KR20160085149A

KR20160085149A - 매괴화 추출물을 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20160085149A
Application number: KR1020150002183A
Authority: KR
Inventors: 김상찬; 박상미; 조일제; 정지윤; 김영우; 박숙자; 구세광
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2015-01-07
Filing date: 2015-01-07
Publication date: 2016-07-15

Abstract

본 발명은 매괴화 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 매괴화 추출물은 간세포 손상 시 증가하는 형질전환성장인자 베타1(TGF-β1)에 의한 Smad 분자의 인산화를 억제하는 효과가 우수하고 정상 세포에 독성을 유발하지 않는다는 것을 확인함으로써, 간질환 치료제 또는 간질환 예방을 위한 건강기능성 식품의 유효성분으로 사용할 수 있다.

Description

매괴화 추출물을 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising the extract of Rosa rugosa Thunb for preventing or treating liver disease}

본 발명은 매괴화 추출물을 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

간은 인간의 신체장기 중 생체 내 대사가 가장 활발하게 일어나는 장기로, 인체 내 소화기계와 전신순환계 사이에 위치하면서 외부에서 들어온 생체 외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있다. 생체 내로 들어온 생체 외 물질은 일단 간을 통과하게 되므로 간은 영양소 이외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 많아 그만큼 손상될 확률도 매우 높다. 그러나 간은 재생능력이 우수한 장기로 약간의 손상이 있을 경우에는 충분히 정상으로 회복되지만, 손상이 지속될 경우에는 간 조직의 일부가 완전히 파괴되고 간 기능도 저하되는 등 정상간으로의 회복이 어려운 상태가 된다. 이러한 간 손상이 만성화되면 그 원인에 상관없이 간 섬유화 또는 간경화, 간암으로 진행된다.

한편, 간 손상을 유발하는 원인으로는 스트레스성 만성 피로 및 지방성분이 포함된 음식 또는 알콜의 과다 섭취, 바이러스의 감염, 각종 약품과 같은 유해물질, 영양부족 등 다양하다.

이러한 간 손상에 의한 간 질환을 치료하기 위한 방법으로는 크게 식이요법과 약제요법이 사용되고 있으며, 이 2가지 방법이 병용되고 있다. 또한, 대표적인 간 질환 치료제로는 실리마린(silymarin)과 비페닐디메칠디카르복실레이트(biphenyl dimethyl dicarboxylate, BDD)가 있으나, 이들 약물 역시 근복적인 치료제가 되지는 못하고 있으며, 이 외 개발된 화합물에 의한 치료제는 체내 다양한 부작용을 유발할 수 있어 제품화 되지 못하고 있는 실정이다.

따라서, 종래 치료제를 대체할 수 있을 만큼 치료효과가 우수하며, 대량 또는 장기간 투여 시에도 부작용이 없는 천연물을 이용한 새로운 간질환 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 매괴화는 장미과 식물 해당화(Rosa rugosa Thunb.)의 갓핀 꽃을 말한다. 매괴화의 신선한 꽃에는 정유(精油) 약 0.03%가 함유되어 있고 그 주요 성분은 citronellol, geraniol, nerol, eugenol, phenyl ethyl alcohol 등이 포함되어 있으며, Citronellol의 함유량은 60%에 달하고, geraniol 함량이 그 다음이며, nerol은 5-10%이고, eugenol과 phenyl ethyl alcohol의 함량은 각각 1%로 함유되어 있다. 이외에도 고미질(苦味質), tannin, fat, gallic acid, cyanin, 황색소(黃色素), wax, β-carotene이 함유되어 있다.

이러한 매괴화는 이기(理氣), 해울(解鬱)하고 화혈산어(和血散瘀)하는 효능과, 월경 불순의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 폐병으로 인한 해수(咳嗽)와 각혈(血)을 낫게 하는 효능이 있는 것으로 알려져 있을 뿐, 간질환 치료를 위한 효능에 대해서는 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 매괴화 추출물이 간세포 손상 시 증가하는 TGF-β1에 의한 Smad 분자의 활성 억제 활성을 가지고 있어 간질환 치료 및 예방을 위한 소재로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국공개특허 제2003-0036589호 2. 대한민국공개특허 제2007-0032520호

본 발명의 목적은 매괴화 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 매괴화 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 매괴화 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 물, C1~C4 의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 이용하여 수득할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총 중량%에 대해 0.1 내지 50 중량%로 함유될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간질환은 간경화, 간섬유증, 급성간염, 만성간염 또는 간암일 수 있다.

