KR101653492B1

KR101653492B1 - 구슬꽃나무 잎 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증 또는 전립선비대증 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101653492B1
Application number: KR1020150054058A
Authority: KR
Inventors: 이민원; 허준혁
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2015-04-16
Filing date: 2015-04-16
Publication date: 2016-09-02

Abstract

본 발명은 염증 또는 전립선비대증 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 구슬꽃나무 잎 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 7로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화제, 및 염증 또는 전립선비대증의 예방, 개선, 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 구슬꽃나무 잎 추출물, 이의 분획물 또는 상기 추출물로부터 분리한 화합물은 DPPH 자유라디칼 및 NBT superoxide 소거활성이 우수하고 염증반응에서 생성되는 NO 및 염증성 사이토카인 생성 억제능이 뛰어나며 전립선비대증을 야기시키는 5-알파환원효소의 활성을 억제하므로 항산화제, 항염증용 조성물, 또는 전립선비대증의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 이용될 수 있다. 또한 상기 항산화제 및 조성물은 천연물에 기반한 것으로서 부작용이 거의 없으므로 안전하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

구슬꽃나무 잎 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증 또는 전립선비대증 치료용 조성물{The composition for treating inflammation and benign prostate hyperplasia comprising extracts from leaves of Adina rubella hance or compound isolated therefrom}

본 발명은 염증 또는 전립선비대증 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 구슬꽃나무 잎 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 7로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화제, 및 염증 또는 전립선비대증의 예방, 개선, 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

구슬꽃나무(Adina rubella hance)는 제주도 한라산 일대에 분포하는 우리나라 특산의 꼭두서니과 식물로서, 가지 끝이나 잎겨드랑이에서 두상꽃차례로 피는 꽃의 모습이 중의 머리를 연상케 하여 중대가리나무로도 불린다. 낙엽관목으로 줄기 높이가 3~4 m이고 잎은 대생하고 광택이 있으며 피침형, 넓은 피침형 또는 난상 피침형이다. 잎의 길이는 약 2~4 ㎝로 양면 맥 위에 잔털이 있고 가장자리는 밋밋하여 엽병은 짧은 특징을 갖는다. 한방에서는 줄기, 잎, 꽃을 사금자(沙金子)라는 약재로 쓰는데 이질, 습진, 중독에 효과가 있고, 사금자를 달인 물을 입 안에 머금고 있다가 뱉으면 치통에도 효과가 있으며 습진 및 외상출혈에도 외용한다.

최근까지 천연물 의약품은 진통제, 항염, 항균, 항바이러스, 항산화, 항당뇨, 항종양, 살충효과, 및 세포독성 효과 등이 있는 것으로 알려져 왔다. 현재까지 구슬꽃나무에서 분리한 화합물에 관한 연구는 주로 구슬꽃나무의 뿌리를 중심으로 연구되어왔으며, 여러 종류의 트리테르페노이드(triterpenoid), 트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponins), 크로몬 글리코시드(chromone glycoside), 알칼로이드(alkaloids), 및 카테킨(catechins) 등의 화합물이 발견되었다. 반면 구슬꽃나무 잎과 관련한 연구결과로서, 구슬꽃나무 잎 추출물은 전립선암 세포인 LNCaP에서 강한 세포독성을 유발함이 보고된 바 있으며, 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물에 관해서는 잘 알려진 바가 없다.

한편, 전립선비대증(benign prostate hyperplasia)은 남성에서 전립선(prostate)이 비종양적으로 커지는 비뇨기 질환으로, 전립선이 비대해져 방광의 배출 장애를 나타내는 증상을 통칭한 하부 요로증상이다. 전립선비대증의 원인은 정확히 알려지지 않았으나 연령과 성호르몬이 영향을 미친다고 알려져 있다. 전립선비대증은 연령이 높아질수록 발병확률이 높아져 50세를 넘어서부터 늘어나기 시작하며 일본의 경우 55세 이상 남성에서 5명 중 1명꼴로 나타난다고 보고된 바 있다. 전립선비대증은 크게 알파차단제 또는 안드로겐 억제제로 나뉘는 약물을 이용하여 치료하거나 수술로 치료하는 방법이 있다. 전립선은 알파아드레날린수용체가 풍부하게 분포하고 있어 알파차단제는 전립선 요도의 압력과 긴장을 낮추어주는 효과가 있다. 안드로겐 억제제로는 5-알파환원효소 억제제(5-α reductase inhibitor)가 치료제로 사용되고 있는데 피나스테리드(finasteride)와 두타스테리드(dutasteride)가 시중에서 판매되고 있다. 상기 5-알파환원효소 억제제는 5-알파환원효소에 의해 테스토스테론(testosterone)이 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone)으로 전환되는 것을 저해하여 전립선의 크기를 줄이는 작용을 한다. 그러나 상기 약물요법에 사용되는 시판 약물들은 어지럼증, 무기력증, 두통 등 부작용을 유발할 수 있다고 알려져 있다(Indian Dermatol Online J. 2012 Jan-Apr; 3(1): 62-65). 따라서 부작용이 없는 천연물을 이용하여 전립선비대증을 예방 또는 치료할 수 있는 천연물신약의 개발이 필요하다.

