KR102259909B1 - 느릅나무속 식물로부터 카테킨 배당체를 고함량 포함하는 추출물을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카테킨 배당체를 고함량으로 포함하는 느릅나무 초임계 추출박의 알코올 추출물 및 이의 용매 분획물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 느릅나무 초임계 추출박으로부터 제조된 추출물 및 분획물은 카테킨 배당체를 고함량으로 포함하며, 항산화 활성 및 항-알러지 활성이 우수하다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 추출물 및 분획물은 항알러지 의약 및 식품의 유효 성분으로 활용될 수 있다.

Description

느릅나무속 식물로부터 카테킨 배당체를 고함량 포함하는 추출물을 제조하는 방법{Method of Preparing Extract Containing High Content of Catechin Gylcoside From Plant of Ulmus davidiana}

본 발명은 느릅나무속 식물로부터 카테킨 배당체를 고함량 포함하는 추출물의 제조 방법에 관한 것이다.

인간의 생명유지를 위해서 산소가 반드시 필요하지만 에너지 생산 과정 중 활성산소종과 자유라디칼이 생성되어 산화적 스트레스를 주어 노화를 비롯하여 면역질환, 성인병, 난치성피부면역질환, 심혈관질환, 암 등과 같은 여러 질환을 불러일으키는 것으로 알려져 있다[1,2]. 현대인의 건강하지 못한 불규칙한 생활 및 식습관을 포함하여 일상생활 및 직장생활의 스트레스 환경에서 활성 산소종의 위협에 노출이 많아짐에 따라서 현대인들은 산화적 스트레스를 줄일 수 있는 생리활성 소재 즉, 항산화제의 필요성에 대해서 긍정적으로 평가하는 전문가들의 의견이 많은 현실이다[3]. 이러한 이유로 항산화제 도입에 있어서 우선 고려했던 점은 우수한 항산화 활성과 경제성이라고 할 수 있다. 그에 따라서 인공합성 항산화제가 많이 이용되었으나, 최근 들어서는 인체의 안전성과 가습기 살균제 합성 화합물의 인체 유해성 논란 등의 사회적 이슈로 인해서 국내는 물론이고 전 세계적으로 부작용이 없으면서 효능이 보장되는 즉, 천연물 유래 항산화제 개발 연구가 꾸준히 이뤄지고 있다[4, 5].

또한, 산화적스트레스는 알러지 질환과도 연관성이 있는데, 알러지 관련 질환의 대표적인 질환들로는 알러지성 아토피피부염, 알러지성 결막염, 알러지성 비염 및 천식 등 이 있는데 이들 알러지성 질환들과 체내 비만세포가 유발하는 것으로 잘 알려져 있다. 비만세포는 탈과립화를 통해서 히스타민, β-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase), 대사산물, 염증성 사이토카인, IgE(Immunoglobulin E) 등의 방출과 연관성이 매우 높다. 알러지성 치료는 원인제거는 현실적으로 어렵고, 증상을 완화하는 방향으로 연구가 진행되고 있고, 기존 약물들이 내성 및 부작용의 보고들로 인해서 수많은 연구자들은 천연물로 부터 부작용 및 내성이 없는 항히스타민제 등의 알러지 및 피부면역질환 치료제 또는 개선제를 개발하고자 많은 연구자들이 노력하고 있다[6-10].

천연소재로부터 항산화 활성과 항알러지 효능이 우수한 유효물질을 추출하는 다양한 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 그 중에서 열수추출, 에탄올추출, 초음파추출, 가압추출, 초임계추출 등 여러 가지 방법들이 시도 되고 있다. 여러 가지 추출방법 중 특히 초임계추출 기술은 환경친화적인 측면과 유기용매의 인체 안전성, 환경오염 등의 문제를 해결하기 위한 방법으로 알려져 있다[11-14].

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.

대한민국 공개특허 제10-2018-0050634호 대한민국 공개특허 제10-2009-0107339호 대한민국 공개특허 제10-2006-0112061호

본 발명자들은 느릅나무속 식물로부터 초임계 추출 기술을 활용하여 유용한 활성물질을 수득하는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 느릅나무를 초임계 추출하고 난 후에 얻어지는 느릅나무의 초임계 추출박을 알코올 용매로 다시 추출하여 얻는 추출물에 고함량의 카테킨이 포함되어 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 느릅나무로부터 카테킨 배당체를 고함량 포함하는 추출물의 제조 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 카테킨 배당체를 고함량 포함하는, 느릅나무 초임계 추출박의 알코올 추출물 및 이의 용매 분획물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 추출물 또는 용매 분획물을 포함하는, 항-알러지용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.

