KR20050100746A - 간 섬유화의 예방 또는 치료를 위한 혼합 생약추출물 및이를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간 섬유화의 예방 또는 치료를 위한 혼합 생약추출물 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인진(茵蔯), 창출(蒼朮), 후박(厚朴), 진피(陳皮), 저령(猪笭), 택사(澤瀉), 백출(白朮), 복령(茯笭), 나복자(蘿蔔子), 생강(生薑), 반하(半夏), 대복피(大腹皮), 삼릉(三稜), 봉출(蓬朮), 청피(靑皮) 및 감초(甘草)를 포함하는 혼합 생약재로부터 열탕 추출한 간 섬유화 억제 추출물 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 생약 추출물은 간 기능 회복, 간 조직의 섬유화 억제작용 및 염증 억제작용에 효과가 있어, 궁극적으로 간 섬유화 및 간경화의 예방 및 치료에 안전한 약제 및 건강식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

간 섬유화의 예방 또는 치료를 위한 혼합 생약추출물 및 이를 포함하는 약학적 조성물{Extract of herbal mixture and pharmaceutical composition for prevention or treatment of liver fibrosis}

본 발명은 간 섬유화의 예방 또는 치료를 위한 혼합 생약추출물 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인진(茵蔯), 창출(蒼朮), 후박(厚朴), 진피(陳皮), 저령(猪笭), 택사(澤瀉), 백출(白朮), 복령(茯笭), 나복자(蘿複子), 생강(生薑), 반하(半夏), 대복피(大腹皮), 삼릉(三稜), 봉출(蓬朮), 청피(靑皮) 및 감초(甘草)를 포함하는 혼합 생약재로부터 열탕 추출한 간 섬유화 억제 추출물 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

최근 우리나라 성인, 특히 40대의 사망 원인을 살펴보면 간암 및 간질환이 각각 17.3% 및 13.7%로 높은 비율을 차지하고 있다. 이러한 간질환 중 간경변(liver cirrhosis)은 그 원인, 발생기전 및 형태가 다양하고 복잡하며, 사망률이 높은 간질환 중의 하나로서, 간염 등으로 인한 간소엽의 지속적인 파괴와 이에 따른 섬유화 현상 및 재생결절로 인하여 간이 굳어지고 구조가 변형되면서, 간기능이 저하되고 문맥압이 높아지는 비가역적인 만성 간질환이다(고려의학 출판부, 간 담도 질환, 고려의학, pp.344-346, 1989; 우홍정 외, 간계내과학, 서울, 동양의학 연구원출판사, pp.323-327, 2001; 이문호, 내과학, 서울, 박애출판사, pp.1003-1015, 1977).

이와 달리 간 섬유증(liver fibrosis)은 여러 원인에 의하여 간에 염증이 유발되면, 그 부위로 각종 염증세포가 밀집되면서 유리되는 각종 사이토카인(cytokine)을 매개로 하여, 섬유아세포(fibroblast)의 콜라겐 합성은 촉진되는 반면 콜라겐의 분해는 억제되어 유발되는 것으로, 간경변과는 달리 가역적이고 가는 원섬유(thin fibril)로 구성되며, 결절 형성이 없어 간 손상의 원인이 제거되면 정상회복이 가능한 간질환이다. 그러나 이러한 간 섬유화 과정 또한 지속적으로 반복되면 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 간의 교차결합(crosslinking)이 증가하여 두꺼운 원섬유(thick fibril)와 결절이 형성되어 결국 비가역적인 간경변으로 이행된다(고려의학 출판부, 간 담도 질환, 고려의학, 344-346, 1989; 우홍정외, 간계내과학, 서울, 동양의학연구원 출판사, 323-327, 2001). 일반적으로 간의 소엽구조나 혈관구조가 정상적으로 유지되어 있는 경우에는 간 섬유증으로 분류하고, 간의 정상적인 구조가 파괴되고, 섬유성 격벽에 의해 분리된 비정상적인 결절이 생긴 경우에는 간경변증으로 분류한다(박찬일 외, 간질환의 병리, 서울, 고려의학, 32-37, 1992).

간에서 콜라겐(collagen)이 증가하면, 간 구조가 파괴되고, 동양구조가 모세혈관으로 전환되어, 기초막을 통한 혈관과 간세포 간의 대사교환에 장애를 일으키게 되는데, 이러한 모세혈관화를 야기하는 주된 요인인 콜라겐은 네 가지 형태가 있으며 그 중 제Ⅳ형 콜라겐이 간섬유화의 지표가 되는 것으로 알려져 있다(고려의학 출판부, 간 담도 질환, 고려의학, pp344-346, 1989; 박찬일 외, 간질환의 병리, 서울, 고려의학, pp32-37, 1992; 이문호, 내과학, 서울, 박애출판사, pp1003-1015, 1977; 박은전 외, 약학회지 41(2), 220-224, 1997). 결국 간경변의 치료는 콜라겐 합성을 억제하는 것과 관련이 있다고 할 수 있다(고려의학 출판부, 간 담도 질환, 고려의학, pp344-346, 1989).

한편, 한의학에서는 황달(黃疸), 창만(脹滿), 적취(積聚), 협통(脇痛) 등이 간질환 범주에 속한다(우홍정 외, 간계내과학, 서울, 동양의학연구원 출판사, pp.323-327, 2001; 반민구 외, 중의내과치료대성, 하북, 중국임상대계, pp.449-458, 1997). 이들의 원인은 습열(濕熱), 열독(熱毒), 한습(寒濕), 어혈(瘀血) 등이며, 특히 습열(濕熱)을 중시하여 청열이습(淸熱利濕)시키는 치료법을 가장 많이 사용하였고, 대표적인 처방은 고금의감(古今醫鑑)에 수록되어 있는 가감위령탕(加減胃笭湯), 금궤요략(金櫃要略)에 수록된 인진오령산(茵蔯五笭散), 중경전서(仲景全書)에 수록된 인진탕 등이 있다(중국고등중 의약교재 편찬심의위원회, 중의내과, 중국, 보건신문사, pp.94-100, 1995; 공정현, 고금의방, 남창, 강서과학기술출판사, p.163, 1990; 장중경, 금궤요략, 북경, 중의고적출판사, p.44, 1997).