본 발명자들은, 상기와 같은 종래의 문제점 해결을 위해, 구슬꽃나무 잎 추출물로부터 분획물을 획득하고 이로부터 3종의 카페오일 유도체, 3종의 플라본, 및 1종의 세코이리도이드 화합물을 분리하였으며, 상기 화합물이 항산화, 항염, 5-알파환원효소 억제 효능을 보임을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 구슬꽃나무의 잎 추출물, 이의 분획물 또는 상기 추출물로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화제, 및 염증 또는 전립선비대증의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 구슬꽃나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화제를 제공한다.

또한, 본 발명은 구슬꽃나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 건강기능성 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 항산화제를 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

본 발명의 일 구현예로, 상기 화합물은 구슬꽃나무 잎 추출물로부터 분리된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화합물은 구슬꽃나무 잎 추출물로부터 분리된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

본 발명의 다른 구현예로, 상기 화합물은 5-알파환원효소(5-α reductase)의 활성을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 전립선비대증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 염증 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 전립선비대증 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 구슬꽃나무 잎 추출물, 이의 분획물 또는 상기 추출물로부터 분리한 화합물은 DPPH 자유라디칼 및 NBT superoxide 소거활성이 우수하고 염증반응에서 생성되는 NO 및 염증성 사이토카인 생성 억제능이 뛰어나며 전립선비대증을 야기시키는 5-알파환원효소의 활성을 억제하므로 항산화제, 항염증용 조성물, 또는 전립선비대증의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 이용될 수 있다. 또한 상기 항산화제 및 조성물은 천연물에 기반한 것으로서 부작용이 거의 없으므로 안전하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은, 본 발명의 구슬꽃나무 잎 추출물, 이의 분획물 및 화합물의 추출과정을 나타낸 플로우차트를 보여주는 것이다.
도 2는, 본 발명의 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물인 카페인산(caffeic acid)의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물인 클로겐산(clogenic acid)의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물인 클로겐산 메틸 에스테르(Clogenic acid methyl ester)의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물인 하이퍼로사이드(Hyperoside)의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물인 퀘르세틴-3-루티노사이드(Quercetin-3-rutinoside)의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물인 캠프페롤-3-O-α-L-람노피라노실(1→6)-β-D-글루코피라노사이드(Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside)의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물인 그란디플로로사이드(Grandifloroside)의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 9는, 구슬꽃나무 잎 추출물의 분획물(A) 및 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물(B)의 DPPH 자유 라디칼 소거활성을 측정한 결과이다.
도 10은, 구슬꽃나무 잎 추출물의 분획물(A) 및 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물(B)의 NBT superoxide 소거활성을 측정한 결과이다.
도 11은, 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 대한 구슬꽃나무 잎 추출물의 분획물(A) 및 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물(B)의 세포 독성 여부를 검증한 결과이다.
도 12는, 구슬꽃나무 잎 추출물의 분획물(A) 및 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물(B)의 NO 생성 억제 활성을 측정한 결과이다.
도 13은, 분화된 THP-1 세포에 염증을 유발하였을 때 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물의 IL-1β 생성 억제 활성을 측정한 결과이다.
도 14는, 분화된 THP-1 세포에 염증을 유발하였을 때 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물의 IL-6 생성 억제 활성을 측정한 결과이다.
도 15는, 분화된 THP-1 세포에 염증을 유발하였을 때 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물의 TNF-α 생성 억제 활성을 측정한 결과이다.
도 16은, 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 화합물의 5-알파환원효소 억제 활성을 측정한 결과이다.

