JP5773997B2 - シミラセマートaを単離するための方法 - Google Patents
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Description
サラシナショウマ属(Cimicifuga)の様々な種は、中国、韓国、および日本の医学において炎症状態の治療剤として用いられている。同様に、植物学的にアメリカショウマ(Cimicifuga racemosa L. Nutt(別名、アクタエア・ラセモーサ(Actaea racemosa))としても知られるブラックコホシュを含有する組成物は、アメリカおよびヨーロッパにおいてハーブの栄養補助食品として広く用いられている。歴史的に、ネイティブアメリカンの女性は、倦怠感、マラリア、リウマチ、異常な腎機能、喉の痛み、月経不順、および出産に関連する疾患の処置のためにブラックコホシュを用いた(Blementhal et al., 2000)。アジア諸国において、このハーブ、ならびにフブキショウマ(Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim.)、ショウマ(Cimicifuga foetida L.)、およびオオミツバショウマ(Cimicifuga heracleifolia Kom.)が含まれるサラシナショウマ属の他の種は、炎症、発熱、頭痛、疼痛、喉の痛み、および悪寒を処置するために用いられる(Foster, 1999; Kusano, 2001; Kim et al., 2004)。しかし、これらのハーブの基礎となる作用機序はまだ完全には解明されていない。
本発明は、サラシナショウマ属からシミラセマートAを単離および抽出するための材料および方法を提供する。本発明に従って、単離されたシミラセマートAを治療組成物としておよび/または栄養補助食品として用いることができる。加えて、単離されたシミラセマートAを、サラシナショウマ属の様々な種に関する生物活性化学マーカーおよび標準物質として用いることができる。
(a)サラシナショウマ属種の十分な量の材料を提供する段階;
(b)未処理の材料を粉砕する段階;
(c)粉砕した該材料を水性溶媒と混合する段階;および
(d)シミラセマートAを単離する段階
を含む、シミラセマートAを精製する方法を提供する。
[本発明1001]
(a)サラシナショウマ属(Cimicifuga)種の十分な量の未処理の材料を提供する段階;
(b)サラシナショウマ属種の未処理の該材料を約20℃〜約28℃の温度で水性極性溶媒と混合して、シミラセマートAを含む溶媒抽出物を得る段階;および
(c)該溶媒抽出物からシミラセマートAを単離する段階
を含む、サラシナショウマ属種からシミラセマートAを単離するための方法。
[本発明1002]
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いてシミラセマートAを前記溶媒抽出物から単離する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
HPLCを用いてシミラセマートAを約210 nmのUV吸光度において前記溶媒抽出物から溶出する、本発明1002の方法。
[本発明1004]
HPLCを用いてシミラセマートAを約23℃で前記溶媒抽出物から溶出する、本発明1003の方法。
[本発明1005]
サラシナショウマ属種の未処理の前記材料を粉砕して粉末にする、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記サラシナショウマ属種が、アメリカショウマ(Cimicifuga racemosa)、ショウマ(Cimicifuga foetida)、およびオオミツバショウマ(Cimicifuga heracleifolia)からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記サラシナショウマ属種がアメリカショウマである、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記水性極性溶媒が、濃度20%未満のエタノールを含む水-エタノールである、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記サラシナショウマ属種を約1:15(w/v)〜約1:20(w/v)の比率で水-エタノールと混合する、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記水性極性溶媒が水である、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記サラシナショウマ属種を約1:15(w/v)〜約1:20(w/v)の比率で水と混合する、本発明1010の方法。
