KR102217551B1 - 오리나무 속 식물로부터 오레고닌을 고함량 포함하는 추출물을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오레고닌을 고함량으로 포함하는, 오리나무 속 식물의 초임계 추출박의 알코올 추출물 및 이의 용매 분획물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 오리나무 속 식물의 초임계 추출박으로부터 제조된 추출물 및 분획물은 오레고닌을 고함량으로 포함하며, 항산화 활성 및 항알러지 활성이 매우 우수하다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 추출물 및 분획물은 항알러지 의약 및 식품의 유효 성분으로 활용될 수 있다.

Description

오리나무 속 식물로부터 오레고닌을 고함량 포함하는 추출물을 제조하는 방법{Method of Preparing Extract Containing High Content of Oregonin From Plant of Alnus spp.}

본 발명은 오리나무 속 식물로부터 오레고닌을 고함량 포함하는 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

자작나무과(Betulaceae)에 속하는 오리나무 속(Alnus spp.) 식물은 한국, 미국, 일본, 중국 등 북반구에 분포하며 국내에는 Alnus japonica Steudel를 포함하여 17종이 자생하는 것으로 알려져 있다(1, 2). 오리나무 속 식물의 가장 특징적인 화합물은 디아릴헵타노이드(diarylheptanoid) 계열의 화합물이며, 이 화합물이 오리나무 속 식물에 존재하고 있다는 사실이 많은 연구자들에 의해서 밝혀지고 있다. 오리나무 속(A. rubura, A. hirsuta, A. japonica)의 나무를 절단하였을 때 적갈색으로 변색하는 물질을 추적하여 디아릴헵타노이드(diarylheptanoid)의 배당체인 오레고닌(oregonin)을 분리하여 구조를 결정한 다수의 보고를 비롯하여, 세계 많은 연구자들에 의해서 오리나무 속 식물의 화학적 계통 분류 연구로서 오레고닌(oregonin)을 지표 물질로 한 연구도 다수 보고되었다(3-16).

한편, 오리나무 속 식물에서 분리된 디아릴헵타노이드류에는 항산화 작용, 설사 및 항암 효과, 마우스 멜라노마 세포주(mouse melanoma cell line) B16-F10 에 대한 증식 억제 효과, NO 생성 억제 효과, 사이클로옥시게나아제-2 (cyclooxygenase-2) 억제 효과, 5-리폭시게나아제(5-lipoxygenase) 억제제로써 작용하여 피부 염증(dermal inflammation) 억제 효과, 혈소판 응집억제 작용, PKC 알파 억제제, 항-종양 촉진 활성, 프로스타글란딘(prostaglandin) 생합성에 각종 효소작용 저해, 항균, 간보호 등의 효과가 보고된 바 있으며, 최근에는 항아토피 효능에 대한 인 비트로(in vitro) 생리활성 연구와 NC/Nga 마우스를 활용한 생리활성 연구가 보고되었고, 인체 모유두 세포로부터 산화적 스트레스를 유발하여 세포사멸(apoptosis)을 유도한 후 오레고닌(oregonin)의 세포사멸 조절 능력을 검증한 항탈모 효능 등이 밝혀진 바 있다. 따라서 오리나무 속 식물의 유효물질이나 지표물질의 대표 화합물을 디아릴헵타노이드(diarylheptanoid) 계열 중에서도 특히 오레고닌을 주목하고 있다(17 - 27). 이처럼 다양한 생리활성 효능이 밝혀져 있고, 유용한 활성물질로 평가되고 있는 디아릴헵타노이드의 배당체인 오레고닌(oregonin)을 고함량으로 추출하는 방법은 유용자원의 활용을 극대화하는 측면에서 매우 의미가 있다.

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.

한국공개특허 제10-2009-0061128호 한국등록특허 제10-1756020호 한국공개특허 제10-2018-0085636호

본 발명자들은 오리나무 속 식물로부터 초임계 추출 기술을 활용하여 유용한 활성물질을 수득하는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 오리나무 속 식물을 초임계 추출하고 난 후에 얻어지는 오리나무 속 식물의 초임계 추출박을 알코올 용매로 다시 추출하여 얻는 추출물에 고함량의 오레고닌(oregonin)이 포함되어 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 오리나무 속 식물로부터 오레고닌을 고함량 포함하는 추출물의 제조 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 오레고닌을 고함량 포함하는, 오리나무 속 식물의 초임계 추출박의 알코올 추출물 및 이의 용매 분획물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 추출물 또는 용매 분획물을 포함하는, 항-알러지용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.

상기 과제를 해결하기 위해,

본 발명은 (a) 오리나무 속 식물을 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계; 및 (b) 상기 얻어진 오리나무 속 식물의 초임계 추출박에 대해 알코올 추출물을 얻는 단계를 포함하는, 오레고닌을 포함하는 추출물의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되고, 오레고닌을 포함하는, 오리나무 속 식물의 초임계 추출박의 알코올 추출물 및 이의 용매 분획물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 추출물 또는 용매 분획물을 포함하는, 알러지의 예방, 완화 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 오리나무 속 식물을 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계; 및 (b) 상기 얻어진 오리나무 속 식물의 초임계 추출박에 대해 알코올 추출물을 얻는 단계를 포함하는, 오레고닌(oregonin)을 포함하는 추출물의 제조 방법을 제공한다.

