KR101528871B1 - 세포 활성화 효능을 통한 항노화 기능을 갖는 조성물 및 이를 함유하는 건강기능식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 홍삼(Panax ginseng C.A.Meyer) 추출물; 포도(Vitis vinifera), 쑥(Artemisia), 복분자(Rubus coreanus Miquel)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 추출물;을 유효 성분으로 함유하는 세포 활성화 효능을 갖는 조성물에 관한 것이다.
구체적으로 상기 세포 활성화 효능은, 세포 생존율, DNA 상해에 대한 회복, 세포 고사의 저해, 비주기성 DNA 합성, DNA 절단 감소율, 저분자량의 DNA 함량 감소, p53 단백질의 발현량 감소 및 p53 의존성 단백질의 발현량 감소를 촉진하는 기능을 포함하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.

Description

세포 활성화 효능을 통한 항노화 기능을 갖는 조성물 및 이를 함유하는 건강기능식품 {A PHARMACEUTICAL WITH ANTI-AGING EFFECT THROUGH CELL ACTIVATION, AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD WITH THE PHARMACEUTICAL}

본 발명은 홍삼(Panax ginseng C.A.Meyer) 추출물; 포도(Vitis vinifera), 쑥(Artemisia), 복분자(Rubus coreanus Miquel)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 추출물;을 유효 성분으로 함유하는 세포 활성화 효능을 갖는 조성물에 관한 것이다.

구체적으로 상기 세포 활성화 효능은, 세포 생존율, DNA 상해에 대한 회복, 세포 고사의 저해, 비주기성 DNA 합성, DNA 절단 감소율, 저분자량의 DNA 함량 감소, p53 단백질의 발현량 감소 및 p53 의존성 단백질의 발현량 감소를 촉진하는 기능을 포함하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.

인간의 질병 및 노화는 DNA의 손상 및 변형 즉 유전체 안정성의 훼손에 따른 세포 생리학적 장애에 기인한다. 특히 활성산소에 따른 산화적 스트레스는 지질, 단백질, DNA, 효소 등의 변성 및 파괴를 유발함으로써 세포에 치명적인 피해를 입히는 주요 병인이다.

개략적으로 보면, 인간을 포함한 생물은 호흡이라는 과정을 통해 에너지를 얻고 신진대사를 하는 과정에서 약 2%를 활성산소로 변환시켜 지니고 있게 된다. 활성산소는 Free radical을 가진 산소를 의미한다. 이러한 활성산소는 불안정한 성격을 띠고 있어 주위의 물질과 반응이 아주 강해 세포내 단백질이나 지질 분자는 물론이고 유전정보를 함유한 DNA까지도 산화적 손상을 입히며 결과적으로는 세포에 손상을 입힌다.

즉 산화적 스트레스를 견딜 수 있는 체내 항산화 물질의 방어력에 이상이 생기게 되면 DNA의 상해가 지속적으로 일어남으로써 세포 생리학적 장애가 발생되는 것이다.

또한 활성산소 및 기타 원인 등에 의하여 DNA 상해가 발생하면 세포는 ATM, p53 단백질들의 활성화 및 p21, GADD45, MDM2 등의 전사 활성화과정이 진행되고, 세포 주기의 정지와 절제회복, 재조합회복, mismatch repair 등의 회복기구가 작동되어 정상세포로 복구되거나, DNA 상해의 양이 과다할 경우 caspase 활성화를 수반하는 세포고사가 작동되어 암세포화 될 가능성을 방지하게 된다.

따라서 세포 활성화를 통하여 유전체의 안정화 기전을 향상시킴으로써 DNA 상해를 받은 세포의 손상을 방지하기 위한 천연물 유래 조성물이 절실한 상황이다.

한편 본 출원인은 세포 활성화 효능을 통해 유전체의 안정화 기전을 향상시키기 위한 조성물의 유효 성분으로서 홍삼, 포도, 쑥, 복분자를 포함하고 제기하는바 이하 이에 대하여 간략하게 살펴본다.

홍삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 수삼을 수증기(증삼) 또는 기타 방법으로 쪄서 건조한 것을 말한다. 배당체 성분인 사포닌(Saponin)을 비롯하여 인삼향성분(Panacen), 폴리아세틸렌(Polyacetylen)계 화합물, 함질소성분, 플라보노이드(Flavonoid), 비타민 B군, 미량원소, 효소, 항산화물질, 유기산 및 아미노산 등을 함유하고 있다. 이들 중 주요 약리활성을 보이는 성분은 진세노사이드라 불리는 사포닌 성분이다.

