KR100389131B1 - 마타리와 황백피의 혼합 추출물로 구성된 비형 간염 및간경화 치료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 B형 간염 및 간경화에 대해 치료 효과를 나타내는, 황백피 (Phellodendron amurense Rupr. cortex)와 마타리(Patrinia scabiosaefolia FISCH.) 식물의 혼합 추출물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 황백피와 마타리 식물의 혼합물을 물과 알코올로 추출하여 수득한 혼합 추출물과, 이 혼합 추출물의 제조 방법 및 B형 간염 및 간경화에 대해 치료 효과를 가진 조성물에 관한 것이다.

특히 본 발명의 조성물은 B형 간염 환자, 또는 간경화에 대하여, 항바이러스 효과및 면역활성 기능의 증강에 의해 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 효과와 간경화 환자의 섬유화된 간세포를 재생하는 효과를 가진다.

또한 본 발명은 부작용을 나타내지 않고, 또한 약물의 내성도 생기지 않을 뿐 아니라, 장기간 사용해도 활성효과가 지속되는 특징을 가진 식물 추출물이다. B형 간염 및 간경화에 대해 효과적인 치료책이 없는 상황에서 본 발명의 조성물은 임상 진료에서 간기능 검사가 정상인 B형 간염 바이러스 보균자, B형 만성간염, 혹은 간경화에 대한 치료제로서 유용하다.

Description

마타리와 황백피의 혼합 추출물로 구성된 비형 간염 및 간경화 치료 조성물{Composition for B type Hepatitis and Cirrhosis of Liver Comprising Phellodendron amurense Rupr. cortex and Patrinia scabiosaefolia FISCH. Extract}

본 발명은 황백피 (黃栢皮)와 마타리 (패장; 敗醬)의 혼합 추출물로 구성된 B형 간염 및 간경화 치료에 효과가 있는 의약 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 황백피 (Phellodendron amurense RUPRCHT cortex)와 마타리 (Patrinia scabiosaefllia FISCH.)의 혼합 추출물을 유효 성분으로 하는 B형 간염 바이러스 활성 및 간경화 치료효과가 있는 물질로서 항 바이러스 효과, 면역증강작용, 섬유화된 간세포를 재생시키는 효과를 나타내는 의약 조성물과 그 제조방법에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스 (HBV)는 DNA 바이러스임에도 불구하고, 변이되기 쉬운 바이러스이다. HBV 유전자는 약 3.2hb의 이중사슬의 환상 (double strand cyclic) DNA이고, 극히 압축된 구조로 되어 있다. Open reading frame (ORF)은 각각 하나의 ORF가 다른 ORF와 전체, 혹은 일부분이 중첩되어 각각 다른 유전정보를 지탱하도록 교묘하게 만들어져 있다. HBV는 다른 DNA 바이러스와는 달리, 감염된 세포 내에서 복제(replication)될 때, 역전사 (reverse transcription)과정을 거친다. 즉, 원래의 게놈 길이보다 긴 3.5kb의 pregenome이라고 불리는 복제 중간체를 만들어, 바이러스 자체의 역전사 효소 / DNA 활성에 의해 이중사슬 DNA를 복제한다.

이와 같은 복제양식은 DNA 사슬을 그대로 복제하는 보통의 DNA 바이러스와 달리, 먼저 숙주의 역전사 효소에 의해 DNA 사슬에서 RNA 사슬로 전사되고 바이러스 고유의 RNA 중합 효소에 의해 반응이 진행된다. 그 때문에 HBV는 DNA 바이러스이면서도, 일반 RNA 바이러스에 필적하는 높은 변이성을 나타낸다. HBV 유전자의 변이는 임의로 일어나지만, 증식속도와 빈도가 일정하다.

한편, 숙주 쪽에서도 HBV 유래의 단백질에 대해 액성 및 세포성 면역반응을 나타내기 때문에 여기에서 걸러진 바이러스들의 변이가 지속적으로 일어난다. 역전사효소 활성을 가진 HBV의 DNA 중합효소가 pregenome RNA를 역전사하고 바이러스 DNA를 복제하고 있다. 일련의 복제는 숙주 염색체와는 독립하여 행해진다. 그러나 바이러스 DNA의 일부는 숙주의 염색체에 끼어 들어 가는 것이 밝혀졌다. HBV DNA가 숙주의 염색체로 끼어 들어가게 되면 유전자가 불안정해지고 거기에서 발현되는 X 단백질에 의해 숙주세포의 전사가 촉진되며 P53유전자 기능이 저해될 가능성이 높다. 이런 상황이 지속적으로 진행되면 간세포암으로 발전하게 된다.

원발성 간암의 대부분은 바이러스성 간염으로부터 출발한다. 간염바이러스의 종류는 A형에서 E형의 5종이었으나, 최근 바이러스 유전자가 클로닝되어 G형을 합해 6종류가 알려져 있으나, 이 가운데 역학적으로 간장의 발암과의 관계가 지적되고 있는 것은 B형 간염 바이러스 (HBV) 와 C형 간염 바이러스 (HCV)의 2종류이다. HBV의 외피는 바이러스 입자 표면에 노출되어 있어 숙주의 면역계와 직접 관계되는 부분이다.