상기 과제를 해결하기 위해,

본 발명은 (a) 느릅나무를 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계; 및 (b) 상기 얻어진 느릅나무 초임계 추출박에 대해 알코올 추출물을 얻는 단계를 포함하는, 카테킨 배당체를 포함하는 추출물의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되고, 카테킨 배당체를 포함하는, 느릅나무 초임계 추출박의 알코올 추출물 및 이의 용매 분획물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 추출물 또는 용매 분획물을 포함하는, 알러지의 예방, 완화 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하에서, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 느릅나무를 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계; 및 (b) 상기 얻어진 느릅나무 초임계 추출박에 대해 알코올 추출물을 얻는 단계를 포함하는, 카테킨 배당체를 포함하는 추출물의 제조 방법을 제공한다.

단계 (a): 느릅나무를 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계

본 발명에서 먼저 느릅나무를 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는다.

본 발명에서 사용되는 느릅나무는 장미목 느릅나무과의 식물이며, 학명은 Ulmus davidiana var. japonica 이다. 느릅나무는 겨울에 잎이 지는 큰키나무이고, 20 - 30m쯤 자라며 온대 북부 지방의 산기슭에서 저절로 자란다. 잎은 어긋나고 거꾸로 된 달걀 모양이며 끝이 뾰족하고 가장자리에 겹톱니가 있다. 앞면은 풀색이고 뒷면은 연한 풀색이다. 뒷면에 거친 털이 있어 까끌까끌하다. 4월에 잎이 나기 전에 잎겨드랑이에서 자잘한 옅은 풀색 꽃이 모여 핀다. 열매는 6월에 여무는데 둥글납작하며 둘레에 날개가 달린 시과이다. 나무껍질이 짙은 회갈색이고 세로로 불규칙하게 갈라진다.

본 발명에서 초임계 추출에 사용되는 느릅나무는 느릅나무의 전체; 또는 줄기, 뿌리, 잎, 꽃, 열매, 및 씨앗으로 구성된 군에서 선택된 느릅나무의 일부를 사용할 수 있다. 바람직하게는 느릅나무의 줄기 또는 뿌리를 사용할 수 있다.

본 발명에서 초임계 추출 전에 상기 느릅무나무 전체 또는 일부를 건조 및/또는 분쇄할 수 있다.

본 발명에서 초임계 추출(supercritical extraction) 방법은 초임계 상태의 유체를 사용하여 천연물에 함유된 향, 색소, 유지류 또는 기능성 물질을 변성 없이 추출하는 방법을 의미한다.

상기 초임계 상태의 유체는 임계점(supercritical point)의 일정한 고온 고압의 한계점을 넘어 기체와 액체의 구별이 되지 않는 상태의 유체를 의미한다. 상기 초임계 유체는 초임계 이산화탄소(supercritical carbon dioxide)를 예로 들 수 있다. 상기 초임계 이산화탄소는 임계온도(31℃) 및 임계압력(7.5 MPa)을 초과한 상태의 이산화탄소로서 기체와 액체의 성질을 동시에 가진 유체이다.

본 발명에서의 초임계 추출법은 예를 들어 초임계 유체와 용질의 혼합물을 추출온도와 같은 온도에서 감압하여 팽창시켜 초임계 유체의 용해력이 감소되면서 용질이 분리되는 압력변화법 방식; 또는 초임계 유체의 온도를 높여서 용해력을 감소시킴으로서 초임계 유체와 용질을 분리하는 온도 변화법 방식으로 행해질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 상기 초임계유체와 함께 보조용매를 사용할 수 있으며, 보조용매는 당업계에서 통상적으로 이용되는 극성 용매를 포함하며, 바람직하게는 알코올, 물, 에틸렌 글라이콜, 폴리에틸렌글라이콜, 프로필렌카보네이트, 포름산, 아세트산, 아세토니트릴, 클로로디프루오로메탄 또는 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 초임계 추출용 용기는 온도와 압력이 조절될 수 있으며, 추출원료와 초임계 유체가 접촉하도록 구성된 용기이면 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에서 초임계 추출에서의 압력은 100-600 bar 범위일 수 있고, 초임계 추출에서의 온도는 10-100℃ 범위일 수 있으며, 초임계 추출에서의 초임계 유체 및 보조용매의 유속은 10-100 g/분일 수 있다.

본 발명에서 느릅나무의 초임계 추출박(supercritical extract residue)은 느릅나무를 상기 초임계 추출방법에 의해 추출하고 남은 잔여물(residue)을 의미한다.

