CN113925948B - 生姜总提取物或其活性成分的用途、药物组合物和制法 - Google Patents

生姜总提取物或其活性成分的用途、药物组合物和制法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了生姜总提取物或其活性成分的用途。本发明提供了生姜总提取物或其活性成分在制备用于预防和/或治疗糖尿病眼病的药物中的用途。根据本发明所述的用途，其中所述活性成分为6‑姜辣素和/或6‑姜烯酚。本发明提供了一种用于治疗糖尿病眼病的药物组合物，所述药物组合物包括6‑姜辣素和6‑姜烯酚。本发明人发现生姜总提取物、6‑姜辣素和6‑姜烯酚均可有效治疗I型及II型糖尿病眼病，其中，单独使用6‑姜辣素或6‑姜烯酚治疗糖尿病眼病的效果优于其当量的生姜总提取物，提示6‑姜辣素和6‑姜烯酚能更有效的防治糖尿病眼病，并且6‑姜辣素和6‑姜烯酚的联合使用，治疗糖尿病眼病具有意料不到的技术效果。

Description

生姜总提取物或其活性成分的用途、药物组合物和制法
技术领域
本发明属于中药领域。具体地，本发明涉及一种生姜总提取物或其活性成分的用途。更具体地，本发明涉及所述生姜总提取物或其活性成分在制备用于预防和/或治疗糖尿病眼病的药物中的用途。本发明还提供了所述生姜总提取物及其活性成分的制备方法、含有其的药物组合物以及该药物组合物的制备方法。
背景技术
糖尿病性视网膜疾病是糖尿病最常见的并发症之一，中医属“消渴内障”范畴。糖尿病微血管及神经病变往往可造成不可逆的损伤。无论是由于自身不能产生足够胰岛素的I型糖尿病还是非胰岛素依赖型的II型糖尿病，长期的高血糖微环境都可导致糖尿病视网膜病变。其病理机制主要为增殖的微血管易破裂而导致视网膜和玻璃体出血，周细胞数量减少而内皮细胞数量增加，无细胞核血管增多，血管通透性增加和视神经损伤。若不及时诊治最终可致盲。目前尚无针对糖尿病视网膜病有效便捷的药物。对此，开辟一种新的安全有效的防治方法尤为重要。
根据《中国药典》(2015版)的记载，生姜(Zingiberis Rhizoma Recens)为姜科植物姜的新鲜根茎。姜属于药食同源类中药，其临床应用相当广泛。近年来，关于生姜提取物抗炎、抗氧化及抗肿瘤的药理学相关报道较为丰富。根据《中国药典》记载，姜辣素与其脱水产物姜烯酚在生姜中的含量很低(分别为0.05％和0.04％)，这严重制约了姜辣素和姜烯酚类化合物的活性研究，故此，针对生姜提取物的研究对姜类中药药理活性研究具有重要意义。姜辣素是生姜根茎中的主要刺激性化合物，赋予生姜特有的辛辣味。姜辣素有热不稳定性，容易发生脱水反应，形成姜烯酚。生姜缓解恶心和关节疼痛的功效主要与姜辣素有关。姜烯酚也具有多种生物活性，包括调节中枢神经系统，抗氧化，抗炎和抗过敏等功效。鉴于生姜的生物活性多样性，姜辣素和姜烯酚也是许多生姜制品质量控制的重要生物标志物。有报道称生姜可有效降低心脏病和肝脏病的发生率。
但是，现有技术中对生姜及其活性成分与糖尿病之间的相关性的研究性较少。
发明内容
因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一中生姜总提取物或其活性成分在制备用于预防和/或治疗糖尿病眼病的药物中的用途；本发明还提供了生姜总提取物或其活性成分的提取方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一方面，本发明提供了一种生姜总提取物或其活性成分在制备用于预防和/或治疗糖尿病眼病的药物中的用途。
根据本发明所述的用途，其中所述生姜总提取物包含挥发油、姜辣素和姜烯酚，其中主要活性成分为6-姜辣素和/或6-姜烯酚。
其中，所述生姜总提取物的主要有效成分是姜辣素和姜烯酚。其中姜辣素占生姜总提取物的重量百分比不低于0.55％，姜烯酚占生姜总提取物的重量百分比不低于0.28％；
更优选地，所述6-姜辣素占生姜总提取物的重量百分比不低于0.35％，6-姜烯酚占生姜总提取物的重量百分比不低于0.18％；