단계 (a): 오리나무 속 식물을 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계

본 발명에서 먼저 오리나무 속 식물을 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는다.

본 발명에서 사용되는 “오리나무 속 식물”은 자작나무과에 속하는 오리나무(Alus)속 식물을 포함한다.

본 발명에서 오리나무(Alnus) 속 식물은 떡오리나무(A. borealis Koidz.); 사방오리(A. firma), 왕사방오리(A. firma var. hirtella Franch. & Sav.); 오리나무(A. japonica), 뾰족잎오리나무(A. japonica var. arguta Call), 털오리나무(A. japonica var. koreana Callier), 섬오리나무(A. japonica var. serrata Nakai), 웅기오리나무(A. japonica var. reginosa Nakai), 민물오리나무(A. hirsuta for. glabra T. Lee); 덤불오리나무(A. mandshurica (Callier) Hand.-Mazz.), 함북오리나무(A. mandshurica for. barbinervis (Nakai) W.T.Lee), 털만주오리나무(A. mandshurica for. pubescens (Nakai) Kitag.); 두메오리나무(A. maximowiczii Callier); 잔털오리나무(A. mayrii Callier); 좀사방오리(A. pendula); 물오리나무(A. sibirica Fisch. ex Turcz.)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 초임계 추출에 사용되는 오리나무 속 식물은 오리나무 속 식물의 전체; 또는 줄기, 뿌리, 잎, 꽃, 열매, 및 씨앗으로 구성된 군에서 선택된 오리나무 속 식물의 일부를 사용할 수 있다. 바람직하게는 오리나무 속 식물의 줄기 또는 뿌리를 사용할 수 있다.

본 발명에서 초임계 추출 전에 상기 오리나무 속 식물의 전체 또는 일부를 건조 및/또는 분쇄할 수 있다.

본 발명에서 초임계 추출(supercritical extraction) 방법은 초임계 상태의 유체를 사용하여 천연물에 함유된 향, 색소, 유지류 또는 기능성 물질을 변성 없이 추출하는 방법을 의미한다.

초임계 상태의 유체는 임계점(supercritical point)의 일정한 고온 고압의 한계점을 넘어 기체와 액체의 구별이 되지 않는 상태의 유체를 의미한다. 상기 초임계 유체는 초임계이산화탄소(supercritical carbon dioxide)를 예로 들 수 있다. 상기 초임계이산화탄소는 임계온도(31 ℃) 및 임계압력(7.5 MPa)을 초과한 상태의 이산화탄소로서 기체와 액체의 성질을 동시에 가진 유체이다.

본 발명에서 초임계 추출법은 예를 들어 초임계 유체와 용질의 혼합물을 추출온도와 같은 온도에서 감압하여 팽창시켜 초임계 유체의 용해력이 감소되면서 용질이 분리되는 압력변화법 방식; 또는 초임계 유체의 온도를 높여서 용해력을 감소시킴으로서 초임계 유체와 용질을 분리하는 온도 변화법 방식으로 행해질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 상기 초임계유체와 함께 보조용매를 사용할 수 있으며, 보조용매는 당업계에서 통상적으로 이용되는 극성 용매를 포함하며, 바람직하게는 알코올, 물, 에틸렌글라이콜, 폴리에틸렌글라이콜, 프로필렌카보네이트, 포름산, 아세트산, 아세토니트릴, 클로로디프루오로메탄 또는 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 초임계 추출용 용기는 온도와 압력이 조절될 수 있으며, 추출원료와 초임계 유체가 접촉하도록 구성된 용기이면 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에서 초임계 추출에서의 압력은 100-600 bar 범위일 수 있고, 초임계 추출에서의 온도는 10-100℃ 범위일 수 있으며, 초임계 추출에서의 초임계 유체 및 보조용매의 유속은 10-100 g/분일 수 있다.

본 발명에서 오리나무 속 식물의 초임계 추출박(supercritical extract residue)은 오리나무 속 식물을 상기 초임계 추출방법에 의해 추출하고 남은 잔여물(residue)을 의미한다.

단계 (b): 상기 얻어진 오리나무 속 식물의 초임계 추출박에 대해 알코올 추출물을 얻는 단계

상기 단계 (a)에서 얻어진 오리나무 속 식물의 초임계 추출박에 대해 알코올 용매를 사용한 추출을 통해 알코올 추출물을 얻는다.

본 발명에서 상기 오리나무 속 식물의 초임계 추출박에 대한 알코올 추출은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계의 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 알코올 용매를 사용하여 추출할 수 있다.

바람직하게는 상기 알코올 추출은 오리나무 속 식물의 초임계 추출박을 추출용매인 알코올과 접촉시키는 공정을 통해 수행된다. 알코올 추출 단계 전에 상기 오리나무 속 식물의 초임계 추출박을 건조 및/또는 분쇄할 수 있다.

본 발명에서 알코올은 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올을 들 수 있다.

본 발명에서 알코올 추출 공정은 추출 용매인 알코올을 부분적으로 또는 완전히 제거하는 단계를 통해 완성되며, 부분적 제거는 상당한 양의 유기용매가 없는 수성 농축물이 얻어질 때까지 농축하는 것을 의미하며, 완전한 제거에 의해서는 건조 잔류물을 얻을 수 있다.

본 발명에서 용어 "추출물" 은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 상기 조추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함하는 의미이다.