진세노사이드는 복합 탄수화물 즉 알코올 또는 페놀과 당의 복합체로서, 대부분 트리테르페노이드(Triterpenoid)계의 담마란(Dammarane)계 사포닌이다. 담마란계 사포닌에는 프로토파낙사디올(Protopanaxadiol, PPD)과 프로토파낙사트리올(Protopanaxatriol, PPT)이 있다.

PPD는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3, Rh2 등을 포함하여 19~22종이 보고되어 있는데, 수산기(OH-)가 2개이며 주로 중추신경계 진정작용을 보유하고 있다. PPT는 진세노사이드 Re, Rf, Rg1, Rg2 등을 포함하여 10~14종이 보고되어 있는데, 수산기(OH-)가 3개이며 주로 중추신경계 흥분작용이 있다고 알려져 있다.

특히 진세노사이드 Rg2는 기억력을 개선시키며, 카테콜아민 분비를 억제하는 기능 및 플라스민을 활성화하여 혈소판의 응집을 억제하는 기능을 보유하고 있다고 알려져 있다.

포도(Vitis vinifera L.)는 포도나무의 열매로서 장과(漿果)이며, 7∼8월에 갈자색으로 익는다. 성숙함에 따라 당분이 증가하고 산이 감소하며, 완숙하면 당분이 최대가 된다. 당분은 보통 14∼15％이다. 향미성분으로는 여러가지 유기산이 있는데, 주석산과 사과산이 대부분을 차지한다

쑥(Artemisia)은 식용식물(전초)로서 고혈압, 동맥경화를 예방하고, 면역기능, 해독작용, 간기능 개선, 각종 부인병에 효능이 있다고 알려져 있다.

복분자(Rubus coreauns Miquel)는 장미과(薔薇科：Rosaceae)에 속한 낙엽관목인 화동복분자(華東覆盆子)의 과실(果實)을 건조한 것으로, 초여름에 과실(果實)이 녹색에서 녹황색(綠黃色)으로 변할 때 채취하여 과경(果梗)을 제거하고 끓는 물에 2~4분 정도 익힌 다음 볕에 말린다.

복분자는 총당(17.3%), 환원당(8.6%), 조단백질(10.6%), 조회분(4.5%), 조지방(3.1%) 및 조섬유(3.9%)와 같은 성분을 함유하고 있으며, 아밀알코올을 포함하는 11종의 알코올류, 발레르산을 포함하는 산(acid)류, 헥산알을 포함하는 20종의 카보닐류, 2-헵타논을 포함하는 5종류의 하이드로카본, 및 메틸팔미트산염을 포함하는 3종류의 에스테르류의 향기성분을 함유하고 있다. 또한 폴리페놀(polyphenol)을 다량 함유하고 있어, 콜레스테롤의 저하, 고혈압이나 동맥경화의 억제, 과산화지질의 생성을 막아 노화의 예방, 혈청중 지질농도의 저하, 중성지질의 생성 억제에 의해 비만 방지 및 모세혈관의 저항력 증진 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.

한편 본 발명의 조성물에 사용된 유효성분을 포함하는 선행기술에 대하여 살펴보면, 대한민국 공개특허공보 10-2011-0080470호에는 홍삼 추출물 및 약초 발효물을 함유하는 면역 증강용 및 항산화용 건강식품 조성물이 기재되어 있다.

개략적으로 살펴보면, 약초 발효물에 사용되는 약초에는 복분자, 쑥 및 포도가 언급되어 있으나, 제조예에는 칡, 솔잎 및 민들레의 발효물을 제조하였고 시험예는 장관 면역계 활성, 대식세포 활성, 항산화 효과에 관한 것이다.

즉 상기 선행기술은 청구항에 복분자, 쑥 및 포도를 기재하였으나 이에 대한 세포 활성화를 통한 유전체 안정화 기전을 촉진시키는 것에 대한 것은 아니라고 할 수 있다.

본 발명의 목적은, 홍삼 추출물과 천연 소재들을 조합함으로써, 세포 활성화를 통한 유전체 안정화를 촉진할 수 있는 조성물 및 건강기능식품을 제공함에 있다.

본 발명은, 홍삼(Panax ginseng C.A.Meyer) 추출물; 포도(Vitis vinifera), 쑥(Artemisia), 복분자(Rubus coreanus Miquel)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 추출물;을 유효 성분으로 함유하는 세포 활성화 효능을 갖는 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

바람직하게, 상기 홍삼 추출물에는 진세노사이드 Rg2 가 1~8 mg/g 포함되고, 상기 포도, 쑥 또는 복분자 추출물은 10~200 ug/ml 포함되도록 한다.

본 발명은, 상기 유효성분을 포함하는 조성물을 포함하고 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가하여 약제학적 단위 투여형으로 제형화 된 발기부전 질환의 예방 및 치료제를 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

여기에서, 담체, 부형제, 희석제로는 토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한 상기 약제학적 투여 형태는 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

또한 상기 유효성분을 포함하는 조성물을 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

또한 상기 약제학적 투여 형태는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 고형 제제에는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분은 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다.

