CN115887542A

CN115887542A - 玫瑰花乙醇提取物在制备抗肝纤维化药物或保健食品中的用途

Info

Publication number: CN115887542A
Application number: CN202211474202.0A
Authority: CN
Inventors: 舒广文; 雷霄; 邓旭坤
Original assignee: South Central University for Nationalities
Current assignee: South Central Minzu University
Priority date: 2022-11-22
Filing date: 2022-11-22
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明涉及中药应用与保健食品技术领域，公开了一种玫瑰花乙醇提取物(ethanol extract of Rosa rugosa，ERS)的用途——ERS在单独使用时既可以缓解四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化，也可以阻断LX‑2肝星状细胞活化。ERS能明显缓解肝纤维化模型小鼠肝脏肿胀，肝脏表面粗糙、肝微结构破坏、细胞外基质过度沉积等病变。ERS还能明显抑制活化LX‑2肝星状细胞的迁移与增殖并下调细胞内活化标志蛋白α‑SMA和collagen I的表达水平。

Description

玫瑰花乙醇提取物在制备抗肝纤维化药物或保健食品中的用途

技术领域

本发明涉及中药应用与保健食品技术领域，特别涉及玫瑰花乙醇提取物的用途。

背景技术

肝纤维化是一种由细胞外基质在肝脏中过度沉积而导致的疾病。如不及时干预，肝纤维化可能会恶化形成一系列致命的晚期肝脏疾病。肝脏由多种细胞构成，主要包括肝细胞、肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)、枯否细胞和窦内皮细胞等。肝星状细胞约占所有肝细胞的10％。在正常肝脏中，肝星状细胞是静止的。静止肝星状细胞的主要功能在于储存维生素A、支持肝脏再生和免疫调节。发生肝损伤后，肝星状细胞被激活。活化的肝星状细胞能大量产生细胞外基质成分，主要包括I型胶原(collagen I)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。由肝星状细胞活化而大量产生的细胞外基质成分导致了肝纤维化。因此，目前普遍认为肝星状细胞活化是肝纤维化的基础。

申请公布号为CN111249410A的中国发明专利公开了一种保肝解毒排脂防治肝损伤回复肝功能的药膳饮料，是将原料中的水飞蓟籽油、枸杞子、人参、桑椹子、余甘子、乌梅、木瓜、佛手、玫瑰花、麦芽、代代花、桃仁、荷叶、茶叶、沙棘、决明子、金银花、蒲公英、枳椇子、山楂、葛根、菊花、罗汉果、茯苓依法制得。中药材玫瑰花是蔷薇科植物玫瑰(Rosa rugosa)的干燥花蕾。尽管目前已知的一些抗肝损伤药物中含有玫瑰花成分，但玫瑰花在这些组合物中的含量很少，尚不能据此判定玫瑰花本身是否具有缓解肝损伤的活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种玫瑰花乙醇提取物(ethanol extract of Rosarugosa，ERS)的用途。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：玫瑰花乙醇提取物在制备抗肝纤维化药物或保健食品中的用途。

本发明的进一步设置为：玫瑰花乙醇提取物作为唯一的原料药在制备抗肝纤维化药物或保健食品中的用途。

本发明的进一步设置为：所述玫瑰花乙醇提取物采用如下方法制备得到：以干燥玫瑰花蕾为原料，粉碎后按每1g玫瑰花粉末溶于20mL的85％乙醇的比例，室温浸泡4h，随后40℃超声提取30min，收集提取液；残渣用相同的条件再提取两次，合并三次提取所得的提取液；减压蒸发除溶剂，冷冻真空干燥即得玫瑰花乙醇提取物粉末；其中的主要特征性化学成分有没食子酸、槲皮素-3-O-槐糖苷、山柰酚-3-O-槐糖苷、鞣花酸和山柰酚-3-O-洋槐糖苷。

本发明的进一步设置为：所述用途表现为玫瑰花乙醇提取物可显著改善肝纤维化模型动物肝脏肿胀，肝脏表面粗糙、肝微结构破坏、细胞外基质过度沉积、肝纤维化表征因子α-SMA和collagen I表达上调等病变。

本发明的进一步设置为：所述用途表现为玫瑰花乙醇提取物可改善肝纤维化模型动物肝脏肿胀，肝脏表面粗糙、肝微结构破坏、细胞外基质过度沉积或肝纤维化表征因子α-SMA和collagen I表达上调中的一种或多种病变。

本发明的进一步设置为：所述用途表现为玫瑰花乙醇提取物抑制活化LX-2肝星状细胞的增殖和迁移能力，下调LX-2细胞内活化标志蛋白α-SMA和collagen I的表达水平。

本发明的进一步设置为：所述药物或保健食品是以玫瑰花乙醇提取物作为唯一原料药制备而成的制剂，或加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