[本発明1012]
アメリカショウマを約1:15(w/v)の比率で水と混合する、本発明1011の方法。
[本発明1013]
(a)サラシナショウマ属種の十分な量の未処理の材料を提供する段階;
(b)サラシナショウマ属種の未処理の該材料を約20℃〜約28℃の温度で水性極性溶媒と混合して、シミラセマートAを含む溶媒抽出物を得る段階;および
(c)該溶媒抽出物からシミラセマートAを単離する段階
からなる、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記水性極性溶媒が水である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記サラシナショウマ属種を約1:15(w/v)〜約1:20(w/v)の比率で水と混合する、本発明1014の方法。
[本発明1016]
サラシナショウマ属種を含有する治療組成物を標準化する方法であって、標準物質としてのシミラセマートAの濃度および/または生物活性を用いる方法。
本発明は、サラシナショウマ属の様々な種からシミラセマートAを単離および抽出するための材料および方法を提供する。本発明に従って、単離されたシミラセマートAを、治療組成物として、または栄養補助食品として用いることができる。加えて、単離されたシミラセマートAは、生物活性化学マーカーおよびサラシナショウマ属の様々な種に関する標準物質として用いることができる。
(a)サラシナショウマ属種の十分な量の未処理の材料を提供する段階;
(b)未処理の該材料を粉砕して粉末にする段階;
(c)該粉末を水性溶媒と混合する段階;および
(d)シミラセマートAを単離する段階
を含む、シミラセマートAを精製する方法を提供する。
水およびエタノール(およびその混合物)が含まれる極性の非毒性溶媒を用いてアメリカショウマからシミラセマートAを抽出した。この溶媒系は、活性な構成成分の異なる極性を抽出する場合に適しているのみならず、ヒトでの消費にとって許容可能である。用いられる溶媒の中で、水および20%またはそれ未満のエタノールはシミラセマートAの最高量を生じた。
本発明に従ってアメリカショウマからシミラセマートAのより高い量を抽出するためには、抽出温度の選択もまた非常に重要である。温度の上昇は、溶質-マトリクス相互作用結合を切断することによって拡散性を有意に増加させて、溶質の揮発性を増加させると報告されていた(Loncin and Merson 1979)。しかし、本発明に従って、室温を超えて温度を上昇させると、シミラセマートAの抽出収率が減少すると判定された。このことは、ハーブからのシミラセマートAの移動が室温(たとえば、25℃)で起こり、より高い温度では分解によりおそらく失われる可能性があることを示した。このように、本発明に従って、室温は、アメリカショウマからシミラセマートAを抽出するために好ましい抽出温度である。
超音波処理は、いくつかの場合において、乾燥ハーブ材料から化合物を抽出するための効率を改善させて、抽出時間を短縮することができる別の方法である。増強の基礎となる機序は、物質移動の強化および溶媒が乾燥ハーブ材料により容易に近づけることである(Vinatoru. 2001; Shotipruk et al., 2001)。分析の状況において、超音波処理は、慣用の抽出技術に対して迅速で、安価でかつ効率的な代替法であり、いくつかの場合において、超臨界流体抽出およびマイクロ波抽出に対する代替法でさえある(Luque-Garcia et ah, 2003)。しかし、本発明に従って、冷浸条件を用いた場合と比較すると、超音波処理は、シミラセマートAの抽出収率を改善しないことが見いだされた(図4および8)。
機器
Agilent 1200シリーズ高速液体クロマトグラフィー-光ダイオードアレイ(HPLC-DAD)(Palo Alto, CA. USA)システムを用いた。これはG1367cオートサンプラー、真空脱気装置、二元ポンプ、DAD検出器、およびLCワークステーションを備えた。ハーブから化合物を抽出するために、超音波浴(J. P. Selecta. Spain)を用いた。