단계 (b): 상기 얻어진 느릅나무 초임계 추출박에 대해 알코올 추출물을 얻는 단계

상기 단계 (a)에서 얻어진 느릅나무의 초임계 추출박에 대해 알코올 용매를 사용한 추출을 통해 알코올 추출물을 얻는다.

본 발명에서 상기 느릅나무의 초임계 추출박에 대한 알코올 추출은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계의 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 알코올 용매를 사용하여 추출할 수 있다.

바람직하게는 상기 알코올 추출은 느릅나무의 초임계 추출박을 추출용매인 알코올과 접촉시키는 공정을 통해 수행된다. 알코올 추출 단계 전에 상기 느릅나무의 초임계 추출박을 건조 및/또는 분쇄할 수 있다.

본 발명에서 알코올은 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올을 들 수 있다.

본 발명에서 알코올 추출 공정은 추출 용매인 알코올을 부분적으로 또는 완전히 제거하는 단계를 통해 완성되며, 부분적 제거는 상당한 양의 유기용매가 없는 수성 농축물이 얻어질 때까지 농축하는 것을 의미하며, 완전한 제거에 의해서는 건조 잔류물을 얻을 수 있다.

본 발명에서 용어 "추출물" 은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 상기 조추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함하는 의미이다.

본 발명에서 느릅나무 초임계 추출박의 알코올 추출물에 대한 용매 분획(fraction)을 얻는 단계 (c)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 용매 분획은 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜, n-헥산, 디에틸에테르, 부틸아세테이트, 및 디클로로메탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매의 분획일 수 있다.

상기 용매에 의한 분획은 상기 용매를 사용한 추가적인 추출 공정을 통해 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 카테킨 배당체(catechin glycoside)는 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)일 수 있다.

본 발명의 기술적 특징 및 이점은 느릅나무의 초임계 추출박을 알코올 추출하여 얻는 추출물 또는 이의 분획물에 카테킨 배당체가 매우 높은 함량으로 포함되어 있다는 점이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 의해 제조되고, 카테킨 배당체를 포함하는, 느릅나무 초임계 추출박의 알코올 추출물 또는 이의 용매 분획물을 제공한다.

본 발명에서 상기 알코올은 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올을 들 수 있다.

본 발명에서 상기 용매 분획은 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜, n-헥산, 디에틸에테르, 부틸아세테이트, 및 디클로로메탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매의 분획일 수 있다.

본 발명에서 상기 카테킨 배당체(catechin glycoside)는 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 느릅나무 초임계 추출박의 알코올 추출물 또는 이의 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 알러지(allergy)의 예방, 완화, 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 “알러지”는 신체의 면역체계가 특정 알러지 유발 항원에 과도하게 반응하여 과도한 항원-항체 반응이 일어나 발생되는 여러 가지 증상을 통칭하는 의미이다.

일반적인 의미에서의 “알러지”는 IgE 항체와 비만세포(mast cell)이 증상을 유발하는 것으로 알여져 있고, 특정 항원에 의해 비만세포가 자극되어 탈과립화(degranulation)이 유발되고, 이에 의해 히스타민(histamine), 류코트리엔(leukotriene), 프로스타글란딘(prostaglandin) 및 IL-4 등의 신호전달물질이 방출되어 알러지 증상을 유발한다.

본 발명의 추출물 또는 분획물은 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 증명되는 바와 같이, RBL-2H3 세포에서 β-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 분비를 효과적으로 억제하므로, 항-알러지 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 알러지의 예방, 완화 또는 치료용 조성물은 (i) 느릅나무 초임계 추출박의 알코올 추출물 또는 이의 용매 분획물의 치료학적 유효량; 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에서 용어 “알러지”는 구체적으로 알러지성 질환을 의미하며, 상기 알러지성 질환은 예컨대, 알러지성 아토피피부염, 알러지성 결막염, 알러지성 비염 및 알러지성 천식를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 “치료”는 알러지성 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.

본 명세서에서 용어 “완화”는 알러지성 질환 또는 질병의 경감을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “예방”은 알러지성 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 인간을 포함한 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 - 1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 알러지의 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물로 제공될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “개선”은 질병으로 인한 증상 또는 질병의 합병증으로 인한 증상의 경감을 의미한다.

본 발명의 조성물이 기능성 식품 조성물인 경우, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 감미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서 천연 감미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시리진 등)] 및 합성 감미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 카테킨 배당체를 고함량으로 포함하는, 느릅나무 초임계 추출박의 알코올 추출물 및 이의 용매 분획물의 제조 방법에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명의 방법에 의해 느릅나무 초임계 추출박으로부터 제조된 추출물 및 분획물은 카테킨 배당체를 고함량으로 포함하며, 항산화 활성 및 항알러지 활성이 매우 우수하다.