본 발명에서 오리나무 속 식물의 초임계 추출박의 알코올 추출물에 대한 용매 분획(fraction)을 얻는 단계 (c)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 용매 분획은 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜, n-헥산, 디에틸에테르, 부틸아세테이트, 및 디클로로메탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매에 의한 분획일 수 있다.

상기 용매에 의한 분획은 상기 용매를 사용한 추가적인 추출 공정을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 기술적 특징 및 이점은 오리나무속 식물의 초임계 추출박을 알코올 추출하여 얻는 추출물 또는 이의 분획물에 오레고닌 화합물이 매우 높은 함량으로 포함되어 있다는 점이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 의해 제조되고, 오레고닌을 포함하는, 오리나무 속 식물의 초임계 추출박의 알코올 추출물 또는 이의 용매 분획물을 제공한다.

본 발명에서 상기 알코올은 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올을 들 수 있다.

본 발명에서 상기 용매 분획은 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜, n-헥산, 디에틸에테르, 부틸아세테이트, 및 디클로로메탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매의 분획일 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 이의 용매분획물에 대한 내용은 상술한 본 발명의 추출방법에서 설명된 내용과 동일하므로, 이를 원용하며 중복하여 설명하지 않는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 오리나무 속 식물의 초임계 추출박의 알코올 추출물 또는 이의 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 알러지(allergy)의 예방, 완화, 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 “알러지”는 신체의 면역체계가 특정 알러지 유발 항원에 과도하게 반응하여 과도한 항원-항체 반응이 일어나 발생되는 다양한 증상을 통칭하는 의미이다.

일반적인 의미에서의 “알러지”는 IgE 항체와 비만세포(mast cell)이 증상을 유발하는 것으로 알려져 있고, 특정 항원에 의해 비만세포가 자극되어 탈과립화(degranulation)가 유발되고, 이에 의해 히스타민(histamine), 류코트리엔(leukotriene), 프로스타글란딘(prostaglandin) 및 IL-4 등의 신호전달물질이 방출되어 알러지 증상을 유발한다.

본 발명의 추출물 또는 분획물은, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 증명되는 바와 같이, RBL-2H3 세포에서 β-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 분비를 효과적으로 억제하므로, 항-알러지 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 알러지의 예방, 완화 또는 치료용 조성물은 (i) 오리나무 속 식물의 초임계 추출박의 알코올 추출물 또는 이의 용매 분획물의 치료학적 유효량; 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에서 용어 “알러지”는 구체적으로 알러지성 질환을 의미하며, 상기 알러지성 질환은 예컨대, 알러지성 아토피피부염, 알러지성 결막염, 알러지성 비염 및 알러지성 천식를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어 “치료”는 알러지성 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.

본 발명에서 용어 “완화”는 알러지성 질환 또는 질병의 경감을 의미한다.

본 발명에서 용어 “예방”은 알러지성 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 인간을 포함한 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 - 1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 알러지의 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물로 제공될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “개선”은 질병으로 인한 증상 또는 질병의 합병증으로 인한 증상의 경감을 의미한다.

본 발명의 조성물이 기능성 식품 조성물인 경우, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 감미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서 천연 감미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시리진 등)] 및 합성 감미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 오레고닌을 고함량으로 포함하는, 오리나무 속 식물의 초임계 추출박의 알코올 추출물 및 이의 용매 분획물의 제조 방법에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명의 방법에 의해 오리나무 속 식물의 초임계 추출박으로부터 제조된 추출물 및 분획물은 오레고닌을 고함량으로 포함하며, 항산화 활성 및 항알러지 활성이 매우 우수하다.

(ⅲ) 본 발명의 방법에 의해 제조된 추출물 및 분획물은 항알러지 의약 및 식품의 유효 성분으로 활용될 수 있다.

도 1은 오레고닌(oregonin)의 화학 구조식이다.
도 2는 오레고닌의 HPLC 크로마토그램(100 - 1000 ppm)이다.
도 3은 오레고닌의 검량선(calibration curve) 및 회귀 직선방정식이다.
도 4는 물오리나무(Alnus sibirica) 가지 열수 추출물(hot water extract)의 HPLC 크로마토그램(chromatogram)이다.
도 5는 물오리나무 가지 60％ 에탄올 추출물의 HPLC 크로마토그램이다.
도 6a는 물오리나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물의 HPLC 크로마토그램이다.
도 6b는 물오리나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획의 HPLC 크로마토그램이다.
도 7은 오리나무(Alnus japonica) 가지의 다양한 추출물의 TLC 결과이다.
도 8은 오리나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물(AJSCFR) 및 이의 에틸아세테이트 용매 분획(AJSCFREA)의 DPPH 라디컬 소거능을 측정한 결과이다.
도 9은 오리나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물(AJSCFR) 및 이의 에틸아세테이트 용매 분획(AJSCFREA)의 ABTS 라디컬 소거능을 측정한 결과이다.
도 10은 오리나무(Alnus spp.) 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물(ASCFR)의 Raw 264.7 대식세포주에 대한 세포 생존능을 측정한 결과이다. 세포 생존능은 MTT 분석에 의해 측정하였다. 실험결과는 대조군 흡광도의 ％으로 표시하였다. 측정값은 3회 실험의 평균±SD이다(p<0.05).
도 11은 오리나무(Alnus spp.) 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물(ASCFR)의 Raw 264.7 대식세포주에서 NO 소거능을 측정한 결과이다.
도 12는 오리나무(Alnuss spp.) 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물(ASCFR)의 RBL-2H3 세포에 대한 세포 생존능을 측정한 결과이다. 세포 생존능은 MTT 분석에 의해 측정하였다. 실험결과는 대조군 흡광도의 ％로 표시하였다. 측정값은 3회 실험의 평균±SD이다(p<0.05).
도 13은 오리나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물(ASCFR)의 β-헥소사미니다아제 분비 억제능을 측정한 결과이다.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