최근에는 간 섬유화에 대한 효과적인 한의학적 약물 및 처방에 대한 선행 연구가 많이 이루어지고 있는데, 먼저, 사염화탄소(CCl₄)로 간 섬유화가 일어난 흰쥐에 인진(茵陳), 인진청간탕(茵陳淸肝湯) 또는 인진청간탕가미방(茵陳淸肝湯加味方)을 투여하였을때 간섬유화 억제에 유의한 결과를 얻은 것으로 나타났고(신상만 외, 대한한의학회지 22(3), 141-155, 2001; 승현석 외, 내과학회지 24(1), 21-32, 2003; 강경태 외, 대한한의학회지 23(2), 39-56, 2002), 소시호탕(小柴胡湯)과 가미지유탕(加味地楡湯)이 디메틸니트로사민(dimethylnitrosamine,DMN)으로 간 섬유화가 유도된 흰쥐에 효과적인 것으로 보고되었다(Ichiro Shimizu et al., Hepatology 29(1), 149-160, 1999; Jin Yeul Ma et al., 대한약학회지 28(4), 215-224, 1997). 이외에도, 박 등은 담도결찰을 통하여 간 섬유화를 유발시킨 흰쥐를 이용하여 영지배양 균사체 유래 다당체가 항섬유화에 효과적임을 발견하였고(박은전 외, 약학회지 41(2), 220-224, 1997), 최 등은 주차환(舟車丸)이 글루탐옥살아세트산 트랜스아미나제(GOT), 글루탐피루빈산 트랜스아미나제(GPT), 락트산 디하이드로게나제(LDH) 및 알칼라인 포스파타제(ALP) 효소 활성도에 대하여 억제 활성이 있음을 보고하였다(최은주 외, 대한 한방내과학회지 24(1), 55-67, 2003). 또한, 정 등은 홍화자가 사이토크롬(cytochrome) P450의 감소와 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(glutathione S-transferase)의 활성증가를 통해 간손상 보호 작용이 있음을 입증하였다(정춘식 외, Journal of Food Hygiene and Safety 14(2), 172-178, 1999). 하 등은 시호사물탕(柴胡四物湯)의 투여로 아스파탐 아미노트랜스퍼라아제 (aspartate aminotransferase, AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(alanine aminotransferase, ALT), 총 빌리루빈(total bilirubin), 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase, ALP)의 수준 및 간의 중량에 대해 중독된 개체들에 비해 대체로 유의성 있는 감소를 보인 것을 보고하였고(하태영 등, 한국수위병리학회지, 5(1), 9-16, 2001), 박 등은 금은화(金銀花) 부탄올 추출물에 간 보호 활성성분이 함유되어 있어 간 보호 작용이 있음을 확인하였다(박선관 등, 응용약물학회지 10, 32-36, 2002). 이밖에도, 고 등은 황연탕(黃連湯)이 간독성 물질에 의한 간세포 및 기능의 손상에 대해 독성 완화 및 보호효과가 있는 것을 보고 하였고(고원도 외, 대한본초학회지 14(2), 61-69, 1999), 서 등은 현호색(玄胡索) 물분획물이 ALP의 활성도 저하, 콜레스테롤 함량의 감소, 간조직 중의 트리글리세리드(triglyceride) 및 말론디알데히드(malondialdehyde; MDA) 수준을 저하시킴으로써 사염화탄소에 의한 간손상 보호 효과를 확인하였다(서인옥 외, 영양위생학회지 15(3), 226-234, 2000).

그러므로, 이러한 다수의 한방학적 연구 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 간 섬유증이 간손상의 원인 제거에 의하여 정상회복이 가능하다는 점을 고려하면, 간 섬유화를 억제하는 생약제의 개발로써 보다 안전하고 효과적인 간질환 예방 및 치료제를 개발할 수 있다고 판단하였다.

이에 본 발명자들은 간암과 간질환에 대한 예방 및 치료적 차원에서 간섬유화를 억제하는데 효과가 있을 것으로 사료되는 혼합 생약추출물을 제조하였다. 즉, 인진, 창출, 후박, 진피, 저령, 택사, 백출, 복령, 나복자, 생강, 반하, 대복피, 삼릉, 봉출, 청피 및 감초를 포함하는 혼합 생약재로부터 열탕 추출방법을 통하여 간섬유화 억제 추출물을 제조하였으며, 상기 추출물이 간기능 회복, 간조직의 섬유화 억제작용 및 염증 억제작용에 효과가 있어, 궁극적으로 간섬유화 및 간경화의 예방 및 치료에 활용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 간질환의 예방 및 치료를 위하여, 인진, 창출, 후박, 진피, 저령, 택사, 백출, 복령, 나복자, 생강, 반하, 대복피, 삼릉, 봉출, 청피 및 감초를 포함하는 혼합 생약재로부터 추출한 간 섬유화 억제 추출물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 생약추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 건강식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 인진, 창출, 후박, 진피, 저령, 택사, 백출, 복령, 나복자, 생강, 반하, 대복피, 삼릉, 봉출, 청피 및 감초를 포함하는 혼합 생약재로부터 추출한 간섬유화 억제 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명의 상기 간섬유화 억제 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 생약추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 건강식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 한방에서 간질환의 예방 또는 치료에 효과가 있는 것으로 알려진 인진, 창출, 후박, 진피, 저령, 택사, 백출, 복령, 나복자, 생강, 반하, 대복피, 삼릉, 봉출, 청피 및 감초를 포함하는 혼합 생약재로부터 간섬유화 억제 추출물을 열탕 추출하였다. 본 발명의 혼합 생약재는 인진:창출, 후박, 진피, 저령, 택사, 백출, 복령, 나복자, 생강:반하, 대복피, 삼릉, 봉출, 청피:감초를 4 내지 16:4 내지 8:3 내지 4:1 내지 4의 중량 조성비로 포함하며, 바람직하게는 8:4:3:2로 포함한다.

구체적으로 본 발명자들은 평위산(平胃散)과 사령산(四笭散)을 포함하는 위령탕을 바탕으로 하여, 대표약제인 인진(茵陳)을 배오하고, 반하(半夏), 대복피(大腹皮), 나복자(蘿蔔子), 삼릉(三稜), 봉출(蓬朮), 청피(靑皮) 및 감초(甘草)를 가미한 후 이를 열탕 추출하여 간섬유화 억제 추출물을 제조하였는데, 이는 청열이습(淸熱利濕) 및 퇴황(退黃)의 효능이 있는 인진(茵陳)과 화담(化痰)및 도체(導滯)의 효능이 있는 나복자(蘿蔔子), 하기관중(下氣寬中) 및 행기소종(行氣消腫)시키는 대복피(大腹皮), 소종산결(消腫散結)의 효능이 있는 삼릉(三稜) 및 봉출(蓬朮)을 가미한 처방으로, 만성간종(慢性肝腫)으로 면황혹부(面黃或浮)하고, 간협비만(肝脇肥滿)하며, 음식무미(飮食無味), 대편유설(大便濡泄), 권태(倦怠) 및 맥과(脈澁)한 임상증상에 사용가능한 처방이다(김영훈, 청강의감, 서울, 성보사, pp.210-211, 1995).

달리 말하면, 본 발명의 간섬유화 억제 추출물의 약물구성은 가감위령탕(加減胃笭湯)에서 군약(君藥)인 인진(茵陳)과 감초(甘草)를 가미하고, 백작약(白灼藥), 곽향(藿香) 및 산사자(山査子)를 제거하여 구성된 처방인데, 가감위령탕은 위령탕에서 백작약, 곽향, 반하, 대복피, 산사자, 나복자, 삼릉, 봉출 및 청피를 가미하여 음식무미(飮食無味), 사지무력(四肢無力), 행보권태(行步倦怠) 및 맥삽이유(脈澁而濡)한 증상을 수반하는 황달 치료에 응용된 처방이다. 가감위령탕의 기본 처방이 되는 위령탕(胃笭湯)은 『단계심법(丹溪心法)』에 수재되어 거습화위(祛濕和胃)의 효능으로 수종(水腫), 복창(腹脹) 또는 소편불리(小便不利) 등의 증상을 치료하며, 평위산(平胃散)과 오령산(五笭散)을 합방(合方)한 것이다(전국한의과대학, 방제학, 서울, 영림사, p.506, 1999). 평위산은 『태평혜민화제국방(太平惠民和劑局方)』에서 처음 수록되어 있으며 조습운비(燥濕運脾), 행기화위(行氣和胃)의 효능으로 광범위하게 활용되어 왔다. 또한 오령산은 『상한론(傷寒論)』에 기록되어 있으나, 본 발명의 간섬유화 억제 추출물의 구성에 포함되어 있는 사령산은『명의지장(明醫指掌)』이 출전으로 오령산에서 계지(桂枝)를 제거하여 구성된 처방으로 이수삼습(利水渗濕)의 효능을 특징으로 한다(유춘안, 팽명, 항암중초약대사전, 호북, 호북홍호시인쇄, pp.704-708, 1994).