(ⅲ) 본 발명의 방법에 의해 제조된 추출물 및 분획물은 항알러지 의약 및 식품의 유효 성분으로 활용될 수 있다.

도 1은 느릅나무 가지의 초임계 추출박의 에탄올 추출물(USCFR, Ulmus davidiana supercritical fluid residue EtOH extracts) 및 이의 에틸아세테이트 용매 분획물(USCFREA, ethyl acetate solvent fraction of supercritical extraction foil)의 추출 과정을 보여준다.
도 2는 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)의 화학 구조식이다.
도 3a는 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드 HPLC 정량분석 결과 크로마토그램이다.
도 3b는 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드 HPLC 분석 결과 크로마토그램이다.
도 3c는 느릅나무 가지 초임계 추출물(USCF)의 HPLC 분석 결과 크로마토그램이다.
도 3d는 느릅나무 뿌리 초임계 추출물(URSCF)의 HPLC 분석 결과 크로마토그램이다.
도 3e는 느릅나무 가지 60％ 에탄올 추출물(U60E)의 HPLC 분석 결과 크로마토그램이다.
도 3f는 느릅나무 뿌리 60％ 에탄올 추출물(UR60E)의 HPLC 분석 결과 크로마토그램이다.
도 3g는 느릅나무 가지 열수추출물(UHWE)의 HPLC 분석 결과 크로마토그램이다.
도 3h는 느릅나무 뿌리 열수추출물(URHWE)의 HPLC 분석 결과 크로마토그램이다.
도 3i는 느릅나무 가지 초임계추출박 에탄올 추출물(USCFR)의 HPLC 분석 결과 크로마토그램이다.
도 3j는 느릅나무 가지 초임계추출박 에탄올 추출물 에틸아세테이트 분획(USCFREA)의 HPLC 분석 결과 크로마토그램이다.
도 3k는 느릅나무 가지 초임계추출박 열수 추출물(USCFRHWE)의 HPLC 분석 결과 크로마토그램이다.
도 3l은 느릅나무 가지 초임계추출박 열수추출물 에틸아세테이트 분획물(USCFRHWEEA)의 HPLC 분석 결과 크로마토그램이다.
도 4는 느릅나무의 다양한 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 양성대조군인 비타민 C와 비교하여 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 느릅나무의 다양한 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성을 양성대조군인 비타민 C와 비교하여 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6a는 에틸갈레이트(ethyl gallate)를 사용하여 Folin-Denis 법에 의해 구해진 검량선이다.
도 6b는 갈산(gallic acid)을 각각 사용하여 Folin-Denis법에 의해 구해진 검량선이다.
도 7은 느릅나무의 다양한 추출물의 박층 크로마토그래피의 결과이다.
도 8a는 느릅나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물의 RBL-2H3 세포를 대상으로 최소농도 50 ㎍/mL부터 최고 농도 500 ㎍/mL 까지 세포독성에 관한 MTT 분석의 결과이다.
도 8b는 느릅나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물의 RBL-2H3 세포를 대상으로 최소농도 50 ㎍/mL부터 최고 농도 500 ㎍/mL 까지 세포독성에 관한 MTT 분석 결과이다.
도 9a는 느릅나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물(USCFR)의 RBL-2H3 세포에서 β-헥소사미니다아제 분석을 수행한 결과이다.
도 9b은 느릅나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물(USCFREA)의 RBL-2H3 세포에서 β-헥소사미니다아제 분석을 수행한 결과이다.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

실시예

1. 실험 재료 및 방법

(1) 실험 재료 및 추출 방법

① 느릅나무의 초임계 추출 및 초임계 추출박 추출

본 실험에서 느릅나무 가지 및 뿌리의 초임계 추출은 초임계유체 추출 연구용 장비(ISA-SEFE-0500-0700-080, Ilsin Autoclave, Daejeon, Korea)를 사용하여 행하였다.

느릅나무 가지와 뿌리를 서울약령시장에서 구입하여 이물질을 제거하고 세척한 후, 음건하여 실험재료로 사용하였다. 건조된 시료 96kg을 200 메쉬(mesh)의 분쇄망을 통과하도록 분쇄하고, 분쇄된 느릅나무 가지 및 뿌리를 추출조의 온도를 50℃로 조절하여 온도를 유지시켰다. 온도가 안정화되면 느릅나무 가지 또는 뿌리 시료를 넣고 CO₂ 가스를 등압으로 유지시킨 후, 고압펌프를 이용하여 라인(line)을 통해 실험압력 조건인 400 bar에 도달할 때까지 컨트롤 밸브(Control valve)를 조절하여 주입하였다. 설정 압력에 도달 후 추출조 하부로 에탄올(HPLC grade)을 분당 3 mL씩 60분 동안 총 180 mL를 투입하여 추출을 진행하였으며, 시료에 남아있는 잔존 에탄올을 제거하기 위해 설정된 압력과 온도로 30분 동안 고압펌프를 이용하여 CO₂를 흘려보내며 추출을 완료하였다.(“USCF”: 느릅나무 가지 초임계추출물, “URSCF”: 느릅나무 뿌리 초임계추출물).