또한, 본 발명은 매괴화 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 물, C1~C4 의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 이용하여 수득한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태의 식품일 수 있다.

본 발명은 매괴화 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 매괴화 추출물은 간세포 손상 시 증가하는 형질전환성장인자 베타1(TGF-β1)에 의한 Smad 분자의 인산화를 억제하는 효과가 우수하고 정상 세포에 독성을 유발하지 않는다는 것을 확인함으로써, 간질환 치료제 또는 간질환 예방을 위한 건강기능성 식품의 유효성분으로 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 매괴화 추출물 (RRE)의 세포독성 여부를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 매괴화 추출물 (RRE)의 TGF-β1로 유도된 SBE의 유전자 활성 억제 효과(2A)와 TGF-β1로 유도된 Smad2 및 Smad3 인산화에 대한 억제 효과(2B)를 나타낸 것이다.
도 3은 매괴화 추출물 (RRE)의 TGF-β1로 유도된 PAI-1의 mRNA 발현 (3A) 및 단백질 발현(3B) 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 매괴화 추출물 (RRE)의 TGF-β1로 유도된 MMP-2 및 MMP-9의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 매괴화 추출물 (RRE)의 TGF-β1로 유도된 α-SMA의 단백질 발현 억제 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 간질환을 예방 또는 치료할 수 있는 유효성분으로 매괴화 추출물을 사용할 수 있음을 최초로 규명한 점에 특징이 있다.

앞서 종래기술에서도 기술한 바와 같이, 현재 사용되고 있는 간질환 치료제들의 경우 근본적인 치료가 이루어지지 않아 약학적 효능이 미비하며 체내 부작용을 초래하기 때문에 천연물을 기반으로 한 새로운 간질환 치료제를 발굴하려고 노력하던 중, 본 발명자들은 매괴화 추출물을 사용할 수 있음을 실험을 통해 확인하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 매괴화 추출물은 간 손상을 유발하는 원인이 되는 형질전환성장인자 베타1(TGF-β1)에 의한 Smad 분자의 활성억제 효능과 Smad 분자의 표적유전자인 PAI-1의 생성억제 효능이 우수한 것으로 나타났다(실험예 2 및 3 참조).

참고로, 간세포의 손상으로 야기되는 염증 반응은 휴지기의 간성상세포를 활성화하여 세포외기질과 다양한 사이토카인(cytokine) 및 케모카인(chemokine)들을 분비하게 하는데 그 중 형질전환성장인자 베타1(TGF-β1)은 많은 세포들에서 강력한 성장억제제로 작용하고 세포외기질 생성을 자극한다. 특히 간섬유화 과정에서 TGF-β1이 활성화되면 간 성상세포에서 콜라겐의 생성과 축적을 포함한 세포외 기질의 리모델링이 증가하여 간섬유화가 진행되고 간경화로 발전되어 간의 기능을 잃게 된다(Cho IJ, Kim YW, Han CY, et al., E-cadherin antagonizes transforming growth factor β1 gene induction in hepatic stellate cells by inhibiting RhoA-dependent Smad3 phosphorylation, Hepatology. 2010;52(6):2053-2064).

따라서 TGF-β1 및 TGF-β1에 의한 활성 인자들을 억제하는 억제제의 경우, 간질환 치료를 위한 치료제로 사용할 수 있다.

나아가 간손상을 주는 원인인자가 일시적인 경우에는 상처치유를 위해 활성화된 간 성상세포가 세포자멸사(apoptosis) 과정을 거치게 되고 MMP(matrix metalloproteinases)에 의해 증가된 세포외기질(extracellular matrix, ECM)이 분해되어 손상을 받기 전의 정상 간으로 복원되도록 되어 있다. 그러나 간손상이 지속적으로 일어날 경우에는 ECM 축적이 과도하게 일어나 영구적인 반흔이 생기게 되고 반흔을 구성하는 ECM에 의해서 간세포들이 둘러싸여 결절이 생기게 되어 병리학적으로 비가역적인 간경화로 진행하게 된다(Friedman SL, Liver fibrosis - from bench to bedside, J Hepatol. 2003;38 Suppl 1:S38-53).