試料を抽出して移動相を調製するために、ミリQ水システム(Millipore, Bedford, MA, USA)から脱イオン水を得た。標準溶液および/または試料溶液を調製するために、分析等級のエタノール(EtOH, Merck, Germany)を用いた。移動相を調製するために、HPLC等級のアセトニトリル(ACN, Tedia, USA)を用いた。
アメリカショウマの未処理の材料を、2008年5月にMonterey Bay Spice Company(Santa Cruz, USA)から購入した。粉砕器(IKA, Germany)を用いて、材料を粉砕して粉末にした。次に、粉末を乾燥器中で保存し、全ての実験に用いた。
水アルコール溶媒比の効果
アメリカショウマ(2 g)を0%、20%、40%、60%、80%、および100%(v/v)EtOH水溶液10 mlによって抽出した。抽出は、室温で30分間超音波処理することによって行った。各溶媒に関して3回同じ実験を行った。抽出工程を繰り返して、実験を3回行った。抽出物を4000 rpmで5分間遠心沈降させた後、濾紙(No 1 , Advantec, Japan)を通して濾過した。得られた濾液を蒸発させ、かつ抽出物の乾燥重量を得るために凍結乾燥させた。
3種類の抽出温度(室温、50℃および100℃)を用いてシミラセマートAの抽出収率を調べた。アメリカショウマの乾燥粉末(2.0 g)を、ミリQ水10 mlによって各々の抽出温度で30分間超音波処理した。各温度について実験を3回繰り返し、抽出工程を3回繰り返した。抽出物を4000 rpmで5分間遠心沈降させた後、上記の濾紙を通して濾過した。次に、抽出物の乾燥重量を得るために、得られた濾液を凍結乾燥した。
アメリカショウマ(2.0 g)を室温でミリQ水10 mlによって抽出した。5、10、20、および30分間の冷浸および/または超音波処理によって抽出を行った。各抽出時間について同じ実験を3回行い、抽出工程を3回繰り返した。抽出物を4000 rpmで5分間遠心沈降させた後、上記の濾紙を通して濾過した。抽出物の乾燥重量を得るために、得られた濾液を蒸発させて凍結乾燥させた。
アメリカショウマ(2.0 g)をミリQによって、1:5(w/v)、1:10(w/v)、1:15(w/v)、および1:20(w/v)の比率で、室温で30分間連続的に超音波処理することによって抽出した。各抽出体積に関して同じ実験を3回繰り返して、抽出工程を3回繰り返した。抽出物を4000 rpmで5分間遠心沈降させて、上記の濾紙を通して濾過した。抽出物の乾燥重量を得るために、得られた濾液を蒸発させて凍結乾燥させた。
乾燥抽出物をメタノール(MeOH)(25 mg/ml)に溶解した後、逆相Lichrospher 100 C18(250×4.6 mm内径、5μm)カラム(Alltech, USA)を用いてHPLCによって測定した。ACN(25〜90%で15分間)およびミリQ水(75〜10%で15分間)を用いて、直線勾配溶出によって分離を行った。流速は1.0 ml/分であった。検出波長およびカラム温度をそれぞれ、210 nmおよび23℃に設定した。注入体積は5μlであった。他の溶出ピークからのシミラセマートAの最善の分離が与えられるように、この実施条件を最適化した。
アメリカショウマの3つの対応物:フブキショウマ、ショウマ、およびオオミツバショウマは、Purapharm International(H.K.)Ltdから提供された。各ハーブ(2.0 g)をミリQ水40 mlによって室温で超音波処理(30分間)によって抽出した。抽出工程を3回繰り返して、各ハーブに関して同じ実験を3回行った。水性抽出物を凍結乾燥した後、MeOHに溶解して最終濃度25 mg/mlを得た。ハーブのフィンガープリントのみならず、シミラセマートAの収率百分率を上記のHPLC-PDAを用いて測定した。
SPSS統計学パッケージを用いてデータを解析した。抽出条件におけるシミラセマートAの抽出収率の差を、Shapiro-Wilkの検定を用いて正規性に関して、およびCochranのC検定を用いて分散の均一性に関して調べた。次にそれらを一元配置ANOVAの後にTukey検定を用いて比較した。全ての場合において、有意性の閾値は5%であった。