상기 비 수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 연령, 성별, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 0.001 내지 200 mg/kg으로 투여하는 것이 좋고, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 상기 유효성분을 함유하는 조성물에 식품 보조 첨가제를 추가하여 세포 활성화 효능을 촉진시키기 위한 건강기능식품 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 20 중량% 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 상기 추출물을 함유하는 외의 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외에 향미제로써 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그 밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 Rg2를 증진시킨 홍삼과 천연 소재를 조합한 조성물은 자외선 등과 같은 외부 환경 스트레스에 의한 세포 손상 및 DNA 손상을 방지함으로써, 뛰어난 항노화 효과를 보유하고 있다.

본 발명에 따른 조성물은 세포 활성화 효능을 보유하되, 구체적으로 세포 생존율, DNA 상해에 대한 회복, 세포 고사의 저해, 비주기성 DNA 합성, DNA 절단 감소율, 저분자량의 DNA 함량 감소, p53 단백질의 발현량 감소 및 p53 의존성 단백질의 발현량 감소를 촉진하는 기능을 보유하고 있다.

도 1 내지 도 8은 Comet assay방법으로 홍삼과 천연 소재 추출물이 DNA 상해원을 처리했을 때 절단 분석되는 DNA에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 9 및 도 10은 자외선에 의해 손상된 DNA에 형성되는 Cyclobutane pyrimidine dimer 구조에 홍삼 및 천연 소재 추출물이 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 11 및 도 12는 Western blotting 방법을 이용하여 홍삼 및 천연 소재 추출물이 p53 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 13 내지 도 15는 Western blotting 방법을 이용하여 Rg2가 증진된 홍삼 추출물과 천연 소재 추출물을 혼합한 조합물이 p53 의존성 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다.

본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

실험예 1. 홍삼과 천연 소재 후보물질에 대한 유전체 안정화 효능 검증

1-1. 실험준비

인간 피부 세포(Human Keratinocyte; HaCaT cell)를 10% fetal bovine serum (FBS)이 존재하는 RPMI-1640으로 37도 CO₂ humidified incubator에서 배양하였다. 정상배지 또는 물질 조합 함유 배지에서 적정시간 배양한 후 트리판 블루(trypan blue) 염색법을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
살아있는 세포는 트리판 블루가 세포안으로 들어오는 것을 막지만, 죽은 세포는 세포막이 제 기능을 수행하지 못하기 때문에 트리판 블루에 의해 파랗게 염색된다.
따라서 세포계수기(hematocytometer) 위에서 트리판 블루를 흡입한 세포의 수를 측정하고, 전체에 대한 비율로 산출하여 세포 생존율을 구하였다.

천연 소재 후보물질로는 블루베리, 쑥, 복분자, 포도, 감잎, 오디, 마늘, 생강 및 포도 축을 이용하였으며, 물 및/또는 주정 추출물 농도 0, 10, 50, 100, 200 ug/ml를 처리하였다.
여기에서 포도 축(軸)은 축(軸) 자에서 알 수 있듯이, 포도 송이가 열리는 가지, 과병(열매자루) 및 덩굴손 등을 포함하는 부분을 일컫는다.

홍삼은 진세노사이드 Rg2가 1, 2, 3, 4, 8 mg/g 포함된 추출물 농도 0, 10, 50, 100, 200 ug/ml를 처리하였다.

1-2. 실험결과

상기의 [표 1]에 천연 소재 후보물질들의 실험결과가 기재되어 있으며 이를 살펴보면, 블루베리(주정), 쑥(물), 마늘(주정), 생강(주정), 복분자(물, 주정) 추출물의 경우 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 감잎(주정), 오디(물, 주정), 감잎(물) 추출물의 경우에는 농도 의존적으로 세포 활성도를 약 12% 정도 감소시켰다.

그러나 쑥(주정), 포도(물, 주정)과 포도 축(주정) 추출물을 처리했을 때 상대적인 고농도에서 각각 약 8% 정도 세포 활성도를 증가시키는 것을 확인하였다.

Rg2가 증진된 5개의 홍삼 추출물의 경우, 농도의존적으로 또한 진세노사이드 Rg2가 함유된 양이 많을수록 세포 활성도가 증가하였는데, 약 6 ~11% 정도 세포 생존율을 증가시키는 것을 확인하였다.