그래서, 숙주의 면역반응에서 이탈하고, 존속하기 위해 HBV는 표면 항원의 구조를 변화시키고 있다. 항원 구조의 변화는 다양하게 일어나며, 병의 진전이나 지속감염을 결정하는 중요한 인자가 되고 있다. 바이러스에 대한 숙주의 면역반응이 부적절하거나 T 세포의 기능 결여, 스테로이드와 같은 내분비 기능, 약물 등의 요인에 의해 급성간염에서 만성형으로 발전한다.

간염 증세가 6개월 이상 지속되고, 생화학적 검사와 혈청학적 검사의 개선이 없으면 만성형이라고 부른다. 만성형은 다시 만성 지속성 간염과 만성 활동성간염으로 구분되는데, 만성 활동성 간염은 간 조직의 손상이 점진적으로 진행되어 간경화, 간기능 부전, 치사에 이르게 된다. B형이나 C형 간염 바이러스에 의한 만성 간염은 간경화로 이환되는 비율이 높고 여기에서 더 진전되면 간세포 암으로 발전한다. 간경화의 원인은 다양하여 바이러스 감염, 기생충, 후천성 매독, 음주, 약물이나 화학물질의 독성, 담관폐쇄, 울혈, 혈색소증, 윌슨병 등이다.

여러 가지 원인에 의하여 간경화로 진행되면 간실질 조직세포가 손실되고, 혈관 만곡을 동반하는 망상조직의 허탈과 섬유조직 증식, 그리고 잔유 간세포의 증식과 광범위하게 분포된 결체 조직의 증식이 일어나며, 점진적으로 위축된다. 간질이 증식하는 한편 실질에는 괴사와 재생이 일어나 간은 정상적인 구조를 잃고 소엽이 결체조직 증식에 의해 분할되거나 합병 등으로 개출된다. 이 개축은 문맥에서 중심정맥의 혈류로를 방해하기 때문에 순환장애를 일으켜 문맥압 항진증을 유발하여 복수, 방측 순환(식도정맥류 또는 제정맥의 확장으로 소위 메두사 머리를 형성함), 비종대 등을 일으킨다. HBV 양성의 간경화 결절은 증식 패턴이 긴밀한 세포로구성되고, 전암 상태라 볼 수 있는 단계에서 이미 클론같은 세포군이 존재하는 것이 보인다. 그러나 이 상태에서는 암의 시발 (initiation)에 관련되는 유전자의 이상은 없다.

HBV에 의한 B형 만성간염의 치료에 사용되고 있는 약제에는 작용기전에 따라 항바이러스 제제와 면역 증강제가 있다. 항바이러스 제제에는 Ara-A, Ara-Amp, acyclovir, suramin 등이 있다. B형 만성간염에 대한 새로운 치료법으로, 최근 라미뷰딘(1amivudine, 3TC)이 임상시험에 사용되고 있다. 라미뷰딘은 핵산 유도체로서 경구 항바이러스제이고, HIV (후천성 면역 결핍증 바이러스)의 역전사효소 활성을 특이적으로 저해하여 에이즈치료제로서 1995년부터 구미에서 사용되었다. 라미뷰딘은 최초로 디엔스타스(Dienstas) 등에 의해 B형 만성 간염 환자에게 시험적으로 사용되었는데, 투여 중 HBV DNA가 음성화하고, 19%의 환자에서 ALT치의 정상화되어 지속적인 혈중 HBV DNA의 음성화가 인정되었다. 그러나 라미뷰딘은 약물 자체의 독성 때문에 장기간 사용하기 어려운 단점이 있고, 약의 복용을 중지하면 억제되었던 바이러스의 증식이 계속되어 원래의 상태로 되돌아간다. 최근, 6개월-12개월의 장기간의 라미뷰딘 투여에 대한 저항성을 나타낸 환자에서 이 약물에 대해 내성을 나타내는 HBV 변이주가 출현한다는 사실이 밝혀졌다.

면역증강제인 인터페론도 B형 간염 치료에 사용하고 있으나 그 유효성은 극히 적다. 그러나, 3개월 내지 6개월간 투여가 표준으로 되어 있고, 장기투여시 좀더 유용한 결과가 예상되지만 부작용이 크고 약물 투여를 중단하면 바이러스의 증식이 다시 증가되어 원래 상태로 되돌아간다. B형 만성간염의 치료에 있어서, ALT치의 개선과 동시에 HBe항원의 음성화가 치료의 지표가 된다. 그러나 그 중에는 혈중 HBe항원이 음성임에도 불구하고, 활동성 간염의 상태가 계속 되는 경우도 있다.

그러나, 현재까지 알려진 어떠한 의료적 방법으로도, 간경화에 대해서는 실질적인 치료 방법이 알려져 있지 않은 실정에 있다.