따라서 지속적인 간 손상 시, 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 축적을 억제할 수 있도록 MMPs의 활성을 억제한다면 간 손상을 감소시킬 수 있다. 이러한 점에서 본원발명의 매괴화 추출물은 TGF-β1에 의해 유도되는 ECM 재배열 관련 유전자인 MMP2와 MMP9를 유전자 발현 수준에서 억제하는 것으로 나타났다(실험예 5 참조).

그러므로 본 발명의 매괴화 추출물은 형질전환성장인자 베타1(TGF-β1) 및 TGF-β1에 의해 간손상에 영향을 주는 인자들의 발현 및 활성을 억제하는 효과가 우수하므로 간질환 치료제의 주요 소재로 활용할 수 있으므로, 본 발명은 매괴화 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 매괴화 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 매괴화를 대상으로 추출물을 분리 및 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 매괴화로부터 추출할 수 있다. 이때 추출물을 수득하기 위해 사용할 수 있는 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 매괴화 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

바람직하게는 용매로서 물을 이용하고 열수추출법으로 매괴화 추출물을 수득할 수 있다.

또한 상기 본 발명의 약학적 조성물은상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 매괴화 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 50 중량%로 포함될 수 있다.

이러한 본 발명의 매괴화 추출물이 치료, 예방, 개선할 수 있는 상기 간질환은 이에 제한되지는 않으나, 간경화, 간섬유증, 급성간염, 만성간염 또는 간암일 수 있다.

특히 본 발명의 매괴화 추출물은 TGF-beta1의 작용을 억제하여 간 손상을 보호하는 효과가 있는데, 최근 TGF-beta1이 간섬유화 및 간경화의 중요 매개물로 밝혀진 바 있다.

상기 기술된 간질환 중, 간경화는 만성적인 염증으로 인해 정상적인 간조직이 광범위하게 파괴된 결과로 섬유조직의 증식과 재생성 결절 형성의 형태학적 특징을 보이며, 2차적으로 간 내 혈관의 변형 및 간기능의 저하가 초래되는 질병이다(Bataller B, Brenner DA. Hepatic Fibrosis. In : Arias IM et al., The liver biology and pathobiology. 5th ed. Wiley-Blackwell, 2009, p.433-452). 간경화의 증상은 매우 다양하게 나타나는데 피부에 거미상 혈관이 나타나거나, 호르몬 대사의 이상으로 손바닥이 정상인보다 붉어지고, 남성에서는 여성호르몬이 파괴되지 않아 가슴이 커지며 성기능이 저하될 수 있다. 비장이 커지면서 왼쪽 옆구리에서 만져질 수 있고, 복수가 차고 양쪽 다리가 부을 수 있으며, 피부 바깥쪽까지 확장된 혈관이 튀어나올 수 있다. 또한 간기능의 저하로 황달이 나타날 수 있고, 간성혼수(hepatic coma)로 인해 인격이 변하거나 의식을 잃을 수도 있다. 식도정맥류 출혈 등이 발생하면 피를 토하거나 흑변, 혈변이 보일 수도 있다(Goldmann DR, Complete home medical guide, DK publishing, 2003, p.643-651).

이러한 간경화는 섬유조직의 증식 및 재생성 결절을 나타내는 질환으로 정상상태로 되돌리는 것은 불가능하며, 간경화에 대한 치료는 완치를 목적으로 하는 것이 아닌 현재의 간기능을 최대한 활용할 수 있도록 하는 것이다. 바이러스 성 간경화의 경우, 그 원인을 억제하기 위한 페그인터페론(Peginterferon)이나 항바이러스제 등의 약물을 사용할 수 있으나, 간경화를 적극적으로 치료하기 위한 치료제는 없는 실정이다.