실험예 2. 홍삼과 천연 소재 후보물질에 대한 유전체 안정화 효능 검증분석

2-1. 실험준비

정상배지 또는 물질 조합 함유 배지에서 적정시간 배양한 후에 MTT dye (500 ng/ml)를 4시간 동안 처리한 후, DMSO 50 ㎕를 처리, ELISA leader를 이용하여 OD 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
이때 측정된 흡광도는 MTT가 세포에 의해 포마잔(formazan(blue))으로 분해된 양을 나타내며, 따라서 살아있는 세포 수와 비례한다.
각 실험군의 세포 활성도는 대조군(시료 무처리 군)의 평균 흡광도 값에 대한 백분율 값을 산출하여 측정되었다.

천연 소재 후보물질의 및 시료 농도와 홍삼 시료 농도 등은 실험예 1과 동일하게 처리하였다.

2-2. 실험결과

상기의 [표 3]에 천연 소재 후보물질들의 실험결과가 기재되어 있으며 이를 살펴보면, 블루베리(물, 주정), 쑥(물), 마늘(주정), 생강(주정), 복분자(물, 주정) 추출물의 경우 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 감잎(주정), 오디(물, 주정), 감잎(물) 추출물의 경우에는 농도 의존적으로 세포 활성도를 약 25% 정도까지 세포 활성도를 감소시켰다.

그러나 쑥(주정), 포도(물, 주정)과 포도 축(주정) 추출물을 처리했을 때 상대적인 고농도에서 각각 약 10~15% 정도 세포 활성도를 증가시켰다.

Rg2가 증진된 5개의 홍삼 추출물의 경우, 농도의존적으로 또한 진세노사이드 Rg2가 함유된 양이 많을수록 세포 활성도가 증가하였는데, 약 7~11% 정도 세포 활성도를 증가시켰다.

실험예 3. 홍삼과 천연 소재 후보물질에 대한 세포 독성 저해능 분석 실험

3-1. 실험준비

자외선 등의 스트레스 유발원을 처리하고, 정상배지 또는 물질 조합 함유 배지에서 적정시간 배양한 후에 MTT dye (500 ng/ml)를 4시간 동안 처리한 후, DMSO 50ug를 처리, ELISA leader를 이용하여 OD 570 nm에서 세포활성을 측정하였다.

천연 소재 후보물질의 및 시료 농도와 홍삼 시료 농도 등은 실험예 1과 동일하게 처리하였다.

3-2. 실험결과

자외선을 조사한 후 포도 물 추출물을 처리한 경우 세포 활성은 농도 의존적으로 점차 증가하여 상대적인 고농도에서는 추출물을 처리하지 않는 대조군에 비해 약 10%가 증가되었으나, 오디, 감잎, 복분자, 쑥 물 추출물들은 대조군에 비해 세포의 활성도가 감소시켰다. 그러나 블루베리 물 추출물의 경우 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 유의적인 결과를 나타내지 않았다.

자외선을 조사한 후 포도 주정 추출물을 처리했을 때 세포 활성은 농도 의존적으로 점차 증가하여 상대적인 고농도에서 추출물을 처리하지 않는 대조군에 비해 약 11%가 증가하였다. 그러나 포도 축 주정 추출물의 경우에는 유의적인 차이를 나타내지 않음을 알 수 있었다. 포도 축의 경우 자외선을 조사하지 않았을 경우에는 세포 활성도를 증가시키는 결과를 나타냈으나 자외선을 조사한 후 처리한 경우에는 세포 활성도에 영향을 미치지 않는 것으로 보아 세포 활성도에는 영향을 미치나 DNA 상해에 대한 보호 또는 회복 효능을 나타내지 않을 것으로 생각된다.

또한 포도 물 추출물과 쑥, 복분자 주정 추출물을 처리한 경우 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 농도 의존적으로 증가하였다. 그러나 오디, 생강, 감잎 추출물의 경우에는 농도 의존적으로 미약하게 감소시켰다.

자외선을 조사한 후 Rg2가 증진된 홍삼 추출물을 처리하여 DNA 상해 반응에 대한 보호 또는 회복 효과를 나타내는지를 확인하였다. Rg2가 증진된 홍삼 추출물의 경우 농도 의존적으로 점차 증가하였다. 그 효과는 4, 8배의 Rg2가 증진된 홍삼 추출물에서 가장 높게 증가하였다.

실험예 4. 홍삼과 천연 소재 후보물질에 대한 세포 독성 저해능 성장 분석

실험예 3과 동일하게 실험을 수행하되, 24시간 동안 배양하면서 1, 3, 9, 24시간 때의 세포활성도를 측정하였다.

천연 소재 후보물질로는 블루베리(물, 주정), 포도(물, 주정), 쑥(주정), 복분자(주정), 포도 축(주정)을 처리하여 측정하였다. 홍삼 시료는 실험예 1과 동일하게 처리하였다.