결론적으로, 본 발명의 간섬유화 억제 추출물의 처방을 분석하면 평위산과 사령산을 포함하고 있는 위령탕을 바탕으로, 황달의 증상을 치료하기 위하여 백작약, 곽향, 반하, 대복피, 산사자, 라복자, 삼릉, 봉출 및 청피를 가미하여 구성된 가감위령탕이 기본 처방이 되며, 여기에 청열이습(淸熱利濕)하는 대표약물인 인진을 군약으로 배오하고, 감초를 가미한 후, 백작약, 곽향 및 산사자를 제거하여 구성된 것이다. 이는 평위산, 사령산 및 이진탕(二陳湯)의 약물을 포함하고 있으므로 조습운비(燥濕運脾), 이수삼습(利水渗濕) 및 이기화중(理氣和中)하는 효능을 바탕으로 인진, 반하, 대복피, 나복자, 삼릉, 봉출 및 청피를 가미한 것으로 해석할 수도 있다.

군약(君藥)으로 사용된 인진(茵蔯)은 청열이습(淸熱利濕) 및 퇴황달(退黃疸)의 효능이 있어 각종 간질환에 다용하는 약물이다. 특히, 간세포 보호, 간독성 억제, 담즙분비 촉진, 항산화기전의 활성, 간암의 억제 및 지질 강하 효능은 이미 보고 된 바 있다(안덕균 외, 본초학, 서울, 영림사, pp.289-292, 302-305, 328-329, 347-350, 365-366, 373-374, 417-419, 448-449, 536-537, 540-542, 1992; 안덕균 외, 한약임상응용, 서울, 성보사, pp.171-178, 1982; 진존인, 한방의약대사전, 서울, 송산, pp.82-83, 1990; 왕본선, 현대중약약리학, 중국, 천율과학기술, pp.571-575, 1999; 유춘안, 팽명, 항암중초 약대사전, 호북, 호북홍호시인쇄, pp.704-708, 1994; 정호점, 중약현대연구여응용 제4권, 북경, 학원출판사, pp.3092-3108, 1998). 이외에도 이뇨작용과 중추를 통하여 내장혈관 및 말초 혈관을 확장시키는 강압의 효과가 있다 (국가중의약관리국 , 중화본초, 상해, 상해과학기술출판사, pp.6732, 6753,7094, 7677, 7679, 7765, 1998).

인진에 대한 연구를 구체적으로 살펴보면, 강 등은 인진이 간세포의 활성을 높이고, 세포주기 및 DNA 손상에 의해 유도되는 아폽토시스(damage-induced apoptosis)에 관여하는 유전자 발현에 관계하여, 세포 손상을 억제하며 간기능을 보호하는 효과가 있음을 확인하였다(강경태 외, 대한한의학회지 23(2), 39-56, 2002). 신 등은 인진이 TGF-β1 합성을 억제하고, 세포증식과 섬유화 유발 유전자의 발현을 억제함을 보고하였고(신상만 외, 대한한의학회지 22(3), 141-155, 2001), 이 등은 인진호의 메탄올 추출물, 에테르 및 부탄올 추출 분획이 CCl₄로 유발되는 간실질 장해에 대한 보호 활성을 가지고 있음을 증명하였다(이채중 외, 대한한방내과학회지 21(1), 100-107, 2000). 또한, 이 등은 인진 분획물이 세포주기에 작용하면서 fas 매개 아폽토시스(fas mediated apoptosis)를 강력히 억제하여, 세포활성은 높이면서 손상을 막아 간기능을 보호하는 효과가 있음을 입증하였다(이종훈 외, 대한한방내과학회지 21(3), 363-368, 2000).

또한, 본 발명의 조성물을 구성하는 약물 중에 간질환에 효과 있는 것으로 이미 보고 된 약물로는 삼릉(三稜), 봉출(蓬朮), 택사(澤瀉), 백출(白朮), 청피(靑皮) 및 감초(甘草)이며, 삼릉은 파혈중지기(破血中之氣) 산혈어기결(散血瘀氣結) 소종지통(消腫止痛)하며, 최근 임상 연구에는 간비종대, 간경화 및 종양에도 효과 있는 것으로 보고 되었다(국가중의약관리국, 중화본초, 상해, 상해과학기술출판사, pp.6732, 6753, 7094, 7677, 7679, 7765, 1998). 봉출은 주일절기(主一切氣) 능통간경취혈(能通肝經聚血) 행기소어(行氣消瘀) 통경화식지통(通經化食止痛)의 효능이 있어, 상기 두 약물은 간염이 진행하여 간조직의 섬유화와 재생결절이 생기는 경우에 임상에서 활용되고 있다(안덕균 외, 본초학, 서울, 영림사, pp.289-292, 302-305, 328-329, 347-350, 365-366, 373-374, 417-419, 448-449, 536-537, 540-542, 1992).

택사는 이수삼습(利水渗濕)하여 저단백과 고지방 사료로 유발되는 지방간을 억제하고 간세포 보호 작용이 있으며, 백출은 보비익기(補脾益氣), 조습이뇨(燥濕利尿) 작용과 간세포의 보호 및 이담 작용이 있다(국가중의약관리국, 중화본초, 상해, 상해과학기술출판사, pp.6732, 6753, 7094, 7677, 7679, 7765, 1998;안덕균 외, 본초학, 서울, 영림사, pp.289-292, 302-305, 328-329, 347-350, 365-366, 373-374, 417-419, 448-449, 536-537, 540-542, 1992).

청피는 간기울체(肝氣鬱滯)로 인한 협늑창통(脇肋脹痛) 및 산기(疝氣) 등의 통증을 완화하는 효능이 있고, 감초는 조화제약(調和諸藥)하며 간세포를 보호한다(국가중의약관리국, 중화본초, 상해, 상해과학기술출판사, pp.6732, 6753, 7094, 7677, 7679, 7765, 1998;안덕균 외, 본초학, 서울, 영림사, pp.289-292, 302-305, 328-329, 347-350, 365-366, 373-374, 417-419, 448-449, 536-537, 540-542, 1992).

이외에 창출(蒼朮)은 비위(脾胃)의 습사(濕邪)를 화습(化濕)시키므로 조습건비(燥濕健脾)하며, 후박(厚朴)은 장위(腸胃)의 기체(氣滯)를 제거하고, 비장(脾臟)의 습탁(濕濁)을 조(燥)하여, 행기(行氣), 도체(導滯), 조습(燥濕)한다(국가중의약관리국, 중화본초, 상해, 상해과학기술출판사, pp.6732, 6753, 7094, 7677, 7679, 7765, 1998).

진피(陳皮)는 이기(理氣), 조습(燥濕) 및 화담(化痰)하며, 복령(茯??)은 행수(行水), 이습열(利濕熱)하여 설리(泄利)시키고, 나복자는 소식도체(消食導滯)의 작용이 있으며, 반하(半夏)는 조습화담(燥濕化痰)하고, 대복피(大腹皮)는 하기관중(下氣寬中)하면서 수종(水腫)을 없애준다(국가중의약관리국, 중화본초, 상해, 상해과학기술출판사, pp.6732, 6753, 7094, 7677, 7679, 7765, 1998; 안덕균 외, 한약임상응용, 서울, 성보사, pp.171-178, 1982).

최근 연구에 사용되고 있는 간 질환 모델을 만드는 방법으로는 사염화탄소(CCl₄) 또는 디메틸니트로사민(dimethylnitrosamine,DMN)을 투여하는 방법이나, 담도결찰의 방법이 많이 이용된다(박은전 외, 약학회지 41(5), 622-628, 1997).

본 발명에서는 DMN을 사용한 간섬유화 모델을 사용하였다. DMN은 음식이나 담배연기, 산업 환경, 공장의 연기 등 널리 만연되어 있고, 체내에서 괴사 및 독성 세포사를 일으키는 물질로, 1952년 영국의 화학회사에서 공업용매로 개발 중인 DMN 기술자의 간경변 발병을 계기로 여러 장기에서 암을 일으킬 수 있다는 사실이 만성 독성실험 결과 확인되었다(S.A. Jenkins et al., Journal of Hepatology 1 ,489-499, 1985).