본 발명자들은 구슬꽃나무 잎 추출물로부터 분획물을 획득하고 이로부터 3종의 카페오일 유도체, 3종의 플라본, 및 1종의 세코이리도이드 화합물을 분리하였으며, 상기 화합물이 항산화, 항염, 전립선비대증을 야기하는 5-알파환원효소에 대한 억제 효능을 보임을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 구슬꽃나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화제를 제공한다. 또한 상기 구슬꽃나무 잎 추출물 또는 이의 분획물은 항산화용 약제학적 조성물, 건강기능성 식품 조성물, 또는 화장료 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 구슬꽃나무 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 조성물은 약제학적 조성물, 건강기능성 식품 조성물, 또는 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명의 상기 구슬꽃나무 잎 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 물, 탄소 수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 아세톤을 이용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 70-100% 아세톤을 이용할 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 80%의 아세톤을 이용할 수 있다.

상기 구슬꽃나무 잎 분획물은 상기 구슬꽃나무의 잎 추출물을 물, 메탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 획득할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리된 하기 화학식 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 항산화제를 제공한다. 또한 상기 화합물은 항산화용 약제학적 조성물, 건강기능성 식품 조성물, 또는 화장료 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리된 하기 화학식 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 조성물은 약제학적 조성물, 건강기능성 식품 조성물, 또는 화장료 조성물일 수 있다.

또한, 본 발명은 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리된 하기 화학식 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여에 의해 염증 또는 전립선비대증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증 또는 전립선비대증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 상기 화학식 1 내지 화학식 7로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 구슬꽃나무 잎 추출물에서 분리한 상기 화학식 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 건강기능성 식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 건강기능성 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

본 발명에서는 하기 실시예를 통해 구슬꽃나무 잎으로부터 추출물 및 이의 분획물을 획득하였고, 상기 추출물로부터 7종의 화합물을 분리하였으며 상기 추출물, 이의 분획물 및 화합물의 항산화, 항염, 및 전립선비대증을 야기하는 5-알파환원효소의 억제 활성을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 구슬꽃나무 잎으로부터 추출물을 획득하고 순차적으로 분획하여 10종류의 분획물(AR-1~10)을 얻었으며, 상기 분획물로부터 7종의 화합물을 분리하였다. NMR 분석을 통해 화합물의 구조를 규명하였으며 상기 7종의 화합물은 3종의 카페오일 유도체, 3종의 플라본, 및 1종의 세코이리도이드임을 확인하였다(실시예 1 및 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명의 실시예에서 획득한 상기 구슬꽃나무 잎 추출물, 이의 분획물 및 상기 7종의 화합물에서 DPPH 자유 라디칼 소거활성 및 NBT superoxide 소거활성 측정을 통해 항산화 활성이 있음을 확인하였으며, 염증유발시 NO 생성 억제활성 측정을 통해 항염 활성이 있음을 알 수 있었다(실시예 3 및 4 참조).

더욱이, 상기 화합물은 염증 유발시 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α의 생성을 억제하였으며, 전립선비대증을 야기하는 5-알파환원효소의 활성을 억제함을 확인하였다(실시예 5 및 6 참조).

또한 본 발명의 실시예를 통해 카페오일(caffeoyl)과 말단 비닐기를 가지고 있는 세코이리도이드인 그란디플로로사이드(Grandifloroside)가 항산화, 항염 및 전립선비대증 개선에 대해 가장 우수한 효과를 보임을 알 수 있었다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 재료 준비 및 실험 방법

1-1. 구슬꽃나무 잎 준비

구슬꽃나무(Adina rubella Hance)의 잎은 제주도 한라수목원에서 수집하였으며, 표본은 중앙대학교 약학대학의 식물표본실에서 얻었다.

1-2. 구슬꽃나무 잎 추출물, 이의 분획물 , 및 화합물 분리

상온에서 구슬꽃나무 잎을 80% 아세톤(acetone)으로 추출하여 추출물을 얻었다. 상기 추출물에서 아세톤을 증발시켜 제거한 후 아세톤이 제거된 추출물을 celite 545(Duksan Pure Chemicals Co.,Ltd, Korea)를 이용하여 필터링하였다. 상기 필터링한 추출물을 Ambelite XAD-2(20-50 ㎛, 10 ㎏, 70 × 50 ㎝)를 이용해 물(H₂O), 50% 메탄올(MeOH), 100% 메탄올(MeOH) 용매계(solvent system)를 사용하여 순차적으로 용출시켜 10개의 분획물(fraction)을 얻었으며, AR-1~10으로 명명하였다. 이후 상기 분획물로부터 물 : 메탄올이 100 : 0 내지 0 : 100의 용매구배를 갖는 MCI gel column(50 ㎛, 400 g, 3 × 50 ㎝)을 이용하여 소분획물(sub fraction)을 얻었다. 상기 소분획물로부터 물 : 메탄올의 용매구배를 달리한 ODS gel column(50 ㎛, 250 g, 3 × 50 ㎝)을 이용하여 7종류의 화합물을 분리하였으며, 상기 과정을 도 1에 나타내었다.