이상과 같이 느릅나무 가지를 초임계 추출을 하고 난 후에 얻어진 느릅나무 초임계 추출박 시료 96kg을 음건하여 60％ 에탄올으로 실온에서 1회 추출하여 여과하였다. 그 추출액을 감압농축 및 동결건조를 실시해 최종 4.62 kg을 확보한 후 실험에 사용하였다(“USCFR”: 느릅나무 가지 초임계추출박 에탄올 추출물).

확보된 느릅나무 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물을 1 kg 정량하여 분별깔때기를 이용하여 에틸아세테이트 용매분획을 실시하여 에틸아세테이트 용매 분획물 183.4 g을 확보하여 실험에 사용하였다.(“USCFREA”: 느릅나무 가지 초임계추출박 에탄올 추출물 에틸아세테이트 분획물)(도 1 참조).

느릅나무 가지를 초임계 추출을 하고 난 후에 얻어진 느릅나무 초임계 추출박 시료 96kg을 음건하였다. 음건한 시료를 100℃의 물로 1회 추출 및 여과하여 그 추출액을 감압농축 및 동결건조를 통해 얻은 시료를 실험에 사용하였다(“USCFRHWE”: 느릅나무 가지 초임계추출박 열수추출물).

상기 확보된 느릅나무 가지 초임계 추출박 열수추출물을 1 kg 정량하여 분별깔때기를 이용하여 에틸아세테이트 용매분획을 실시하여 에틸아세테이트 용매 분획물 183.4 g을 확보하여 실험에 사용하였다(“USCFRHWEEA”: 느릅나무 가지 초임계추출박 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물).

② 느릅나무 에탄올 추출 또는 열수 추출

상기 설명된 바와 같이 음건하여 준비한 느릅나무 가지 또는 뿌리를 60％ 에탄올로 실온에서 1회 추출하여 여과하였다. 그 추출액을 감압농축 및 동결건조를 실시해 최종 4.62 kg을 확보한 후 실험에 사용하였다(“U60E”: 느릅나무 가지 60％ 에탄올 추출물, “UR60E”: 느릅나무 뿌리 60％ 에탄올추출물).

또한, 상기와 같이 음건하여 준비한 느릅나무 가지 또는 뿌리를 100℃의 물로 1회 추출하여 여과하였다. 그 추출액을 감압농축 및 동결건조를 실시해 최종 4.62 kg을 확보한 후 실험에 사용하였다(“UHWE”: 느릅나무 가지 열수추출물, “URHWE”: 느릅나무 뿌리 열수추출물).

(2) HPLC 분석

HPLC 분석을 위해 Waters 2695 separation module을 사용하였고, 검출기로는 Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector를 사용하였다. 컬럼은 SkyPak C18 column(250 X 4.6mm)을 사용하였고, 컬럼 온도는 25℃로 세팅하였다. 이동상으로는 D.W.(A), 아세토니트릴(B)이고, 다음과 같은 Gradient program을 사용하여 분석을 진행하였다.

Time(분)	% A	% B
0	95	5
5	90	10
7	85	15
30	75	25
31	95	5
35	95	5

(3) DPPH 라디칼 소거작용의 측정

DPPH 라디칼 소거능 분석을 위해 96 웰에 샘플 20㎕, 1 mM DPPH 시약 180㎕를 넣고 30분간 암실반응을 하였다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, 다음과 같은 계산식을 이용하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 산출하고 이에 대한 IC₅₀ 값을 구하였다.

(4) ABTS 라디칼 소거작용의 측정

ABTS 라디칼 소거능 분석을 위해 2.45 mM 포타슘 퍼설페이트(Potassium persulfate)에 7.0 mM ABTS를 1:1 비율로 혼합하여 16 시간 동안 암실 반응하여 라디칼을 생성시키고, 이를 PBS 완충액에 희석하여 흡광도 값이 0.7 - 1.0 사이의 값을 나타내도록 희석하여 사용하였다. 96-웰에 샘플 20 ㎕, ABTS 시약 180 ㎕를 넣고 30분간 암실반응을 하였다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 750 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, 다음과 같은 계산식을 이용하여 DPPH 라디칼 소거활성을 산출하고 이에 대한 IC₅₀ 값을 구하였다.