실시예

1. 실험 재료 및 방법

(1) 실험 재료

물오리나무(A. sibirica Fisch. ex Turcz)는 2019년 4월 서울약령시장 천지가약초에서 구입을 하였고, 경기도 포천시에 위치한 국립수목원에서 진혜영 연구관(국립수목원)으로부터 식물학적 감정한 후 실험에 사용하였으며, 표준품은 광주여자대학교 천연 기능성 소재 연구실에 보관하고 있다(AS2019-05).

(2) 기기 및 시약

¹H 및 ¹³C-NMR spectra는 JEOL-JNM-AL300(300MHz, 75MHz)로 측정하였다. HPLC(High pressure liquid chromatography)는 Waters 2695 system(USA)을 이용하였으며, 세부적으로는 2487 dual rhamda absorbance detector, guard column은 Phenomenex KJ0-4282 guard column을 사용하였고, 컬럼(column)은 SkyPak C18(5um, 250 X 4.6 mm)을 사용하였으며, 컬럼 오븐 온도(column oven temperature)는 25℃ 설정하였고, 이동상(mobile phase)은 다음과 같이 구성하였다. 즉, 1％ 증류수(Distilled Water, D.W.)(A), 아세토니트릴(acetonitrile, B)로 구성하였으며, 데이터 시스템은 Empower 2 softwaer(Waters Co., USA)를 각각 이용하였다. LC/MS는 Shimadzu prominence UFLC-MS system, pump A는 LC-30AD, pump B는 LC-30AD, detector는 SPD-20A, auto sampler는 SIL-20A XR, 컬럼 오븐(column oven)은 CTO-20A, communications bus module은 CBM-20A, MS는 ESI-IT-TOF MS을 이용하였으며, LC 조건은 각각 다음과 같다. 즉, 컬럼(column)은 Waters ACQUITY UPLC® BEH C18 2.1 x 150 mm, 1.7 um, 컬럼 오븐 온도(column oven temperature)는 35℃, UV 검출기(detector) 설정은 280 nm, 인젝션 볼륨(injection volume)은 1 ㎕, 유량(flow)는 0.21 ml/min, 용매(solvent) A는 water in 0.1% formic acid, 용매 B는 아세토니트릴(acetonitrile), 용매 조건이며, MS 조건은 nebulizing gas flow는 1.5 L/min, CDL 온도는 200℃, 히트 블록 온도는 200℃를 각각 설정하여 실험에 활용하였다.

TLC(Thin layer chromatography) 플레이트는 프리-코팅된 실리카 겔 60 F254 플레이트(Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였다.

항산화활성 측정용 시약인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), ABTS(2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)), L-아스코르브산은 Sigma Aldrich(Milw., WI, USA)에서 구입하였고, 포타슘 설페이트(Samchun, Korea), 99.5％ 에탄올은 Merck(Darmstadt, Germany)에서 각각 구입하여 사용하였다. 흡광도는 ELISA 리더(TECAN, Salzburg, Austria)를 사용하여 측정하였다.

초임계추출장비는 초임계유체추출연구용장비(ISA-SEFE-0500-0700-080, Ilsin Autoclave, Daejeon, Korea)와 초임계유체추출시험생산장비(SCFE-P400, Ilsin Autoclave, Daejeon, Korea)를 사용하였다.

물오리나무 가지를 서울약령시장에서 구입하여 이물질을 제거하고 세척한 후, 음건하여 실험재료로 사용하였다. 건조된 시료 100 kg을 200 메쉬(mesh)의 분쇄망을 통과하도록 분쇄하고, 분쇄된 물오리나무 가지를 추출조의 온도를 50℃로 조절하여 온도를 유지시켰다. 온도가 안정화되면 물오리나무 가지 시료를 넣고 CO₂ 가스를 등압으로 유지시킨 후, 고압펌프를 이용하여 라인(line)을 통해 실험압력 조건인 400 bar에 도달할 때까지 조절 밸브(control valve)를 조절하여 주입하였다. 설정 압력에 도달 후 추출조 하부로 에탄올(HPLC grade)을 분당 3 mL씩 60분 동안 총 180 mL를 투입하여 추출을 진행하였으며, 시료에 남아있는 잔존 에탄올을 제거하기 위해 설정된 압력과 온도로 30분 동안 고압펌프를 이용하여 CO₂를 흘려보내며 추출을 완료하였다.

이상과 같이 수피를 포함한 물오리나무 가지를 초임계 추출을 하고 난 후의 물오리나무 초임계 추출박 시료 중 79.97 kg을 음건하여 60％ 에탄올로 실온에서 1회 추출하여 여과하였다. 그 추출액을 감압농축 및 동결건조를 실시해 최종 1.84 kg을 확보한 후 실험에 사용하였다(“AJSCFR”: 물오리나무 가지 초임계 추출박 에탄올 추출물).