1-3. 세포 배양

본 발명의 실시예에서 사용한 마우스 유래 대식세포주인 Raw 264.7과 사람 유래 단핵구 세포주인 THP-1은 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)에서 구입하였다. Raw 264.7 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 및 100 IU/㎖ 페니실린 G(penicillin G)와 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)이 함유된 DMEM 배지(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium, Sigma, St. Louis, MO, USA)에서, THP-1 세포는 10% FBS, 및 100 IU/㎖ 페니실린 G(penicillin G)가 함유된 RPMI1640 배지(Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 5% CO₂, 37℃ 조건하에서 배양하였다. 각 세포는 혈구계산기(hemocytometer)로 세포 수를 측정한 후 실험에 사용하였다.

1-4. DPPH 라디칼 소거활성 측정

항산화 활성을 검증하기 위한 방법으로써 1,1-디페닐-2-피크릴-히드라질(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl; DPPH) 자유 라디칼(Sigma, St. Louis, USA)의 소거활성을 측정하였다. 각 샘플 즉, 상기 실시예 1-2의 방법으로 얻은 구슬꽃나무 잎 추출물, 추출물의 10종류 분획물(AR-1~10), 또는 상기 추출물 유래 7종류의 화합물 20 ㎕를 180 ㎕의 DPPH 용액(0.2 mM, in absolute ethanol)에 첨가하고 잘 섞어 30분 동안 놓아둔 후 ELISA reader(TECAN, Salzburg, Austria)로 518 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 샘플로 L-아스코르브산(L-ascorbic acid)을 사용하였다.

1-5. NBT superoxide 소거활성 측정

항산화 활성을 검증하기 위한 또 다른 방법으로써 니트로테트라졸리움 블루 클로라이드(Nitrotetrazolium Blue chloride; NBT) superoxide 소거활성을 측정하였다. 실시예 1-2의 방법으로 얻은 구슬꽃나무 잎 추출물의 10종류 분획물(AR-1~10), 또는 상기 추출물 유래 7종류의 화합물 20 ㎕, 1 mM의 NBT 용액을 포함한 혼합액 160 ㎕, EDTA(0.05 mM)를 포함하는 50 mM 인산 완충액(phosphate buffer, pH 7.5)에 녹인 크잔틴 산화효소(xantine oxidase, 1.2 U/㎕)(Sigma, St. Louis, MO) 20 ㎕를 섞고 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 샘플로 알로푸리놀(allopurinol)을 사용하였다.

1-6. MTT assay

세포 생존능을 측정하기 위해 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테트라졸리움-브로마이드[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromide, MTT](Sigma, St. Louis, MO, USA) assay를 수행하였다. RAW 264.7 세포를 96well plate에 분주하고 3시간 동안 배양한 후 실시예 1-2의 방법으로 얻은 구슬꽃나무 잎 추출물, 추출물의 10종류 분획물(AR-1~10), 또는 상기 추출물 유래 7종류의 화합물을 각각 12.5, 25, 50, 및 100 uM 농도로 세포에 처리하였다. 상기 세포를 24시간 동안 배양한 후 0.5 ㎎/㎖ MTT가 함유된 새로운 배지로 갈아주고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이후 세포의 배지를 제거하고 생성된 불용성의 포르마잔(formazan)을 100 ㎕ DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 ELISA reader(TECAN, Salzburg, Austria)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

1-7. NO 생성 억제활성 측정

Raw 264.7 마우스 대식세포주를 96well plate에 분주하고 5% CO₂, 37℃ 조건하에서 3시간 동안 배양한 후 0.1 ㎍/㎖ LPS(Sigma, St. Louis, MO, USA)와 샘플 즉, 실시예 1-2의 방법으로 얻은 구슬꽃나무 잎 추출물, 추출물의 10종류 분획물(AR-1~10), 또는 상기 추출물 유래 7종류의 화합물을 포함하는 배지에서 배양하였다. 배양 24시간 후 Griess 시약(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 상기 LPS와 샘플을 처리한 세포 배양액과 섞어 30분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 샘플로 NO 합성효소(NO synthase; NOS) 억제제인 L-NMMA를 사용하였다.