또한, 간섬유화(간섬유증)는 결합조직의 합성 및 분해 과정의 균형이 상실된 상태로서, 간 조직 내에 결합조직이 과도하게 축적되어 발생되며 괴사나 염증이 동반된다. 특히 간에서 간기능이 정상적인 상태에서 비타민 A를 저장하는 역할을 하는 간성상세포(hepatic stellate cells : HSCs)는 급 만성 간 손상에 의해 근섬유아세포(myofibroblast) 형태로 전이되고 급속히 증식하여 콜라겐(collagen), 프로테오글리칸(proteoglycan), 히알유로난(hyaluronan) 등과 같은 세포외 기질의 생성을 증가시키고 이동시켜 과도한 결합조직을 생성함으로써 간의 섬유화 과정을 진행시키는 것으로 알려져 있다[Friedman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82: 8681 (1985) Gressner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151: 222 (1988) Gressner et al., J. Hepatol., 22: 28 (1995)]. 이 과정에서 TGFβ는 간조직 내의 여러 세포들, 특히 쿠퍼 세포나 TGFβ에 의해 활성화된 간성상세포로부터 생성 및 분비, 활성화되어 간성상세포의 증식과 분화를 유도하며 이로 인해 콜라겐과 같은 세포외 기질 (extracellular matrix)의 과생산과 축적을 유발하는 중요한 역할을 하게 된다. 간섬유화나 간경화와 같은 만성 간질환에서 TGFβ는 섬유화가 진행되고 있는 간 조직에서만 발현되어 세포외 기질을 증가시켜 간섬유화 진행을 촉진시키는 역할을 한다고 알려져 있기 때문에[[Bauer and Schuppan, FEBS Lett. 502:1-3 (2001); Bedossa and Paradis, J Hepatol., 22(Suppl. 2):37-4 (1995)], TGFβ의 활성 억제 및 TGFβ 로 인한 간손상 신호전달 매개물질을 조절함을 통해 이러한 간질환을 치료할 수 있다.

간암 역시 상기 기술된 간손상 질환인 간경화 및 간섬유화와 같은 증상이 악화되고 간 손상의 지속적인 원인 작용으로 발병될 수 있어, 본 발명의 매괴화 추출물은 간암의 치료에도 효과적일 수 있다.

나아가 본 발명의 조성물은 간질환 치료 및 예방을 위한 약학적 조성물 이외에도 식품 조성물로 사용될 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 매괴화 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 매괴화 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 매괴화 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 간손상을 개선 및 예방하기 위한 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 매괴화 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 매괴화 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 매괴화 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 매괴화 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 매괴화 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태로 제조될 수 있으며, 예로 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 참고예 >

재료 및 시약준비

형질전환성장인자 베타1(transforming growth factor beta 1, TGF-β1)는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였고, 소혈청(fetal bovine serum, FBS), 페니실린, 스트렙토마이신은 Gibco/BRL(Eggenstein, Germany)에서 구입하였으며, L-글루타민은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. Smad 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA), PAI-1 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 하기 실시예와 실험예에서 사용하였다.

< 실시예 1>

매괴화 추출물의 제조

매괴화는 대원약업사(Daegu, Korea)에서 구입하여 물로 세척하여 음건한 후 건조중량 100g에 1.3L의 물을 첨가하고 3시간 동안 전탕하였다. 이후 수득한 추출액을 여과지(No.2 filter paper, Nalgene, New York, NY, USA)를 사용하여 여과한 후 진공회전농축기(EYELA CCA-1110, SER.NO.10406050, Tokyo, Japan)로 농축하여 28.5g(수율 28.5%)의 매괴화 추출물을 수득하였으며 하기 실험예에 사용하였다.

< 실험예 1>

매괴화 추출물이 간 성상세포( LX -2 cell )에 미치는 영향

상기 실시예 1에서 수득한 매괴화 추출물이 간 성상세포(LX-2 cell, 서울대학교 약학대학에서 기증 받음)의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 하기와 같이 실험하였다.

간 성상세포(LX-2 cell)를 10% 소혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 1% L-글루타민을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco/BRL, Eggenstein, Germany) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 세포배양기(Sanyo, Japan)에서 배양하면서 실험에 사용하였다. 간 성상세포(LX-2 cell)를 24 well plate에 5×10⁴ cells/well로 분주한 다음 매괴화 추출물을 농도별로 처리하고 세포 생존율을 측정하였다. 배양 후 생존세포에 3-(4,5-(디메틸티아졸(dimethylthiazol))-2-yl)-

2,5-디페닐테트라졸리움(diphenyltetrazolium)(MTT, Sigma, St. Louis, MO, USA) 1.0mg/ml을 300μl 넣고 4시간 동안 배양한 후 배지를 조심스럽게 제거하고 생성된 포마잔 크리스탈(formazan crystals)을 DMSO에 녹여 티테르텍 멀티스칸 오토메틱 엘라이자 마이크로플레이트 리더기(Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader, Model MCC/340, Huntsville, AL)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포생존율은 하기 수학식 1에 나타난 공식을 사용하여 대조군 세포(control cell)에 대한 백분율로 나타내었으며 하기 수학식에서 실험군 시료는 본 발명의 매괴화 추출물을 농도별로 처리한 군을 말한다.