확보된 오리나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물을 1kg 정량하여 분별깔때기를 이용하여 에틸아세테이트 용매분획을 실시하여 에틸아세테이트 용매 분획물을 확보하였다. 이를 실험에 사용하였다.(“AJSCFREA”: 물오리나무 가지 초임계추출박 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물).

(3) 추출 및 분리

수피를 포함한 물오리나무 가지를 각각 1 kg을 절단한 후 60％ 에탄올으로 실온에서 1회 추출하여 여과하였다. 그 추출액을 감압농축과 동결건조를 통해 최종 66.1g을 확보하였고, HPLC 로딩(loading)용으로 정량하여 실험에 사용하였다(“AJ60E”: 물오리나무 가지 에탄올 추출물).

또한, 열수 추출물은 100℃로 4시간을 가열하여 1회 추출 및 여과하여 그 추출액을 감압농축 및 동결건조를 통해 최종 36.6g을 확보하였고, HPLC 로딩(loading)용으로 정량하여 실험에 사용하였다(“AJHWE”: 물오리나무 가지 열수 추출물).

초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물과 기존에 전통적인 추출 방식인 60％ 에탄올 추출과 열수추출을 각각 실험용으로 조제하여 HPLC 분석용 실험에 사용하였다.

기존에 실험실에서 보유중인 오리나무 수피로부터 분리 및 정제한 표품인 오레고닌(oregonin)을 1 mg을 정확히 취해 80％ MeOH을 가하여 전체량이 1 ㎖가 되도록 하여 스톡 용액(stock solution)(1000 ppm)을 조제하였다. 이 스톡 용액(stock solution)을 희석하여 100, 250, 500, 1000 ppm 농도의 표준용액을 조제하였다. 표준용액을 20㎕ 씩 취하여 표준용액이 잘 분리되는 HPLC 크로마토그램을 얻었다. 또한 실험의 재현성을 위해 반복실험을 통해서 표준용액과 물오리나무 가지 추출물 미지검액의 머무름 시간(retention time, RT)의 평균과 표준오차를 구하였다.

표품의 분석조건을 아래와 같이 설정한 다음, 반복정제를 통해서 오레고닌 표준품과 동일한 RT 값을 나타내는 피크(peak)를 수집하여 단일 화합물을 확보하여 NMR과 LC/MS 데이터를 측정하였다.

(4) HPLC 분석 조건

이동상의 조건은 아래 표 1과 같이 구성을 하였으며, 유량은 1 ml/min, 파장(wavelength)은 280 nm, inject volumn은 20 ㎕, total run time은 40 min, 컬럼 오븐(column oven) 온도는 25℃로 분석조건을 적용하였으며, guard column은 Phenomenex KJ0-4282 Guard column을 사용하였고, 분석용 컬럼은 SkyPak C18(5um, 250 X 4.6 mm)를 사용하여 분석을 하였다.

	0분	12분	24분	25분	40분
용매A(H2O)	90	75	60	90	90
용매B(CH3CN)	10	25	40	10	10

(5) LC/MS 분석조건

LC 조건은 다음과 같이 설정하여 수행하였다. 컬럼은 Waters ACQUITY UPLC® BEH C18 2.1 x 150 mm, 1.7 um, 컬럼 오븐(column oven)의 온도는 35℃, UV detector는 254 nm, injection volume은 1 ㎕, 유량은 0.21 ml/min 으로 각각 설정하여 분석을 시행하였으며, 이동상의 조건은 표 2와 같이 설정하였다.

	0분	20분	24분	25분	30분
용매A (0.1％, 아세트산-H2O)	95	40	40	95	95
용매B (아세토니트릴)	5	60	60	5	5

한편, MS 조건은 nebulizing gas flow는 1.5 L/min, CDL 온도는 200℃, 히트 블록 온도(heat block temperature)는 200℃로 각각 설정하여 분석에 적용하였다.

오레고닌(Oregonin): 갈색의 무정형 분말

Positive LC/MS m/z : 501 [M+Na]+, Negative LC/MS m/z: 477 [M-H]- 1H-NMR (300MHz, DMSO-d6+D2O): δ6.61-6.53(4H in total, H-2′, 2″, 5′, 5″), 6.42-6.37(2H in total, H-6″, 6′), 4.25(1H, brd, J=7.8Hz, xyl-1), 4.13 (1H, m, H-5), 3.72 (1H, dd, J=11.4, 6Hz xyl-5e), 3.27(1H, m, xyl-4), 3.07-2.50 (8H in total, H-1,2,4,7), 1.66-1.59 (2H in total, m, H-6).

¹³C-NMR (75 MHz, DMSO-d6+D2O) : δ 28.4 (C-1), 30.3 (C-7), 39.7 (C-6), 44.9 (C-2), 47.2 (C-4), 65.8 (xyl-5), 69.5 (xyl-4), 74.3 (xyl-2), 76.6 (C-5, xyl-3), 102.6 (xyl-1), 115.4 (C-2′, C-2″), 115.6 (C-5′), 115.7 (C-5″), 118.8 (C-6′, C-6″), 132.9 (C-1′), 133.0 (C-1″), 143.1 (C-4′, C-4″), 145.8 (C-3″), 145.9 (C-3′), 209.0 (C-3).