1-8. 대식세포(macrophage) 분화 및 자극

사이토카인 생성 억제 검증 실험을 위해 THP-1 단핵구를 성숙한 대식세포 유사 상태로 유도하고자 하였다. THP-1 세포를 24well plate에 1x10⁵/well 만큼 분주하고 10 nmol의 12-O-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA)(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 처리하였다. 분화된 THP-1 세포는 PBS(phosphate buffered saline)으로 한번 수세한 후 10% FBS와 100 IU/ml 페니실린 G(penicillin G)가 포함된 RPMI1640 배지로 갈아주고 배양하였다.

1-9. 사이토카인 생성 억제활성 측정

실시예 1-8에서 분화시킨 세포에 실시예 1-2의 방법으로 얻은 구슬꽃나무 잎 추출물 유래 7종류의 화합물을 50 μM 농도로 처리한 후 5% CO₂, 37℃ 조건하에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 0.1 ㎍/㎖의 LPS를 함유하는 배지에서 24시간 동안 배양한 후 새로운 배지로 갈아주고 24시간 동안 더 배양한 후 각 화합물을 처리한 세포의 배양배지를 이용하여 ELISA(enzymelinked immunosorbent assay)를 통해 배지 내 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α의 단백질 양을 측정하였다. 양성대조군으로는 강력한 항산화작용과 항염작용이 있는 것으로 알려져있는 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate; EGCG)를 사용하였다.

1-10. 간 마이크로솜 제조

간 마이크로솜(liver microsomes)을 제조하기 위해 성숙한 Sprague-Dawley 수컷 쥐(rat) 두 마리를 희생시키고 간을 적출하여 가위로 잘게 조각내었다. 조각낸 간 조직을 조직의 3배 양만큼 medium A(0.32 M sucrose, 1 mM dithiothreitol, and 20 mM sodium phosphate, pH 6.5)를 넣고 균질화 한 다음 10,000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 얻어진 펠렛에 2배 양만큼의 medium A를 넣고 수세하여 다시 원심분리를 수행한 후 마이크로솜이 포함된 상층액을 얻었으며, 이를 4 ㎖ medium A에 현탁하였다. 이후 간 마이크로솜 현탁액을 적은 양으로 분주하여 -80℃에서 보관하였으며, 사용 전에 배지에 희석하여 사용하였다. 또한 단백질 함량은 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) 염색 시약을 이용하여 측정하였다.

1-11. 5- 알파환원효소 억제활성 측정

실시예 1-2의 방법으로 얻은 구슬꽃나무 잎 추출물 유래 7종류 화합물의 전립선비대증 개선 효과를 검증하기 위해 전립선비대증을 야기하는 5-알파환원효소(5-α reductase) 억제활성을 측정하였다. 모든 군에 인산완충용액(phosphate buffer) 1350 ㎕, 테스토스테론(1㎎/㎖) 150 ㎕, 및 NADPH 350 ㎕를 첨가하고 양성대조군으로써 시판되고 있는 피나스테리드(Finasteride)를 처리하거나 상기 7종의 화합물을 처리하였다. HPLC를 이용하여 테스토스테론을 검출하였으며, 실시예 1-10에서 제조한 간 마이크로솜 부분 효소인 5-알파환원효소를 모든 군에 처리한 후 반응을 종료하기 위해 모든 군에 디클로로메탄(dichloromethane) 2 ㎖을 처리하였다. 반응 후의 테스토스테론의 양은 고압액체크로마토그래피(high pressure liquid chromatography)를 이용하여 정량하였다.

실시예 2. 구슬꽃나무 잎 추출물 유래 화합물의 구조 규명

상기 실시예 1-2의 방법으로 구슬꽃나무 잎 추출물로부터 분리한 7종의 화합물의 구조를 규명하기 위해 1H-(300 또는 600 MHz) 및 13C-(600 MHz) 핵자기공명(nuclear magnetic resonance; NMR)과 같은 1D-NMR, 양성자 상호관계 스펙트로스코피(proton correlation spectroscopy; ¹H¹H-COSY), 이핵 종 단일 양자 코히런스(heteronuclear single quantum coherence; HSQC), 및 이핵 종 다중 결합 코히런스(heteronuclear multiple bond coherence; HMBC) 실험을 수행하였다. 그 결과, 3종의 카페오일 유도체(Caffeic acid(1), Chlorogenic acid(2), 및 Chlorogenic acid methyl ester(3)), 3종의 플라본(Hyperoside(4), Quercetin-3-O-rutinoside(5), 및 Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside(6)), 및 1종의 세코이리도이드(Grandifloroside(7))가 분리되었음을 확인하였다.