DMN은 시토크롬(cytochrome) P4502E1에 의해 대사되어 아세트알데히드(acetaldehyde)를 생성함으로써 간손상을 유발하며, 단백질과 핵산 등을 메틸화(methylatio)시켜 발암성을 나타내는 것으로 알려져 있다. DMN은 소량으로도 2 내지 3 주만에 간에 병변을 일으키며, 투약을 중단하여도 간의 병변이 유지되는 장점이 있다. CCl₄는 간세포의 응고괴사를 유발시키며, 모세혈관망 내면세포에는 영향을 미치지 않는 반면, DMN은 특징적으로 출혈성 괴사를 일으키며, 이때 소엽중심에 혈액이 집중된다. 또, 투여 10일 후에는 정맥폐쇄성 병변이 관찰되고, 실질세포와 유동내면세포에 모두 영향을 미쳐 출혈과 중심정맥 주위의 주상망상식구조(trabecular reticulin framework)의 압괴(collapse)를 초래한다(R. Mancini et al., Journal of Hepatology 15, 361-366, 1992).

DMN과 간병변과의 관계에 대한 연구는 Mancini 등이 DMN에 의한 시누소이드 세포(sinusoidal cell)의 분아 증식 정도와 간의 염증성 침윤에 대한 분석을 하였고(R. Mancini et al., Journal of Hepatology 15, 361-366, 1992; R. Mancini et l.a, Int. J. Exp. Path. 72, 119-128, 1991) , Jenkins 등은 DMN 투여를 2 주, 24 주 및 44 주로 나누어 병변의 정도를 실험하였으며(S.A. Jenkins et al., Journal of Hepatology 1 ,489-499, 1985), Toshimi 등은 DMN 유발 실험 방법을 구체적으로 밝혔다(Toshimi Kaido et al., Journal of surgical research 74(2), 173-174, 1998).

DMN을 이용하여 간섬유화를 유발한 실험은 Ma 등의 가미지유탕, Ichiro 등의 소시호탕(小柴胡湯) 및 Yutaka 등의 비파엽(枇杷葉)에 대한 연구가 있다(Ichiro Shimizu et al., Hepatology 29(1), 149-160, 1999; Jin Yeul Ma et al., 대한약학회지 28(4), 215-224, 1997; Yutaka Nishioka et al., Biol.Pharm.Bull. 25(8), 1053-1057, 2002).

본 발명자들은 상기와 같이 제조한 간섬유화 억제 추출물을 간섬유화의 유발인자인 DMN 투여시점을 기준으로 전처리 투여군과 후처리 투여군으로 나누어 비교 측정하였다. 후처리 투여군은 DMN을 복강 내에 주사한 후, 그 당일로부터 간섬유화 억제 추출 분말 10 내지 3,000 mg/kg, 바람직하게는 100 내지 1,000, 보다 바람직하게는 1,000 mg/kg을 2 주일간 매일 경구 투여하였으며, 전처리 투여군은 간섬유화 억제 추출물 분말 10 내지 3,000 mg/kg, 바람직하게는 100 내지 1,000, 보다 바람직하게는 1,000 mg/kg을 2 주일간 매일 경구투여한 후, DMN을 1 회 복강 주사하고 다시 2 주일 경과 후 각각의 항목에 대하여 측정하였다.

전처리 투여군과 후처리 투여군으로 나누어 실험한 방법은 이미 Ichiro 등이 소시호탕을 DMN 간섬유화 모델 흰쥐에 투여한 실험에서 소개되었다(Ichiro Shimizu et al., Hepatology 29(1), 149-160, 1999). 전처리군은 예방적 차원에서 의미가 있고, 후처리군은 치료적 차원에서 의미가 있다. 이는 간경변의 경우 비가역적인 반면, 간섬유화는 가역적이며 치료 가능하다는 측면에서 본 발명의 간 섬유화 억제 추출물이 간질환의 예방 및 치료에 모두 효과가 있음을 밝히고자 수행한 것이다.

본 발명의 간섬유화 억제 추출물 효과 분석은 체중의 변화, 간장의 중량과 체중의 비율, 혈액의 생화학적 분석을 통한 혈중 아스파탐 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase, AST)(GOT), 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(alanine aminotransferase, ALT)(GPT), 총 빌리루빈(total bilirubin), 알부민(albumin), 락트산 디하이드로게나아제(lactate dehydrogenase, LDH)의 함량 측정, 간장의 적출 후 콜라겐(collagen) 함량 측정 및 광학현미경을 이용한 육안의 병리조직학적 관찰을 통하여 수행하였다.

그 결과는 하기와 같다.

1) 체중 변화에 있어, 간섬유화 억제 추출물 후처리군은 DMN 투여 후 1 주 동안 급격한 체중의 감소를 보였고 2 주 후부터 증가하였으나, DMN 투여 이전의 체중으로 회복되지는 않았다. 간섬유화 억제 추출물 전처리군에서는 DMN 투여 후 처음 1 주 동안에 체중이 큰 변화를 보이지 않았고, 2 주 후에도 체중이 감소되지 않고 지속적으로 증가하였다.

2) 간장의 중량과 체중의 비율은 간섬유화 억제 추출물 후처리군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였으며, 간섬유화 억제 추출물 전처리군은 대조군에 비해 감소하였으나 유의성은 없었다.

3) 혈액의 생화학적 분석에 있어, AST, ALT, 총 빌리루빈, 알부민 및 LDH 함량은 간섬유화 억제 추출물 전·후 처리군 모두 대조군에 비해 상승 억제효과를 나타내었으며, 혈중 알부민 함량은 간섬유화 억제 추출물 후처리군에서만 대조군에 비해 상승 효과를 관찰하였다.

4) 콜라겐 함량을 측정한 결과, 간섬유화 억제 추출물 전·후처리군 모두 대조군에 비해 그 발현이 감소되었으며, 전처리군이 후처리군보다 현저한 효과를 보였다.

5) 병리조직학적 검사 결과, 간섬유화 억제 추출물 전·후 처리군 모두 대조군에 비해 간소엽의 입체구조가 소실된 정도가 적었으며, 문맥주위와 중심정맥주위로의 섬유화, 미만성 간세포괴사와 염증의 억제효과가 있는 것이 관찰되었다.

상기한 결과는 본 발명의 간 섬유화 억제추출물이 DMN으로 간섬유화가 유발된 흰쥐에 대하여 간기능 회복, 간조직의 섬유화 및 염증 억제작용이 뚜렷하여 임상에서 간질환의 치료 및 예방의 측면에 이용될 수 있음을 의미한다.

본 발명의 간 섬유화 억제 생약추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

본 발명의 간섬유화 억제 추출물의 유효용량은 10 내지 3,000 mg/kg 이고, 바람직하기로는 100 내지 1,000 mg/kg 이며, 하루 1 내지 4 회 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 간섬유화 억제 추출물은 흰쥐를 대상으로 한 급성독성검사 결과 경구투여 및 복강내 주사 시 50% 치사량이 공히 체중 kg 당 10 g 이상으로서 전혀 독성을 나타내지 않았다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 간섬유화 억제 추출물의 제조

본 실험에서 사용된 인진(茵陳)은 사철쑥(Artemisia capillaris Thunb.)으로 강원도 홍천지역에서 채취한 것이며, 기타 약재는 서울특별시 동대문구 제기동 경동약령시장의 원광약업사를 통하여 구입하여 경희대학교 방제학교실에서 외부형태를 비교 조사하여 확인한 후 사용하였다. 처방의 내용과 용량은 다음과 같다(표 1).