HPLC条件の最適化
バイオアッセイ法によって誘導される分画および同定のスキームを用いて、抗炎症活性を有するシミラセマートA(図1)をアメリカショウマの水性抽出物から単離した。各抽出物からのシミラセマートAを定量するために、0.15625μg/μlから1.25μg/μlの範囲の検量線を得た(y=9197.4x−12.457、R2=0.9993)。
水アルコール溶媒比の効果
抽出溶媒におけるエタノール含有量に関連したアメリカショウマにおけるシミラセマートAの収率百分率を図2および6に示す。図2に示されるように、シミラセマートAのピーク(*で示す)は、0%エタノール(すなわち、100%水)で最高であったが、これはエタノール含有量が増加すると実質的に低くなった。エタノール含有量が0%から100%に増加すると、シミラセマートAの抽出収率は、1.36%から0.19%まで減少した(図6)。結果は、エタノール含有量が、アメリカショウマからのシミラセマートAの抽出に影響を及ぼし、抽出溶媒中のエタノール含有量が増加すると、抽出効率が減少することを示した。したがって、さらなる研究のために水を抽出溶媒として用いた。
温度がシミラセマートAの抽出収率にどのように影響を及ぼすかを調べるために、アメリカショウマを異なる3種類の温度条件で抽出した:室温、50℃および100℃。図3に、最適化されたHPLC条件から得られた抽出物のクロマトグラムを示した。シミラセマートAのピーク(*で示す)は、室温で最高であり、室温から50℃、次に100℃の順に実質的に低くなった(図3)。加えて、室温、50℃、および100℃でのシミラセマートAの抽出収率はそれぞれ、1.24、0.51、および0.11%であった(図7)。結果は、温度がシミラセマートAの抽出収率に有意に影響を及ぼすこと(Tukey検定、p<0.05)、および温度が増加するとシミラセマートAの抽出効率は実質的に減少することを示した。したがって、今後の試験のために室温を選択した。
異なる時間の超音波処理を行ったアメリカショウマから抽出されたシミラセマートAの収率百分率を図4および8に示す。図4において、シミラセマートAのピークは、全ての抽出物において類似の強度で出現した。シミラセマートAの収率百分率は、0、5、10、20、および30分の超音波処理時間でそれぞれ、1.20、0.96、1.39、1.56、および1.34%であると測定された(図8)。本発明者らの結果は、超音波処理が、シミラセマートAの抽出収率を有意に増加させないことを示した(Tukey検定、p>0.05)。
アメリカショウマ由来のシミラセマートAの抽出効率に及ぼす溶媒の体積の効果を、1:5(w/v)、1:10(w/v)、1:15(w/v)、および1:20(w/v)の比率でミリQによってハーブを抽出することによって判定した。結果は、1:15(w/v)および1:20(w/v)から得たシミラセマートAのピーク強度が他の2つの比より高いことを示した(図5)。図9において、シミラセマートAの収率百分率は、水の1:5(w/v)、1:10(w/v)、1:15(w/v)、および1:20(w/v)の比率でそれぞれ、0.98%、0.93%、1.68%、および1.52%であると測定された。結果から、シミラセマートAのより高い抽出収率を得るために、アメリカショウマ対水の比率が1:15(w/v)より高くあるべきであることが判明した。
フブキショウマ、ショウマ、およびオオミツバショウマ由来のシミラセマートAの定量
同じ最適化抽出条件でハーブを抽出した後、ブラックコホシュの設定と同じHPLCの設定でクロマトグラフィーを行うことによって、フブキショウマ、ショウマ、およびオオミツバショウマの参照フィンガープリントを決定した。結果は、フブキショウマがシミラセマートAを含有しないが、ショウマ、およびオオミツバショウマは図10に示すように、異なるレベルのシミラセマートAを含有することを示した。一般的に、同じ最適化抽出およびHPLC条件を用いると、アメリカショウマのみならず、その対応物、すなわち、ショウマおよびオオミツバショウマの未処理ハーブ中の化合物を同定することは容易である。