상기 [표 7]를 참조하면, 자외선을 조사한 후 배양배지를 처리하여 다양한 시간 동안 배양한 결과 시간 의존적으로 세포 활성도가 감소를 하는 것으로 나타났으며 24시간 동안 배양한 경우 약 57% 정도의 세포 활성이 감소되었다.

포도, 쑥, 복분자, 포도축의 주정 추출물을 처리하고 자외선을 조사한 후 다양한 시간동안 배양한 결과 시간 의존적으로 점차 감소하긴 하였으나, 배양 배지에 비해 약 5~10% 이상 세포 활성도를 증가시켰다.

Rg2가 증진된 5개의 홍삼 추출물의 경우, 농도의존적으로 또한 진세노사이드 Rg2가 함유된 양이 많을수록 대조군에 비하여 세포 활성도가 증가하였다.

즉 홍삼 추출물 (Rg2 1mg/g)의 경우에는 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 약 5% 정도 높게 나타났다. 또한 Rg2를 2, 3, 4배의 Rg2가 증진된 홍삼 추출물에서도 배양 배지에 비해 약 8~12% 정도 증가하였고 8배의 Rg2가 증진된 홍삼 추출물에서는 약 14% 까지 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 5. 홍삼과 천연 소재 후보물질에 대한 세포 고사 저해능 분석

5-1. 실험준비

살아 있는 세포에서는 능동적 수송에 의해서 포스파티딜세린(phosphatidyl serine)이 세포 내에 위치하는데 세포고사가 진행하면서 세포막의 바깥쪽에 위치하게 된다.

Annexin V-FITC가 칼슘의 존재 하에 이 포스파디딜세린(phosphatidyl serine)과 결합하는 성질을 이용하는 실험 방법이다. 세포에 자외선(200 J/m²)과 같은 스트레스 유발원을 처리하고 정상배지 또는 물질 조합 함유 배지에서 적정 시간 배양한 후 Annexin V-FITC와 propidium iodide를 첨가한다.
빛을 차단한 상온에서 즉시 형광현미경을 이용해서 형광을 측정하는데, 이때 살아 있는 세포는 어느 것에도 염색되지 않고, 괴사된 세포는 propidium iodide와 annexin V-FITC 모두에 염색되어 형광을 나타낸다.

실험군의 형광 정도를 대조군(시료 무처리 군)의 수치와 비교하여, 추출물이 세포 고사 저해에 미치는 영향을 백분율로 환산하였다.

천연 소재 후보물질로는 포도, 쑥, 복분자 및 포도 축의 주정 추출물을 이용하였으며, 홍삼 시료는 실험예 1과 동일하게 처리하였다.

5-2. 실험결과

자외선을 조사한 후 포도, 쑥, 복분자, 포도 축 주정 추출물을 처리하여 자외선에 의한 세포 고사율에 미치는 영향을 확인하였다.

포도 주정 추출물을 처리했을 때 농도 의존적으로 감소하여 고농도에서는 약 10% 정도의 세포 고사를 저해하는 것을 확인하였다. 쑥 또는 복분자 주정 추출물의 경우도 약 8~11% 정도의 세포 고사 저해를 나타냈다.

그러나 포도 축 주정 추출물은 추출물을 처리하지 않은 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다.

Rg2가 증진된 홍삼 추출물을 처리하여 DNA 상해 반응에 대한 세포 고사율에 미치는 영향을 확인하였다. 홍삼 추출물 (Rg2 1mg/g)을 처리한 경우에는 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 약 9% 정도 세포 고사를 저해하였다. 2, 3, 4, 8배의 Rg2가 증진된 홍삼 추출물에서도 배양 배지에 비해 약 11~15% 정도 저해하는 것을 확인하였다.

실험예 6. 홍삼과 천연 소재 후보물질에 대한 세포 고사율 측정

6-1. 실험준비

Facstar는 세포 주기분석, 세포 증식률, CD14 발현 측정과 세포 고사율을 측정하는데 이용되는 연구 방법이다. 488 nm 세기로 발광된 argon ion laser beam 200 mW 출력에서 분석하며 염색형광물질은 530 nm/610 nm의 band pass filter 에서 선택적으로 투과 감지되며 tubes 당 약 만개의 세포가 분석에 이용되기도 한다.

감지된 정보는 Hewlett-Packard computer의 consort 30 program에 의하여 분석하여 세포 고사 집단의 백분율을 수치화하였다.

천연 소재 후보물질 및 홍삼의 처리는 실험예 5와 동일하게 하였다.

6-2. 실험결과

포도 주정 추출물을 처리했을 때 농도 의존적으로 감소하여 고농도에서는 약 5% 정도의 세포 고사를 저해하는 것을 확인하였다. 쑥 또는 복분자 주정 추출물의 경우도 약 9~13% 정도의 세포 고사 저해를 나타냈다.

