KR20220155507A - 초석잠 및 엉겅퀴 추출물을 함유하는 숙취해소 및 간기능 개선용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 초석잠 추출물과 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 하는 숙취해소 및 간기능개선용 조성물에 대한 것이다. 초석잠 추출물과 엉겅퀴 추출물의 조성물은 3:7 내지 7:3 중량비의 혼합인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 3:7의 중량비의 혼합이다. 본 발명의 조성물은 부작용없이 안전하게 섭취할 수 있으며 음주로 인한 간손상을 효과적으로 방지할 수 있고 간 기능을 효과적으로 개선할 수 있다. 특히 초석잠추출물 및 엉겅퀴 추출물의 유효성분들간의 시너지로 인해 우수한 숙취해소 및 간기능 개선효과를 제공할 수 있다.
Description
초석잠 및 엉겅퀴 추출물을 함유하는 숙취해소 및 간기능 개선용 식품조성물에 관한 것이다.
간은 사람이 매일 먹는 음식물, 오염물질 등 호흡을 통하여 인체에 들어온 수많은 물질들을 분해, 합성, 해독, 저장 등의 역할을 수행하는 매우 정밀한 화학 공장이다. 알코올도 몸속에 들어오면 간의 해독 과정에서 아세트알데하이드의 유리기(free radical)과 같은 독성물질이 간의 기능을 저하시키고 염증과 조직에 손상을 일으킬 수 있다.
이와 같은 알코올의 분해산물인 아세트알데하이드와 유기리 등 간에 계속 축척되면 간 기능의 저하되어 숙취가 잘 해소되지 않고 간에서는 간세포의 손상, 지방간 등을 일으킨다. 이러한 독성물질에 의하여 손상된 간은 각종 독성물질을 해독시킬 수 없고, 지방산도 분해 시킬 수 없어 지방간이 발병한다. 초기에는 지방간으로 발병하지만 다양한 패턴과 병의 진행이 있어서 임상적으로는 경과에 따라 결국에는 섬유화(fibrosis)나 간경화(cirrhosis)로 발전하게 된다. 따라서 과도한 음주습관이 간의 손상을 일으키고 반복되는 음주로 인하여 손상된 간은 알코올성 지방간, 알코올성 간염 및 알코올성 간경변, 간 암 들 점진적으로 발병한다.
알코올성 지방간 증세가 악화되면 알코올성 간염으로 진행디어 간의 해독작용이 유해물질들에 의해 간 세포가 손상되면 심각한 염증반응이 진행된 상태가 된다. 이 관계에서 습관적 음주가 반복적으로 계속되면 간염이 악화되어 알코올성 간경변증으로 진행 될 수 있다. 알코올성 간경변증은 알코올성 간 질환의 가장 심한 형태로 정상 간 조직이 지속적으로 염증을 일으켜 간 세포에 손상을 주는 다양한 형태로 간경변증을 일으켜 회복이 어려운 비가역적인 상태에 이르게 된다.
이러한 알코올의 숙취해소와 간 질환 예방과 치료를 위하여 다양한 노력을 기울어 왔다. 대한민국 등록 특허 제 0604354호는 인진, 백출, 운지, 와송 및 저령추출물을 유효성분을 함유하는 간 질환의 예방 및 개선용 생약 조성물을 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제 0867320호는 인진, 백출, 백봉령, 택사, 창출, 단삼, 저인, 사인, 지실, 감초 및 목향의 복합생약 수 추출하며 제조되는 간 보호, 간경화의 예방과 개선용 한약 성물을 제시하고 있다.
그리고 대한민국 등록 특허 제 10-1113603호에는 겨우살이 추출물, 구기자 추출물 및 가시오가피 추출물을 포함하는 간 기능 개선용 조성물이 개시되었고, 대한민국 등록 특허 제 10-1344055호에 더덕 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물이 개시되었다. 그러나 상기와 같은 조성물은 다양한 한약제를 사용하기 때무에 취급 및 제조가 용이하지않고 알코올 숙취해소, 지방간 등의 개선효과가 있는 유효성분이 낮을 뿐 아니라 각종 한약제 무분별한 조합으로 오히려 간에 부담을 줄 수 있다는 문제가 있다.
초석잠(Stachys sieboldi Miq)의 기원식물로는 크게 석잠풀과 쉽사리로 양분되고 있다. 석잠풀인 초석잠(Stachys Sieboldii MIQ)은 꿀풀과(Labiata)의 석잠풀속(Stachys Linne)의 여러해살이 식물이다. 초석잠은 일명 Chinese artichoke, japanese artichoke, crosne, knoo troot으로 불리며 중국, 일본, 러시아 등에서 주로 재배되고 있으나 우리나라에서 전국적으로 광범위하게 재배되고 있다. 주로 풀밭에서 자라는 1년생 본초로 줄기는 직립이며 은잠타원형의 꽃은 8월 하순에 담홍색의 이삭모양으로 개화한다. 뿌리는 가을에 3~6cm정도로 자라는데 누에모양을 하고 있어서 식물의 동충하초로 불리우며 중국의 중약현에 의하면 초석잠은 장수채로서 즐겨 먹고있으며, 뇌경색, 기억력증진, 알코올성 치매, 간 기능 및 장을 강화하는 등 예로부터 애용되어져왔다. 일본에서도 정월요리에 귀하게 쓰이기도 하고 각종 성인병과 만성병 치료에 유용하게 쓰이고 있다. 초석잠에는 irridoid glycosides, flavonoids, phenolics 등의 성분들이 분리 보고되고있으며 항산화, 항균, 인지기능 개선, 항종양 등이 보고 된 바 있다.