2-1. Caffeic acid

카페오일산(Caffeic acid)을 1번 화합물로 명명하였고, 규명된 구조를 도 2에 나타내었으며, NMR 결과는 하기와 같다.

¹H-NMR (300 MHz, MeOH-d₄+D₂O) : δ 7.56 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7), 7.04 (1H, d, J=2.1 Hz, H-2), 6.95 (1H, dd, J=2.1, 8.4 Hz, H-6), 6.90 (1H, dd, J=8.4 Hz, H-5), 6.24 1H, d, J=15.9 Hz, H-8).

2-2. Chlorogenic acid

클로로겐산(Chlorogenic acid)을 2번 화합물로 명명하였고, 규명된 구조를 도 3에 나타내었으며, NMR 결과는 하기와 같다.

¹H-NMR (300 MHz, MeOH-d₄+D₂O) : δ 7.58 (1H, d, J=15.6 Hz, H-7'), 7.09 (1H, d, J=2.1 Hz, H-2'), 6.95 (1H, dd, J=2.1, 8.1 Hz, H-6'), 6.86 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5'), 6.34 (1H, d, J=15.6 Hz, H-8'), 5.35 (1H in total, m, H-3), 4.27 (1H, m, H-5), 3.82 (1H, m, H-4), 2.09 (4H in total, m, H-2, 6).

¹³C-NMR (600 MHz, MeOH-d₄+D₂O): δ 176.6 (C-7), 168.1 (C-9'), 148.9 (C-4'), 146.5 (C-7'), 146.2 (C-3'), 127.2 (C-1'), 122.4 (C-6'), 115.8 (C-5'), 114.6 (C-2'), 114.6 (C-8'), 75.7 (C-1), 72.9 (C-3), 71.4(C-4), 70.8 (C-5), 38.3 (C-2), 37.6 (C-6).

2-3. Chlorogenic acid methyl ester

클로로겐산 메틸 에스테르(Chlorogenic acid methyl ester)를 3번 화합물로 명명하였고, 규명된 구조를 도 4에 나타내었으며, NMR 결과는 하기와 같다.

¹H-NMR (300 MHz, MeOH-d₄+D₂O) : δ 7.55 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7'), 7.05 (1H, d, J=2.1 Hz, H-2'), 6.95 (1H, dd, J=2.1, 8.1 Hz, H-6'), 6.79 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5'), 6.24(1H, d, J=15.9 Hz, H-8'), 5.28 (1H in total, m, H-3), 4.15 (1H, m, H-5), 3.75 (1H, m, H-4), 2.14 (4H in total, m, H-2, 6).

¹³C-NMR (600 MHz, MeOH-d₄+D₂O): δ 174.0 (C-7), 166.8 (C-9'), 148.2 (C-4'), 145.7(C-7'), 145.4 (C-3'), 126.2 (C-1'), 121.5 (C-6'), 115.1 (C-5'), 113.7 (C-8'), 113.6 (C-2'), 74.4 (C-1), 71.1 (C-3), 70.6(C-4), 68.8 (C-5), 51.5 (OCH3), 36.6 (C-6), 36.3 (C-2).

2-4. Hyperoside

하이퍼로사이드(Hyperoside)를 4번 화합물로 명명하였고, 규명된 구조를 도 5에 나타내었으며, NMR 결과는 하기와 같다.

¹H-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ 7.67 (1H, dd, J = 2.1, 8.7Hz, H-6'), 7.54 (1H, d, J =2.1Hz, H-2'), 6.83 (1H, d, J =8.7Hz, H-5'), 6.41 (1H, d, J =2.1Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J =1.8Hz, H-6), 5.38 (1H, d, J =7.8Hz, H-1''), 3.20-3. (6H in total, m, H-2'', 3'', 4'', 5'' and 6'').