<수학식 1>

세포 생존율(Viability; % of control)= (실험군 시료의 흡광도)/(대조군의 흡광도) x 100

분석 결과, 매괴화 추출물을 10, 30, 100μg/ml의 농도로 24시간 처리 시 매괴화 추출물은 세포에 대해 거의 세포독성을 나타내지 않았으며, 300μg/ml의 고농도에서도 약간의 세포독성을 나타내었다(도 1 참조). 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 매괴화 추출물이 체내 안정하며, 정상적인 간세포에는 독성을 유발하지 않으므로 간 질환 치료 및 개선을 위한 치료제 또는 건강기능식품의 유효성분으로 안심하고 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실험예 2>

매괴화 추출물이 TGF -β1에 의한 Smad 분자 활성화에 미치는 영향

상기 실시예 1에서 수득한 매괴화 추출물이 간 손상이 유발되면 증가되는 TGF-β1에 의한 활성화 지표인 대표적인 전사인자 Smad 분자 활성에 영향을 미치는지 확인하기 위해 Smad 결합영역 (Smad bindin element, SBE)을 포함한 리포터 유전자 분석법 및 웨스턴 블롯으로 하기와 같이 실험하였다.

먼저, 리포터 유전자 분석법은 Smad 결합영역을 포함하는 리포터 유전자(p-GL4.48, promega, Madison, WI, USA)를 간 성상세포주인 T-HSC/Cl-6에 FugeneHD 리포펙타민 시약을 이용하여 형질도입하였고, 하이그로마이신(hygromycin)으로 형질도입된 세포를 스크리닝하여 p-GL4.48 플라스미드를 안정적으로 발현하는 재조합 세포주를 제작하였다. 제작된 재조합 세포주에 매괴화 추출물 10, 30, 100 μg/ml을 30분간 각각 전처리한 후, TGF-β1 5ng/ml을 12시간 동안 처리하였다. 이후 이들 세포를 라이시스(lysis)시킨 후 루시퍼레이즈 리포터 어세이 시스템 키트(Luciferase Reporter Assay System^TM, Promega Co.)를 사용하여 티테르텍 멀티스칸 오토메틱 엘라이자 마이크로플레이트 리더기(Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader, Model infinite M200, Huntsville, AL)로 리포터 유전자 발현의 활성도를 측정하였다. 측정된 루시퍼레이즈 활성은 세포 조추출액중의 총단백질량으로 보정하였다.

또한, 웨스턴 블롯은 간 성상세포(LX-2 cell)에 매괴화 추출물 10, 30, 100μg/ml 및 TGF-β1 5ng/ml을 1시간 동안 병용처리한 후 라이시스(lysis) 버퍼 [20mM Tris Cl (pH 7.5), 1% 트리톤 엑스-100(Triton X-100), 137mM 염화나트륨(sodium chloride), 10% 글리세롤(glycerol), 2mM EDTA, 1mM 오소바나데이트 나트륨(sodium orthovanadate), 25mM 베타 글리세로포스페이트(b-glycerophosphate), 2mM 피로인산나트륨(sodium pyrophosphate), 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(phenylmethylsulfonylfluoride), 1mg/ml 류펩틴(leupeptin)] 100μl를 넣고 스크래퍼(scrapper)로 긁어 15,000×g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 이후 정량한 단백질 50μg을 취하여 10% SDS-PAGE에 전기영동시킨 후 니트로세룰로즈(Nitrocellulose) 지에 전이시키고 p-Smad2, p-Smad3 및 Smad2/3 항체와 반응시킨 후, 이어 2차 항체인 서양고추냉이 퍼록시다아제 공액 앤티-래빗 IgG(horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG) 항체와 함께 반응시켰다. ECL 발색시약(ECL detection reagents, Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 p-Smad2, p-Smad3 및 Smad2/단백질의 발현 정도를 확인하였고 밀도 분석(Densitometric analysis)을 위해 이미지 분석기(Image analyzing system, ultra-Violet Products Ltd., Upland, CA, USA)를 사용하여 분석하였다.