그러나 포도 축 추출물은 추출물을 처리하지 않은 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다.

Rg2가 증진된 홍삼 추출물을 처리하여 DNA 상해 반응에 대한 세포 고사율에 미치는 영향을 확인하였다. 홍삼 추출물 (Rg2 1mg/g)을 처리한 경우에는 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 약 15% 정도 세포 고사를 저해하였다. 2, 3, 4, 8배의 Rg2가 증진된 홍삼 추출물에서도 배양 배지에 비해 약 16~20% 정도 저해하는 것을 확인하였다.

실험예 7. 홍삼과 천연 소재 후보물질에 대한 비주기성 DNA 합성 분석

7-1. 실험준비

세포를 slide glass위에서 가득 차게 배양한 후 자외선 등과 같은 DNA 상해원을 처리하고, 물질 조합이 포함된 배지로 후배양한 후 3H-thymidine (5 Ci/ml)로 세포의 DNA를 표지하고 autoradiography하여 세포당 beta선의 흔적인 grain의 수를 현미경하에서 측정하였다.

천연 소재 후보물질과 홍삼의 처리는 실험예 6과 동일하게 하였다.

7-2. 실험결과

포도 주정 추출물을 처리했을 때 농도 의존적으로 감소하여 고농도에서는 약 25% 정도의 비주기성 DNA 합성량이 증가하는 것을 확인하였다. 쑥 또는 복분자 주정 추출물의 경우도 약 21~32% 정도의 비주기성 DNA 합성량을 나타냈다.

그러나 포도 축 추출물의 경우에는 추출물을 처리하지 않은 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다.

Rg2가 증진된 홍삼 추출물을 처리하여 DNA 상해 반응에 대한 비주기성 DNA 합성에 미치는 영향을 확인하였다. 홍삼 추출물 (Rg2 1mg/g)은 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 약 45% 정도 비주기성 DNA 합성을 증가시켰다. 2, 3, 4, 8배의 Rg2가 증진된 홍삼 추출물에서도 배양 배지에 비해 약 45~60% 정도 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 8. 홍삼과 천연 소재 후보물질에 대한 DNA 사 절단 분석

8-1. 실험준비

세포에 DNA 상해원을 처리하고 물질 조합을 처리한 후 DNA를 알칼리 조건에 노출하여 단사화 한 후 전기영동 또는 Comet assay로 분석하여 추출물 처리의 효과를 비처리시와 비교하여 정량화하였다.

DNA 절단 분석은 DNA 고사 및 비주기성 DNA 합성에 유의적인 차이를 나타내지 않은 포도축 추출물은 실험군에서 제외하였다.

8-2. 실험결과

도 1 내지 도 8은 Comet assay방법으로 홍삼과 천연 소재 추출물이 DNA 상해원을 처리했을 때 절단 분석되는 DNA에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

구체적으로 보면, 도 1은 포도 주정 추출물이 DNA 절단에 미치는 영향(white bars, 자외선을 조사하지 않고 추출물만 처리한 실험군; black bars, 자외선을 조사한 후 추출물을 처리한 실험군)을 나타내며, 도 2는 쑥 주정 추출물, 도 3은 복분자 주정 추출물, 도 4 내지 도 8은 홍삼 추출물(1, 2, 3, 4, 8 mg/g)의 영향을 각각 나타낸 도면이다.

포도 주정 추출물을 처리했을 때 농도 의존적으로 감소하여 고농도에서는 약 11% 정도의 DNA 절단사를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 쑥 또는 복분자 주정 추출물은 각각 약 5, 7% 정도의 DNA 절단 감소율을 나타냈다.

홍삼 추출물 (Rg2 1mg/g)을 처리했을 때 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 약 7% 정도 DNA 절단사를 감소시키는 것을 확인할 수 있었으며 2, 3, 4, 8배의 Rg2가 증진된 홍삼 추출물에서도 배양 배지에 비해 약 10~13% 정도의 DNA 절단 감소율을 나타냈다.

실험예 9. 홍삼과 천연 소재 후보물질에 대한 DNA 상해 수준 분석

9-1. 실험준비

세포에 UVB을 조사하고 물질조합을 처리한 후 genomic DNA를 추출하고 slot blot을 이용하여 filter membrane에 부착시켰다. UV에 의해 손상된 DNA가 갖는 구조. 티민(Thymine) 이 연속된 서열에 UV가 가해지면 Cyclobutane pyrimidine dimer (CPD)를 형성하게 되는데 anti-CPD를 반응 시킨 후 이미지를 분석하여 수치화하여 형성된 CDP의 양을 정량화하였다.

9-2. 실험결과

도 9 및 도 10은 자외선에 의해 손상된 DNA에 형성되는 Cyclobutane pyrimidine dimer 구조에 홍삼 및 천연 소재 추출물이 미치는 영향을 측정한 결과이다.