¹³C-NMR(600MHz, DMSO-d6): δ 177.9 (C-4), 164.7 (C-7), 161.6 (C-5), 156.7 (C-9), 156.6 (C-2), 148.9 (C-4'), 145.2 (C-3'), 133.8 (C-3), 122.4 (C-6'), 121.5 (C-1'), 116.3 (C-2'), 115.6 (C-5'), 104.3 (C-10), 102.2 (C-1''), 99.1 (C-6), 94.0 (C-8), 76.3 (C-5''), 73.6 (C-3''), 71.6 (C-2''), 68.4 (C-4''), 60.6 (C-6'').

2-5. Quercetin -3-O- rutinoside

퀘르세틴-3-O-루티노사이드(Querecetin-3-O-rutinoside)를 5번 화합물로 명명하였고, 규명된 구조를 도 6에 나타내었으며, NMR 결과는 하기와 같다.

¹H-NMR (300MHz, MeOH-d₄+D₂O): δ 7.65 (1H, dd, J = 2.1, 8.4Hz, H-6'), 7.53 (1H, d, J =2.1Hz, H-2'), 6.83 (1H, d, J =8.4Hz, H-5'), 6.39 (1H, s, H-8), 6.20 (1H, s, H-6), 5.31 (1H, d, J =7.5Hz, H-1''), 4.40 (1H, s, H-1'''), 3.20-3.58 (9H in total, m, H-2'', 3'', 4'', 5'', 6'', 2''', 3''', 4''', 5'''), 1.03(3H, d, J=6.0Hz, H-6''').

¹³C-NMR (600 MHz, MeOH-d₄+D₂O): δ 177.9(C-4), 164.6(C-7), 161.4(C-5), 157.5 (C-9), 156.9 (C-4'), 148.5 (C-2), 144.3 (C-3'), 134.4 (C-3), 121.6 (C-1'), 121.3 (C-6'), 116.5 (C-2'), 114.6 (C-5'), 104.5 (C-10), 104.1 (C-1''), 100.4 (C-1'''), 98.6(C-6), 93.5(C-8), 73.8 (C-8), 73.6 (C-3''), 72.4 (C-2''), 71.7 (C-4'''), 70.8 (C-2'''), 70.6 (C-3'''), 68.7 (C-4''), 68.2(C-5'''), 65.9 (C-5''), 16.5(C-6''').

2-6. Kaempferol -3-O-α-L- rhamnopyranosyl (1→6)-β-D- glucopyranoside

캠프페롤-3-O-α-L-람노피라노실(1→6)-β-D-글루코피라노사이드(Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside)를 6번 화합물로 명명하였고, 규명된 구조를 도 7에 나타내었으며, NMR 결과는 하기와 같다.

¹H-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ 8.06 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-2', 6'), 6.88 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-3', 5'), 6.42 (1H, brs, H-8), 6.20 (1H, brs, H-6), 5.31 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1''), 4.39 (1H, brs, H-1'''), 3.0-4.4 (10H, m, rha. glc), 1.06 (3H, d, J = 6.0 Hz, rha. CH3).

¹³C-NMR (600MHz, DMSO-d6): δ 177.8 (C-4), 164.9(C-7), 161.5 (C-5), 161.5 (C-5), 160.3 (C-4'), 157.1 (C-2), 156.9 (C-9), 133.7 (C-3), 131.4 (C-2', 6'), 121.3 (C-1'), 115.5 (C-3', 5'), 104.3 (C-10), 102.5 (C-1''), 100.5 (C-1'''), 99.2 (C-6), 94.2 (C-8), 74.0 (C-3''), 73.4 (C-5''), 72.3 (C-2''), 71.5 (C-4'''), 70.9 (C-3'''), 70.8 (C-2'''), 68.7 (C-4''), 68.4 (C-5'''), 65.9 (C-6''), 16.5 (C-6''').

2-7. Grandifloroside

그란디플로로사이드(Grandifloroside)를 7번 화합물로 명명하였고, 규명된 구조를 도 8에 나타내었으며, NMR 결과는 하기 표 1과 같다.

[표 1]

실시예 3. 구슬꽃나무 잎 추출물의 분획물 및 화합물의 항산화 효과 검증

3-1. DPPH 자유 라디칼 소거활성 확인

실시예 1-2의 방법으로 추출한 구슬꽃나무 잎 추출물, 추출물의 10종류 분획물(AR-1~10), 또는 상기 추출물 유래 7종류의 화합물의 항산화 효능을 검증하기 위해 실시예 1-4의 방법으로 상기 분획물 또는 화합물의 처리 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다.