엉겅퀴(Cirsium Japonicum)는 국화과 속하는 다년생 초본으로 높이가 50 내지 80cm 정도로 뿌리가 곧으며 가지가 사방으로 퍼지고 근생엽과 및 부분의 잎은 꽃이 될 때 쓰러진다. 꽃은 가지 끝에 두상 꽃 차례로 무리지어 달리는데 꽃이 필 때 쓰러진다. 전국 각지에 분포하는 우리나라에 자생하는 약용식물로 예로부터 민간약으로 지혈, 토혈, 혈압 강하, 조직의 예방과 치료, 숙취해소에 이용되어 왔다. 엉겅퀴의 주요성분인 플라보노이드는 Flavan 핵 구조를 가진 저분자량의 폴리페놀화합물로 페놀 또는 피란(pyran) 핵으로 구성된 디페닐프로판 골격에 갖종 기능기(활성기)가 결합되어 있어 지질과산화 억제, 항산화, 항돌연변이, 항균작용, 간 질환의 예방과 치료 등 다양한 생리 기능이 확인되고 있다.
이에 본 발명자는 식품재료로 허용된 식물만을 추출원료로 사용함으로 인체에 부작용이 거의 없고 안전하게 사용 할 수 있으며 숙취해소에 뛰어나고 뿐만 아니라 간 기능 개선에도 효과적인 새로운 식품을 개발하기 위하여 다양한 연구를 시도하였다. 결과적으로 초석잠 추출물과 엉겅퀴 추출물은 숙취해소 뿐만 아니라 간 기능 개선에 우수한 기능성 성분들이 많으며 이들 혼합추출물의 상호 시너지 효과로 인해 매우 우수한 숙취해소 및 간 기능 개선 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 초석잠 추출물 및 엉겅퀴 추출물로 이루어진 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 숙취해소, 간 기능 개선 및 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 초석잠 추출물과 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 하는 숙취해소 및 간기능개선용 조성물을 제공한다.
초석잠 추출물과 엉겅퀴 추출물은 3:7 내지 7:3 중량비의 혼합인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 3:7의 중량비로 조성물을 구성한다. 이는 초석잠 추출물과 엉겅퀴 추출물의 상승작용을 위한 최적의 혼합비율로, 상기 중량비를 벗어난 경우 숙취의 해소 및 간 질환개선, 예방 및 치료에 있어 각 조성물을 개별적으로 사용한 경우에 비해 효과가 낮아진다.
본 발명의 조성물에 있어서 초석잠 추출물 및 엉겅퀴 추출물은 물을 용매로 사용하여 추출한 것이 바람직하다. 구체적으로 초석잠 추출물은 초석잠뿌리를 80 내지 90℃에서 24 내지 30시간동안 중탕 추출하여 얻어진 추출물이고, 엉겅퀴 추출물은 80 내지 90℃에서 20 내지 28시간동안 중탕 추출하여 얻어진 추출물인 것이 바람직하다. 중탕 추출 온도 및 시간이 상기 기술한 하한치 미만인 경우에는 유효성분이 추출되지 않을 수 있으며 상기 상한치 초과시에는 탄 맛이 강하고 영양성분이 파괴될 수 있다. 또한 물을 사용하는 중탕 추출 외 유기용매 추출 등의 다른 방식으로 추출을 수행하는 경우에는 숙취해소 및 간 기능개선에 대한 효과가 미미하며 쓴 맛이 강하게 나타날 수 있다.
본 발명에 따르면 동물모델을 이용한 실험 및 임상 실험을 통해 본 발명의 조성물이 동물 및 사람에서 숙취해소 및 간 기능 개선에 우수한 효과가 있는 것으로 나타났다. 구체적으로 쥐를 동물모델로 하고 알코올을 투여하면서 간 세포가 손상되는 경우 혈중으로 방출되어 혈중 수치가 증가하혈액 생화학적 지표인 ADH 및 ALDH 활성을 분석한 결과, 본 발명의 조성물을 함께 투여하였을 때 알코올 등으로 인한 간 세포 손상으로부터 보호 효과가 있다는 것을 확인하였다.
본 발명의 조성물로서 실제 임상실험을 통해 숙취해소 및 간 기능 개선 효과를 확인하였다. 동물실험이 그치지않고 임상실험을 통해 숙취해소와 간 기능 개선효과를 확인하였다. 임상실험을 통해, 본 발명의 조성물을 섭취할 경우 음주 후 숙취해소에 큰 효과가 있었으며, 간 기능이 저하된 사람에게 섭취시키자, 정상인에 유사한 정도로 회복되어 우수한 간 기능 개선 효과가 있음이 확인되었다.