구체적으로 보면, 도 9는 천연 소재 추출물이 DNA 상해 회복에 미치는 영향 (open circle, 자외선을 조사하지 않고 추출물만 처리한 대조군; closed circles, 자외선을 조사한 후 추출물을 처리한 실험군)을, 도 10은 Rg2를 증진시킨 홍삼 추출물이 DNA 상해 회복에 미치는 영향을 나타낸다.

포도 주정 추출물은 자외선을 조사한 후 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 약 10% 정도 CPD의 양을 감소시켰다. CPD의 양이 감소하는 것으로 보아, 포도 추출물은 자외선으로부터의 DNA 상해 회복에 영향을 미칠 것으로 판단된다. 쑥 또는 복분자 추출물의 경우에는 농도 의존적으로 CPD의 양을 상대적인 고농도인 200 ug/ml에서 최대 10~13%까지 감소시켰다 (도 9).

Rg2를 증진시킨 홍삼 추출물의 DNA 상해 반응 회복 효과에 대해서 실험한 결과 Rg2의 모든 농도에서 CPD의 양이 감소하는 것으로 확인할 수 있었다. 특히 Rg2를 8배 증진시킨 홍삼 추출물의 경우, 약 15~17% 정도 CPD의 양을 감소시켜, 높은 DNA 상해 반응 회복 효과를 나타냈다 (도 10)

실험예 10. 홍삼과 항산화능 식품소재 후보물질에 대한 Internucleosomal DNA ladder 분석

표준적인 저분자 DNA 함량 측정 기법을 이용하였으며, 실험결과는 하기의 [표 15] 및 [표 16]에 나타내었다.

포도 주정 추출물을 처리했을 때 자외선을 조사한 후 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 약 21% 정도 저분자량의 DNA 함량을 감소시켰다. 쑥 또는 복분자 주정 추출물의 경우에는 농도 의존적으로 저분자량의 DNA 함량을 상대적인 고농도인 200 g/ml에서 최대 14~19%까지 감소시켰다.

Rg2를 증진시킨 홍삼 추출물의 저분자량의 DNA 함량에 미치는 영향을 확인한 결과, Rg2의 모든 농도에서 저분자량의 DNA 함량이 감소시켰다. 특히 8mg/g의 Rg2를 증진시킨 홍삼 추출물의 경우, 약 35% 정도 저분자의 DNA 합량을 감소시키는 것으로 확인하였다.

실험예 11. 홍삼과 천연 소재 후보물질에 대한 DNA 상해 후 유전체 안정화 분자 지표의 변화 분석

DNA 상해 후 유도되는 유전체 안정화 관련 단백질인 p53 단백질들의 변화는 Western blotting으로, 전사체 수준 변화는 RT-PCR로 분석하는데 이들의 구체적인 방법은 Sambrook등의 "Molecular Cloning"에 준용하여 실험하였다.

도 11 및 도 12는 Western blotting 방법을 이용하여 홍삼 및 천연 소재 추출물이 p53 단백질 발현에 미치는 영향을 각각 분석한 결과이다.

포도 주정, 쑥 주정, 복분자 주정 추출물이 자외선에 의해 증가되었던 p53의 발현량을 감소시켰으며. 이 중 복분자 주정 추출물이 가장 감소효과가 현저하였다 (도 11).

Rg2를 증진시킨 홍삼 추출물의 경우, 자외선에 의해 증가되었던 p53의 발현량을 감소시켰다. 특히 증진된 Rg2의 농도가 높아질수록 더 많은 양의 p53 발현량을 감소시키는 것으로 확인할 수 있었다 (도 12).

이하, 실험예 12 내지 실험예 18에서는 홍삼 추출물과 포도, 쑥, 복분자 추출물의 조합물을 이용하여 실험하였으며 동일 항목의 실험방법에 대해서는 상기 실험예 1 내지 실험예 11에 서술된 내용에 준함을 밝혀둔다.

실험예 12. 조합물 3종의 세포 독성 저해능 분석 실험

Rg2가 증진된 홍삼 추출물을 단독으로 처리했을 때 상대적인 고농도에서 약 15~20% 정도의 세포 활성 및 독성 저해능력을 확인하였으나(실험예 3, 4 참조), 조합물의 경우 단독으로 처리했을 때에 비해 약 10~15%정도 더욱 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 13. 조합물 3종에 대한 세포 고사율 측정

Rg2가 증진된 홍삼 추출물을 단독으로 처리한 경우 상대적인 고농도에서 약 15~20% 정도의 세포 고사 저해율을 확인하였으나(실험예 5, 6 참조), 조합물은 약 20~35%정도 더욱 높게 나타나는 것을 확인하였으며, 이 중 포도 또는 복분자 주정 추출물과 조합했을 때, 세포 고사 저해율이 가장 높게 나타났다.