따라서, 본 발명의 목적은, B형 만성 간염에 치료효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 간경화에 치료효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 항체의 역가 증가와 T세포 증식에 효과가 있는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, B형 간염 치료용 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1a는 임상예 1(HBe 항원)의 치료 효과를 도시한 그래프이고,

도 1b는 임상예 1(HBs 항원)의 치료 효과를 도시한 그래프이고,

도 2a는 임상예 2(HBe 항원)의 치료 효과를 도시한 그래프이고,

도 2b는 임상예 2(HBs 항원)의 치료 효과를 도시한 그래프이고,

도 3a는 임상예 3(HBe 항원)의 치료 효과를 도시한 그래프이고,

도 3b는 임상예 3(HBs 항원)의 치료 효과를 도시한 그래프이고,

도 4a 내지 4d는 대조군, DMN 투여군, DMN+본 발명의 조성물 150㎎/㎏ 투여군 및 DMN+본 발명품 500㎎/㎏ 투여군에 대한 간경화의 치료 효과를 보인 사진들이고,

도 5는 마타리 추출물의 UV 검색도이고,

도 6은 황백피 추출물의 UV 검색도이고,

도 7은 본 발명인 마타리와 황백피의 혼합 추출물의 UV 검색도이고,

도 8은 마타리 추출물의 HPLC 분석도이고,

도 9는 본 발명에 따른 마타리와 황백피의 혼합 추출물의 HPLC 분석도이고,

도 10은 황백피 추출물의 HPLC 분석도이고,

도 11은 본 발명에 따른 마타리와 황백피의 혼합 추출물의 HPLC 분석도이다.

이와 같은 본 발명의 목적은, 황백피와 마타리의 혼합 추출물을 치료적 유효량으로 함유하는 B형 간염 치료용 조성물에 의해 달성될 수 있다. 또한 본 발명에 따라 황백피와 마타리의 혼합 추출물을 치료적 유효량으로 함유하는 조성물은 간경화 치료용 조성물로서 유용하며, 항체 생성시 역가 증가 및 T 세포 증식 효과를 갖는 의약 조성물로서 유용하다.

본 발명에 사용되는 마타리는 일명 패장 (敗醬)이라고도 하며, 마타리(Patrinia scabiosaefolia FISCH.), 뚝갈 (白花敗醬; Patrinia villosa JUSS.), 돌마타리 (岩敗醬; Patrinia sibirica JUSS.) 등의 종류가 있다. 마타리는 한국을 비롯하여 세계 도처의 온대 지방의 산야에서 자생하는 다년생 초본이다. 전초 (全草)를 사용하며, 한방에서는 안질, 화농성연구균 (Streptococcus pyogens), 부종, 대하증 등의 소염에 이용한다.

또한 마타리의 열 추출물은 항 종양효과 (예: 자궁암, 식도암, 위암, 장암, 폐암 등)가 있음이 보고된 바 있고, 시험관 내 시험에서 황색 포도구균, 연쇄구균 등의 발육을 강력하게 억제한다. 그리고 손상된 간 세포의 재생능을 가지고 그의 변성을 방지하며, 문맥의 순환을 개선하여 간세포의 재생을 촉진하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 중추신경계에도 작용하여 신경을 안정시키며, 강한 진통효과를 나타내고, 혈압강하효과와 항이뇨(antidiuretic) 효과를 가지는 것으로 알려져 있다.

마타리의 뿌리에는 정유, 여러 사포닌, 탄수화물 및 쿠마린 (cumarin)과 같은 미량의 알칼로이드가 들어 있다. 뿌리의 진피층에는 아세트산, 포름산, 발레린산 등이 있고, 카티닌 (Chatinine) 및 발레리아닌 (valerianine) 등의 알칼로이드가 함유되어 있다. 이중 발레르산(valeric acid)은 매우 강력한 진통효과를 가진 것으로 알려져 있다. 건조된 종자에는 19.4 - 19.9%의 단백질과 30 - 34.4%의 지방이 함유되어 있다. 그러나 아직까지 마타리에 대하여 그의 활성성분이나 약물학적 성질에 관한 구체적인 연구는 이루어지지 않고 있다.

본 발명에 사용되는 또 다른 식물인 황백피는 한국, 일본, 중국 등에서 자생하는 황벽나무 혹은 황백나무 줄기의 껍질이며, 황백나무의 대표적인 것은 펠로덴드론 아무렌스 루프레트 (Phellodendron amurense RUPRECHT)이다. 그의 변종으로 라티폴리오라텀 나가이 가와모도, 짜포니컴 오이, 펠로덴드론 인귤레르 나가이, 펠로덴드론 물레 나가이, 펠로덴드론 쌀젠트 등이 있다. 황백피에는 황색 또는 황갈색 색소 물질과 수종의 알칼로이드 성분이 1.5 - 4.5%가 포함되어 있다. 알칼로이드의 주성분은 베르베린 (berberine)이다. 그밖에 팔마틴 (palmatine), 마그노후로린 (magnoflorine), 구아니딘 (guanidine) 자테오리진 (jateorrizine), 펠로덴드린 (phellodendrine), 칸디신 (candicine), 메니스페린 (menisperine) 등이고, 고미질로는 오바쿠논 (obakunone) 및 오바쿠락톤 (obakulactone), ??-시토스테롤(??-Sitosterol) 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 이들 성분은 강한 항균작용, 혈압강하작용, 중추신경억제작용, 아세틸콜린 증강작용 및 항염작용이 있고 본초강목이나 약학에서는 골질환 및 황달에 사용되었다. 또한 장티푸스, 콜레라에도 효과가 있고, 건위, 정장에도 효과적이며, 이들의 수피는 고미건위제, 정장제 소염성 수렴약으로서 위장염, 복통, 황달 등에도 사용되어 왔다.

본 발명에 생약제로서 B형 간염 바이러스를 감소시킬 뿐만 아니라 간경화에 대해서도 효과를 나타내는 중요한 특징을 갖는다. 마타리와 황백피의 혼합 추출물을 이용한 본 발명의 조성물은 B형 간염바이러스 감염에 의한 간염에 대해 직접적인 항바이러스 효과를 나타내는 동시에 염증을 치료하며 숙주의 면역체계 중 T 헬퍼세포 (helper cells)를 강화시키는 효과가 있다. 또한 섬유화된 간 조직 중 간세포의 재생을 통하여 간세포 내의 중심정맥을 회복시킴으로써 간경화에 대한 치료효과를 나타낸다.