本发明的有益效果是：

1.蔷薇科植物玫瑰(Rosa rugosa)的干燥花蕾在中药、保健食品领域具有较为广泛的用途。本发明公开了玫瑰花乙醇提取物(ethanol extract of Rosa rugosa，ERS)的一种新用途——ERS在单独使用时既可以缓解四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化，也可以阻断LX-2肝星细胞活化。

2.本发明主要针对ERS在缓解肝纤维化中的应用。虽然，现有研究中存在将ERS与其他多种药物配伍实用来治疗肝病的研究，但仅能说明ERS在与其它原料配伍使用时具有治疗肝硬化的作用，而且，在这种配伍使用中，ERS用量比例非常小，其仅作为一种配料使用。

3.并且，现有研究中没有提到ERS通过阻断LX-2肝星细胞活化而达到缓解肝纤维化的应用。肝损伤分为很多种，肝纤维化是肝损伤中的一种，本发明将ERS用于阻断LX-2肝星细胞活化，从而达到治疗肝纤维化的效果，可对治疗由肝纤维化而导致的肝损伤提供更具有针对性的治疗方案。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：小鼠肝脏外观(a)；肝组织切片HE、天狼星红和Masson染色图(b)；免疫组化检测小鼠肝脏内α-SMA和collagen I蛋白的表达水平(c)。

图2：划痕试验(a)和Transwell试验(b)检测ERS对TGF-β1诱导LX-2肝星状细胞迁移的影响。EdU掺入试验(c)检测ERS对TGF-β1诱导LX-2细胞增殖的影响；免疫荧光染色(d)和免疫印迹(e)检测ERS对经TGF-β1处理的LX-2细胞中α-SMA和collagen I蛋白表达水平的影响。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

玫瑰花乙醇提取物在制备抗肝纤维化药物或保健食品中的应用实施例如下。

实施例1：ERS对CCl₄所致小鼠肝纤维化的缓解作用

1.准备主要实验材料

玫瑰花的干燥花蕾；无水乙醇；没食子酸、二-O-没食子酰基-HHDP-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-槐糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷、鞣花酸、山奈酚-3-O-(6-没食子酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷标准品；色谱纯乙腈；α-SMA(α平滑肌肌动蛋白)和collagen I(I型胶原蛋白)抗体；AST(谷丙转氨酶)、ALT(谷草转氨酶)、ALP(碱性磷酸酶)测定试剂盒、HYP(羟脯氨酸)、HA(透明质酸酶)、PC III(III型前胶原)ELISA试剂盒；苏木素-伊红(HE)、Sirius Red(天狼星红)、Masson(马松)染色试剂盒。

2.准备实验小鼠

无特定病原体(SPF)级雄性昆明种小鼠32只(8周龄，23±2g)，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2020-0018。小鼠饲养于SPF级动物房内，自由饮水进食，适应性喂养7天后开始实验。

3.制备ERS并对其中的主要特征性化学成分进行分析

以干燥玫瑰花蕾为原料，粉碎后按每1克原料20毫升的比例加入85％的乙醇，室温浸泡4小时，随后40摄氏度超声提取30分钟，收集提取液。残渣用相同的条件再提取两次，合并三次提取所得的提取液。减压蒸发除溶剂，冷冻真空干燥即得玫瑰花乙醇提取物粉末(每10克干燥玫瑰花蕾可得乙醇提取物约1.1克)。

按照申请公布号为CN113484434A的中国发明专利公开的方法，对ERS中主要特征性化学成分没食子酸、槲皮素-3-O-槐糖苷、山柰酚-3-O-槐糖苷、鞣花酸和山柰酚-3-O-洋槐糖苷进行定量分析，结果如表1所示。

表1：ERS中主要特征性化学成分的含量

4.检测ERS对CCl₄造成的小鼠肝纤维化保护作用

将32只实验小鼠随机分为以下4组，每组8只。

第1组——健康组：8只小鼠既不给予CCl₄，也不给予ERS，仅给予等量溶剂作为对照，持续四周。

第2组——模型组：8只小鼠自第二周起每日腹腔注射10％ CCl₄(0.01mL/g)，持续三周到第四周结束。

第3组——ERS低剂量给药组：8只小鼠自第二周起每日腹腔注射10％ CCl₄(0.01mL/g)，持续三周。自第三周起，灌胃给予低剂量ERS(35mg/kg)，持续两周。

第4组——ERS高剂量给药组：8只小鼠自第二周起每日腹腔注射10％ CCl₄(0.01mL/g)，持续三周。自第三周起，灌胃给予低剂量ERS(70mg/kg)，持续两周。

