.
상기 효소 가수분해물의 분자량에 따른 분획 결과, 3kDa 이하의 가수분해물이 가장 효과적으로 히스타민 분비 및 IL-8의 생산을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다(데이타 미도시).
2-3. 생리활성 펩타이드의 정제
2-3-1. 이온교환 크로마토그래피
효소 가수분해물로부터 펩타이드들의 정제는 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC, AKTA, Amersham Biosciences Co., Uppsala, Sweden)를 이용하여 HiPrep 16/10 디에틸아미노에틸 고속 유량(DEAE FF) 음이온-교환 컬럼(16×100mm, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) 상에서 이루어졌다. 가수분해물(40mg/ml)은 20mM 초산 나트륨 버퍼(pH4.0)로 평형이 유지된 HiPrep 16/10 DEAE 음이온 교환 컬럼에 로딩(2ml)하고, 동일 버퍼에 용해된 염화나트륨(0-2M)의 선형 구배를 이용하여 유속 2ml/min로 하여 용리하였다. 각 분획은 280 nm에서 모니터링하고, 4ml 부피로 수집한 후 회전증발기를 이용하여 농축하였다.
상기와 같은 이온교환 크로마토그래피 결과 2번째 분획에서 가장 효과적인 히스타민 분비 억제 및 IL-8 생산 억제 효과를 나타내는 것으로 나타났으며(데이타 미도시), 따라서 상기 분획을 감압동결건조한 후 추가 실험을 진행하였다.
2-3-2. 젤 여과 크로마토그래피
상기 감압동결건조된 분획은 GE Healthcare SuperdexTM Peptide 10/300 GL 젤여과 컬럼(10×300mm)을 이용하여 정제하였다. 상기 컬럼은 인산 나트륨 버퍼(50mM, pH 7)을 이용하여 용리하였고, 분획 1ml을 유량 1ml/min 상에서 수집하였다. 분획은 280nm에서 모니터링한 후, 생리활성 분획을 동결 건조하여 추가 실험을 진행하였다.
상기 이온교환크로마토그래피에 의해 분획한 2번째 분획을 다시 10개로 분획하여 히스타민 분비 억제 및 IL-8 생산 억제 효과를 관찰한 결과, 8번째 분획에서 가장 뛰어난 히스타민 분비 억제 및 IL-8 생산 억제 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다(데이타 미도시).
2-3-3. 고성능 액체 크로마토그래피( HPLC )
상기 젤 여과 크로마토그래피에 의해 수득한 감압동결건조된 분획은 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)를 포함하는 선행 구배 아세토니트릴(0-40%)를 가지고 유량 1ml/min으로 하여 Primesphere 10 C18(10×250mm, Phenomenex, Cheshire, England) 컬럼 상의 역상 HPLC(RP-HPLC, Dionex Korea Ltd., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 추가 정제하였다. 용리 피크는 215nm에서 측정하였고, 활성 피크는 회전증발기를 이용하여 농축한 후 감압 동결건조하였다. 최종 정제된 펩타이드는 아미노산 서열 분석에 사용되었다.
2-4. 아미노산 서열 분석
정제된 펩타이드의 정확한 분자량 및 아미노산 서열은 전자분무이온화(ESI) 소스와 결합된 Q-TOF 질량 분석기(Micromass, Altrincham, UK)를 이용하여 분석하였다. 정제된 펩타이드는 메탄올/물(1:1, v/v)에 용해된 후 전자분무 소스에 주입하고 2가로 대전된 상태 (M+2H)2+로 분자량을 측정하였다. 분자량 측정 후, 펩타이드는 분절하여 직렬질량분광법(tandom mass spectroscopy)에 의해 도 1과 같이 LDAVNR의 펩타이드 서열(서열번호 1) 또는 도 2와 같이 MMLDF와 같은 펩타이드 서열(서열번호 2) 정보를 얻을 수 있었다.