优选地，所述生姜总提取物还包括糖类、蛋白质、纤维素、胡萝卜素、维生素C、硫胺素、尼克酸、钙、磷和/或铁。
根据本发明所述的用途，其中，所述生姜总提取物是中药材生姜经过水煎煮提取，再将提取液进行冷冻干燥得到的提取物粉末。
根据本发明所述的用途，其中，所述生姜总提取物是生姜水提物所有提取成分，且至少包含6-姜辣素和6-姜烯酚
根据本发明所述的用途，其中，所述糖尿病眼病为I型或II型糖尿病引起的视网膜病变、视神经病变或脉络膜病变，优选地为视网膜病变。
另一方面，本发明提供了一种用于治疗糖尿病眼病的药物组合物，其中，所述药物组合物包含6-姜辣素和6-姜烯酚。
根据本发明所述的药物组合物，其中，所述6-姜辣素与6-姜烯酚的质量比为0.1～10:1；更优选地为0.5～5:1；最优选地为1:1。
根据本发明所述的药物组合物，其中，还包含一种或多种药学上可接受的辅料和/或赋形剂；优选地，所述辅料和/或赋形剂选自溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂和着色剂中的一种或多种。
根据本发明所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为口服制剂或注射制剂；优选地，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸或口服液体制剂。
根据本发明所述的药物组合物，其中，所述糖尿病眼病为I型或II型糖尿病引起的视网膜病变、视神经病变或脉络膜病变，优选地为视网膜病变。
再一方面，本发明提供了一种生姜总提取物的提取方法，其包括以下步骤：
将生姜用重量为生姜重量8-12倍的水煎煮，过滤并将滤液浓缩、冷冻干燥，得到生姜总提取物；
优选地，所述方法包括以下步骤：
将生姜洗净去表皮，切片，干燥18-30小时，随后加入到重量为药材总重量8-12倍的沸水中煎煮1-3次，每次煎煮2-3小时，定性滤纸滤过，合并滤液并浓缩冷冻真空干燥，得到生姜总提取物；
更优选地，所述方法包括以下步骤：
将生姜洗净去表皮，切片，放入60度烘箱中干燥24小时，粉碎过60目筛，加入到重量为药材总重量10倍的沸水中煎煮2次，每次煎煮2.5小时，定性滤纸滤过，合并滤液并浓缩冷冻真空干燥，得到生姜总提取物。
优选地，所述生姜产于中国山东省。
再另一方面，本发明提供了一种6-姜辣素的提取方法，其包括以下步骤：
1)使用乙醇浸提新鲜生姜，并将所得乙醇提取液旋蒸浓缩至乙醇被清除，得到浓缩提取液；
2)将浓缩提取液溶于去离子水中，用乙酸乙酯萃取，并进行旋蒸浓缩；
3)将旋蒸浓缩的提取液相使用大孔树脂分离，分别用30％和60％体积浓度的乙醇依次洗脱，并进行旋蒸浓缩，得到6-姜辣素粗提物；
优选地，所述方法包括以下步骤：1)选取体积浓度为90％的乙醇浸提新鲜生姜2.5小时，并将所得乙醇提取液在45℃下旋蒸浓缩至乙醇被清除，得到浓缩提取液；
2)将浓缩提取液溶于去离子水中，用3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，并再次进行旋蒸浓缩；
3)大孔吸附树脂用体积分数为90％的乙醇浸泡24小时后上柱，用体积分数为90％的乙醇冲洗，然后再用去离子水冲洗到无醇味；将步骤2)得到的浓缩液溶解在体积分数为30％的乙醇中上样吸附；随后，分别用3倍于柱体积的体积分数分别为30％和60％的乙醇依次洗脱，并在45℃下，旋蒸浓缩，得到6-姜辣素粗提物。
在一个优选的实施例中，使用HPLC外标法检测，使用本申请的方法得到的6-姜辣素的纯度为80％
再另一方面，本发明提供了一种6-姜烯酚的提取方法，其包括以下步骤：
a.将新鲜生姜打碎成粉，溶于乙醇盐酸水溶液充分混匀并加热旋蒸；
b.将步骤a.得到生姜乙醇盐酸水溶液用乙酸乙酯萃取，并旋蒸浓缩萃取液，得到6-姜烯酚粗提物。
优选地，所述方法包括以下步骤：
a.新鲜生姜打碎成粉，随后溶于含0.5M盐酸的体积浓度为50％的乙醇水溶液中，充分混匀并在70℃下加热旋蒸100分钟；