또한, 본 발명은 초석잠 추출물 및 엉겅퀴 추출물로 이루어진 조성물을 유효성분으로 함유하는 숙취해소 및 간 기능 개선 및 예방 치료용 약학조성물 내지 기능성 식품 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 초석잠 추출물과 엉겅퀴 추출물을 각각 10 내지 1500mg/ml의 농도이고, 가장 바람직하게는 100 내지 1,000㎎/ml의 농도로 함유하는 조성물이 숙취해소 및 간기능 개선에 유리하나, 초석잠 및 엉겅퀴는 천연식품소재로서 과량투여하여도 인체에 부작용이 없어 본 발명의 조성물 내에 포함되는 초석잠 및 엉겅퀴의 양적 상한은 당사자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미료, 결합제, 윤활제, 피복제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다. 상기 약학조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화 할 수 있다. 액상용액으로 제제화 되는 조성물에 있엇 허용가능한 약제학적 담체로는 열균 및 생체에 적합할 것으로 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민주사액, 텍스트로스용액, 말토텍스트린용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 완충제, 정규제, 항산화제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면 활성제 및 윤활제 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제 및 결합제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 한약, 캡슐, 과립 및 정제로 제제화 할 수 있다.
본 발명 약학조성물 내지 기능성식품조성물의 형태는 시럽, 분말, 환, 티백(tea bag) 등의 형태로 제조될 수 있다.
분말상으로 제조하는 경우, 상기 초석잠 추출물을 동결건조한 분말과 엉겅퀴 분말을 혼합하여 제조하고, 상기 분말을 물과 혼합하여 반죽물을 제조하여 성형하여 과립상 또는 환의 형태로 제조할 수 있다.
상기 초석잠과 엉겅퀴를 본 발명의 중량비에 따라 혼합하여 80 내지 90°c에서 중탕 추출한 추출물을 동결건조시켜 분말화한 다음 수득된 분말을 사용하여 시럽 또는 과립을 제조할 수 있다.
티백으로 제조하는 경우 상기 초석잠 및 엉겅퀴의 추출물을 동결건조한 분말을 80 내지 120°c에서 로스팅한 후 티백에 넣어 포장하여 제조할 수 있다.
더 나아가 본 발명이 속한 기술분야에 알려진 방법에 따라 각 질환에 바람직하게 제제화할 수 있다
본 발명의 조성물은 식물 추출물을 원료로하여 부작용없이 안전하게 섭취할 수 있으며 혈중 ADH, ALDH 농도를 감소시킬뿐 아니라 음주로 인한 간손상을 효과적으로 방지할 수 있고 간 기능을 효과적으로 개선할 수 있다. 특히 초석잠추출물 및 엉겅퀴 추출물의 유효성분들간의 시너지로 인해 우수한 숙취해소 및 간기능 개선효과를 제공할 수 있다.
도1은 초석잠(Stachys sieboldi Miq)의 크로마토그래피 결과 그래프이고,
도2는 Qtrap LC-MS/MS를 통해 분석한 초석잠 유효성분의 Mass data를 나타낸 결과이며,
도3은 초석잠에 함유되어 있는 유효성분의 구조식이며,
도4는 엉겅퀴(Cirsium Japonicum)의 크로마토그래피 결과 그래프이고,
도5는 Qtrap LC-MS/MS를 통해 분석한 엉겅퀴 유효성분의 Mass data를 나타낸 결과이며,
도6은 엉겅퀴에 함유되어 있는 유효성분의 구조식이며,
도7은 초석잠 및 엉겅퀴 혼합 조성물이 ADH 및 ALDH에 미치는 영향을 보여주는 그래프이며,
도8은 초석잠 및 엉겅퀴 혼합조성물이 간조직에 미치는 영향을 보여주는 간조직 사진이다.
도2는 Qtrap LC-MS/MS를 통해 분석한 초석잠 유효성분의 Mass data를 나타낸 결과이며,
도3은 초석잠에 함유되어 있는 유효성분의 구조식이며,
도4는 엉겅퀴(Cirsium Japonicum)의 크로마토그래피 결과 그래프이고,
도5는 Qtrap LC-MS/MS를 통해 분석한 엉겅퀴 유효성분의 Mass data를 나타낸 결과이며,
도6은 엉겅퀴에 함유되어 있는 유효성분의 구조식이며,
도7은 초석잠 및 엉겅퀴 혼합 조성물이 ADH 및 ALDH에 미치는 영향을 보여주는 그래프이며,
도8은 초석잠 및 엉겅퀴 혼합조성물이 간조직에 미치는 영향을 보여주는 간조직 사진이다.