(6) DPPH 자유 라디칼 소거작용 측정

Hatano et al.(28)의 방법에 의하여 실시하였다. 즉 시료를 각 농도별로 조제한 용액 100㎕(control : 99.5％ ethanol)에 0.1mM DPPH 용액(99.5% ethanol) 1.9 ㎖을 가하였다. 각 시료는 5가지 농도로 조제하였다. Vortex mixer로 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이후 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조약물로는 L-아스코르브산(L-ascorbic acid)를 5가지 농도로 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화작용은 IC₅₀ 수치(DPPH 라디칼 형성을 50%로 억제하는 데 필요한 농도)로 나타내었다.

(7) ABTS 자유 라디칼 소거작용 측정

ABTS 라디칼 소거 활성은 Re et al.(29)의 방법을 수정하여 측정하였다. ABTS(Sigma Co. USA) 시약을 증류수에 용해하여 7.0 mM의 농도로 준비하고, 포타슘 설페이트(potassium perdulfate, Sigma Co. USA)를 증류수에 용해하여 2.45 mM 농도로 준비하여 두 용액을 1:1 비율로 섞어서 12-16 시간 동안 암실상태로 방치하여 라디칼 스톡 용액(radical stock solution)을 제조하였다. 제조한 스톡 용액을 PBS 완충액(pH 7.4)으로 희석하여 750 nm에서 흡광도를 측정하여 0.7-1.0 사이의 흡광값이 나오도록 희석하여 준비하였다. 농도별로 시료를 준비하여 96-웰 플레이트에 시료(sample):ABTS 반응 비율을 1:9로 맞춰서 30분 동안 암실에서 반응을 시키고, 반응이 끝난 후 750 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

(8) 마우스 대식세포(Mouse macrophage) RAW 264.7 세포 배양

마우스 대식세포(Mouse macrophage) RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행에서 동결상태로 구입하였다. 세포가 들어있는 앰플을 미온수(30-40℃)에 바로 녹여 10％ FBS(fetal bovine serum), 페니실린 G(100 IU/mL), 스트렙토마이신(100 ㎍/mL)을 포함한 DMEM 배지를 이용하여 동결 과정에서 넣어준 DMSO를 제거하였다. DMSO를 제거한 RAW 264.7 세포에 DMEM을 5mL 넣어, 온도 37℃와 5％의 CO₂를 유지하면서 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다. 1-2일 마다 세포의 성장 정도에 따라 계대 배양하였다.

(9) RBL-2H3세포 배양

RBL-2H3세포는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)로부터 구매하였으며, 15％ 우태아혈청(Fetal bovine serum, FBS; Gibco, USA)과 100 unit/ml의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)(Gibco, USA)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium; Gibco, USA)에 2 mM L-글루타민(Gibco,USA)를 첨가한 배지에서 배양하였다. 성장 배지는 2-3일 마다 교환해 주었으며, 37℃, 5％ CO2 조건을 유지하였다.

(10) MTT 분석

본 실험에서 RAW 264.7 세포와 RBL-2H3 세포에 대한 물오리나무 가지 초임계 추출박 에탄올 추출물의 세포 독성 및 실험시 처리 농도를 결정하기 위해 MTT 분석을 실행하였다(30).

(11) 산화질소(Nitric oxide, NO) 생성 억제 작용 측정

산화질소(Nitric oxide, NO) 생성 억제 작용은 Griess의 방법(31, 32)으로 측정하였다. 즉, Griess reagent (1％ sulfanilamine, 0.1％ N-(1-naphthyl)-ethylene diamine dihydrochloride, 2.5％ H₃PO₄)는 NO를 산화시켜 NO₂로 변화시키며 생성된 NO₂는 540nm에서 흡광도를 측정하여 그 농도를 NaNO₂의 검량선을 이용하여 구하였다. 즉, RAW 264.7 세포를 DMEM으로 배지 1 mL 당 5 X 10⁴개 만큼 배양시킨 다음, 1 mL 당 1 X 10⁴개로 희석하여 96-웰에 160 uL씩 넣고 2시간 동안 배양해서 세포들이 부착되도록 한 다음 LPS(1 ㎍/mL) 10 ㎕을 포함한 각각의 시료를 20 ㎕씩 넣고 20 시간 배양시킨 후, 배양액에 생성되어 있는 NO의 양을 Griess reagent를 이용하여 정량하였다.

(12) β-헥소사미니다아제(hexosaminidase) 분석

세포 접종(cell seeding)은 RBL-2H3 세포를 10％ FBS를 포함한 DMEM에 현탁 시킨 후 24-웰 플레이트에 2 X 10⁵ 세포/mL의 세포수가 되도록 분주하였다. 세포 감작(cell sensitization)은 세포 분주 후 500 ng/mL 농도의 anti-DNP(dinitrophenol) IgE 로 감작하고 37℃, 5％ CO₂ 인큐베이터에서 12시간 배양하였다. 세포 활성화(cell activation)은 각 웰의 세포들을 Siraganian buffer (119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 25 mM PIPES, 40 mM NaOH, pH7.2)로 2번 세척한 다음, 각 웰당 5.6 mM 글루코오스, 1 mM CaCl₂, 0.1％ BSA가 포함된 Siraganian buffer에 추출물을 농도별로 첨가한 후 30분 동안 37℃, 5％, CO2 인큐베이터에서 배양하고, dinitrophenol-conjugated human serum albumin ((DNP-HSA)-specific IgE)의 농도가 100 ng/mL이 되도록 처리하여 10분 동안 반응시킨 후, 얼음조(ICE bath)에 10분 동안 방치하여 반응을 종결시켰다. 얻어진 상등액은 3분간 3,000rpm에서 원심분리 시킨 후, 상등액 30 ㎕를 96-웰 플레이트에 옮기고 동량의 기질 완충액(substrate buffer)(1 mM 4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide, 0.1 M citrate buffer pH 4.5)를 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 0.1M 카보네이트 완충액(carbonate buffer) 200μL를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 마이크로플레이트 리더(TECAN, Salzburg, Austria)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다(33).