b.将得到的生姜乙醇盐酸水用3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，并再次旋蒸浓缩得到6-姜烯酚粗提物。
任选地，所述方法还包括将6-姜烯酚粗提物进行硅胶柱色谱分离梯度洗脱，之后收集洗脱液并旋转蒸发成浓缩液，将浓缩液冷冻干燥后得到6-姜烯酚提取物的步骤；
更优选地，所述洗脱进行3次，洗脱剂的极性依次为(1)石油醚:乙酸乙酯＝55:1；(2)石油醚:乙酸乙酯＝30:1；(3)石油醚:乙酸乙酯＝25:1；其中将第(2)和(3)次洗脱液需要收集并旋转蒸发成浓缩液，将浓缩液冷冻干燥得到6-姜烯酚提取物。
在一个优选的实施例中，使用HPLC外标法检测，使用本申请的方法得到6-姜烯酚的纯度为82％。
再另一方面，本发明提供了所述组合物的制备方法，其包括以下步骤：
I.提取6-姜辣素；
II.提取6-姜烯酚；
III.将6-姜辣素和6-姜烯酚按质量比混合，加入到重量为其总重量10倍的沸水中煎煮2次，每次煎煮1小时，滤过后合并滤液并浓缩，得到所述组合物。
再另一方面，本发明提供了一种治疗糖尿病眼病的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的生姜总提取物或其活性成分。
其中，所述生姜总提取物包含挥发油、姜辣素和姜烯酚，其中所述活性成分为6-姜辣素和/或6-姜烯酚；
优选地，述姜辣素占生姜总提取物的重量百分比不低于0.55％，姜烯酚占生姜总提取物的重量百分比不低于0.28％；
更优选地，所述6-姜辣素占生姜总提取物的重量百分比不低于0.35％，6-姜烯酚占生姜总提取物的重量百分比不低于0.18％；
优选地，所述生姜总提取物还包括糖类、蛋白质、纤维素、胡萝卜素、维生素C、硫胺素、尼克酸、钙、磷和/或铁。
其中，所述糖尿病眼病为I型或II型糖尿病引起的视网膜病变、视神经病变或脉络膜病变，优选地为视网膜病变。
其中，所述生姜总提取物或其活性成分(6-姜辣素和/或6-姜烯酚)的在实验小鼠中(db/db小鼠，C57BL/j，BABL/c)给予量为20mg/kg。
与现有技术相比，本发明的方法具备以下优点：
1.本发明的预防或治疗糖尿病眼病的生姜总提取物或其活性成分廉价易得，制备方法简单，并且给药方便。
2.通过药理研究，本发明人发现生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚均可有效治疗I型及II型糖尿病眼病，其中，单独使用6-姜辣素或6-姜烯酚治疗糖尿病眼病的效果优于其当量的生姜总提取物，提示6-姜辣素和6-姜烯酚能更有效的防治糖尿病眼病。
3.本发明人进一步发现，将6-姜辣素和6-姜烯酚联合使用比单独使用6-姜辣素或6-姜烯酚能有显著有效的防治I型及II型糖尿病眼病。由此可见，6-姜辣素和6-姜烯酚的联合使用，治疗糖尿病眼病具有意料不到的技术效果。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1A-图1D表明了本发明的生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚对II型糖尿病db/db小鼠糖尿病眼病的防治作用。其中，图1A分别示出了正常、模型、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚小鼠的视网膜血管铺片(在0.076mm2视网膜中的个数(250*250μM))；图1B分别示出了正常、模型、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚小鼠的视网膜血管周细胞与内皮细胞数量之比；图1C分别示出了正常、模型、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚小鼠的视网膜无核血管数量；图1D分别示出了正常、模型、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组小鼠的Evans Blue血管通透性测试结果，BRB通透性(Blood-retinal barrier permeability)。