본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 초석잠 및 엉겅퀴 추출물의 제조
초석잠 및 엉겅퀴는 원재료를 수급하여 흐르는 물에 3회 반복하여 씻은 후 양질의 원료만을 선별하였다. 그 후 대류순환식 드라이 오븐을 통해 50℃에서 48시간 건조하였다. 건조된 시료을 2kg 칭량하여 그에 15배인 30L의 증류수를 첨가하여 환류냉각추출기로 60℃에서 12시간 추출하였다. 추출액은 필터페이퍼(Whatman qualitative No. 6, 185 mmØ)을 통해 여과하여 감압농축기(40℃)를 이용하여 농축하였다. 적당히 농축된 추출액은 진공동결건조기를 통해 동결건조 되었고, 동결건조된 분말은 알루미늄팩에 실리카겔과 함께 포장하여 -20℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.
실시예 2. 초석잠 및 엉겅퀴의 분석 시료 제조
1) 유효성분의 분리
분석시료의 제조는 -20℃에서 보관중인 동결건조 분말 20g을 증류수 400ml에 용해시킨 후 헥산을 사용하여 추출물에 남아 있을 비극성 불순물을 제거하고 남은 여액에 에틸아세테이트 200ml을 첨가하여 성분을 분획추출하였다(3회).
분획추출된 성분에 무수(無水) Na2SO4를 첨가하여 미세하게 남아있을 수분을 제거하고, 그 여액을 필터페이퍼를 통해 여과한다.
여과액은 감압농축기를 통해 완전 분말화될 때까지 농축하여 -20℃에 보관하였다.
2) HPLC-MS/MS 시료 제조
HPLC와 MS/MS의 분석에 사용될 시료는 -20℃에 보관중이던 분말화된 파우더를 1000ug/mL의 농도 즉, 1000ppm의 농도로 70% 메탄올에 용해하여 0.45μm menbrane filter에 여과한 후 사용하였다.
3) 비율별 시료의 제조
초석잠(Stachys sieboldi Miq) 및 엉겅퀴(Cirsium Japonicum)의 비율별 시료 제조는 유효성분이 분리된 시료를 70% 메탄올에 용해하여 1000ppm의 농도로 제조한 후 이를 비율별로 혼합하여 제조하였다. 그 비율은 3:7, 5:5, 7:3 이였다.
실시예 3. HPLC-MS/MS를 통한 초석잠(
Stachys sieboldi Miq
) 및 엉겅퀴(
Cirsium Japonicum
)내에 함유되어 있는 유효성분 확인
초석잠(Stachys sieboldi Miq) 및 엉겅퀴(Cirsium Japonicum)내에 함유된 유효성분의 분석조건은 Table 1에 정리하였다. 분석에 사용된 기기는 Agilent 1260 series HPLC 및 3200 QTrap tandem mass system(Sciex LLC, spray voltage set at -4.5 kV, positive ion mode) 사용하였으며, 칼럼은 Pronto SIL column(length: 250 mm, inner diameter: 4.6mm, particle size: 5um, Phenomenex Co., Ltd,; Biochoff Chromatography)를 사용하였다.
분석에 사용된 이동상은 A: water, B: ACN의 비율이 점차적으로 변화하는 gradient mode를 사용하여 분석하였다. Gradient mode의 용매변화는 다음과 같다 : 0-10 min; 10-15%; B, 10-20 min; 15-20%; B, 20-30 min; 20-25%; B, 30-40 min; 25-40%; B, 40-50 min; 40-70%; B, 50-60 min; 70-95%; B, 60-70 min; 95-95%; B, 70-90 min; 95-95%; B. 이동상은 0.5 ml/min으로 흘렸으며, oven temperature은 35℃로 설정하였다. 분석 파장대는 UV-Vis 284 및 364 nm을 사용하였다.
실시예 4. 초석잠(
Stachys sieboldi Miq
) 및 엉겅퀴(
Cirsium Japonicum
)의 혼합조성물이 랫의 숙취해소 및 간 조직에 미치는 영향
1)동물복지와 IACUC
본 시험은 안전성평가연구소 경남 분소 생명자원연구그룹 표준작업지침서 및 시험계획서에 따라 동물에 대한 일반적인 복지를 실시하였고, 실험동물복지법 (Guide for the Care and Use of Laboratory Animal (by ILAR publication)에 따라 동물 시험을 실시하였다. 본 시험은 안전성평가연구소 경남분소 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) 심의를 통과하였다.