< 실시예 3>
히스타민으로 자극된 상피세포에서 본 발명에 따른 펩타이드가 사이토카인 생산에 미치는 영향 분석
IL-6 및 IL-8은 염증반응에 관여하는 주요 사이토카인으로 죽상동맥경화증을 확인하는 주요 지표 중 하나이다. 또한 PGE 2는 동맥경화반의 불안정성과 연관되어 있다고 보고되고 있고(Gomez-Hernandez et al., 2006), LTB4는 화학주성인자로 관 내피 세포으로 백혈구를 부착시키고, 혈관 투과성을 증가시키며 혈관평활근 세포의 증식과 이동을 촉진하여 동맥경화증후군에서 발현이 증가하는 인자들이다. 한편, MCP-1은 내피하세포층에 단핵 백혈구를 모집하여 죽상동맥경화증의 진행에 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 스피룰리나 맥시마를 가수분해하여 정제된 펩타이드(P1, P2)의 죽상동백경화증 치료 효과를 확인하기 위하여 EA. hy926 세포를 24-웰 플레이트(2×104 cells/ml)에 분주하고, 다양한 농도의 생리활성 펩타이드(50, 100, 200μM)를 12시간 동안 처리한 후, 히스타민(최종 농도, 10μM)으로 20시간 동안 자극하고 상청액을 수집하여 IL-6, IL-8, PGE2, LTB 4, MCP-1의 생산량을 R&D Systems의 프로토콜에 따라 샌드위치 면역분석법을 이용하여 정량화하였다.
그 결과, 펩타이드 처리에 의해 사이토카인 생산량은 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, IL-6의 경우, 히스타민을 처리하지 않은 음성 대조군의 경우 23pg/ml, 히스타민만을 처리하고 펩타이드를 처리하지 않은 양성 대조군의 경우 380pg/ml의 생산량을 나타내었으나, 서열번호 1의 펩타이드를 처리한 경우 148pg/ml, 서열번호 2의 펩타이드를 처리한 경우 112pg/ml로 IL-6의 생산량이 의미있게 감소하였다(도 3A). 한편, IL-8의 경우에도, 히스타민을 처리하지 않은 음성 대조군의 경우 116pg/ml, 히스타민만을 처리하고 펩타이드를 처리하지 않은 양성 대조군의 경우 1624pg/ml의 생산량을 나타내었으나, 서열번호 1의 펩타이드를 처리한 경우 626pg/ml, 서열번호 2의 펩타이드를 처리한 경우 532pg/ml로 IL-8의 생산량이 의미있게 감소되는 것이 관찰되었다(도 3B).
또한, PGE2 및 LTB4 생산에 있어서도, 히스타민을 처리하지 않은 음성 대조군의 경우 각각 135pg/ml, 86pg/ml의 생산량을 나타내고, 히스타민만을 처리하고 펩타이드를 처리하지 않은 양성 대조군의 경우 각각 813pg/ml, 432pg/ml의 생산량을 나타내었으나, 서열번호 1의 펩타이드를 처리한 경우에는 각각 362pg/ml, 195pg/ml, 서열번호 2의 펩타이드를 처리한 경우 각각 302pg/ml, 156pg/ml의 생산량을 나타내어 본 발명에 따른 펩타이드(P1, P2)가 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 PGE2 및 LTB4 생산을 유의하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
마지막으로, MCP-1의 생산에 있어서도 히스타민을 처리하지 않은 경우 71pg/ml의 MCP-1 생산량을 나타내고, 히스타민을 처리한 상피세포의 경우 477pg/ml의 MCP-1 생산량을 나타내어 히스타민 처리에 의한 MCT-1의 생산량이 현저히 증가하였으나, 서열번호 1 및 서열번호 2의 펩타이드를 각각 처리한 경우 233pg/ml, 191pg/ml의 MCP-1의 생산량을 나타내어 히스타민에 의해 자극된 상피세포에서 현저히 증가된 MCP-1의 생산량을 본 발명에 의한 펩타이드가 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다(도 5).
< 실시예 4>
히스타민으로 자극된 상피세포에서 본 발명에 따른 펩타이드가 사이토카인 발현에 미치는 영향 분석
본 발명자들은 상기 <실시예 3>에서 히스타민으로 자극된 상피세포의 사이토카인 생산량이 본 발명에 의한 펩타이드에 의해 현저히 저해되는 효과를 확인한 바, 이러한 효과가 펩타이드의 사이토카인 발현 자체를 저해시키는 것에 기인하는지 확인하고자 웨스턴 블라팅 및 RT-PCR 실험을 진행하였다.