图2A-图2D示出了本发明的生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚对免疫系统紊乱引起的I型糖尿病眼病的防治作用。其中，图2A分别示出了正常、模型、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组小鼠的视网膜血管铺片(在0.076mm2视网膜中的个数(250*250μM))；图2B分别示出了正常、模型、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组小鼠的视网膜血管周细胞与内皮细胞数量之比；图2C分别示出了正常、模型、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组小鼠的视网膜无核血管数量；图2D分别示出了正常、模型、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚小鼠的Evans Blue血管通透性测试结果，BRB通透性。
图3A-图3D示出了本发明的生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚对胰岛素缺乏引起的I型糖尿病眼病的防治作用。其中，图3A分别示出了正常组、模型组、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组小鼠的视网膜血管铺片(在0.076mm2视网膜中的个数(250*250μM))；图3B分别示出了正常组、模型组、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组小鼠的视网膜血管周细胞与内皮细胞数量之比；图3C分别示出了正常组、模型组、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组小鼠的视网膜无核血管数量；图3D分别示出了正常组、模型组、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组小鼠的Evans Blue血管通透性测试结果，BRB通透性。
图4A示出了生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚对晚期糖基化终末产物(AGE)生成的体外抑制作用；图4B示出了生姜总提取物和6-姜辣素和6-姜烯酚对db/db小鼠血液中的AGE含量的抑制作用；图4C示出了生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚对NOD小鼠血液中的AGE含量的抑制作用；图4D示出了生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚对链脲佐菌霉素(STZ)引起的高血糖小鼠血液中的AGE含量的抑制作用。
图5A-图5D示出了本发明的生姜总提取物、6-姜辣素、6-姜烯酚以及“6-姜辣素+6-姜烯酚组合”治疗糖尿病眼病的效果比较。其中，图5A分别示出了正常组、模型组、生姜总提取物、6-姜辣素、6-姜烯酚以及“6-姜辣素+6-姜烯酚组合”组小鼠的视网膜血管周细胞与内皮细胞数量之比(在0.076mm2视网膜中的个数(250*250μM))；图5B分别示出了正常组、模型组、生姜总提取物、6-姜辣素、6-姜烯酚以及“6-姜辣素+6-姜烯酚组合”组小鼠的视网膜无核血管数量；图5C分别示出了正常组、模型组、生姜总提取物、6-姜辣素、6-姜烯酚以及“6-姜辣素+6-姜烯酚组合”组小鼠的Evans Blue血管通透性测试结果，BRB通透性；图5D分别示出了正常组、模型组、生姜总提取物、6-姜辣素、6-姜烯酚以及“6-姜辣素+6-姜烯酚组合”组小鼠的db/db小鼠血液中的AGE含量。
具体实施方式
下面结合如下实施例对本发明做更进一步的详细说明，其并不意味着限制本发明。