이상과 같은 분석 방법에 의해 분석한 결과, 리포터 유전자 분석법의 경우, TGF-β1로 유도된 Smad 결합영역 (Smad bindin element, SBE)의 유전자 발현활성이 매괴화 추출물에 의하여 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났으며(도 2A 참조), 웨스턴 분석 결과, TGF-β1에 의해 증가하는 Smad2 및 Smad3의 인산화가 매괴화 추출물에 의하여 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다(도 2B 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 매괴화 추출물이 TGF-β1에 의한 Smad의 유전자 발현을 억제하는 것으로 나타났고, Smad2 및 Smad3의 인산화 억제를 통해 이들 단백질의 활성을 억제하는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 3>

매괴화 추출물이 PAI -1 생성 억제에 미치는 영향

매괴화 추출물에 의한 Smad 분자의 활성 억제가 표적유전자의 발현을 직접적으로 억제할 수 있는지 확인하기 위해 프로모터 내 SBE를 가지고 있는 대표적인 표적유전자인 plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)의 발현조절을 관찰하였다. 이를 위해 본 발명의 매괴화 추출물이 간 손상을 유도하는 TGF-β1의 활성화로 생성된 PAI-1를 억제할 수 있는지를 real time RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 하기와 같이 실험하였다.

Real time RT-PCR은 간 성상세포(LX-2 cell)를 매괴화 추출물 10, 30, 100μg/ml 및 TGF-β1 5ng/ml과 병용처리한 후 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. 분리한 총 RNA 중 PAI-1 mRNA를 cDNA로 전환한 후 PAI-1 선택적인 polymerase chain reaction)으로 DNA를 증폭하였다. Real time RT-PCR을 위해 사용한 PAI-1의 프라이머 서열은 표 1과 같다.

프라이머 서열

타겟유전자	프라이머 서열	사이즈(bp)
PAI-1	센스 : TCGTCCAGCGGGATCTGA	512
PAI-1	안티센스 : CCTGGTCATGTTGCCTTTC	512

또한, 웨스턴 블롯은 간 성상세포(LX-2 cell)에 매괴화 추출물 10, 30, 100μg/ml 및 TGF-β1 5ng/ml을 24시간 동안 병용처리한 후 라이시스(lysis) 버퍼 [20mM Tris Cl (pH 7.5), 1% 트리톤 엑스-100(Triton X-100), 137mM 염화나트륨(sodium chloride), 10% 글리세롤(glycerol), 2mM EDTA, 1mM 오소바나데이트 나트륨(sodium orthovanadate), 25mM 베타 글리세로포스페이트(b-glycerophosphate), 2mM 피로인산나트륨(sodium pyrophosphate), 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(phenylmethylsulfonylfluoride), 1mg/ml 류펩틴(leupeptin)] 100μl를 넣고 스크래퍼(scrapper)로 긁어 15,000×g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 debris를 제거하였다. 정량한 단백질 50 μg을 취하여 10% SDS-PAGE에 전기영동시킨 후 니트로세룰로즈(Nitrocellulose) 지에 전이시켜 PAI-1 항체와 결합시키고 이어 2차 항체인 서양고추냉이 퍼록시다아제 공액 앤티-래빗 IgG(horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG) 항체와 함께 반응시켰다. ECL 발색시약(ECL detection reagents, Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 단백질의 발현 정도를 확인하고 밀도 분석(Densitometric analysis)을 위해 이미지 분석기(Image analyzing system, ultra-Violet Products Ltd., Upland, CA, USA)를 사용하였다.

분석 결과, TGF-β1로 유도된 PAI-1의 mRNA 발현은 본 발명의 매괴화 추출물 처리에 의해 감소하는 것으로 나타났으며(도 3A 참조), 이러한 결과는 PAI-1을 유전자 수준에서 뿐만 아니라 PAI-1의 단백질 수준에서도 발현을 억제하는 것으로 나타났다(도 3B 참조).

< 실험예 4>

매괴화 추출물이 MMPs 생성 억제에 미치는 영향

상기 실시예 1에서 수득한 본 발명의 매괴화 추출물이 간 손상 시 증가되는 TGF-β1에 의해 발현이 증가되는 것으로 알려진 ECM 재배열 관련 유전자의 발현에도 영향을 미치는지 확인하기 위해 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현을 real time RT-PCR로 하기와 같이 실험하였다.