웨스턴 블라팅을 위하여, EA. hy926 세포는 6-웰 플레이트(2×104 cells/ml)에 분주하고, 생리활성 펩타이드(50, 100, 200μM)를 12시간 처리한 후 히스타민(최종 농도 10μM)로 자극하였다. 그 후, 세포를 RIPA lysis buffer (NP-40, Sigma-Aldrich, USA)로 용해하고 동일 양의 단백질을 10% SDS-PAGE 전기영동한 후 니트로셀루로오즈 멤브레인으로 이동시켰다. 상기 멤브레인을 5% (w/v) 소혈청 알부민을 포함하는 TBS-T 버퍼(20 mM Tris, pH 7.6, 0.1% Tween 20)로 블라킹 하고, 적당한 일차 항체(1:1000 희석)으로 1시간 이상 반응시킨 후, TBS-T 버퍼로 3번 세척하고 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated IgG 이차 항체(1:5000 희석)로 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 TBS-T 버퍼를 이용하여 3번 세척하고 면역반응을 나타내는 밴드를 electrochemiluminescence (ECL)를 이용하여 확인하였다. 한편, 핵 단백질의 경우 제조자 방식에 따라 핵 추출 시약(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 추출한 단백질을 웨스턴 블라팅에 활용하였다.
한편, RT-PCR을 위하여 EA. hy926 세포는 6-웰 플레이트(2×104 cells/ml)에 분주하고, 생리활성 펩타이드(50, 100, 200μM)를 12시간 처리한 후 히스타민(최종 농도 10μM)로 자극하였다. 또는 랫 IL-4(10ng/ml)을 이용하여 24시간 동안 민감화하였다. 세포 내 RNA를 제조자 방식에 따라 Trizol 시약으로 추출한 후 cDNA 합성을 위해 총 RNA 중 2㎍을 RNase-free water와 oligo (dT)에 첨가하고 70℃에서 5분간 변성하고, 즉시 냉각하였다. RNA는 1× RT 버퍼, 1mM dNTPs, 500 ng oligo (dT), 140 U M-MLV 역전사 효소, and 40 U RNase 저해제를 포함하는 마스터 믹스를 이용하여 42℃에서 1시간 동안 역전사하였다. 합성된 cDNA를 PCR 분석에 사용하였으며, GAPDH를 대조군으로 사용하였다. 본 발명에 사용된 프라이머 서열은 하기와 같다.
IL-6 sense 5'-AGG-AGA-CTT-GCC-TGG-TGA-AA-3'
IL-6 antisense 5'-CAG-GGG-TGG-TTA-TTG-CAT-CT-3'
IL-8 sense 5'-ATG-ACT-TCC-AAG-CTG-GCC-GTG-GCT-3'
IL-8 antisense 5'-TCT-CAG-CCC-TCT-TCA-AAA-ACT-TCT-C-3'
COX-2 sense 5'-TGA-AAC-CCA-CTCCAA-ACA-CA-3'
COX-2 antisense 5'-GAG-AAG-GCT-TCC-CAG-CTT-TT-3'
5-LO sense 5'-ACC-ATT-GAG-CAG-ATC-GTG-GAC-ACG-C-3'
5-LO antisense 5'-GCA-GTC-CTG-CTC-TGT-GTA-GAA-TGG-G-3'
GAPDH sense 5'-GAG-TCA-ACG-GAT-TTG-GTC-GT-3'
GAPDH antisense 5'-GAC-AAG-CTT-CCC-GTT-CTC-AG-3'
증폭 조건은 95℃에서 45초(변성), 55℃에서 50초(어닐링), 72℃에서 60초 (연장) 조건에서 30 사이클 진행하였으며, 증폭된 산물은 1% 아가로오스 전기영동 하여 1mg/ml EtBr 염색하여 UV를 이용한 AlphaEase® gel image analysis software(Alpha Innotech. San Leandro, CA, USA)로 분석하였다.
그 결과, 히스타민에 의해 증가된 IL-6 및 IL-8의 발현량은 본 발명에 의한 펩타이드(P1, P2)를 처리하자 단백질 및 mRNA 레벨에서 모두 효과적으로 감소하는 것이 확인되었다(도 6).