각 군은 5마리의 실험동물로 구성되었으며, 알코올은 음용수에 포함하여 자유급이 하였으며, 혼합 조성물은 먹이에 첨가하여 10주간 공급하였고 총 실험기간은 12주로 하였다. 사육실의 환경은 표준작업지침서에 따라 자동으로 제어되었으며(온도: 20~27℃, 상대습도: 50±20%, 명암주기: 12 hour light/ 12 hour dark cycle, 조도: 150~300Lux, 환기: 시간당 10~20회), 동물실과 사육상자 청소는 안전성평가연구소 경남분소 생명자원연구그룹의 표준작업지침서에 따라 실시하였다. 모든 사육상자에는 케이지 카드를 부착하고, 동물실의 입구에는 동물실사용기록지를 부착하였다. 실험동물용 고형사료(AIN-93G)를 급이하였으며, 물은 미세여과기와 자외선 유수살균장치를 통과한 상수도수를 사용하였다. 실험동물에 공급되는 물은 6개월마다 환경부에서 지정한 검사기관에 의뢰하여 총 세균수, 대장균수, 납, 염소 및 특정 오염물질 등에 대하여 검사하였다. 실험동물은 negative control군은 알코올과 식이조성물을 급이하지 않은 군이며, 알코올 5% 및 15% 급이군은 각각 positive-1 및 positive-2군으로 명명하였다. Positive-1군에서 혼합 조성물을 1% 및 3% 급이한 군은 실험-1군 및 실험-2군, Positive-2군에서 혼합조성 물을 1% 및 3% 급이한 군은 실험-3군 및 실험-4군으로 명명하여 실험을 진행하였다(표 2).
2) 혈중 ADH 측정
혈중에서 ADH의 활성 측정은 Alcohol Dehydrogenase Activity Assay Kit (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)로 수행하였다. 간략히, 혈청 2mL에 ADH 분석 완충액 18ml을 첨가하여 희석한다. 희석된 시료를 2ml 웰에 추가하고 ADH assay buffer을 첨가하여 50ml로 적용한다. 각 웰에 반응용액을 100ml 추가하고 수평 쉐이커에서 잘 섞어준다(빛으로부터 플레이트를 보호). 그 후 37℃에서 2~3분 반응 후 초기 측정(Tinitial)을 수행한다(450nm에서 흡광도 측정). 이 후 5 min마다 측정을 수행하면서 37℃에서 플레이트를 계속 반응시킨다(빛으로부터 플레이트를 보호). 가장 활동적인 시료의 값이 가장 높은 표준물의 수치(10 nmole/well)의 값보다 클 때까지 계속 측정한다.
계산식은 다음과 같다. ADH의 단위는 37℃/pH8에서 1.0mmol의 NADH를 생성하는 효소의 양이다.
3) 혈중 ALDH 측정
혈중에서 ALDH의 활성 측정은 Aldehyde Dehydrogenase Activity (Sigma-Aldrich. St. Louis, MO)로 수행하였다. 간략히, NADH를 농도별로 희석하여 표준물질을 준비하고, 이 표준물질은 측정 실험을 진행할 때 동시에 진행하였다. 우선적으로 샘플의 NADH의 백그라운드 판독값을 생성하기 위해 백그라운드 컨트롤로 반응 믹스에서 아세트 알데히드를 조절하여 값을 수정하였다. 표준물질, 백그라운드 컨트롤 및 시료를 50μl 96 웰 플레이트에 투여하였다. 그 후 키트에 포함되어 있는 반응시작을 50ul씩 분주하고 짧은 시간 혼합하여 주었다. 그 다음으로 실온에서 5분간 반응시킨후 450 nm의 파장에서 OD를 측정한 다음 20분 후 450nm에서 OD를 다시 측정하는 과정을 계속하여 주었다. 이때 OD 값이 표준곡선 끝부분에 위치하면 더 이상 측정을 하지 않았다.
계산식은 다음과 같다.
계산값을 표준곡선에 대입하여 NADH값을 구한다.
ALDH의 단위는 실온/pH 8에서 1.0 μmol의 NADH를 생성하는 효소의 양이다.
4) H&E stain을 통한 간 조직 관찰
알코올을 섭취한 랫에서 초석잠(Stachys sieboldi Miq) 및 엉겅퀴(Cirsium Japonicum) 복합물이 간 조직의 변화에 미치는 영향을 관찰하기 위해 H&E stain을 진행하였다. 조직 섹션 후 오븐(60℃)에 두었던 조직 슬라이드를 꺼내서 xulene용액에 3분간 3회 방치한다(파라핀을 제거하기 위함). 그 후 xylene을 제거하기 위해 100% 에탄올 용액에 3분간 처리하고 95%-90%-70%의 에탄올에 순차적으로 3분씩 처리한다. 10분간 흐르는 DW에 10분간 수세하여 준 후, hemaxoylin 용액에 5분간 처리하여 준다. 그 후 5분간 흐르는 DW에 수세하고 70% 에탄올에 희석된 1% HCl용액에 2회정도 처리해준다(염색약이 적당히 제거될 정도). 그리고 5분 동안 흐르는 DW에 수세한 후 70% 에탄올에 희석된 1% 암모니아 용액에 2분 처리하여 줍니다(조직의 변색화). 5분간 흐르는 DW에 수세한 후 eosin용액에 2분간 담궈준다(적당히 염색될 정도). 그 후 70%-80%-90%-95% 에탄올 순으로 1분씩 처리한다(과도하게 오래처리하게 되면 eosin이 쉽게 제거됨). Xylene으로 총 3분씩 3회 처리한 후 조직을 봉입제와 cover glass를 사용하여 봉입한 후 광학현미경으로 관찰한다.