(5) 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography)

Silica60 254 nm 코팅된 TLC 플레이트를 가로 4 cm, 세로 5 cm 크기와 가로 8 cm, 세로 5 cm 크기로 재단하였고, 밑부분에서 약 1 cm 가량 떨어진 곳에 연필을 이용하여 출발선을 긋고 각 샘플의 표식을 남겨두었다. 샘플 제조 농도를 10 mg/ml 로 제조하여 모세관을 이용 최소 5번 이상 점적하여 건조시켰다. TLC 전개조에 들어가는 전개용매는 클로로포름:메탄올:물(70:30:4)이고, TLC 전개조에 먼저 넣고 기액 평형이 이루도록 방치하였다. 점적후 건조된 TLC 플레이트를 전개용매가 들어간 TLC 전개조에 투입 후 전개용매가 TLC 플레이트에 완벽하게 흡수될 때 까지 기다렸다. 전개가 완료된 TLC 플레이트를 꺼내서 건조 후 UV lamp(254 nm, 365 nm)를 이용하여 관찰하고, 10％ 황산과 FeCl₃ 발색시약을 이용하여 발색한 후 결과를 관찰하였다.

(6) RBL-2H3세포 배양

RBL-2H3 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)로부터 구매하였으며, 15％ 우태아혈청(Fetal bovine serum, FBS; Gibco, USA)과 100 unit/㎖의 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, USA)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium; Gibco, USA)에 2 mM L-글루타민(Gibco,USA)를 첨가한 배지에서 배양하였다. 성장배지는 2-3일 마다 교환해 주었으며, 37℃, 5％ CO₂ 조건을 유지하였다.

(7) MTT 분석(assay)

본 실험에서 RBL-2H3 세포에 대한 느릅나무 가지 초임계 추출박 에탄올 추출물과 이의 에틸아세테이트 용매 분획물의 세포 독성 및 실험 시 처리 농도를 결정하기 위해 MTT 분석을 실행하였다[18].

(8) β-헥소사미니다아제 분석

세포 접종(cell seeding)은 RBL-2H3 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 24-웰 플레이트에 2 X 10⁵ 세포/mL의 세포수가 되도록 분주하였다. 세포 감작(cell sensitization)은 세포 분주 후 500 ng/mL 농도의 항-DNP(dinitrophenol) IgE로 감작하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 12시간 배양하였다. 세포 활성화는 각 웰(well)의 세포들을 Siraganian buffer (119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 25 mM PIPES, 40 mM NaOH, pH7.2)로 2번 세척한 다음 각 well당 5.6 mM glucose, 1 mM CaCl₂, 0.1％ BSA가 포함된 Siraganian buffer에 추출물을 농도별로 첨가한 후 30분 동안 37℃, 5％, CO₂ 인큐베이터에서 배양하고, (dinitrophenol-conjugated human serum albumin (DNP-HSA)-specific IgE)의 농도가 100 ng/mL이 되도록 처리하여 10분 동안 반응시킨 후, 얼음조(ICE bath)에 10분 동안 방치하여 반응을 종결시켰다. 얻어진 상등액은 3분간 3000rpm에서 원심분리 시킨 후, 상등액 30μL를 96-웰 플레이트에 옮기고 동량의 기질 완충액(substrate buffer)(1 mM 4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide, 0.1 M citrate buffer pH 4.5)를 넣어 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 0.1M 카보네이트 완충액(carbonate buffer) 200μL를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)(TECAN, Salzburg, Austria)를 사용하여 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다[19].

(9) 총 페놀 함량

총 페놀 함량은 표준물질로 갈산(gallic acid)와 에틸갈레이트(ethyl gallate)를 사용하여 Folin-Denis법[20]에 따라서 수행하여 총 페놀 함량을 산출하였다.

(10) 통계 처리

본 실험 결과들은 3회 반복 측정하여 평균값± 표준편차로 나타내었으며, 각 실험 농도별 표준 차이를 검증하기 위해 분산분석을 수행하였으며, 유의성이 발견된 경우 Tukey’s HSD test[21]에 의해 농도 간의 유의성을 분석하였다. 모든 자료의 통계처리는 SPSS(Statistical Package for Science, version 24.0 SPSS Inc, Chicago, IL, USA)를 사용하여 처리하였고, 유의수준 α=0.05로 하였다.