본 발명에 따른 조성물은 황백피와 마타리의 혼합 추출물을 치료적 유효량으로 함유한다. 여기서 혼합 추출물은 황백피와 마타리를 혼합하여 이들을 추출하는 것도 가능하고, 황백피의 추출물과 마타리의 추출물을 혼합하여도 좋다.

본 발명은 이들 두 식물의 추출물이 혼합된 상태에서 상승 효과에 의해 탁월한 치료 효과를 나타내기 때문에, 이들 두 식물 황백피와 마타리의 조성비는 2:5 내지 5:2의 중량비의 범위로 하는 것이 바람직하다. 이 범위로 이들 두 식물의 유효성분의 추출물이 혼합될 때 본 발명의 항 바이러스, 간경화 및 면역증강의 효과를 극대화시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 직접적인 anti-HBV효과를 가지는 동시에 T 세포가 관여하는 면역체계를 강화시킴으로써 B형 간염에 대한 치료효과가 높고, 섬유화된 간세포를 재생시키는 효과가 있으면서 독성은 매우 낮아 가장 이상적인 약물로 평가된다.

본 발명의 다른 특징에 따라서, 황백피와 마타리를 수성 용매로 혼합 추출하여 여과하고; 여액을 고압하에서 포화시켜 생성된 응고단백질의 침전물을 원심분리하여 제거하고; 여액에 유기용매를 가하여 유기용매-가용성 물질을 제거한 다음에 수층을 분리하여 건조시키는 단계;를 포함하는 의약 조성물의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 황백피와 마타리의 총추출물은 마타리와 황백피를 1:1 (중량비)로 혼합하여 분말화한 후 상수 또는 증류수를 사용하여 고압 하에서 가열 추출한 다음 추출물을 원심분리하여 침전물을 제거하고 추출물은 다시 고압 하에서 끓여 잔존하는 단백질을 응고시킨 후, 여과하여 제거한다. 여액을 다시 증기압에 포화시켜 잔존의 단백질을 응고시키고 원심분리하여 침전물을 제거한 다음에 여과한다. 여액에 용매, 예를 들면 클로로포름과 헥산을 가하여 여액에 용해된 상태로 존재하는 수지, 섬유질 등 용매로 추출되는 모든 추출물을 제거한 후에, 수층을 탈크 등을 이용하여 정제하고, 동결건조시켜 총추출물의 분말을 수득한다.

위와 같은 방법에 의해 수득한 본 발명에 따르는 혼합 추출물은 치료학적 유효량을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 약제학적 조성물의 형태로 제형화하여, 경구투여하거나 주사함으로써 B형 간염 및 간경화에 대한 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명에 따르는 혼합 추출물의 유효량 범위는 목적하는 효과가 무엇인지에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로는 성인에 대한 경구투여의 경우, 체중 1㎏당 1일 5 내지 50㎎, 바람직하게는 10 내지 40㎎의 용량을 투여할 수 있다. 또한 본 발명에 따르는 추출물은 필요에 따라 간염치료제, 항염제, 항바이러스제 등과 같은 약제와 배합 또는 병용 할 수 있다. 본 발명에 따르는 조성물과 병용할 수 있는 약제로는 DDB (diphenyl dimethyl dicarboxylate)나 마늘유 (galic oil), 글리시리진, 실리마린 등을 들 수 있다.

이하 실시예 및 실험예에 의거해서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 이들은 예시의 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 혼합 추출물의 제조

건조된 황백피 (Phellodenddrion amurense RUPRECHT)와 마타리 (Patrinia scabiosaefolia FISCH.)를 동비례로 혼합한 것을 분쇄기로 분쇄한 분말 중의 100g을 분취하고, 여기에 증류수 3,000 ㎖을 가하여 고압 하에서 50분간 포화 추출한 후, 추출액은 분취하고 잔사는 제거하였다. 추출액은 원심분리하여 침전물을 제거하고 수액은 여과한 다음에 전량이 1500 ㎖가 되도록 농축하고 여과하였다. 다시 고압 (121℃, 15 pound/in a²) 하에서 15분간 포화시켜 생성된 응고 물질, 특히 단백질을 포함한 침전물을 원심분리하여 제거한 후에 여과하였다. 여액을 분액깔대기에 넣고 클로로포름 400 ㎖을 가하여 수지 및 섬유질 등을 용출시키고 클로로포름 층을 분리 제거하였다. 이 같은 방법을 2회 되풀이한 후 수층에 다시 n-헥산 200 ㎖를 가하여 잔존하는 단백질, 수지, 섬유질 및 n-헥산 가용물질 등을 용출시켰다. 수층을 회수하여 60 내지 80℃로 가온시킨 다음에 탈크 500 g을 가하여 교반하였다. 이를 다시 감압여과하여 탈크는 제거하고 여액은 다시 서서히 여과하여, 여액을 동결건조시켜 분말화하였다. 이 방법에 의하여 황백피와 마타리의 혼합물에서 약 15 %의 수율 (건조 중량 기준)로 추출물 약 15 g을 수득하였다.