第四周结束时，从小鼠眼眶静脉丛取血并立即处死小鼠，解剖取肝脏，观察外观特征。取部分肝脏用10％福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片后HE染色观察肝微结构，天狼星红和Masson染色观察细胞外基质沉积情况，免疫组化染色观察α-SMA和collagen I表达情况。部分肝脏用生理盐水冲洗后快速冷冻保存于-80℃。按试剂盒说明书规定的操作方法，测定血清中的AST、ALT、ALP、HA、PC III含量以及肝组织中HYP含量。

5.数据分析

实验结果以均数±标准差(mean±std)表示。用单因素方差分析(one way ANOVA)来进行统计学检验，当分析数据的组数多于两组时，还要采用Turkey法进行两两比较。P<0.05时，认为差异具有统计学意义。

6.实验结果

6.1.ERS对肝纤维化模型小鼠肝脏组织病理学的影响。

如图1所示，与正常小鼠相比，肝纤维化模型小鼠肝脏肿大，表面凸凹不平，微结构破坏(图1a)。肝纤维化模型小鼠肝脏切片中天狼星红和Masson染色阳性区域增加(图1b)，提示出现了细胞外基质过度沉积。免疫组化染色结果表明，肝星状细胞激活的标志蛋白α-SMA和collagen I的蛋白表达水平也有明显增加(图1c)。ERS能明显改善上述病变。

6.2.ERS对肝纤维化模型小鼠血清与肝脏相关生化指标的影响。

如表2和表3所示，与正常组的小鼠相比，模型组血清中AST、ALT、ALP、PC III、HA水平和HYP肝脏匀浆中水平均有明显提高，提示出现了肝损伤和肝纤维化。经ERS给药处理后，以上指标均呈明显下降。(注：n＝8，mean±std；^##：与正常组比较，P<0.01；^**：与模型组比较，P<0.01)

表2：各组小鼠血清AST、ALT和ALP水平

表3：各组小鼠血清HA、PC III水平与肝脏匀浆HYP水平

实施例2：ERS对TGF-β1诱导的LX-2肝星状细胞活化的抑制作用

1.准备主要实验材料

DMEM培养基；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、胰酶消化液、青/链霉素(Invitrogen公司)；彩色预染蛋白分子量标准(Thermofisher Scientific)；重组TGF-β1来自美国R&D公司(Minneapolis)。

2.准备人LX-2肝星状细胞系

人LX-2肝星状细胞购自中国典型培养物保藏中心。LX-2细胞使用含有10％ FBS、1％青/链霉素的DMEM培养基进行培养。

3.统计分析

所采用的统计方法与“实施例1”类似。

4.实验结果

如图2所示，ERS抑制了活化肝星状细胞的迁移(图2a和b)和增殖(图2c)。免疫荧光染色和免疫印迹结果均表明，ERS能显著下调活化肝星细胞内collagen I和α-SMA的蛋白表达水平(图2d和e)。综上所述，ERS能明显缓解TGF-β1诱导的LX-2肝星状细胞活化。

Claims

1.玫瑰花乙醇提取物在制备抗肝纤维化药物或保健食品中的用途。

2.玫瑰花乙醇提取物作为唯一的原料药在制备抗肝纤维化药物或保健食品中的用途。

3.根据权利要求1或2所述的玫瑰花乙醇提取物采用如下方法制备得到：以干燥玫瑰花蕾为原料，粉碎后按每1g玫瑰花粉末溶于20mL的85％乙醇的比例，室温浸泡4h，随后40℃超声提取30min，收集提取液；残渣用相同的条件再提取两次，合并三次提取所得的提取液；减压蒸发除溶剂，冷冻真空干燥即得玫瑰花乙醇提取物粉末；其中的主要特征性化学成分有没食子酸、槲皮素-3-O-槐糖苷、山柰酚-3-O-槐糖苷、鞣花酸和山柰酚-3-O-洋槐糖苷。

4.根据权利要求1或2所述的玫瑰花乙醇提取物制备抗肝纤维化药物或保健食品中的用途，其特征在于：所述用途表现为玫瑰花乙醇提取物可改善肝纤维化模型动物肝脏肿胀，肝脏表面粗糙、肝微结构破坏、细胞外基质过度沉积或肝纤维化表征因子α-SMA和collagenI表达上调中的一种或多种病变。

5.玫瑰花乙醇提取物在抑制肝星状细胞活化的用途，其特征在于：所述用途表现为玫瑰花乙醇提取物抑制活化LX-2肝星状细胞的增殖和迁移能力，下调LX-2细胞内活化标志蛋白α-SMA和collagen I的表达水平。

6.根据权利要求1或2所述玫瑰花乙醇提取物在制备抗肝纤维化药物或保健食品中的用途，其特征在于：所述药物或保健食品是以玫瑰花乙醇提取物作为唯一原料药制备而成的制剂，或加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。