(13) 통계 처리

본 연구의 실험 결과들은 3회 반복 측정하여 평균값±표준편차로 나타내었으며, 각 실험 농도 별 표준차이를 검증하기 위해 분산분석을 수행하였으며, 유의성이 발견된 경우 Tukey’s HSD test34)에 의해 농도 간의 유의성을 분석하였다. 모든 자료의 통계처리는 SPSS(Statistical Package for Science, version 24.0 SPSS Inc, Chicago, IL, USA)를 사용하여 처리하였고, 유의수준 α=0.05로 하였다.

2. 실험결과

(1) 오레고닌(Oregonin)의 구조동정

TLC 플레이트상에서 10％-H₂SO₄ 및 FeCl₃ 용액에 의한 발색과 1H, ¹³C-NMR, MS spectrum data를 기존 문헌(35)과 비교하여 각각 일치함을 확인하여 오레고닌(oregonin)으로 최종 동정하였다(도 1).

(2) 추출물별 오레고닌의 함량 분석

추출 방법에 따른 오레고닌 함량의 변화에 대한 정량 분석은 HPLC를 이용하여 다음과 같이 실시하였다.

C18 역상 컬럼을 사용하여, 전개 분리되는 최적용매조건을 찾기 위하여 이동상으로 H₂O와 아세토니트릴(acetonitrile)을 여러 가지 혼합비율로 혼합하여 그 분리능을 측정 검토한 결과, 용매조건은 H₂O : 아세토니트릴 = 90 : 10 의 조성에서 시작하여 24 분후 H₂O : 아세토니트릴 = 60 : 40 인 gradient mode에서 분석이 잘 되었으며, 파장은 280nm에서 최대 흡수파장을 나타내었다. 이러한 조건에서 오레고닌 표준 용액을 100 - 1000 ppm 다양한 농도의 시료가 유의성 있게 머무름 시간(retention time, RT)이 확인이 되었고, 확보된 HPLC 크로마토그램(도 2)을 근거로 여기서 얻은 피크 영역(peak area)와 농도의 관계로부터 검량선을 작성한 결과 100 - 1000ppm의 농도범위에서 회귀 직선방정식은 y=2485.5x - 19996 이고, R-square값이 0.9987로서 1.0에 근접하여 그 직선성이 인정되었다(도 3).

또한, 표품인 오레고닌의 머무름시간(retention time)과 추출물별 분석시료의 머무름 시간이 거의 동일함을 확인할 수 있었다(표 3).

샘플	머무름 시간 (Retention Time, min)
오레고닌	15.462±0.19
물오리나무 열수 추출물	15.050±0.15
물오리나무 60％ 에탄올 추출물	15.129±0.14
물오리나무 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물	15.094±0.12
물오리나무 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획	15.020±0.16

HPLC 분석에 의한 추출물별 크로마토그램으로부터 수피를 포함한 물오리나무 가지에서 분리된 오레고닌의 표준용액 검량선에 의하여 함량을 결정하였으며, 열수추출물은 131.82±0.17 ppm, 60％ 에탄올 추출물은 280.27±0.14 ppm으로 각각 확인할 수 있었다. 한편, 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물에서 오레고닌 함량 분석을 한 결과에서는 810.13±0.15 ppm으로 확인이 되어, 열수추출물 대비 614.57％ 향상, 일반적인 60％ 에탄올 추출물 대비 289.05% 향상된 오레고닌 함량이 확인되어 기존 추출방법 대비 매우 높은 고함량 오레고닌 추출 방법이라는 것을 확인할 수 있었다(도 4, 도 5, 도 6a, 도 6b, 표 4 참조).

시료(sample)	함량(Content, ppm)
오레고닌
오리나무 열수 추출물	131.82±0.17
오리나무 60％ 에탄올 추출물	280.27±0.14
오리나무 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물	810.13±0.15
오리나무 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획	986.51±0.16

(3) TLC 결과

오리나무 가지의 다양한 추출물의 TLC 결과는 도 7에 나타내었다.