실험예 14. 조합물 3종에 대한 비주기성 DNA 합성

포도 조합물의 경우 농도 의존적으로 고농도에서는 포도 추출물만 처리한 경우보다 약 38% 정도의 비주기성 DNA 합성량이 증가하였다. 쑥 또는 복분자 조합물의 경우도 약 24~29% 정도의 비주기성 DNA 합성량이 증가하였다.

실험예 15. 조합물 3종에 대한 DNA 절단 분석

Rg2가 증진된 홍삼 추출물을 단독으로 처리한 경우 상대적인 고농도에서 약 7~10% 정도의 단사 절단 저해율을 확인하였으나(실험예 8 참조), 조합물은 약 10%정도 더욱 높게 나타나는 것을 확인하였다.

실험예 16. 조합물 3종에 대한 DNA 상해 수준 분석

Rg2가 증진된 홍삼 추출물을 단독으로 처리했을 때 상대적인 고농도에서 약 10~15% 정도의 CPD 잔여량이 감소하는 것을 확인하였다.(실험예 9 참조) 그러나 자외선을 조사한 후 조합물을 처리한 경우 약 15~25% 정도로 CPD의 잔여량이 감소하였다.

실험예 17. 조합물 3종에 대한 Interucleosomal DNA ladder 분석

Rg2가 증진된 홍삼 추출물을 단독으로 처리했을 때 상대적인 고농도에서 약 20~28% 정도의 저분자량 DNA 함량이 감소하는 것을 확인하였다.(실험예 10 참조) 그러나 자외선을 조사한 후 조합물을 처리한 경우 약 5~25% 정도로 저분자량 DNA 함량이 감소하였다.

실험예 18. 조합물 3종에 대한 DNA 상해 후 유전체 안정화 분자 지표의 변화 분석

도 13 내지 도 15는 Western blotting 방법을 이용하여 Rg2가 증진된 홍삼 추출물과 천연 소재 추출물을 혼합한 조합물이 p53 의존성 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 결과로서, 도 13은 포도 조합물, 도 14는 쑥 조합물, 도 15는 복분자 조합물을 각각 나타낸다.

Rg2가 증진된 홍삼 추출물을 단독으로 처리했을 때 자외선에 의해 증가되었던 p53 발현량을 감소시켰다. 자외선을 조사한 후 조합물을 처리한 결과 홍삼 추출물이 증진된 Rg2의 농도가 높아질수록 더 많은 양의 p53 발현량을 감소시켰다.

Rg2를 8배 증진시킨 홍삼 추출물과 포도, 쑥, 복분자 주정 추출물을 각각 조합한 조합물의 경우 자외선에 의해 증가되었던 p53 발현량과 p53 의존성 단백질의 발현량을 모두 감소시켰다.

실험예 19. 조합물 3종에 대한 동물 실험

실험동물은 온도 22도, 습도, 55%, 12시간 light-dark cycle의 통제된 사육실에서 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 반입 후 7일 동안 적응 사육시킨 후 실험에 사용하였다. 실험군은 1주일간 적응 사육시킨 후 무게별로 균등하게 7마리씩 4 group으로 나누어 조합물의 농도 중 가장 효능이 높았던 조합물을 도출하여 경구 투여시켜 hydroxy guanine (8-OHdG) 양을 비투여 그룹과 비교하였다.

자외선을 조사한 후 조합물을 처리한 결과, 홍삼 추출물의 농도 및 Rg2의 함량이 높을수록 자외선에 의해 형성된 8-OHdG의 양을 감소시켰다.

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 홍삼(Panax ginseng C.A.Meyer) 추출물, 포도(Vitis vinifera) 추출물, 쑥(Artemisia sp.) 추출물 및 복분자(Rubus coreanus Miquel) 추출물을 유효 성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부손상 예방용 건강기능식품 조성물이되,
   상기 조성물은 세포 생존율 증가, DNA 상해에 대한 회복, 세포 고사의 저해, 비주기성 DNA 합성, DNA 절단 감소, 저분자량의 DNA 함량 감소, p53 단백질의 발현량 감소 및 p53 의존성 단백질의 발현량 감소 효능을 보유하며,
   상기 홍삼 추출물에는 진세노사이드 Rg2 가 1~8 mg/g 포함되고,
   상기 조성물에 포도 추출물, 쑥 추출물 또는 복분자 추출물은 각각 10~200 ug/ml 포함되며,
   상기 조성물의 투여량은 마우스 경구투여 기준으로 1일에 0.0001 내지 200 mg/kg인 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부손상 예방용 건강기능식품 조성물.
   

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