한편, PGE2 및 LTB4 생산량 감소와 관련하여 이들 분비에 관여하는 COX-2, 5-LO의 발현량을 관찰한 결과 히스타민에 의해 증가된 COX-2 및 5-LO의 발현량은 본 발명에 의한 펩타이드(P1, P2)를 처리하자 단백질 및 mRNA 레벨에서 모두 효과적으로 감소되었다(도 7).
또한, 히스타민에 의해 증가된 MCP-1도 본 발명에 의한 펩타이드(P1, P2)를 처리하자 단백질 및 mRNA 레벨에서 모두 효과적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 8).
< 실시예 5>
히스타민으로 자극된 상피세포에서 본 발명에 따른 펩타이드가 접합분자 형성에 미치는 영향 분석
E-selectin과 P-selectin은 혈관벽에 백혈구를 접합시키는 역할을 하고, 백혈구가 혈관 내피세포에 접합하여 경내피 세포로 이동하면 죽상동맥경화증이 발병하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 접합분자인 E-selectin과 P-selectin의 형성에 본 발명에 의한 펩타이드(P1, P2)가 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 이를 위하여 EA. hy926 세포는 생리활성 펩타이드로 12시간 동안 처리하고, 히스타민(최종 농도 10μM)으로 20시간 자극하였다. 그 후 세포를 세척하고 항-E-셀렉틴 또는 항-P-셀렉틴 항체로 4시간 동안 반응시킨 후 FITC-접합된 2차 항체로 추가 반응하였다. 세포를 세척하고 PBS를 첨가한 후 형광 현미경(CTR 6000, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 형광 이미지를 관찰하였다.
그 결과, 본 발명에 의한 펩타이드를 처리한 경우 히스타민으로 자극된 상피세포의 접합 분자인 E-selectin과 P-selectin의 형성이 현저히 감소됨을 확인할 수 있었다(도 9). 한편, 펩타이드 처리에 따른 E-selectin과 P-selectin의 단백질 및 mRNA 발현량을 상기 <실시예 4>에 기재된 방법에 따라 실험해 본 결과 이들 단백질 및 mRNA 발현량도 펩타이드 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하는 것이 확인되었다(도 10).
< 실시예 6>
히스타민으로 자극된 상피세포에서 본 발명에 따른 펩타이드가 단핵 백혈구 모집에 미치는 영향 분석
본 발명에 의한 펩타이드(P1, P2)가 히스타민에 의해 자극된 상피세포로의 단핵 백혈구 모집을 저해할 수 있는지 관찰하기 위하여 in vitro 접합 실험을 실시하였다.
이를 위하여 U937 세포의 융합성 EA. hy926 세포에 대한 접합은 칼세인의 아세틸 옥시메틸에스테르로 표식된 U937 세포의 형광 신호를 이용하여 측정하였다. 이를 위하여 U937 세포(2×104 cells/ml)를 칼세인-AM(최종 농도 5μM)을 포함하는 배지에 풀어주고 실온 암조건에서 60분간 반응시켰다. 그 후 세포를 세척하고 다시 수를 센 후 배지에 풀어주었다. 이와 동시에 EA. hy926 세포 (2×105 cells/ml)는 생리활성 펩타이(200 μM)로 12시간 동안 처리하고 히스타민(최종 농도 10μM)으로 자극하였다. 그 후, 세포 단층을 세척하고 칼세인-AM-표식된 U937 세포를 1시간 동안 덮어 씌웠다. 결합되지 않은 세포를 제거하기 위하여 2회 세척하고 형광 현미경(CTR 6000, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 형광이미지를 관찰하였다.
그 결과, 히스타민을 처리하지 않은 상피세포에는 단핵 백혈구가 접촉하는 것이 관찰되지 않았으나, 히스타민을 처리하자 단핵 백혈구가 강하게 염색되는 것이 확인되었다. 그러나, 본 발명에 의한 펩타이드와 히스타민을 함께 처리한 상피세포에는 단핵 백혈구가 모집되지 않는 것으로 나타났다(도 11).