2. 실험 결과

(1) HPLC 분석 결과 크로마토그램

각 추출물에서 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드를 HPLC 정량분석한 결과는 도 3a 내지 도 3e에 나타내었고, 각 추출물의 함량을 아래의 표 2에 정리하였다.

시료명	RT(min.)	함량(μg/ml)
카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드	14.449±0.14
USCF	N.D.	N.D.
URSCF	N.D.	N.D.
U60E	14.271±0.12	12.16±0.15
UR60E	14.140±0.14	27.52±0.14
UHWE	14.340±0.14	9.09±0.12
URHWE	14.307±0.13	14.87±0.13
USCFR	14.482±0.16	131.45±0.18
USCFREA	13.687±0.15	350.98±0.16
USCFRHWE	14.332±0.11	10.72±0.12
USCFRHWEEA	14.498±0.14	63.77±0.13

상기 표에서 각각의 약어가 지칭하는 추출물은 다음과 같다:

USCF : 느릅나무 가지 초임계추출물

URSCF : 느릅나무 뿌리 초임계추출물

U60E : 느릅나무 가지 60％ 에탄올 추출물

UR60E : 느릅나무 뿌리 60％ 에탄올 추출물

UHWE : 느릅나무 가지 열수추출물

URHWE : 느릅나무 뿌리 열수추출물

USCFR : 느릅나무 가지 초임계추출박 에탄올 추출물

USCFREA : 느릅나무 가지 초임계추출박 에탄올추출물의 에틸아세테이트분획물

USCFRHWE : 느릅나무 가지 초임계추출박 열수추출물

USCFRHWEEA : 느릅나무 가지 초임계추출박 열수추출물의 에틸아세테이트분획물

(2) DPPH 라디칼 소거능 활성

느릅나무의 다양한 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 양성대조군인 비타민 C와 비교하여 측정한 결과는 도 4에 나타내었다. 느릅나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물에 대해 측정한 결과 모든 실험 농도에서 농도 의존적으로 통계적으로 유의적인 DPPH 라디칼 소거능이 관찰되었다. IC₅₀ 값(㎍/㎖)을 비교해 보면 양성대조군인 비타민 C는 15.87±0.25 ㎍/㎖, 느릅나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물은 30.24±0.19 ㎍/㎖, 느릅나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물은 17.19±0.12 ㎍/㎖으로 확인되었다. 이는 기존 천연물 유래 초임계 추출물에서는 확인되기 어려운 강력한 항산화 활성이다.

(3) ABTS 라디칼 소거능 활성

느릅나무의 다양한 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성을 양성대조군인 비타민 C와 비교하여 측정한 결과는 도 5에 나타내었다. 느릅나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물에 대해 측정한 결과 모든 실험 농도에서 농도 의존적으로 유의적인 ABTS 라디컬 소거능이 관찰되었다. IC₅₀ 값(㎍/㎖)을 비교해 보면 양성대조군인 비타민 C는 8.35±0.15 ㎍/㎖, 느릅나무 가지 초임계 추출박 60% 에탄올 추출물은 3.94±0.11 ㎍/㎖, 느릅나무 초임계 추출박 60% 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물은 3.22±0.04 ㎍/㎖으로 확인되어 양성대조군인 비타민 C에 비해서 매우 강력한 항산화 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는, 느릅나무 가지 초임계 추출박 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물이 산화적 스트레스로 인해 유발하는 면역질환, 노화질환, 만성 염증성 알러지성 질환군을 포함한 난치성 피부면역질환의 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있는 천연 항산화제로 개발 가능성을 시사한다.

(4) 총 페놀 함량

느릅나무의 다양한 추출물의 총 페놀 함량을 측정하기 위해서 페놀 화합물의 표준물질로 가장 보편적으로 잘 활용되고 있는 에틸갈레이트(ethyl gallate)와 갈산(gallic acid)을 각각 사용하여, Folin-Denis 법[20]에 의해 구해진 검량선으로부터 총 페놀 함량을 측정하였다(도 6a 및 도 6b)(표 3).

Samples	USCF	URSCF	U60E	UR60E	UHWE	URHWE	USCFR	USCFREA	USCFRHWE	USCFRHWEEA
EG(μg/mlk)	51.14 ±0.11	58.34 ±0.95	53.72 ±0.50	59.26 ±0.30	35.92 ±0.39	59.31 ±0.34	134.17 ±0.13	154.77 ±1.05	91.61 ±0.30	125.89 ±0.71
GA(μg/mlk)	46.69 ±0.41	54.10 ±0.84	49.35 ±0.49	55.04 ±0.53	31.06 ±0.30	55.09 ±0.68	132.02 ±0.24	153.18 ±1.10	88.28 ±0.35	123.51 ±0.67

상기 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 느릅나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물(USCFR)은 느릅나무 가지 60% 에탄올 추출물(U60E) 대비 249％(134.17/53.72), 267％(132.02/49.35)의 더 높은 페놀함량을 나타내었고, 느릅나무 가지 초임계 추출박 60% 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물(USCFREA)은 느릅나무 가지 60% 에탄올 추출물(U60E) 대비 288％(154.77/53.72), 310％(153.18/49.35)의 높은 페놀함량을 나타내었다.