실시예 2: 알코올에 의한 추출물의 제조

건조한 황백피와 마타리를 동비례로 혼합한 것을 분쇄기로 분쇄한 분말 100g에 70% 메탄올 1,500㎖를 가하여 때때로 교반하면서 60 시간을 방치한 다음, 이를 감압여과하여 알코올 추출물을 취하고, 잔사는 제거하였다. 환류냉각장치에서 알코올을 회수하고 남은 알코올 추출물에 증류수 1,000㎖를 넣어 혼합하고, 수용화하기 위하여 100℃에서 5분간 가열하였다. 이 혼탁 추출물에 적량의 탈크를 넣고 교반후 감압여과하여 1차 정제하였다. 정제된 여액을 분획 깔대기에 넣고 클로로포름 300ml를 가하여 수지 및 섬유질 등을 용출시키고, 클로로포름 층을 분리 제거한 후, 수층에 다시 n-핵산 200㎖를 가하여 잔존하는 단백질, 수지, 섬유질 및 n-핵산 가용물질등을 용출시켰다. 수층을 회수하여 60-80℃로 가온시킨 다음에 다시 적량의 탈크를 가하여 교반 후, 감압여과하여 탈크를 제거하고 여액을 다시 서서히 여과시킨 다음, 동결건조시켜 분말화하였다. 이 방법에 의하여 황백피와 마타리의 혼합추출물에서 약 10%의 수율 (건조중량기준)로 추출물 약 10g을 수득하였다.

조성예 1: 정제

실시예 1에서 제조된 본 발명의 동결 건조된 분말상의 혼합 추출물 250㎎을 부형제 직타용 락토즈 260㎎과 아비셀(미결정 셀룰로오스) 35㎎, 붕해 보조제인 나트륨 전분 글리코네이트 15㎎, 결합제인 직타용 L-HPC(Low-hydroxyprophylcell ulose) 80㎎을 섞어 U형 혼합기에 넣고 20 분간 혼합하였다. 혼합완료 후 활탁제 마그네슘 스테아레이트 10㎎를 추가로 넣고 3분간 혼합하였다. 정량시험과 항습도 시험을 거쳐 타정하고 필름 코팅하여, 1 정당 혼합 추출물 250㎎을 함유하는 정제를 제조하였다.

조성예 2: 시럽제

일정량의 물에 적당량의 백당을 용해시키고, 여기에 보존제로서 파라옥시메틸벤조에이트 80㎎ 및 파라옥시프로필벤조에이트 16㎎을 가하고, 실시예 1에서 제조된 본 발명의 동결 건조된 분말상의 혼합추출물 4.5g을 넣고, 60℃로 유지시키면서 완전히 용해시킨 후, 냉각시키고 증류수를 가해 150 ㎖로 만들어 시럽제를 제조하였다.

조성예 3: 캅셀제

실시예 1에서 제조된 본 발명의 동결 건조된 분말상의 혼합추출물 500㎎을 경질 젤라틴 캅셀에 충전하여 캅셀제를 제조하였다.

조성예 4: 음료

실시예 1에서 제조된 본 발명의 동결건조된 분말상의 혼합추출물 500㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 고과당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다.

조성예 5: 주사제

실시예 1에서 제조된 본 발명의 동결 건조된 분말상의 혼합 추출물 200㎎을 1%의 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1 %의 농도로 함유하는 주사 제제를 제조하였다.

임상예 1: 본 발명의 조성물을 B형 간염 환자에게 투여

실시예 1에서 제조된 본 발명의 조성물을 포함하는 캅셀을 38세 남자인 만성적인 B형 간염 환자에게 1일 2회 2캅셀씩 경구 투여하였다. 결과를 도 1에 도시한다. 도 1은 anti-HBV 항체를 RIA (방사성 동위원소 분석) 방법으로 조사한 결과로서 본 발명의 B형 간염에 대한 치료효과를 나타낸다(도 1a: HBe 항원, 도 1b: HBs 항원).

임상예 2: B형 만성간염 환자에 대한 투여

B형 만성간염으로 진단된 36세의 남자 환자에게 본 발명의 조성물 캅셀을 경구로 1일 2회 2캅셀씩 (1일 2000 mg) 11개월 간 투여한 결과 B형 간염 바이러스에 대한 항체가 생성되어 HBe항원과 HBs항원이 모두 거의 없어져 항원 역가(antigen titer)가 0에 가까이 떨어지거나 감소하는 것을 볼 수 있다. 임상예2 (도 2a, 도 2b)의 경우에는 B형 만성 간염으로 치료 전 항원이 많이 검출되었으나 본 발명의 조성물을 투여한 결과 HBe항원에 대한 항체가 생성되어 HBe항원이 감소하고 이와 비슷하게 HBs항원도 감소하여 6개월 뒤에는 0 가까이 떨어진 것이 관찰되었다.

임상예 3

HBV에 의한 만성 간염 환자(34세, 남자)에게 본 발명의 조성물 캅셀을 1일 2회 2캅셀씩 (1일 2,000㎎) 경구로 8개월간 투여하였다. 결과를 도 3a 및 3b에 도시한다. 이 도면에서 보는 바와 같이, HBV에 대한 항원 수치가 0 가까이 떨어졌다.

이들 임상예의 결과로 볼 때 본 발명의 조성물은 B형 간염 치료에 탁월한 효과가 있다는 것을 알 수 있다.