< 실시예 7>
히스타민으로 자극된 상피세포에서 본 발명에 따른 펩타이드가 TLR4 발현에 미치는 영향 분석
죽상동맥경화증의 발병 및 진행에 TLR-4가 밀접한 관련이 있다는 상당수의 연구가 진행되어 있다. 따라서 본 발명자들은 죽상동맥경화증에 있어서 본 발명에 따른 펩티아드의 치료 효과를 확인하기 위하여, TLR-4의 발현이 본 발명에 의한 펩타이드에 의해 저해되는지 실험해 보았다. 이를 위하여 EA. hy926 세포를 이용하여 다양한 농도의 펩타이드를 전처리하고 히스타민을 20시간 동안 처리한 후 TLR-4의 단백질 및 mRNA 발현양을 상기 <실시예 4>에 기재된 방식과 같이 관찰하였다.
그 결과, 히스타민에 의해 자극된 TLR-4의 단백질 및 mRNA 발현양은 펩타이드 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 12).
< 실시예 8>
히스타민으로 자극된 상피세포의 Egr -1 발현에 미치는 펩타이드의 영향 분석
본 발명에 의한 펩타이드가 히스타민에 의해 유도된 염증 관련 분자들 및 접합 분자의 생산량과 발현량에 미치는 영향과 관련된 기전을 확인하기 위하여 본 발명자들은 Egr-1의 발현량에 미치는 본 발명에 의한 펩타이드의 영향에 대해 조사해 보았다.
이를 위하여 EA. hy926 세포를 다양한 농도의 펩타이드로 처리하고, 히스타민을 처리한 후 Egr-1의 단백질 발현량 및 mRNA 발현량을 관찰해 본 결과, 본 발명에 의한 펩타이드를 처리하는 경우 Egr-1의 발현량이 단백질 및 mRNA 레벨에서 모두 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 12).
그 결과, 히스타민에 의해 자극된 TLR-4의 단백질 및 mRNA 발현양은 펩타이드 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 13).
< 실시예 9>
히스타민으로 자극된 상피세포에서 본 발명에 따른 펩타이드가 c- fos 발현에 미치는 영향 분석
전사인자인 c-fos는 Egr-1의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명에 의한 펩타이드(P1, P2)의 Egr-1 발현 억제 효과가 c-fos 발현 억제 효과에 기인하는 것인지 확인해 보고자 웨스턴 블라팅을 실시하였다. 그 결과, 펩타이드 처리에 따라 농도 의존적으로 c-fos의 발현량이 감소하는 것이 확인되었다(도 14).
< 실시예 10>
히스타민으로 자극된 상피세포에서 본 발명에 따른 펩타이드가 MAPK 활성에 미치는 영향 분석
MAPK는 전사인자인 c-fos 및 Egr-1의 상위 신호 전달 분자로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명에 의한 펩타이드가 MAPK의 활성에 미치는 영향에 대해 추가적으로 실험해 보았다.
ERK의 인산화를 저해하기 위한 저해자를 처리한 경우 c-fos 및 Egr-1의 단백질 발현이 저해되는 것과 마찬가지로, 본 발명에 의한 펩타이드를 처리한 경우 ERK, p38, JNK를 포함하는 MAPK의 활성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다(도 15). 따라서, 이들 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 의한 펩타이드가 전사인자인 c-fos 및 Egr-1의 발현을 억제하는 효과는 ERK 활성을 억제하는 것에 기인하는 것이라고 결론내릴 수 있었다.
< 실시예 11>
히스타민으로 자극된 상피세포에서 본 발명에 따른 펩타이드가 PKC 활성에 미치는 영향 분석
PKC의 활성은 MAPK 신호전달의 활성을 일으키는바, 본 발명자들은 본 발명에 의한 펩타이드가 PKC 활성에 어떠한 영향을 미치는지 분석해 보았다. 그 결과, 본 발명에 의한 펩타이드를 처리한 경우 농도 의존적으로 PKC의 활성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다(도 16).
< 실시예 12>
히스타민으로 자극된 상피세포에서 본 발명에 따른 펩타이드가 ROS 생산에 미치는 영향 분석
활성산소종은 죽상동맥경화증과 연관된 상피세포의 기능저하와 관련되어 있으며, 죽상동맥경화증의 발병의 주요 원인 중 하나로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 히스타민으로 자극된 상피세포에서 ROS 생성에 대한 본 발명에 다른 펩타이드의 소거활성을 실험해 보았다.