<표 1> 간섬유화 억제 추출물의 구성 성분 및 용량

약재	약학명	용량(g)
인진(茵陳)	Artemisiae capillaris Herba	8.0
창출(蒼朮)	Atractylodis Rhizoma	4.0
후박(厚朴)	Magnoliae Cortex	4.0
진피(陳皮)	Citri Pericarpium	4.0
저령(猪笭)	Polyporus	4.0
택사(澤瀉)	Alismatis Rhizoma	4.0
백출(白朮)	Atractylodis japonicae Rhizoma	4.0
복령(茯笭)	Hoelen	4.0
나복자(蘿蔔子)	Raphani Semen	4.0
반하(半夏)	Pinelliae Rhizoma	4.0
대복피(大腹皮)	Arecae Pericarpium	3.0
삼릉(三稜)	Sparganii Rhizoma	3.0
봉출(蓬朮)	Zedoariae Rhizoma	3.0
청피(靑皮)	Citri reticulatae viride Pericarpium	3.0
감초(甘草)	Glycyrrhizae Radix	2.0
생강(生薑)	Zingiberis Rhizoma Recens	4.0
계(Total)		62.0

먼저, 상기의 간섬유화 억제 추출물 약재 10첩 분량 450 g을 환류추출기에 1차 증류수 9,000 ㎖와 함께 넣고, 100℃ 가까이 온도가 상승하여 탕액이 끓는 시점으로부터 2 시간 동안 가열하여 추출한 다음, 여과지(filter paper)로 감압 여과한 여과액을 진공건조기(rotary vacuum evaporator)를 이용하여 농축액을 얻고, 다시 이를 동결건조기로 건조하여 분말을 얻었다. 그 결과, 24.9%의 수율로 동결건조 추출물 111.9 g을 얻었다. 동결 건조한 추출물은 일정량의 증류수에 용해한 후 경구 투여하였다.

<실험예> DMN으로 유발된 간섬유화 억제 효과

본 발명의 간섬유화 억제 추출물이 DMN으로 유발된 간 섬유화에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 각 실험군 당 흰쥐(rats) 10마리를 1 군으로 하여, 정상군(Normal), DMN 투여군(Control), DMN 처치 후 간섬유화 억제 추출물 1,000 ㎎/㎏을 투여한 후처리 투여군(IYT-a), 간섬유화 억제 추출물 1,000 ㎎/㎏ 투여 후 DMN을 처치한 전처리 투여 및 DMN 처치군(IYT-b)으로 나누었다. 실험 동물은 200±20 g 내외의 7 주령 위스터(Wistar)계 수컷 흰쥐(중앙실험동물, 한국)를 고형사료(삼양배합사료 실험 동물용, 삼양유지사료, 한국)와 물을 충분히 공급하여 1 주일간 실험실 환경(온도 22±2℃, 습도 55±5%, 명/암 12 시간)에 적응시킨 후 사용하였다.

먼저, 간섬유화 억제 추출물 후처리 투여군은 DMN 40 ㎎/㎏의 용량을 복강 내에 1 회 주사한 후, DMN 처치 당일부터 간섬유화 억제 추출물 1,000 ㎎/㎏ 을 2 주일간 매일 1 회씩 경구투여 하고, 간섬유화 억제 추출물 전처리 투여군은 간섬유화 억제 추출물 1,000 ㎎/㎏을 2 주일간 매일 1 회씩 경구투여 한 후 DMN을 복강 주사하고, 다시 2 주일 경과 후 하기의 각 항목을 측정하였다.

상기한 방법으로 DMN에 의한 간경화를 유도한 후 흰쥐를 에테르(ether)로 가볍게 마취하여 심장으로부터 채혈하였고, 채혈한 혈액은 실온에서 약 30 분 정도 방치한 후 원심분리기에 넣고 2,000 rpm에서 20 분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다.

<실험예 1> 간장의 중량 및 체중 측정

체중은 2 일 간격으로 측정하였고, 심장 채혈 후 각 개체들로부터 간장을 적출한 즉시 전자저울(Mettler, U.S.A.)로 간장의 중량(Wet weight)을 측정하였다.

그 결과, 체중의 변화는 실험 종료 후 정상군의 체중이 255.3 g인데 비하여 DMN 투여 대조군의 체중은 213.7 g으로 2 주에 걸쳐 급격하게 감소하였으며, 일부 동물은 생존하지 못하여 DMN 투여로 인하여 야기된 심각한 간섬유화를 확인할 수 있었다. 간섬유화 억제 추출물 후처리군에서는 실험 첫날 시작 체중이 239.7 g였으나, DMN 투여 후 1 주 동안 급격한 체중의 감소를 보였고, 2 주 후에 229.8 g으로 증가하였으나 DMN 투여 이전의 체중으로 회복되지는 않았다. 간섬유화 억제 추출물 전처리군에서는 DMN 투여 후 처음 1 주 동안 체중의 감소를 보이지 않았고, 2 주 후에도 체중이 감소되지 않고 지속적으로 증가하는 양상을 보여, 간 질환의 예방적 측면에서의 본 발명의 간섬유화 억제 추출물 복용이 DMN 투여로 인한 전신적인 쇠약 증상에 대하여 효과가 있음을 확인하였다(도 1).

체중에 대한 간장의 중량 비율은 정상군에 비하여 DMN 투여 대조군이 유의성있게 증가하였다(p<0.05). 간섬유화 억제 추출물 후처리군은 대조군에 비하여 유의성있게 감소하였으며(p<0.05), 간섬유화 억제 추출물 전처리군은 대조군에 비하여 감소하였으나 유의성은 없었다(표 2 및 도 2). 구체적으로, DMN 투여군은 3.3으로 정상군에 비해 유의성 있는 증가를 보여 간의 비대를 보였으며, 후처리군은 2.8로 대조군에 비해 유의성 있게 감소하여 간의 비대를 억제한 결과를 보였다. 전처리군은 3.1로 대조군에 비해 감소하였으나 유의성은 없었다. 본 발명에서 체중에 대한 간장의 중량비가 증가한 것은 DMN으로 인해 2 주 동안 간장 내 트리글리세라이드(triglyceride), 콜레스테롤 및 총 지방이 증가된 결과로 간장의 비대 현상이 온 것으로 보여 진다(양재헌 외, 생약학회지 27(3), 167-172, 1996).

<표 2> 체중 및 체중에 대한 간장의 중량비의 변화

군	체중(g)	간장의 중량/체중(%)
정상군	255.3± 22.20	2.9± 0.10
대조군	213.7± 15.50	3.3± 0.27
IYT-a	229.8± 17.00	2.8± 0.13
IYT-b	277.6± 16.00	3.1± 0.12

각 수치 : 평균± 표준편차

# : 정상군의 수치에 대한 유의도(# : p<0.05)

* : 대조군의 수치에 대한 유의도(* : p<0.05)

IYT-a: 간섬유화 억제 추출물 후처리군

IYT-b: 간섬유화 억제 추출물 전처리군

<실험예 2> 혈액의 생화학적 분석

<2-1> 혈중 아스파탐 아미노트랜스퍼라아제(Aspartate amino- transferase, AST) (GOT) 함량 측정

아스파탐 아미노트랜스퍼라아제(Aspartate aminotransferase, AST)의 활성은 1 ㎖의 L-아스파라진산 염(aspartate) 200 mM, 2-옥소글루타레이트(2-oxoglutarate) 12 mM, 말레이트 디하이드로게나제(malate dehydrogenase) 600 Unit/L 및 NADH 0.25 mM이 함유된 Hepes 완충용액(pH 7.8)에 100 ㎕의 혈청을 더하여 340 nm에서의 흡광도의 시간당 감소율로 측정하였다. 사용시약은 AST(Sigma, U.S.A.)이며, 측정기기는 UV 분광광도계(spectrophotometer)로 ADIVA 1650(Bayer, Germany)을 사용하였다(S. Retman et al.,, Arm. J. Clin. Patrol. (28), 58-63, 1957).