(3) DPPH 및 ABTS 자유 라디컬 소거능 활성

수피를 포함한 물오리나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물(AJSCFR) 및 이의 에틸아세테이트 분획물(AJSCFREA)의 항산화 활성을 검정하기 위해서 두 가지 실험 방법인 DPPH 라디컬 소거능과 ABTS 라디컬 소거능 측정법을 통해서 항산화 활성을 측정하였다(양성대조군: 비타민 C). 실험결과, IC₅₀를 각각 비교하였을 때, 물오리나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물(AJSCFR)은 DPPH 라디컬 소거능은 28.62±0.32 ㎍/mL, ABTS 소거능은 12.82±0.17 ㎍/mL로 각각 측정 되었으며, 물오리나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 용매 분획(AJSCFREA)의 DPPH 라디컬 소거능은 7.01±0.19 ㎍/mL, ABTS 소거능은 4.53±0.11 ㎍/mL로 각각 측정 되었다. 양성대조군인 비타민 C의 DPPH 라디컬 소거능은 15.87±0.25 ug/ml, ABTS 소거능은 8.35±0.15 ug/ml로 각각 측정되었다. 각 실험에서 사용한 농도 범위에서 DPPH 라디컬 소거능은 실험 최고 농도인 100 ㎍/mL에서는 양성대조군과 실험군의 실험 결과값이 통계적으로 유의적인 차이가 나지 않았으며, ABTS 라디컬 소거능에서는 실험 농도 중 50, 100 ㎍/mL 두가지 농도에서는 양성대조군과 실험군에서 통계적인 유의적인 군간 비교가 되지 않음이 각각 확인되어, 고농도로 갈수록 양성대조군과 동등 이상의 매우 강력한 항산화 활성을 확인할 수 있었다(도 8 및 도 9 참조).

(4) 산화질소(Nitric oxide, NO) 소거능

인체에서 과도하게 생산된 NO에 의해서 인체에 다양한 염증성 질환, 특히 류마티스 관절염, 아토피피부염 등과 같은 난치성 면역 질환의 염증반응을 악화시키므로 유해한 작용을 나타내게 된다. 염증 반응에 의한 NO생성의 저해는 만성염증성 질환에서 치료적 방법으로 중요한 영역으로 알려져 있다(36). 물오리나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물의 난치성 면역 질환 천연 신소재로서 활용 가능성을 확인하기 위해서 Raw 264.7 대식세포주에서 LPS로 유도된 NO 생성 억제능을 실험하였다. NO 생성 억제능 실험에 앞서, 실험에 사용할 농도 1-50 ㎍/mL 에서 MTT 분석을 통해서 세포 독성 여부를 확인한 결과, 도 10에서와 같이 모든 실험군에서 통계적으로 유의성 있는 세포독성은 확인되지 않았다. 그러나, 실험 최고 농도인 50 ㎍/mL에서는 세포독성의 경향을 감안하여 NO 측정 실험에서 1-20 ㎍/mL의 농도범위에서 NO 소거능을 확인하였다. NO 소거능 실험 결과를 도 11에 나타내었다. 실험에 사용된 농도 중 10, 20 ㎍/mL에서 음성 대조군인 LPS 유도군에 비해서 통계적으로 유의성 있게 NO 소거능이 확인이 되었으며, 정상(normal) 대조군과 비교하였을 때 물오리나무 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물은 NO 소거능이 매우 강한 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 추출물은 항염증 활성을 갖는 천연물 유래 신소재로 개발이 가능할 것이며, 특히 만성 염증성 면역 질환에 적용 가능한 기능성 소재로 활용 가능할 것이다.

(5) β-헥소사미니다아제 탈과립 억제에 의한 항알러지 효능 평가

오리나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물의 항알러지 효능 검정을 위해서 RBL-2H3 세포를 대상으로 최소농도 1 ㎍/mL부터 최고농도 20 ㎍/mL까지 세포독성을 MTT 분석을 통하여 검정하였다. 실험 결과, β-헥소사미니다아제 분석을 수행한 각각의 실험 농도에서는 RBL-2H3 세포에 어떠한 독성도 없었음을 확인할 수 있었다(도 12). 세포독성이 없는 실험 농도에서, β-헥소사미니다아제 분석을 수행한 결과, 오리나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물은 세포 독성이 없는 농도 10 및 20 ㎍/mL 두 농도에서 정상 대조군(normal control)과 음성 대조군(negative control)군 2개 군과 비교하였을 때, 20 ㎍/mL 농도에서 통계적으로 유의성 있게 β-헥소사미니다아제 분비를 억제하는 것이 확인되었다(도 13). 이상의 결과로 부터 오리나무 가지 초임계 추출박 60％ 에탄올 추출물은 β-헥소사미니다아제 분비 억제능이 통계적으로 유의성 있게 확인되었다. 상기 추출물은 향후 알러지성 질환과 관련된 천연물 유래 신소재로 개발 가능성이 높다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (9)

1. (a) 오리나무 속 식물을 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계; 및
   (b) 상기 얻어진 오리나무 속 식물의 초임계 추출박에 대해 알코올 추출물을 얻는 단계를 포함하는, 오레고닌(oregonin)을 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 알코올은 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올인 것인, 오레고닌을 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 알코올은 에탄올인, 오레고닌을 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 오리나무 속 식물의 초임계 추출박에 대한 알코올 추출물에 대해 용매 분획을 얻는 단계 (c)를 더 포함하는, 오레고닌을 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 용매 분획은 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜, n-헥산, 디에틸에테르, 부틸아세테이트, 및 디클로로메탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매의 분획인, 오레고닌을 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 용매 분획은 에틸아세테이트 용매 분획인, 오레고닌을 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 오리나무 속 식물은 오리나무 속 식물의 가지 또는 줄기인 것인, 오레고닌을 포함하는 추출물의 제조 방법.
   
8. 삭제
9. 삭제

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