实验药材和试剂：
生姜药材采自中国山东省，经鉴定为《中国药典》(2015版)【生姜】项下所载药材。
链脲佐菌霉素购自美国Sigma公司。
实验动物
C57BL/KsJ/db-/-小鼠(db/db小鼠)购自美国Jackson实验室。
NOD小鼠(免疫缺陷型)：购自香港大学实验动物中心。
BABL/c小鼠购自香港大学实验动物中心。
C57BL/J小鼠购自香港大学实验动物中心。
实施例1生姜总提取物的提取
将生姜药材500g洗净去表皮，切片后放入60度烘箱中干燥24小时，随后粉碎过60目筛并加入重量为药材总重量10倍的沸水中煎煮2次，每次煎煮2.5小时，滤过，合并滤液并浓缩冷冻真空干燥，最终得到生姜总提取物9.54g。
采用高效液相色谱法测定生姜总提取物中6-姜辣素和6-姜烯酚的含量占生姜总提取物的重量百分比分别为0.35％和0.18％。
实施例2生姜提取6-姜辣素的提取
6-姜辣素提取的工艺流程如下：
新鲜生姜→体积分数为90％的乙醇浸提→旋蒸浓缩→乙酸乙酯2倍体积萃取3次→旋蒸浓缩萃取的乙酸乙酯相→大孔吸附树脂分离→逆流色谱纯化→得到6-姜辣素。
具体实施方案如下：
1.选取体积分数为90％的乙醇浸提新鲜生姜2.5小时，将所得乙醇提取液旋蒸浓缩(旋蒸温度为45度)，直到乙醇被清除，获得浓缩提取液。
2.将提取液溶解于去离子水中，用3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，并再次进行旋蒸浓缩。
3.将旋蒸浓缩的生姜乙酸乙酯相进行大孔树脂分离，并浓缩提取6-姜辣素。将大孔吸附树脂用体积分数90％乙醇浸泡24小时后上柱，用体积分数90％乙醇冲洗然后再用去离子水冲洗到无醇味。将溶解在30％乙醇中的生姜乙酸乙酯溶液上样吸附。随后，分别用3倍于柱体积的体积分数30％和60％的乙醇依次洗脱并进行旋蒸浓缩(旋蒸温度为45度)，得到6-姜辣素粗提物。
HPLC外标法检测6-姜辣素的纯度为80％。
实施例3生姜提取6-姜烯酚的提取
6-姜烯酚从药材生姜中的提取工艺条件如下：
6-姜烯酚提取的工艺流程如下：
新鲜生姜→50％乙醇盐酸水溶液(0.5M盐酸)→加热旋蒸浓缩→乙酸乙酯3倍体积萃取3次→旋蒸浓缩萃取的乙酸乙酯相→硅胶柱色谱分离梯度洗脱→得到6-姜烯酚。
具体实施方案如下：
首先，新鲜生姜打碎成粉，随后溶于体积分数50％乙醇盐酸水溶液(0.5M盐酸)充分混匀并70度加热旋蒸100分钟。将所得生姜乙醇盐酸水用3倍体积的乙酸乙酯萃取3次并再次旋蒸浓缩得到6-姜烯酚粗提物。
将旋蒸浓缩的生姜乙酸乙酯相进行硅胶柱色谱分离梯度洗脱。一共洗脱3次，洗脱剂的极性依次为(1)石油醚:乙酸乙酯＝55:1；(2)石油醚:乙酸乙酯＝30:1；(3)石油醚:乙酸乙酯＝25:1.其中第(2)和(3)次洗脱液需要收集并旋转蒸发成浓缩液。随后将浓缩液冷冻干燥得到6-姜烯酚提取物。
用HPLC外标法测得其纯度为82％。
实施例4 6-姜辣素+6-姜烯酚组合物的制备
将实施例2和实施例3中得到的6-姜辣素和6-姜烯酚提取物按照6-姜辣素和6-姜烯酚的质量之比为1:1混合，加入重量为药材总重量10倍的沸水中煎煮2次，每次煎煮1小时，滤过后合并滤液并浓缩后得到6-姜辣素+6-姜烯酚的组合物。
实施例5片剂的制备
向实施例1-4中制得的中药提取物中加入按重量计占20％的HPMClvioo，10％的乳糖和1％的硬脂酸镁，制备片剂。
实施例6胶囊剂的制备
向实施例1-4制得的中药提取物中按1:1的重量比加入淀粉，制备胶囊剂。
实施例7生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚分别对II型糖尿病小鼠db/db糖尿病 眼病的防治作用