그 결과, 정상군의 혈중 AST 함량인 102.0±12.0 U/I에 비하여 대조군은 156.1±10.5 U/I로 유의한 상승을 보였다(p<0.05). 간섬유화 억제 추출물 후처리군(IYT-a)에서는 104.0±13.3 U/I(p<0.01), 간섬유화 억제 추출물 전처리군(IYT-b)에서는 121.0±18.5 U/I으로 대조군에 비하여 상승억제효과를 나타내었다(p<0.05)(표 3). AST(GOT)는 간, 심장, 근육, 신장 등의 다양한 조직에 분포되어 있어 이들 조직과 관련된 질환에서 혈청 중의 농도가 증가되기 때문에 본 실험에서도 간질환이 유발되면서 수치가 증가하였고, 약물 투여 후에는 대조군에 비하여 감소되었다.

<표 3> AST, ALT, T-bil, Alb, LDH 수준의 변화

군	AST(U/I)	ALT(U/I)	T-bil(㎎/dL)	Alb(g/dL)	LDH(IU/L)
정상군	102.0±12.0	44.7± 4.6	0.31±0.02	3.25±0.17	1249.75±250.10
대조군	156.1± 10.5#	78.8±13.9##	0.35±0.04#	2.95±0.13#	2195.75±582.31#
IYT-a	104.0± 13.3**	46.0±4.8**	0.27±0.03*	3.28±0.29*	857.25±333.93*
IYT-b	121.0± 18.5*	54.0±8.4**	0.25±0.00**	2.95±0.10	1365.00±271.36*

각 수치 : 평균±표쥰편차

# : 정상군의 수치에 대한 유의도(# : p<0.05 및 ## : p<0.01)

* : 대조군의 수치에 대한 유의도(* : p<0.05 및 ** : p<0.01)

IYT-a: 간섬유화 억제 추출물 후처리군

IYT-b: 간섬유화 억제 추출물 전처리군

<2-2> 혈중 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(alanine aminotransferase, ALT)(GPT) 함량 측정

알라닌 아미노트랜스퍼라아제(alanine aminotransferase, ALT)의 활성은 1 ㎖의 L-알라닌(alanine) 400 mM, 2-옥소글루타레이트(2-oxoglutarate) 12 mM, 아세테이트 디하이드로게나아제(acetate dehydrogenase) 2,000 Unit/L 및 NADH 0.25 mM이 함유된 Hepes 완충용액(pH 7.4)에 100 ㎕의 혈청을 더하여 340 nm에서의 흡광도의 시간당 감소율로 측정하였다. 사용시약은 ALT(Sigma, U.S.A.)이며, 측정기기는 UV 분광광도기 ADIVA 1650(Bayer, Germany)을 사용하였다(S. Retman et al.,, Arm. J. Clin. Patrol. (28), 58-63, 1957).

그 결과, 정상군의 혈중 ALT 함량인 44.7±4.6 U/I에 비하여 대조군은 78.8±13.9 U/I로 유의한 상승을 보였다(p<0.01). 간섬유화 억제 추출물 후처리군에서는 46.0±4.8 U/I, 간섬유화 억제 추출물 전처리군에서는 54.0±8.4 U/I로 대조군에 비하여 상승억제효과를 나타내었다(p<0.01)(표 3). ALT(GPT)는 다양한 조직에 분포되어 있으나, 특히 간에서 생성되기 때문에 간염, 간경변, 황달, 간암 등의 질환에서 증가한다. 상기에서 전처리군과 후처리군을 비교하면 두 군 모두 유의성있게 호전 되었으나, 후처리군은 DMN 투여로 간손상을 받았으나 2주 동안 집중적으로 간섬유화 억제 추출물을 통해 간기능이 회복된 것이고, 전처리군은 DMN 손상 후 간섬유화 억제 추출물이 공급되지 않아 상대적으로 회복이 적은 것으로 사료된다.

<2-3> 혈중 총 빌리루빈(total bilirubin, t-Bil) 함량 측정

빌리루빈은 헤모글로빈의 구성성분인 헴(heme)의 대사산물로서 간에서 포합, 배설되는데 간질환이 있으면 정체되어 혈중 농도가 증가된다(F. Mashige et al., Clinical Chemistry 27(8), 1352-6, 1981). 혈중 총 빌리루빈의 함량은 간접 빌리루빈과 직접 빌리루빈을 함께 측정하였다. 시료 중 간접 빌리루빈은 반응촉진제를 포함하는 총 빌리루빈용 디아조 시약에 의해 영향을 받아, 직접 빌리루빈과 함께 디아조화(diazonization)되어 아조빌리루빈이 된다. 또한, 시료중의 직접 빌리루빈은 직접 빌리루빈용 디아조 시약에 의해 디아조화되어 아조빌리루빈이 된다. 아조빌리루빈은 알카리 용액에서 청색을 띠므로 이의 흡광도를 측정하여 총 빌리루빈의 함량을 구하였다. 사용시약은 총 빌리루빈(total bilirubin, Wako, Japan)이며, 측정기기는 UV 분광광도계로 ADIVA 1650(Bayer, Germany)을 사용하였다.

그 결과, 정상군의 혈중 총 빌리루빈의 함량인 0.31±0.02 ㎎/dL에 비하여, 대조군은 0.35±0.04 ㎎/dL로 유의한 상승을 보였다(p<0.05). 간섬유화 억제 추출물 후처리군에서는 0.27±0.03 ㎎/dL(p<0.05), 간섬유화 억제 추출물 전처리군에서는 0.25±0.00 ㎎/dL로 대조군에 비하여 상승억제효과를 나타내었다(p<0.01)(표 3).

<2-4> 혈중 알부민(albumin) 함량 측정

알부민은 간이 심하게 손상되면 알부민, 프로트롬빈, 피브리노겐 및 여러 단백의 생성이 감소되므로 간의 손상 정도를 알 수 있으며, 만성질환의 정도를 나타내는 지표로 해석된다(주왕석 외, 대한본초학회지 14(2), 51-59, 1999). 혈중 알부민의 측정은 pH 4.2에서 BCG와 결합되어 청록색의 알부민-BCG 복합체(complex)를 형성하는 원리를 이용하여, 660 nm에서의 흡광도 증가를 측정함으로써 시행하였다. 사용시약은 알부민(albumin, Bayer, Germany)이며, 측정기기는 UV 분광광도계 ADIVA 1650(Bayer, Germany)을 사용하였다.

그 결과, 정상군의 혈중 알부민 함량인 3.25±0.17 g/dL에 비하여 대조군은 2.95±0.13 g/dL로 유의한 감소를 보였다(p<0.05). 간섬유화 억제 추출물 후처리군에서는 3.28±0.29 g/L로 대조군에 비하여 유의한 상승효과를 나타내었으나(p<0.05), 간섬유화 억제 추출물 전처리군에서는 2.95±0.10g/dL로 상승효과를 관찰할 수 없었다(표 3).

<2-5> 락트산 디하이드로게나아제(Lactate dehydrogenase, LDH) 함량 측정

LDH는 해당작용(glycolysis system)의 최종 단계에서 작용하는 효소로서 NADH에서 NAD로의 산화를 초래하여 피루브산(pyruvate)이 L-락트산(lactate)으로 전환되는 촉매작용을 일으킨다(주왕석 외, 대한본초학회지 14(2), 51-59, 1999). 간질환에서 LDH의 증가는 아미노트랜스퍼라아제의 활성치 만큼 예민하지는 않지만, 중독성 간염의 경우 10배 이상의 증가를 보이기 때문에 급성 간 질환의 경우 LDH 함량을 측정한다. 일반적으로 산화율과 LDH의 활성도는 비례적으로 나타나며, 본 발명에서 LDH의 활성도는 340 nm에서의 흡광도 감소량을 측정함으로써 결정하였다. 사용시약은 LDPL(Bayer, Germany)이며, 측정기기는 UV 분광광도계 ADIVA 1650(Bayer, Germany)을 사용하였다.