5) 결과 및 고찰
a. 초석잠 유효성분 분석 결과
초석잠(Stachys sieboldi Miq)에 함유된 유효성분을 HPLC-MS/MS를 통해 분리 및 동정한 결과는 하기 표 3에 나타내었다 (도 1 및 도2). 도 3은 초석잠에 함유된 유효성분의 구조이다.
HPLC를 통해 초석잠(Stachys sieboldi Miq)내에 함유되어 있는 유효성분을 분리한 결과는 도 1의 크로마토그램과 같다. 총 7개의 peak가 검출되었으며, 이 크로마토그래피를 토대로하며 LC-MS/MS 분석하였다. Qtrap-MS/MS를 통해 분석한 결과를 도. 2에 나타냈으며, 이는 총 질량값과 MS의 충격으로 인해 분해되는 물질의 파편조각을 분석하여 그 물질을 찾아내는 분석방법이다. 이를 통해 밝혀진 유효성분의 구조는 도 3과 같고, 밝혀진 유효성분의 특성은 표 3에 표시하였다.
총 7개의 peak 중 6개의 성분을 동정하였는데, 각성분은 stachyose, dimethoxybenzoic acid, verminoside, phenylalanine, isoacteoside 및 L-tryptophan이였다. stachyose는 올리고당과 함께 수많은 채소 및 기타 식물들에게서 자연적으로 생성되는 성분이다. Peak No. 2 Dimethoxybenzoic acid는 veratric acid라고도 불리며, 식물과 과일에서 주로 검출되는 성분이다. Dimethoxybenzoic acid는 항산화, 항염, 혈압 강하에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, UVB 조사 후 상향 조절된 COX-2발현과 PGE2, IL-6의 수준을 감소시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. eak No. 3 Verminoside는 항염증, 항박테리아 및 항특성을 나타내며, 세포 내 ROS 및 스트레스 수준을 약화시켜 수명을 연장하고, 수명 및 스트레스 조절은 인슐린을 조절하는 daf-16발현의 VMS 매개 변화에 기인 할 수 있다. Verminoside는 PARP-1 및 p53 단백질과 관련된 인간 림프구에서 유전 독성을 유도하는 것으로 알려져 있다. Peak No. 4 phenylalanine은 티로신의 전구물질로 사용되고, 감미료 중 아스파탐의 주 원료가 되기도 한다. 또한, 필수아미노산 중 하나이며, 인체내에서 다양한 역할을 수행하는 단백질 중 하나이다. Peak No. 6는 isoacteoside는 페닐에타노이드 배당체로써 중국 전통 의학에 다방면으로 활용되는 항염증 허브작물에 다량 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. Peak No. 7는 tryptophan은 필수 아미노산 중 하나로, 식물체에서 시키미산이나 안트라닐레이트를 전구체로하여 합성하는 것으로 알려져 있다. Tryptophan은 필수 아미노산으로써 인간은 스스로 트립토판을 합성할 수 있기에 반드시 식품으로 섭취를 하여야하며, 트립토판을 포함하는 아미노산들의 가장 중심적인 역할은 단백질 생합성의 재료로 쓰인다.
하기 표 4에는 초석잠 내에 함유되어 있는 유효성분을 area값으로 표시하였고, 모든 성분 대비 각성분의 area 값을 %로 추가 표기하였다. Stachyose는 area값이 16200.6으로 초석잠이 함유하고 있는 유효성분들 중 가장 많은 61.12%를 차지하고 있었다. 다음으로는 Verminoside가 4279.7(16.14%), Dimethoxybenzoic acid가 2420.5(9.13%)의 순으로 높은 수준이었다. 그 후 tryptophan이 1697.3(6.40%)였고, Isoacteoside, phenylalanine 및 unknow 성분은 879.7~455.3(3.32~1.72%)로 함량이 다소 낮았다.
b. 엉겅퀴 유효성분 분석 결과
엉겅퀴(Cirsium Japonicum) 에 함유된 유효성분을 HPLC-MS/MS를 통해 분리 및 동정한 결과는 하기 표 5에 나타내었다 (도 4 및 도5). 도 6은 초석잠에 함유된 유효성분의 구조이다.
HPLC를 통해 엉겅퀴(Cirsium Japonicum)내에 함유되어 있는 유효성분을 분리한 결과는 도 4의 크로마토그램과 같다. 총 10개의 peak가 검출되었으며, 이 크로마토그래피를 토대로하며 LC-MS/MS 분석하였다. Qtrap-MS/MS를 통해 분석한 결과를 도 5에 나타냈으며, 이는 총 질량값과 MS의 충격으로 인해 분해되는 물질의 파편조각을 분석하여 그 물질을 찾아내는 분석방법이다. 이를 통해 밝혀진 유효성분의 구조는 도 6과 같고, 밝혀진 유효성분의 특성은 table 5에 표시하였다.