8周雄性C57BL/KsJ/db-/-小鼠(db/db小鼠)，随机分成5组，分别为正常组、模型组、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组，其中同窝野生型C57BL/KsJ/db-/-小鼠作为正常组对照。生姜总提取物治疗组每天口服灌胃实施例1-3中制备的生姜总提取物(20mg/kg)、6-姜辣素(20mg/kg)和6-姜烯酚(20mg/kg),分别每天口服灌胃持续8周。正常组和模型组大鼠分别灌胃等量蒸馏水。8周后，各组小鼠处死，采用Evans Blues法测定视网膜血管通透性；摘取眼球剥离视网膜进行血管铺片，对周细胞、内皮细胞和无核血管进行计数。结果表明，生姜总提取物(20mg/kg)、6-姜辣素(20mg/kg)和6-姜烯酚(20mg/kg)均能够显著提高糖尿病小鼠视网膜血管上周细胞与内皮细胞的比例，恢复到正常组水平(图1A和1B)，降低无核血管数量(图1A和1C)，并减少Evans Blues的眼底泄漏(图1D)，提示视网膜通透性减少。值得注意的是治疗糖尿病眼病疗效排序为6-姜烯酚＞6-姜辣素＞生姜总提取物。这些结果表明生姜中的6-姜辣素和6-姜烯酚能更针对性有效地治疗糖尿病眼病。
实施例8生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚对免疫性胰岛炎诱发的I型糖尿病 NOD小鼠模型糖尿病眼病的防治作用
8周雄性NOD小鼠(免疫缺陷型)，随机分成5组，分别为正常组、模型组、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组。野生型BABL/c小鼠作为正常组对照。生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚治疗组每天口服灌胃实施例1-3中制备的生姜总提取物(20mg/kg)、6-姜辣素(20mg/kg)和6-姜烯酚(20mg/kg)，持续8周。正常组和模型组大鼠分别灌胃等量蒸馏水。8周后，各组小鼠处死，采用Evans Blues法测定视网膜血管通透性；摘取眼球剥离视网膜进行血管铺片，对周细胞、内皮细胞和无核血管进行计数。结果表明，生姜总提取物(20mg/kg)、6-姜辣素(20mg/kg)和6-姜烯酚(20mg/kg)都能够显著提高糖尿病小鼠视网膜血管上周细胞与内皮细胞的比例，恢复到正常组水平(图2A和2B)，降低无核血管数量(图2A和2C)，并减少Evans Blues的眼底泄漏(图2D)，提示视网膜通透性减少。这些结果表明生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚能够抑制免疫性胰岛炎诱发的I型糖尿病引起的视网膜病变。6-姜烯酚的疗效要好于6-姜辣素和生姜总提取物。
实施例9生姜提取物对于胰岛素缺乏诱发的I型糖尿病眼病的防治作用
8周雄性C57BL/J小鼠，随机分成随机分成5组，分别为正常组、模型组、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组。除正常组外，其它三组小鼠空腹腹腔注射链脲佐菌霉素(STZ)55mg/kg，连续五天。稳定两天后，测定随机血糖于18.0-25.0mmol/d者纳入研究中。生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚治疗组每天口服灌胃实施例1-3中制备的生姜总提取物(20mg/kg)、6-姜辣素(20mg/kg)和6-姜烯酚(20mg/kg)。持续8周。正常组和模型组大鼠分别灌胃等量蒸馏水。8周后，各组小鼠处死，采用Evans Blues法测定视网膜血管通透性；摘取眼球剥离视网膜进行血管铺片，对周细胞、内皮细胞和无核血管进行计数。结果表明，生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组均能显著提高糖尿病小鼠视网膜血管上周细胞与内皮细胞的比例，恢复到正常组水平(图3A和3B)，降低无核血管数量(图3A和3C)，并减少EvansBlues的眼底泄漏(图3D)，提示视网膜通透性减少。这些结果表明生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚都能够抑制胰岛素缺乏诱发的I型糖尿病引起的视网膜病变，6-姜烯酚的疗效好于6-姜辣素和生姜总提物。