실험예 1: 본 발명품의 간경화에 대한 치료 효과

본 발명에 따른 조성물의 간경화에 대한 효과를 조사하기 위하여 백서를 대상으로 DMN(N-Nitrosodimethylamine) 40㎎/㎏ 복강내에 1회 주사하여 간경화를 유발하였다. DMN은 인간의 간경화와 가장 유사한 조직의 변화를 초래하는 물질로 간경화 실험에 많이 사용되는 모델이다.

24마리의 백서를 6마리씩 4개군으로 나누어 1군은 대조군, 2군은 DMN만 40㎎/㎏을 투여하였고, 3군은 DMN 40㎎/㎏을 투여하고 본 발명의 조성물을 150㎎/㎏ 용량으로 2주일간 투여하였으며, 4군은 DMN 40㎎/㎏을 투여하고 본 발명품을 500㎎/㎏ 용량으로 2주간 투여하였다. 대조군과 DMN만 투여한 군에는 같은 기간동안 생리식염수를 투여하였다.

2주 후 모든 동물을 희생시켜 혈액을 채취하고 간을 적출하여 4% 포르말린 용액에 고정하였다. 혈액에서는 ALT, AST, 빌리루빈, 알부민 등의 지표를 조사하였고, 간 조직은 병변의 진행과정에 따른 조직의 기질화를 관찰하기 위하여 유리질변성(hyaline degeneration), 섬유소(fibrin) 등과 같은 병적 산물에 염색되는 AZAN 염색을 실시하여 현미경하에서 관찰하였다.

AZAN(Azocarmine) 염색을 하기 위하여 매염제 (mordant: 10% potassium dichromate (K₂Cr₂O₇) 수용액 50㎖ + 10% 트리클로로아세트산 (CCl₂COOH)수용액 50㎖)에 담갔다가 Azocarmine 용액으로 고온에서 처리하였다. 염색 후 식혀서 아닐린-알코올로 핵이 뚜렷이 구별될 때까지 분별하고 아세틱-알코올로 정지시켰다. Aniline blue-Orange G용액으로 처리한 후 100% 에탄올로 분별 및 탈수시키고 봉입하여 슬라이드를 완성하였다.

현미경 하에서 검경한 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4-1은 정상적인 간조직으로 중심정맥이 뚜렷이 보인다. 도 4-2는 DMN을 주어 간경화를 유발한 것으로 섬유화된 간 조직이 푸른 색으로 보인다. 도 4-3은 본 발명의 조성물 150㎎/㎏을 투여했을 때 간경화의 정도가 완화되어 푸른 색으로 염색되는 부분이 감소하였다. 도 4-4는 본 발명품 500㎎/㎏을 투여했을 때 섬유화된 부분이 거의 정상으로 되돌아온 것을 관찰할 수 있다. 중심정맥도 점차 회복되어가는 양상을 나타내었다.

이상의 결과로 본 발명의 조성물이 섬유화된 간세포의 재생능력이 있으며 간경화에 대한 치료효과가 있음이 분명히 입증되었다.

실험예 2: 본 발명에 따른 조성물의 구성성분인 황백피와 마타리 단독추출물과 본 발명의 조성물의 면역증강효과 비교 (생체내에서의 T세포 의존성 항체생성반응에 대한 상승효과)

체중이 17-20g 정도인 Balb/c 마우스 25마리를 각 군당 5마리씩 5군으로 나누어 SRBC (Sheep Red Blood Cell) 2.4 x 10⁸개를 복강내 이식하고 본 발명의 조성물의 구성물질인 황백피와 마타리 각각의 추출물 및 본 발명의 조성물 분말을 물에 녹여 이식 첫날부터 3일간 체중 1 kg당 3 - 100 mg의 양을 경구로 투여하였다(0, 1, 2일).

대조군은 생리식염수를 같은 투여경로로 투여하였다. 4일 후 동물을 희생시켜 무균적으로 비장을 적출한 다음 조직을 잘게 자르고, 메쉬(mesh)를 사용하여 비장세포를 분리하여 3㎖의 HBSS(Hank's balanced salt solution)가 담긴 페트리 디쉬에서 주사기의 플런저(plunger)를 이용하여 세포를 유리시켰다.

세포 현탁액을 15㎖의 코니칼 튜브로 옮겨 5분간 방치시킨 후, 2㎖의 상층액을 취하여 1200 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 2㎖의 EBSS로 다시 현탁시킨 후 EBSS로 30배 희석시켜 한번의 플라그 형성 세포 분석에 100씩 사용하였다. EBSS를 이용하여 세척한 SRBC (25㎕, 표적세포), EBSS로 2배 희석한 기니아 피그 보체 (guinea pig complement 25㎕), 및 아가로즈 (0.85% in EBSS, 350㎕)와 섞은 후 페트리 디쉬에 부어 굳힌 후, 37℃, CO₂배양기에서 약 1시간 방치하였다. 항체를 생성하는 세포 (antibody forming cells)의 수는 modified Jerne plaque assay를 사용하여 측정하였다. 플라그수 및 세포수를 계수하여 항체 생성세포/10⁶cells로 표현했다.

그 결과 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조성물을 투여한 경우 항체형성 세포의 수가 구성분 각각보다 면역증강효과가 훨씬 증가하였다.