총 10개의 Peak중 8개의 성분을 동정하였는데, 각 성분은 procyanidin trimer monogallate, sucrose, 3-O-caffeoylquinic acid, shikimic acid, adenine, tryptophan, sinapyl alcohol 및 dimethoxyluteolin 이였다. Peak No. 1인 procyanidin trimer monogallate는 3개의 procyanidin과 하나의 gallate가 결합한 구조로 이루어져 있으며, procyanidin은 프로안토시아니딘 계열의 플라보노이드에 속한다. 카테킨과 에피카테킨 분자로 형성된 올리고 화합물로써 산화조건에서 해중합되면 시아니딘으로 형성된다. 다양한 식물체에 존재하며 항산화, 항염, 항암과 같은 생리활성효과를 가지고 있다. Peak No. 2는 sucrose로 1분자의 프락토오스와 1분자의 글루코오스가 글리코사이드 결합한 이당류이며, 이를 정제하여 일상에서 소비하는 설탕을 제조한다. 자연에서 sucrose는 많은 식물들에 존재하는데 이는 주로 광합성에서 에너지를 저장하는 수단으로 이용되기 때문이다. Peak No. 3는 3-O-caffeoylquinic acid (Chlorogenic acid)으로 카페인산과 퀸산의 에스테르 결합으로 구성된 천연 화합물이다. Chlorogenic acid는 리그닌 생합성에서 중요한 중간체이며, 산화방지제, 식후 혈중 포도당의 방출을 조절하는 것으로도 알려져있다. Peak No. 4는 shikimic acid로 식물의 중요한 생화학 반응 중간체로써, 팔각에서 얻어진 시키미산은 오셀타미비르(타미플루)를 제조하는 원재료로 사용되고 있다. Peak No. 6인 adenine은 핵산인 DNA와 RNA에서 발견되는 5가지 주요 핵염기들 중 하나이며, NAD, FAD의 형태로 세포 호흡을 포함한 생화학에서 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 생체 내에서 인산과 결합하여 아데노신 일인산의 형태로 존재하는 것이 일반적인 형태로 유리된 형태로 존재하는 경우는 식물체에서 간혹 발견된다. Peak No. 8인 tryptophan은 상기 기재된 초석잠 분석결과 부분에서 언급했듯, 필수 아미노산 중 하나로, 식물체에서 시키미산이나 안트라닐레이트를 전구체로하여 합성하는 것으로 알려져 있다. Tryptophan은 필수 아미노산으로써 인간은 스스로 트립토판을 합성할 수 있기에 반드시 식품으로 섭취를 하여야하며, 트립토판을 포함하는 아미노산들의 가장 중심적인 역할은 단백질 생합성의 재료로 쓰인다는 것이다. Peak No. 9 sinapyl alcohol은 리그닌 또는 리그난의 전구체인 모노 리그놀 중 하나이며, 다양한 스틸 베 노이드와 쿠마린의 생합성 전구체로 이용된다. Sinapyl alcohol은 1차 리그닌 당량체로써, 항염증 및 항통각에 효과가 있으며, 환원제로써도 이용되고 있다. Peak No. 10 dimethoxyluteolin은 항산화 활성을 가지고 있으며 FcRI-알파 사슬의 하향 조절을 통해 히스타민 방출 및 칼슘 유입의 강력한 억제제로 활용되고 있다.
엉겅퀴 내에 함유되어 있는 성분의 Area 결과값으로 엉겅퀴 추출물 내에 포함된 모든 성분 대비 각성분의 area 면적값을 %로 표시하였다. 각 성분의 설명은 상기 기재되어 있는 LC-MS/MS 결과 해석에 기재하였다. Procyanidin trimer monogallate는 area값이 23094.3으로 엉겅퀴가 함유하고 있는 성분들 중 가장 많은 55.95%을 함유하고 있다. 다음으로 shikimic acid(6719.5(16.28%)), sinapyl alcohol(5599.3(13.57%))의 순으로 높았다. 그 외 성분들은 5.04~0.55%의 범위로 큰 함유량은 아니였으며, 그 순서는 dimethoxyluteolin(2080.9(5.04%)), tryptophan(1068.9(2.59%)), adenine(846.7(2.05%)), sucrose(735.6(1.78))으로 그 뒤로 unknow의 성분이 472.3(1.14%) 및 432.6(1.05%) 였다(표 6).