实施例10生姜提取物作为晚期糖基化终末产物(AGE)抑制剂的应用
发明人考察葡萄糖和牛血清白蛋白(BSA)(美国Sigma公司)诱导的AGE形成是否被生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚抑制。采用非酶催化系统，将50mg/ml BSA，144mg/ml葡萄糖和0.2M磷酸盐缓冲生理盐水(美国Sigma公司)在37摄氏度情况下共孵育7天作为AGE诱导混合剂。生姜总提取物、6-姜辣素或6-姜烯酚组中加入0.1mg/ml AGE诱导混合剂。根据实施例1步骤1-3中的方法制备生姜总提取物、6-姜辣素或6-姜烯酚，随后和AGE诱导混合剂共孵育。七天后于荧光定量仪测定AGE浓度(激发光栅370nm，发射光栅440nm)。结果表明加入生姜总提取物、6-姜辣素或6-姜烯酚后，AGE的体外生成明显被抑制(图4A)。同时发明人采用免疫酶连反应法(ELISA)测定正常组、模型组、生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组各组小鼠血清中含量，结果显示生姜总提取物、6-姜辣素和6-姜烯酚组均能够显著减少血清中AGE的含量(图4B-4D)，并且6-姜烯酚的治疗效果显著更好。
实施例11生姜提取物中的6-姜辣素和6-姜烯酚联合用药
利用实施例9中动物模型，发明人察了实施例2-3中制备的6-姜辣素和6-姜烯酚联合用药对糖尿病眼病的治疗作用。STZ小鼠分为5个组，分别为正常组、模型组、6-姜辣素、6-姜烯酚以及“6-姜辣素+6-姜烯酚组合”组。生姜总提取物、6-姜辣素、6-姜烯酚、“6-姜辣素+6-姜烯酚组合”治疗组每天口服灌胃实施例1-3中制备的生姜总提取物(20mg/kg)、6-姜辣素(20mg/kg)、6-姜烯酚(20mg/kg)以及“6-姜辣素+6-姜烯酚组合(6-姜辣素10mg/kg+6-姜烯酚10mg/kg)”，正常组与模型组给予等量水。结果表明6-姜辣素10mg/kg+6-姜烯酚联合用药组对糖尿病小鼠视网膜血管上周细胞与内皮细胞的比例(图5A)，无核血管数量(图5B)，Evans Blues的眼底泄漏(图5C)和AGE形成量(图5D)相对于单独使用6-姜辣素或6-姜烯酚具有显著更好的改善作用，提示6-姜辣素和6-姜烯酚组合联合用药可以更好的预防和治疗糖尿病眼病的效果。
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式的范例，但本领域的技术人员应当理解，以上这些仅为举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均应落入本发明的保护范围。

Claims (20)

1.6-姜辣素和6-姜烯酚作为仅有活性成分在制备用于预防和/或治疗糖尿病眼病的药物中的用途，所述6-姜辣素与6-姜烯酚的质量比为0.5~5: 1。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述糖尿病眼病为I型或II型糖尿病引起的视网膜病变、视神经病变或脉络膜病变。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述糖尿病眼病为I型或II型糖尿病引起的视网膜病变。
4. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述6-姜辣素与6-姜烯酚的质量比为1: 1。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物还包含一种或多种药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述辅料选自溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂和着色剂中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物为口服制剂或注射制剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、或口服液体制剂。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述口服制剂为混悬剂或滴丸。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述6-姜辣素是通过包括以下步骤的方法制备的：