생체내에서 본 발명의 조성물의 T-세포 의존성 항체생성 반응에 대한 효과

약물의 농도	항체생성 세포수 (세포 백만개 당)
	황백피 추출물	마타리 추출물	본 발명의 조성물
대조군3㎎/㎏10㎎/㎏30㎎/㎏100㎎/㎏	2672 ±1352845 ±2452996 ±2733391 ±4844208 ±548	2672 ±1353212 ±4544036 ±463920 ±1054408 ±72	2672 ±1353690 ±986027 ±4446610 ±3748215 ±533

실험예 3: 본 발명에 따른 조성물의 T세포 활성화 반응에 대한 효과

본 발명의 조성물의 T 세포 활성화 반응에 대한 효과를 혼합 면역세포반응법으로 측정했다. 주조직적합성 (MHC class) 항원이 다른 두 종류 마우스에서 면역세포를 분리하여 혼합하면 상대방 세포의 항원을 인식하는 T세포는 증식을 한다.

주조직적합성 (MHC class) 항원이 서로 다른 B6C3F1 (H-2k)와 BDF1 (H-2d)의 두 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하여 비장세포를 유리시켰다. 분리한 면역세포는 2.5 x 10⁶cells/ml이 되도록 조절한 후 96 well plate에 각각 100㎕/well 씩 넣어서 최종 200㎕로 만들었다.

여기에 본 발명의 조성물을 0.01에서 100㎍/㎖의 농도로 처리한 후 37℃, CO₂배양기에서 3일간 배양하였다. 배양이 끝나기 18시간 전에 각 well 당 1 ??Ci의 [³H] thymidine을 첨가하였다. Automatic cell harvestor를 이용하여 세포를 수거한 뒤 [³H] thymidine의 흡수정도를 측정함으로써 면역세포의 증식정도를 측정하였다.

그 결과 표 2에 나타난 바와 같이 본 발명품의 농도에 따라서 T세포의 증식이 증가했다.

본 발명의 조성물의 T 세포의 증식에 대한 영향

실험조건	증식도 (DPM/250,000세포)
대조군본 조성물 0.01 (㎍/㎏)본 조성물 0.03본 조성물 0.1본 조성물 0.3본 조성물 1본 조성물 3본 조성물 10본 조성물 30본 조성물 100	3809 ±4194329 ±5225245 ±6116769 ±9167146 ±4109008 ±104610243 ±103410792 ±61111178 ±133211045 ±1364

실험예 4: 급성 독성 실험

정상 ICR 마우스(♀, 19±1g) 30 마리를 1 개군에 6 마리씩 5 개군으로 나누어 첫번째 A군에게는 체중 1 ㎏당 3 g을 투여하는 것으로부터 등차적으로, B군에는 6 g, C군에는 9 g, D군에는 12 g 및 E군에는 15 g 씩을 각각 경구투여하고 베렌스-칼버(Behrens-Krber)법 [참고문헌: 高木敬次郞 外: 藥物實驗, 南山堂, Japan, p131, 1960]으로, 본 발명의 혼합추출물의 경구 (p.o.)투여에 의한 LD₅₀량을 측정하였다. LD₅₀(치사량)은 약물의 급성독성을 나타내는 지표가 되는 중요한 의미가 있는 수치로서 본 발명품의 안전도를 나타내는 것이다.

결과는 다음 표 3과 같이 본 발명품을 체중 1 kg당 15 g을 경구투여한 군에서도 동물이 한마리도 폐사되지 않아 LD₅₀값을 측정할 수 없었다. 따라서 본 발명의 혼합추출물의 경구투여에 의한 LD₅₀값은 15 g/㎏ body weight 이상이며 본 발명품이 생체에 매우 안전하다는 것을 증명한다. 즉, 본 발명의 혼합추출물은 독성이 거의 없이 안전하게 투여될 수 있는 것임을 명백히 알 수 있다.

부검 및 병리조직학적 시험 방법은 다음과 같다. 시험종료시 전 생존동물에 대하여 에테르 마취 후 방혈 치사시킨 다음 장기를 적출하여 육안적으로 모든 장기의 이상을 검사하였다. 병리조직 검사를 위하여 부검한 전 장기들을 10% 중성포르말린 용액에 10일 이상 고정시킨 다음 탈수과정을 거쳐 파라핀 포매기 (Fisher, Histomatic Tissue Processor, 166A)에 포매한 후 로타리 마이크로톱 (AO Rotary Microtome)으로 5㎕ 절편을 만들어 Hematoxylin과 Eosin염색을 하여 관찰하였다.

각 군의 모든 동물을 해부하여 현미경으로 조사한 병리조직학적 소견은 다음과 같다. 본 발명의 조성물을 마우스 체중 1㎏당 15g까지 투여시 간 조직에 있어서 약물 투여에 의한 이상적인 소견은 관찰되되 않았다. 또한 신장과 심근세포, 위장관, 췌장, 폐장, 비장, 부신, 뇌, 고환, 난소, 골수 등에 있어서 약물투여에 의한 이상 소견은 관찰되지 않아, 본 발명에 따른 조성물을 마우스에 투여할 수 있는 최대용량인 체중 1㎏당 15 g 투여시 전 장기에 대하여 급성독성에 의한 부작용이 없었으며, 또한 독성을 유발하지 않는 안전한 약물로 판단된다.