천연물 유래 다양한 기능성 소재 발굴에 있어서 중요한 역할을 하는 것은 폴리-페놀(poly-phenol) 화합물로부터 기인하는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, 총 페놀 함량 분석은 신규 천연 소재가 향후 기능성 소재로 활용될 가치에 대한 중요한 평가 요소이다. 이 것은 폴리 페놀 화합물이 프리라디컬 소거능을 기반으로 한 항산화 활성 및 항염증, 항균, 면역치료 등 다양한 생리활성을 나타내기 때문이다.

(5) 박층 크로마토그래피

느릅나무의 각각의 추출물의 박층 크로마토그래피의 결과는 도 7에 나타내었다.

(6) MTT 분석-세포독성 평가

느릅나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물의 항알러지 효능 검정을 위해서 RBL-2H3 세포를 대상으로 최소농도 50 ㎍/mL 부터 최고 농도 500 ㎍/mL 까지 세포독성을 MTT 분석을 통하여 확인하였다(도 8a 및 도 8b). 실험 결과에 따라, β-헥소사미니다아제 분석을 수행한 실험 농도에서는 RBL-2H3 세포에 어떠한 독성도 없었음을 확인할 수 있었다.

(7) β-헥소사미니다아제(hexosaminidase) 탈과립 억제로 인한 항알러지 효능 평가

느릅나무 가지 초임계 추출박 60% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물의 항알러지 효능을 평가하기 위해서 RBL-2H3 세포로부터 β-헥소사미니다아제 분석을 수행하였다(도 9a 및 도 9b). 느릅나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물은 세포 독성이 없는 농도 250, 500 ㎍/mL의 두 농도에서 정상 대조군(normal control)과 음성 대조군(negative control)과 비교하였을 때, 통계적으로 유의성 있게 β-헥소사미니다아제 분비를 억제하는 것이 확인되었다. 특히, 실험최고 농도인 500 ㎍/mL에서는 정상 대조군(normal control)과 동등한 β-헥소사미니다아제 분비능이 확인이 되어 강력한 β-헥소사미니다아제 분비 억제가 되었음을 알 수 있었다.

또한, 느릅나무 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물의 실험 결과를 살펴보면, 세포 독성이 없는 농도 10 ㎍/㎖ 및 20 ㎍/㎖ 두 농도에서 정상 대조군과 음성 대조군과 비교하였을 때, 통계적으로 유의성 있게 β-헥소사미니다아제 분비를 억제하는 것이 확인이 되었다. 실험 최고 농도인 20 ㎍/mL 에서는 정상 대조군과 동등한 β-헥소사미니다아제 분비능이 확인이 되어 강력한 β-헥소사미니다아제 분비 억제가 되었음을 알 수 있었다. 특히, 에틸아세테이트 용매분획물의 실험결과에서 초임계 추출박 에탄올 추출물에 비해서 훨씬 적은 농도인 25배 이상의 적은 농도에서도 통계적으로 유의성 있는 β-헥소사미니다아제 분비 억제능이 확인이 되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (10)

1. (a) 느릅나무를 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계; 및
   (b) 상기 얻어진 느릅나무 초임계 추출박에 대해 알코올 추출물을 얻는 단계를 포함하는, 카테킨 배당체를 포함하는 추출물의 제조 방법으로서,
   상기 카테킨 배당체는 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)인 것인, 카테킨 배당체를 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 알코올은 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올인 것인, 카테킨 배당체를 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 알코올은 에탄올인 것인, 카테킨 배당체를 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 느릅나무 초임계 추출박에 대한 알코올 추출물에 대해 용매 분획을 얻는 단계 (c)를 더 포함하는, 카테킨 배당체를 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 용매 분획은 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜, n-헥산, 디에틸에테르, 부틸아세테이트, 및 디클로로메탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매의 분획인, 카테킨 배당체를 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 용매 분획은 에틸아세테이트 용매 분획인, 카테킨 배당체를 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
7. 삭제
8. 제 1 항에 있어서, 상기 느릅나무는 느릅나무의 가지 또는 줄기인 것인, 카테킨 배당체를 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
9. 삭제
10. 삭제

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