그 결과, 정상군의 혈중 LDH 함량인 1249.75±250.10 IU/L에 비하여 대조군은 2195.75±582.31 IU/L로 유의한 상승을 보였다(p<0.05). 간섬유화 억제 추출물 후처리군에서는 857.25±333.93 IU/L, 간섬유화 억제 추출물 전처리군에서는 1365.00±271.36 IU/L로 유의한 상승 억제효과를 나타내었다(p<0.05)(표 3).

<실험예 3> 콜라겐(Collagen) 함량 측정

만성 간질환에 있어서 간섬유화 정도를 평가하는 가장 유용한 검사는 경피적 간생검을 통한 조직학적 검사와 비침습적인 방법인 혈청 히루론산(hyluronic acid)과 Ⅳ형 콜라겐의 측정이며, 특히 콜라겐 함량 측정은 간섬유화 정도를 반영하는데 유용한 혈청 표지자다(Jin Yeul Ma et al., 대한약학회지 28(4), 215-224, 1997; 황준영 외, 대한소화기학회 추계학술대회, 296, 2002). 섬유화의 지표로 인식되는 콜라겐은 섬유성 단백질(fibrous protein)로 인체의 거의 모든 조직에 분포한다. 현재까지 밝혀진 콜라겐 중 간 조직에서의 분포와 양상이 비교적 잘 알려진 것은 Ⅰ, Ⅲ 및 Ⅳ형 콜라겐이며, 특히 간섬유화 진행의 혈청학적 지표로서의 가능성이 주목된 것은 Ⅲ 및 Ⅳ형이다. 이는 간섬유화에서 나타나는 동양구조의 연속적인 기저막의 주성분이 Ⅳ형 콜라겐과 라미닌이기 때문이며, 간장과 골수를 제외한 모든 혈관에 분포하기도 한다. 정상간에서는 기저막이 혈관, 림프관 및 일부 신경섬유 주위에서만 존재하고 동양구조에서는 존재하지 않아 혈액과 간세포사이의 물질교환이 자유로이 이루어지는 반면, 간경변증에서는 동양구조와 간세포사이에 연속적인 기저막이 형성되면서 간세포와 혈액사이의 순환이 폐쇄되어 간기능 부전이 더욱 악화된다(강경태 외, 대한한의학회지 23(2),39-56, 2002). 특히 콜라겐은 특이한 아미노산 배열 (Gly-Xaa-Yaa)을 가지고 있으며, Yaa 위치에 프롤린(proline) 또는 하이드록시프롤린(hydroxyproline)이 배열되어 있어 간 조직 중의 하이드록시프롤린을 측정함으로써 간 조직 중의 콜라겐 함량을 측정할 수 있다(박은전 외, 약학회지 41(5), 622-628, 1997).

본 발명에서는 적출된 간장으로부터 0.2 g의 조직을 채취하여 6 N HCl 용액 4 ㎖과 함께 균질화한 뒤, 테프론(teflon) 처리된 시험관에 넣고, 110℃에서 18 시간 동안 가수분해하였다. 이를 50 ㎕ 씩 시험관에 나누어 65??에서 4 시간 동안 증발시키고, 이소프로판올(Isopropanol) 1.2 ㎖ 및 0.56% 완충 클로로아민(chloroamine)-T 용액을 0.2 ㎖씩 첨가했다. 이로부터 10 분이 경과한 후, 1.0 ㎖의 Ehrlich's 용액을 각각 넣어 충분히 혼합하고, 50℃에서 90 분간 배양하여 발색시켜, UV 분광광도계(Molecular devices, U.S.A.)로 558 nm에서 증류수를 대조군으로 하여 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 정상군의 하이드록시프롤린(hydroxyproline)은 3.715±0.857 ㎍이었으나, DMN 투여 대조군에서는 11.407±1.259 ㎍으로 발현이 현저하게 증가되었다(p<0.001). 이에 비하여, 간섬유화 억제 추출물 후처리군에서는 7.308±1.514 ㎍(p<0.01), 간섬유화 억제 추출물 전처리군에서는 5.967±0.575 ㎍로서 대조군에 비하여 발현이 유의성있게 감소되었다(p<0.001) (표 4 및 도 3).

정상군 대비 콜라겐 발현 억제율은 (실험군-대조군)/(대조군-정상군) ×100의 공식에 의하여 산출하였으며, DMN투여군이 정상군에 비해 콜라겐이 증가한 비율을 100%라고 보았을 때, 간섬유화 억제 추출물 후처리군은 대조군만큼 유발되어야 할 콜라겐 수치가 53.3% 억제되었고, 간섬유화 억제 추출물 전처리군은 70.7%의 콜라겐 발현이 억제되어 간섬유화 억제 추출물의 예방적 복용이 DMN 투여로 인한 콜라겐 합성을 억제하는데 효과가 뛰어남을 확인하였다.

<표 4> 하이드록시프롤린(Hydroxyproline) 수준의 변화

군	하이드록시프롤린(㎍)	억제율(%)
정상군	3.715±0.857
대조군	11.407±1.259###	100
IYT-a	7.308±1.514**	53.3
IYT-b	5.967±0.575***	70.7

각 수치 : 평균± 표쥰편차

# : 정상군의 수치에 대한 유의도(### : p<0.001)

* : 대조군의 수치에 대한 유의도(**: p<0.01 및 ***: p<0.001)

IYT-a: 간섬유화 억제 추출물 후처리군

IYT-b: 간섬유화 억제 추출물 전처리군

<실험예 4> 병리조직학적 관찰

각 실험군에서 부검한 흰쥐의 간장 조직을 병리조직학적인 측면에서 관찰하기 위하여 먼저, 육안적으로 관찰한 후 10% 중성 포르말린(formalin)에 고정하였다. 이렇게 고정된 조직은 파라핀 포매 과정을 거쳐 회전 박절기(rotary microtome, Leica, Germany)를 이용하여 4 ㎛ 두께로 조직절편을 만든 뒤, H-E(Hematoxylin ＆ Eosin) 염색 및 마송 삼색(Masson trichrome) 염색을 시행하여 광학현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 정상군에서는 간소엽의 입체구조가 잘 유지되었고, 문맥 주위 및 중심 정맥 주위의 섬유화 및 간세포 괴사나 염증 반응은 관찰되지 않았으며, 콜라겐도 관찰되지 않았다(표 5, 도 4 및 도 5).

DMN 투여 대조군에서는 간소엽의 입체구조가 소실되었고, 문맥주위와 중심정맥 주위로 심한 섬유화가 관찰되었다. 또한, 간조직 전반에 걸쳐 미만성 간세포 괴사가 관찰되었으며, 급성 및 만성 염증반응이 관찰되었으며, 문맥주위 및 중심정맥 주위로 많은 콜라겐도 관찰되었다(표 5, 도 4 및 도 5).

간섬유화 억제 추출물 후처리군에서는 간소엽의 입체구조가 소실되었고 문맥주위와 중심정맥 주위로 중등도의 섬유화가 관찰되었다. 그러나, 간조직 전반에 걸쳐 간세포 괴사는 관찰되지 않았으며, 염증 반응이 관찰되었으나 대조군에 비하여 림프구(lymphocytes)는 감소하였다. 또한, 문맥 주위 및 중심 정맥 주위로 중등도의 콜라겐이 관찰되었다(표 5, 도 4 및 도 5).

간섬유화 억제 추출물 전처리군에서도 간소엽의 입체구조가 소실되었고, 문맥주위와 중심정맥 주위로 경도의 섬유화가 관찰되었다. 간조직 전반에 걸쳐 다수의 간세포 괴사가 관찰되었으며, 염증반응이 관찰되었으나 대조군에 비하여 림프구는 감소하였다. 문맥주위 및 중심정맥 주위로 경도의 콜라겐이 관찰되었다(표 5, 도 4 및 도 5).