본 발명의 혼합추출물의 경구 투여에 의한 치사량(LD₅₀)

실험군	용 량(g/㎏)	경구투여군(p.o.)	복강내투여군(i.p.)	*Z	**d
		사망동물수/사용동뮬수	사망동물수/사용동물수
A	3	0 / 6	0 / 6	-	-
B	6	0 / 6	0 / 6	0	2.0
C	9	0 / 6	3 / 6	1.5	2.0
D	12	0 / 6	4 / 6	3.5	2.0
E	15	0 / 6	6 / 6	5.0	3.0

주)

* z : 2 개의 연속되는 용량으로 사망동물수의 ½ 값

** d : 2 개의 연속되는 용량의 차이

실험예 5. UV 흡광도에 따른 본 발명의 추출물의 특성

본 발명의 마타리와 황백피의 혼합 추출물을 자외선 분광 광도계 (Spectrophotometer; Pharmacia, Ultrospec 2000)와 HPLC(HP1090)를 사용하여 조사한 결과는 다음과 같다. 도 5는 마타리 추출물(0.5 ㎎/㎖)의 UV 흡광도 검색 결과를 나타내는데 282 ㎚에서 흡광도가 상승하는 결과를 보인다. 도 6은 황백피 추출물(0.25 ㎎/㎖)의 UV 흡광도를 측정한 결과인데, 황백피 추출물은 278, 325 ㎚에서 흡광도가 증가한다. 도 7은 본 발명의 마타리와 황백피 혼합 추출물(0.5 ㎎/㎖)의 UV 스펙트럼으로 281, 316 ㎚에서 흡광도가 증가하는 결과를 나타내었다.

실험예 4. HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 분석에 따른 본 조성물의 특성

본 발명인 마타리와 황백피의 혼합 추출물 및 마타리와 황백피 각각의 추출물을 HPLC로 분리하기 위하여 각 추출물을 10 ㎎/㎖의 농도로 물에 녹였다. 용해된추출물 용액 10 ㎕를 취하여 HPLC(HP1090)를 사용하여 분석하였다.

(분석조건)

칼럼: Luna 5u C18; 4.6 mm i.d. x 250 mm L (Phenomenex)

이동상: 2% 아세트산과 메탄올의 구배 시스템

유속: 1 ml/min

검출: photodioid array detector로 254 ㎚에서 측정

반복 실험에서 각 추출물에서 특징적인 피크들이 관찰되었다. 도 8은 마타리 추출물의 HPLC 프로필로서 마타리 추출물은 위의 분석 조건하에서 10.245 분, 12.772분, 14.104분, 17.087분, 18.769분에 특징적인 피크가 관찰되었다. 그 중 10.952분에 나타난 피크는 3,4-디하이드록시벤조인산으로서 함량이 0.022%였고 17.087분에 나타난 피크는 클로로제닌산으로 함량이 0.238%였다. 18.769분에 검출된 피크는 카페인산으로 함량은 0.107% 였다. 같은 조건 하에서 본 발명의 조성물을 HPLC로 분석한 결과는 도 9에 제시된 바와 같이 마타리로부터 온 위의 세가지 물질이 각각 3,4-디하이드록시벤조인산은 0.020%, 클로로제닌산은 0.270%, 카페인산은 0.044% 함유되어 있었고, 그 외에 17.299 분, 22.048 분, 22.449분에 특징적인 피크들이 나타났다.

황백피 추출물에 다량 함유된 알칼로이드인 베르베린과 팔마틴을 분석하기 위하여 다음과 같은 조건을 사용하였다.

(분석조건)

칼럼: Luna 5u C18; 4.6 mm i.d. x 250 mm L (Phenomenex)

이동상: 아세토니트릴: 물: KH₂PO₄: SDS = 500:500:3.4:1.7

유속: 1 ㎖/min

검출: photodioid array detector로 254 ㎚에서 측정

HPLC 분석 결과 황백피 추출물에는 도 10에 나타난 바와 같이 팔마틴은 10.629 분에 검출되었으며, 그 함량이 0.988%, 베르베린은 11.314 분에 검출되었고 1.963% 함유되어 있었으나 본 발명의 조성물에서는 팔마틴이 11.751분에 검출되었고 함량은 0.229%였고, 베르베린은 12.650분에 검출되었고 함량이 0.405%로 혼합 추출할 때 수율이 감소하는 경향을 보였다(도 11).

본 발명에 따른 조성물은 B형 간염 바이러스를 억제하고 간경화에 의해 섬유화된 섬유화된 간세포를 재생하는 효과를 가진다. 특히, 부작용이 없고 약물 내성도 유발하지 않기 때문에 장기간 투여할 수 있고 장기간의 투여에 의해서도 조성물의 활성이 지속되는 특징이 있다. 따라서, B형 간염 및 간경화의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (6)

1. 황백피와 마타리의 추출물을 건조 중량을 기준으로 1:0.2 내지 1:5의 비율로 포함하는 혼합 추출물을 치료적 유효량으로 함유하는 B형 간염 치료용 조성물.
2. 황백피와 마타리의 추출물을 건조 중량을 기준으로 1:0.2 내지 1:5의 비율로 포함하는 혼합 추출물을 치료적 유효량으로 함유하는 간경화 치료용 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 황백피와 마타리의 혼합추출물을 성인 체중 1㎏당 10 내지 50㎎의 양으로 투여하는 조성물.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제, 시럽제 또는 식용음료의 형태로서 제제학적으로 허용되는 부형제를 가하여 제형화된 조성물.