c. 초석잠(
Stachys sieboldi Miq
) 및 엉겅퀴(
Cirsium Japonicum
) 혼합조성물이 ADH 및 ALDH에 미치는 영향
체내로 흡수된 알코올의 대부분은 위장과 소장에서 흡수되어 간으로 이동된 후 대사과정을 거쳐 분해되는데, 장기적으로 알코올을 섭취할 경우 영양소의 흡수장애와 간 기능의 손상을 초래할 수 있다(Peters TJ et al., 1982). 간에서의 알코올 분해는 먼저 ADH와 cytochrom P-450에 의해알코올이 acetaldehyde로 전환되는데, 이때 생성된 acetaldehyde는 독성을 가지고있어 맥박상승, 두통, 구토, 홍조 등의 숙취 증상이 나타난 뿐만 아니라 미토콘드리아의 기능을 저해시켜 간 경변, 심장 및 뇌의 기능 저하도 일으킨다고 보고 되어 있다(Husenmoen LL et al. 2008). 간 조직에서 알코올 대사는 먼저 ADH 활성에 영향을 주는 요인들에 의해 조절될 수 있는데[cha JY et al., 2008, Husenmoen LL et al., 2008, Schisler NJ et al., 1989], 지금까지 인삼, 홍삼, 헛개나무, 오리나무, 구기자 등의 한방 천연 약재 추출물에 알코올 해독 작용이 있는 것으로 알려져 왔다.[Lee IS et al., 2002, Lieber CS et al., 1985, Swain T et al., 1959]. 또한 콩나물, 미나리, 무, 배추 등의 식물성 식품소재에서도 효모 유래 ADH 활성을 촉진시키는 결과가 보고된 바 있다[Kang BK et al., 2002].
숙취해소 음료의 주요 소재로 사용되고 있는 헛개나무 열매추추물의 경우 실험동물에서 ADH활성보다 ALDH활성을 더 촉진시킴으로써 빠르게 acetaldehyde를 분해시켜 숙취해소에 상당히 효과가 있는 것으로 알려져 있는데[Kim MH et al., 2000], 본 연구에서 급이한 초석잠 및 엉겅퀴 혼합조성물 또한 ADH보다 ALDH의 활성이 더 높아 숙취해소에 상당히 효과가 있을 것으로 생각된다.
초석잠(Stachys sieboldi Miq) 및 엉겅퀴(Cirsium Japonicum) 복합물을 섭취한 랫에서의 ADH 및 ALDH 효과는 도 7과 같다. 일반 식이를 섭취한 negative control군보다 알코올을 5% 및 15% 섭취한 C1군과 C2군의 알코올 분해효소가 낮은 것을 알 수 있다. 이는 알코올의 지속적인 섭취는 효소의 민감성을 떨어트린다는 것을 알 수 있다. 그에 반해 15% 알코올을 섭취하고 초석잠·엉겅퀴 혼합물을 1% 및 3% 섭취한 T3 및 T4군에서는 C2군에 비해 증가된 효소활성을 확인할 수 있다. 결론적으로 과한 알코올을 섭취하였을 때, 초석잠 및 엉겅퀴 혼합 조성물을 섭취한다면 숙취해소에 도움이 될 것이다.
d. 초석잠(
Stachys sieboldi Miq
) 및 엉겅퀴(
Cirsium Japonicum
) 혼합조성물이 간조직에 미치는 영향
초석잠(Stachys sieboldi Miq) 및 엉겅퀴(Cirsium Japonicum) 혼합조성물이 알코올을 섭취한 실험동물 모델에서의 간조직을 관찰한 사진은 도 8과 같다. 염증세포의 침윤은 거의 관찰되지 않았지만, 알코올 투여군에서는 지방침윤이 관찰되었다. 알코올 투여군에서 지방침윤이 관찰된 것과는 상반되게 알코올과 함께 초석잠 및 엉겅퀴 혼합 조성물을 섭취한 군에서는 지방침윤이 관찰되지 않았다. 이는 초석잠 및 엉겅퀴 혼합 조성물의 섭취가 장기간 알코올 섭취로 인해 유발되는 지방강을 예방하는 작용을 한 것으로 판단된다.
실시예 5. 본 발명의 약학 조성물의 제조
1) 분말(산제)의 제조
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충전하여 분말제품을 제조한다
2) 캅셀제의 제조
통상의 락토스 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다
3) 정제(알약)의 제조
Claims (6)
- 초석잠 추출물과 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 하는 숙취해소 및 간기능개선용 조성물.
- 제1항의 초석잠 추출물과 엉겅퀴 추출물은 3:7 내지 7:3 중량비의 혼합인 것을 특징으로 하는 숙취해소 및 간기능개선용 조성물.
- 제1항의 초석잠 추출물은 초석잠뿌리를 80 내지 90℃에서 24 내지 30시간동안 중탕 추출하여 얻어진 추출물이고, 엉겅퀴 추출물은 80 내지 90℃에서 20 내지 28시간동안 중탕 추출하여 얻어진 추출물인 것을 특징으로 하는 숙취해소 및 간기능개선용 조성물.
- 제1항의 조성물은 초석잠 추출물과 엉겅퀴 추출물을 각각 10 내지 1500mg/ml의 농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 숙취해소 및 간기능개선용 조성물.
- 제4항의 조성물을 유효성분으로 하는 간 기능 증진용 기능성 식품.
- 제5항의 식품은 분말, 과립, 환, 시럽 또는 티백(tea bag)인 것을 특징으로 하는 간 건강 증진용 기능성 식품.
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| KR100626724B1 (ko) | 2004-04-14 | 2006-10-02 | 서울향료(주) | 간 섬유화의 예방 또는 치료를 위한 혼합 생약추출물 및이를 포함하는 약학적 조성물 |
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