本発明の化合物は、ウイルス、細菌、真菌、酵母、および他の微生物による感染症が含まれるがこれらに限定されるわけではない感染症に関連する炎症を処置するために用いることができる。加えて、本発明の化合物は、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、ロイコトリエン、および環境毒素が含まれるがこれらに限定されるわけではない多様な前炎症性因子によって媒介される炎症を処置するために用いることができる。
1つの態様において、本発明は、単離された化合物を提供する。本明細書において用いられる「単離された」とは、それらが本来存在しうる任意の環境から取り出されている化合物を指す。たとえば、単離されたシミラセマートAは、アメリカショウマに存在している状態のままのシミラセマートA化合物を指すのではない。好ましい態様において、本発明の化合物は、少なくとも75%純粋であり、好ましくは少なくとも90%純粋、より好ましくは95%より多く純粋であり、および最も好ましくは99%より多く純粋(実質的に純粋)である。
Claims (17)
- (a)サラシナショウマ属(Cimicifuga)種の十分な量の未処理の材料を提供する段階;
(b)サラシナショウマ属種の未処理の該材料を20℃〜28℃の温度で水性極性溶媒と混合して、シミラセマートAを含む溶媒抽出物を得る段階であって、前記水性極性溶媒は、水、または濃度20%未満のエタノールを含む水-エタノールである、前記段階;および
(c)該溶媒抽出物からシミラセマートAを単離して、シミラセマートAを含む液体又は乾燥組成物を生成する段階
を含む、サラシナショウマ属種からシミラセマートAを単離するための方法。 - 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いてシミラセマートAを前記溶媒抽出物から単離する、請求項1記載の方法。
- シミラセマートAが、210 nmのUV吸光度の検出波長での溶出を用いて単離される、請求項2記載の方法。
- HPLCを用いてシミラセマートAを23℃で前記溶媒抽出物から溶出する、請求項3記載の方法。
- 段階(a)及び(b)の間に、サラシナショウマ属種の未処理の前記材料を粉砕して粉末にする、請求項1記載の方法。
- 前記サラシナショウマ属種が、アメリカショウマ(Cimicifuga racemosa)、ショウマ(Cimicifuga foetida)、およびオオミツバショウマ(Cimicifuga heracleifolia)からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 前記サラシナショウマ属種がアメリカショウマである、請求項6記載の方法。
- 前記水性極性溶媒が、濃度20%未満のエタノールを含む水-エタノールである、請求項1記載の方法。
- 前記サラシナショウマ属種を1:15(w/v)〜1:20(w/v)の比率で水-エタノールと混合する、請求項8記載の方法。
- 前記水性極性溶媒が水である、請求項1記載の方法。
- 前記サラシナショウマ属種を1:15(w/v)〜1:20(w/v)の比率で水と混合する、請求項10記載の方法。
- アメリカショウマを1:15(w/v)の比率で水と混合する、請求項11記載の方法。
- (a)サラシナショウマ属種の十分な量の未処理の材料を提供する段階;
(b)サラシナショウマ属種の未処理の該材料を20℃〜28℃の温度で水性極性溶媒と混合して、シミラセマートAを含む溶媒抽出物を得る段階であって、前記水性極性溶媒は、水、または濃度20%未満のエタノールを含む水-エタノールである、前記段階;および
(c)該溶媒抽出物からシミラセマートAを単離して、シミラセマートAを含む液体又は乾燥組成物を生成する段階
からなる、請求項1記載の方法。 - 前記水性極性溶媒が水である、請求項13記載の方法。
- 前記サラシナショウマ属種を1:15(w/v)〜1:20(w/v)の比率で水と混合する、請求項14記載の方法。
- 単離されたシミラセマートAを、錠剤、カプセル剤、粉剤、ペレット剤、トローチ剤、坐剤、経口液、懸濁液、注射剤から選択される組成物に製剤化することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 単離されたシミラセマートAを、錠剤、カプセル剤、粉剤、ペレット剤、トローチ剤から選択される組成物に製剤化することをさらに含む、請求項16記載の方法。
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