FACs 분석을 위하여 EA. hy926 세포에 생리활성 펩타이드(200 μM)를 12시간 처리하고 5 μM의 DHE 및 DCFH-DA로 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 세포를 세척하고, 히스타민(최종 농도 10μM)을 포함하는 PBS 버퍼에 37℃에서 1시간 동안 풀어주고 유세포분석기(BD Diagnostic Systems, Cockeysville, MD, USA)를 이용하여 분석하였다. 히스토그램 상의 숫자는 ROS 조건에서 DCFH의 산화에 의해 생성된 DCF의 퍼센트를 의미한다.
또한, 형광현미경 관찰을 위하여 EA. hy926 세포에 생리활성 펩타이드(200 μM)를 12시간 처리하고 5 μM의 DHE 및 DCFH-DA로 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 세포를 타이로드 버퍼로 세척하고 히스타민(최종 농도 10μM)으로 1시간 동안 자극한 후 배지를 제거하고 3% 파라포름알데하이드를 30 분간 첨가하고 형광 현미경(CTR 6000, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 형광 이미지를 관찰하였다.
그 결과, 히스타민 처리에 따른 ROS의 양은 0.12%에서 47%로 증가하였으나, 펩타이드를 처리함에 따라 P1 처리시 22%, P2 처리시 15%까지 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 17A). 또한, 형광현미경을 통한 ROS 관찰에서도 펩타이드 처리에 따른 ROS 소거 활성을 관찰할 수 있었다(도 17B).
< 실시예 13>
히스타민으로 자극된 상피세포에서 히스타민 수용체와 히스타민의 결합에 미치는 펩타이드의 영향 분석
본 발명자들은 본 발명에 의한 펩타이드가 히스타민 수용체와의 결합을 통하여 히스타민에 의해 유도되는 신호전달 체계에 영향을 미치는지 확인해 보고자 하였다.
이를 위하여 EA. hy926 세포에 생리활성 펩타이드(200 μM)를 12시간 처리하고 세포를 세척한 후, P1 또는 P2와 FITC-히스타민을 포함하는 cold binding buffer(BD Diagnostic Systems, Cockeysville, MD, USA)에서 풀어 4시간 동안 방치하였다. 그 후 세포를 원심분리로 세척하였으며, cold binding buffer로 다시 풀어주어 유세포분석기(BD Diagnostic Systems, Cockeysville, MD, USA)를 이용하여 분석하였다. 히스토그램 상의 숫자는 히스타민-양성 세포의 퍼센트를 의미한다.
그 결과, H1 및 H2 수용체 특이적 안타고니스트는 모두 상피세포의 히스타민 수용체를 블로킹하여, 형광강도를 94%에서 각각 9%, 11%까지 낮추었다. 한편, 본 발명에 의한 펩타이드인 P1, P2를 처리한 경우에도 형광 강도를 각각 31%, 29%까지 낮추었는데, 이를 통하여 본 발명자들은 본 발명에 의한 펩타이드가 히스타민 수용체를 블로킹 함으로써 신호 전달 체계를 하향조절하는 것을 확인할 수 있었다(도 18).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
P1: 서열번호 1의 펩타이드
P2: 서열번호 2의 펩타이드
<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Composition containing peptides from spirulina maxima for prevention or treatment of Cardiovascular disorders <130> PN1301-027 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Spirulina maxima <400> 1 Leu Asp Ala Val Asn Arg 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Spirulina maxima <400> 2 Met Met Leu Asp Phe 1 5

Claims (12)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 스피룰리나 맥시마(Spirulina maxima) 유래인 것을 특징으로 하는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 IL-6 또는 IL-8의 발현을 억제함으로써 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 PGE2, LTB4 또는 MCP-1의 생성을 저해함으로써 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 COX-2, 5-LO 또는 MCP-1의 발현을 억제함으로써 PGE2, LTB4 또는 MCP-1의 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 P-셀렉틴(P-selectin) 또는 E-셀렉틴(E-selectin)의 생성 또는 발현을 저해함으로써 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 TLR4의 발현을 저해시킴으로써 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 ERK 신호전달 경로를 저해함으로써 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 PKC의 활성화를 저해함으로써 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 활성산소종의 생성을 억제함으로써 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
KR1020130049943A 2013-05-03 2013-05-03 스피룰리나 맥시마 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물 KR101520533B1 (ko)

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