Real time RT-PCR은 간 성상세포(LX-2 cell)를 매괴화 추출물 10, 30, 100μg/ml 및 TGF-β1 5ng/ml과 병용처리한 후 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. 분리한 총 RNA 중 MMP-2 및 MMP-9 mRNA를 cDNA로 전환한 후 MMP-2 및 MMP-9 선택적인 프라이머(primer)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction)으로 DNA를 증폭하였다. Real time RT-PCR을 위해 사용한 MMP-2 및 MMP-9의 프라이머 서열은 표 2과 같다.

타겟유전자	프라이머 서열	사이즈(bp)
MMP-2	센스 : GTATTTGATGGCATCGCTCA	196 bp
	안티센스 : CATTCCCTGCAAAGAACACA
MMP-9	센스 : CACTGTCCACCCCTCAGAGC	263bp
	안티센스 : GCCACTTGTCGGCGATAAGG

분석결과, TGF-β1로 유도된 MMP-2 및 MMP-9의 mRNA 발현이 본 발명의 매괴화 추출물 처리에 의해 감소하는 것으로 나타났으며, 감소 정도는 추출물의 처리 농도에 비례하는 것으로 나타났다(도 4 참조).

< 실험예 5>

매괴화 추출물이 α- SMA 생성 억제에 미치는 영향

본 발명의 매괴화 추출물이 간 손상을 유도하는 TGF-β1의 활성화로 생성된 간 성상세포의 활성화 지표인 α-smooth muscle actin(α-SMA)에 미치는 영향을 확인하기 위해 웨스턴 블롯으로 하기와 같이 실험하였다.

즉, 간 성상세포(LX-2 cell)에 매괴화 추출물 10, 30, 100μg/ml 및 TGF-β1 5ng/ml을 24시간 동안 병용처리한 후 라이시스(lysis) 버퍼 [20mM Tris Cl (pH 7.5), 1% 트리톤 엑스-100(Triton X-100), 137mM 염화나트륨(sodium chloride), 10% 글리세롤(glycerol), 2mM EDTA, 1mM 오소바나데이트 나트륨(sodium orthovanadate), 25mM 베타 글리세로포스페이트(b-glycerophosphate), 2mM 피로인산나트륨(sodium pyrophosphate), 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(phenylmethylsulfonylfluoride), 1mg/ml 류펩틴(leupeptin)] 100μl를 넣고 스크래퍼(scrapper)로 긁어 15,000×g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 debris를 제거하였다. 정량한 단백질 50 μg을 취하여 10% SDS-PAGE에 전기영동시킨 후 니트로세룰로즈(Nitrocellulose) 지에 전이시켜 α-SMA 항체와 결합시키고 이어 2차 항체인 서양고추냉이 퍼록시다아제 공액 앤티-래빗 IgG(horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG) 항체와 함께 반응시켰다. ECL 발색시약(ECL detection reagents, Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 단백질의 발현 정도를 확인하고 밀도 분석(Densitometric analysis)을 위해 이미지 분석기(Image analyzing system, ultra-Violet Products Ltd., Upland, CA, USA)를 사용하였다.

분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, TGF-β1로 유도된 α-SMA의 단백질 발현을 본 발명의 매괴화 추출물이 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.

이상과 같은 실험결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 매괴화 추출물이 간 손상, 특히 TGF-β1으로 이한 간 손상을 매우 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었고, TGF-β1에 의한 하위 신호 전달과 관련된 다양한 인자들의 발현 및 활성을 조절하여 간 손상을 회복, 개선 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

매괴화 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 물, C1~C4 의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 이용하여 수득한 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 조성물 총 중량%에 대해 0.1 내지 50 중량%로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 간질환은 간경화, 간섬유증, 급성간염, 만성간염 또는 간암인 것을 특징으로 하는 조성물.
매괴화 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제5항에 있어서,
상기 추출물은 물, C1~C4 의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 이용하여 수득한 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
제5항에 있어서,
상기 간질환은 간경화, 간섬유증, 급성간염, 만성간염 또는 간암인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
제5항에 있어서,
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태의 식품인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.