1）使用乙醇浸提生姜，并将所得乙醇提取液旋蒸浓缩至乙醇被清除，得到浓缩提取液；
2）将浓缩提取液溶于去离子水中，用乙酸乙酯萃取，并进行旋蒸浓缩；
3）将旋蒸浓缩的提取液相使用大孔树脂分离，分别用30%和60%体积浓度的乙醇依次洗脱，并进行旋蒸浓缩，得到6-姜辣素粗提物。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述6-姜辣素是通过包括以下步骤的方法制备的：
1）选取体积浓度为90%的乙醇浸提新鲜生姜2.5小时，并将所得乙醇提取液在45℃下旋蒸浓缩至乙醇被清除，得到浓缩提取液；
2）将浓缩提取液溶于去离子水中，用3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，并再次进行旋蒸浓缩；
3）大孔吸附树脂用体积分数为90%的乙醇浸泡24小时后上柱，用体积分数为90%的乙醇冲洗，然后再用去离子水冲洗到无醇味；将步骤2）得到的浓缩液溶解在体积分数为30%的乙醇中上样吸附；随后，分别用3倍于柱体积的体积分数分别为30%和60%的乙醇依次洗脱，并在45℃下，旋蒸浓缩，得到6-姜辣素粗提物。
12.根据权利要求10或11所述的用途，其中，使用HPLC外标法检测得到6-姜辣素的纯度。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述6-姜烯酚是通过包括以下步骤的方法制备的：
a. 将新鲜生姜打碎成粉，溶于乙醇盐酸水溶液充分混匀并加热旋蒸；
b. 将步骤a.得到生姜乙醇盐酸水溶液用乙酸乙酯萃取，并旋蒸浓缩萃取液，得到6-姜烯酚粗提物。
14. 根据权利要求1所述的用途，其中所述6-姜烯酚是通过包括以下步骤的方法制备的：a. 新鲜生姜打碎成粉，随后溶于含0.5M盐酸的体积浓度为50%的乙醇水溶液中，充分混匀并在70℃下加热旋蒸100分钟；
b. 将得到的生姜乙醇盐酸水用3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，并再次旋蒸浓缩得到6-姜烯酚粗提物。
15.根据权利要求13或14所述的用途，其中，所述方法还包括将6-姜烯酚粗提物进行硅胶柱色谱分离梯度洗脱，之后收集洗脱液并旋转蒸发成浓缩液，将浓缩液冷冻干燥后得到6-姜烯酚提取物的步骤。
16.根据权利要求15所述的用途，其中，所述洗脱进行3次，洗脱剂的极性依次为(1)石油醚:乙酸乙酯=55:1；(2)石油醚:乙酸乙酯=30:1；(3)石油醚:乙酸乙酯=25:1；其中将第（2）和（3）次洗脱液需要收集并旋转蒸发成浓缩液，将浓缩液冷冻干燥得到6-姜烯酚提取物。
17.根据权利要求13或14所述的用途，其中，使用HPLC外标法检测得到6-姜烯酚的纯度。
18.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物是通过包括以下步骤的方法制备的：
I. 提取6-姜辣素；
II. 提取6-姜烯酚；
III. 将6-姜辣素和6-姜烯酚按质量比混合，加入到重量为其总重量10倍的沸水中煎煮2次，每次煎煮1小时，滤过后合并滤液并浓缩。
19.根据权利要求18所述的用途，其中使用如权利要求10所述的方法提取6-姜辣素。
20.根据权利要求18所述的用途，其中使用如权利要求13所述的方法提取6-姜烯酚。
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