<표 5> 간 조직의 병리조직학적 변화

군	정상군	대조군	IYT-a	IYT-b
섬유증(Fibrosis)	-	+++	++	+
육아종(Granuloma)	-	+++	-	-
괴사(Necrosis)	-	+	-	-
핵 변화(Nuclear change)	-	++	++	++
유사분열(Mitoses)	-	+	+	+
중성구(Neutrophils)	-	++	++	++
림프구(Lymphocytes)	-	++	+	+

괴사; -:나타나지 않음, +:경증(focal), ++:중등도(several foci), +++:중증(multifocal), ++++:매우 중증(diffuse)

섬유증; -:정상, +: 문맥, ++:문맥주위, +++:격벽, ++++:경변

이상의 결과에서 DMN투여로 유발된 흰쥐의 간섬유화에 대하여 간섬유화 억제 추출물 후처리군은 혈중 AST 함량, 혈중 ALT함량, 총 빌리루빈 함량, 알부민 함량, LDH 함량에서 유의성 있는 개선효과를 보였으며, 간섬유화 억제 추출물 전처리군은 DMN 투여로 인한 체중 감소를 회복시켰으며, 혈중 알부민 함량을 제외한 혈중 AST 함량, ALT 함량, 총 빌리루빈 함량, LDH 함량에서 유의성 있는 개선효과를 나타내었다. 또한, 두 처리군 모두에서 콜라겐 발현과 병리조직학적 관찰 결과 현저한 억제 효과를 나타냄을 확인하였다. 특히 콜라겐 발현 억제는 전처리군이 후처리군 보다 효과적이었으며, 이는 본 발명의 간섬유화 억제 추출물이 간 섬유화의 치료뿐만이 아니라 예방적 차원에서도 유용하게 이용될 수 있음을 의미한다.

<실시예 2> 흰쥐(rat)에 대한 경구투여 급성 독성실험

흰쥐(rat)를 사용하여 본 발명의 간섬유화 억제 추출물의 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 흰쥐에 실시예 1의 생약조성물을 2 g/㎏의 용량으로 경구투여 및 복강내 주사하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 생약 조성물은 모두 흰쥐에서 10 g/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며, 경구 투여 최소치사량 (LD₅₀)은 10 g/kg이상인 안전한 물질로 판단되었다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명은 간 섬유화의 예방 또는 치료를 위하여 인진, 창출, 후박, 진피, 저령, 택사, 백출, 복령, 나복자, 생강, 반하, 대복피, 삼릉, 봉출, 청피 및 감초를 포함하는 혼합 생약재로부터 제조한 간 섬유화 억제 추출물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 생약 추출물은 부작용(side effect)과 독성이 적고 안전성이 보강된 것으로 간 기능 회복, 간 조직의 섬유화 억제작용 및 염증 억제작용에 효과가 있어, 궁극적으로 간 섬유화 및 간경화의 예방 및 치료에 안전한 약제 및 건강식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 흰쥐(rat)를 대상으로 하여 정상군(Normal), 간병증을 야기하는 DMN 투여 대조군(Control), DMN 투여 후 본 발명의 간섬유화 억제 추출물을 투여한 후처리 투여군(IYT-a) 및 본 발명의 간섬유화 억제 추출물 투여 후 DMN을 투여한 전처리 투여군(IYT-b)의 체중 변화를 나타낸 그래프이고,

도 2는 흰쥐(rat)를 대상으로 하여 정상군(Normal), 간병증을 야기하는 DMN 투여 대조군(Control), DMN 투여 후 간섬유화 억제 추출물을 투여한 후처리 투여군(IYT-a) 및 간섬유화 억제 추출물 투여 후 DMN을 투여한 전처리 투여군(IYT-b)의 체중에 대한 간장의 중량 비율을 나타낸 그래프이고,

각 수치 : 평균±표준편차

# : 정상군의 수치에 대한 유의도(# : p<0.05)

* : 대조군의 수치에 대한 유의도(* : p<0.05)

도 3은 흰쥐(rat)를 대상으로 하여 정상군(Normal), 간병증을 야기하는 DMN 투여 대조군(Control), DMN 투여 후 간섬유화 억제 추출물을 투여한 후처리 투여군(IYT-a) 및 간섬유화 억제 추출물 투여 후 DMN을 투여한 전처리 투여군(IYT-b)의 하이드록시프롤린(hydroxyproline) 수준을 나타낸 그래프이고,

각 수치 : 평균±표쥰편차

# : 정상군의 수치에 대한 유의도(### : p<0.001)

* : 대조군의 수치에 대한 유의도(** : p<0.01 및 ** : p<0.001)

도 4는 흰쥐(rat)를 대상으로 하여 정상군(Normal), 간병증을 야기하는 DMN 투여 대조군(Control), DMN 투여 후 간섬유화 억제 추출물을 투여한 후처리 투여군(IYT-a) 및 간섬유화 억제 추출물 투여 후 DMN을 투여한 전처리 투여군(IYT-b)의 간조직을 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin) 염색으로 나타낸 광학현미경 사진이고,

A : 정상군(×100) B : 대조군(×100)

C : 간섬유화 억제 추출물 후처리군 (×200)

D : 간섬유화 억제 추출물 전처리군(×400)

도 5는 흰쥐(rat)를 대상으로 하여 정상군(Normal), 간병증을 야기하는 DMN 투여 대조군(Control), DMN 투여 후 간섬유화 억제 추출물을 투여한 후처리 투여군(IYT-a) 및 간섬유화 억제 추출물 투여 후 DMN을 투여한 전처리 투여군(IYT-b)의 간조직을 마송 삼중 염색법(Masson trichrome)으로 나타낸 광학현미경 사진이다.

A : 정상군(×100) B : 대조군(×100)

C : 간섬유화 억제 추출물 후처리군(×100)

D : 간섬유화 억제 추출물 전처리군(×100)

Claims (6)

1. 인진(茵蔯), 창출(蒼朮), 후박(厚朴), 진피(陳皮), 저령(猪笭), 택사(澤瀉), 백출(白朮), 복령(茯笭), 나복자(蘿蔔子), 생강(生薑), 반하(半夏), 대복피(大腹皮), 삼릉(三稜), 봉출(蓬朮), 청피(靑皮) 및 감초(甘草)를 포함하는 혼합 생약재로부터 추출한 간섬유화 억제 추출물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 혼합 생약재는 인진:창출, 후박, 진피, 저령, 택사, 백출, 복령, 나복자, 생강:반하, 대복피, 삼릉, 봉출, 청피:감초를 4 내지 16:4 내지 8:3 내지 4:1 내지 4의 중량 조성비로 포함하는 것을 특징으로 하는 간섬유화 억제 추출물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 간섬유화는 디메틸니트로사민(dimethylnitrosamine, DMN)에 의하여 유발된 것을 특징으로 하는 간섬유화 억제 추출물.
4. 1) 인진, 창출, 후박, 진피, 저령, 택사, 백출, 복령, 나복자, 생강, 반하, 대복피, 삼릉, 봉출, 청피 및 감초를 포함하는 혼합 생약재에 총 무게의 10 내지 30 배의 물을 가하는 단계;

   2) 상기 혼합물을 열수 추출하는 단계; 및

   3) 상기 추출물을 감압농축기로 농축시키고 동결건조하는 단계를 포함하는 제 1항의 간섬유화 억제 추출물의 제조방법.
5. 제 1항의 간섬유화 억제 추출물을 유효성분으로 함유하는 간섬유증 및 간경변증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제 1항의 간섬유화 억제 추출물을 유효성분으로 함유하는 간섬유증 및 간경변증의 예방 또는 개선용 건강식품.