그 결과, 도 9A에 나타낸 바와 같이, 10종류의 분획물 중 5종류의 분획물에서 DPPH 라디칼 소거활성이 높게 나타났다. 특히 AR-5, AR-7, 및 AR-9의 경우 half maximal inhibitory concentration(IC₅₀)을 측정한 결과 양성대조군으로 사용한 L-아스코르브산(L-ascorbic acid)의 IC₅₀보다 낮은 것을 확인함으로써 현저히 높은 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 갖는 것을 알 수 있었다.

구슬꽃나무 잎의 분획물에서 분리한 화합물의 경우 도 9B에 나타낸 바와 같이, 7종 화합물 모두에서 DPPH 라디칼 소거활성이 높게 나타났다. 특히, 3번과 7번 화합물에서 양성대조군과 비교하였을 때 가장 높은 활성을 보임을 확인하였다. 상기 10종류의 구슬꽃나무 잎의 분획물과 7종 화합물의 50%의 DPPH 라디칼 소거활성을 보이는 IC₅₀을 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

3-2. NBT superoxide 소거 활성 확인

실시예 1-2의 방법으로 추출한 10종류의 구슬꽃나무 잎 추출물의 분획물(AR-1~10) 및 상기 추출물에서 분리한 7종 화합물의 항산화 효능을 검증하기 위해 실시예 1-5의 방법으로 상기 분획물 또는 화합물의 처리 농도에 따른 NBT superoxide 소거활성을 측정하였다.

그 결과, 도 10A에 나타낸 바와 같이, 10종류의 분획물 중 AR-5, 및 AR-7의 경우 IC₅₀ 값이 양성대조군으로 사용한 알로푸리놀(Allopurinol)의 IC₅₀ 보다 낮은 것을 확인함으로써 NBT superoxide 소거 활성이 매우 높음을 알 수 있었다.

구슬꽃나무 잎 분획물에서 분리한 화합물의 경우 도 10B에 나타낸 바와 같이, 6번 화합물을 제외하고는 모두 높은 NBT superoxide 소거 활성을 보임을 확인하였다. 특히, 카페오일 유도체와 세코이리도이드인 1, 2, 3, 및 7번 화합물의 경우 양성대조군과 유사한 높은 활성을 나타내었다. 상기 10종류의 구슬꽃나무 잎의 분획물과 7종 화합물의 50%의 NBT superoxide 소거 활성을 보이는 IC₅₀을 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

실시예 4. 구슬꽃나무 잎 추출물의 분획물 및 화합물의 항염증 효과 검증

4-1. 세포독성 검증

실시예 1-2의 방법으로 추출한 구슬꽃나무 잎 추출물, 이의 10종류의 분획물(AR-1~10), 및 상기 추출물에서 분리한 7종 화합물의 항염증 효과 검증실험을 수행하기 전 RAW 264.7 세포에서 세포독성을 유발하는지 검증하기 위해 실시예 1-6의 방법으로 MTT assay를 수행하였다.

그 결과, 도 11A에 나타낸 바와 같이, 상기 추출물은 100 ㎍/㎖ 농도에서 약간의 세포독성을 유발하였지만 10 종류의 분획물 모두 12.5 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖ 농도에서 80% 이상의 세포생존능을 나타내었으므로 세포독성을 유발하지 않음을 확인하였다. 7종의 화합물의 경우에도 도 11B에 나타낸 바와 같이, 12.5 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖ 농도에서 역시 80% 이상의 세포생존능을 나타내었으므로 세포독성을 유발하지 않음을 알 수 있었다.

4-2. NO 생성 억제 활성 검증

실시예 4-1을 통해 상기 10종류의 구슬꽃나무 잎 추출물의 분획물 및 7종의 화합물이 마우스 유래 대식세포주인 RAW 264.7에서 세포독성을 유발하지 않음을 확인하였으므로, 상기 분획물 및 화합물의 항염증 효과를 검증하기 위해 실시예 1-7의 방법으로 NO 생성 억제 활성을 확인하였다.

그 결과, 도 12A에 나타낸 바와 같이, 10종류의 구슬꽃나무 잎 추출물(Extrace; EX) 및 분획물의 경우 추출물과 분획물 4, 5, 6, 및 7번이 NO 생성 억제효과를 나타내어 항염증 효과를 가짐을 확인하였다.

상기 7종 화합물의 경우, 도 12B에 나타낸 바와 같이, 대체적으로 좋은 NO 생성 억제 활성을 나타내었다. 특히, 화합물 1번과 7번은 양성대조군인 L-NMMA보다 낮은 IC₅₀을 나타내어 현저히 높은 NO 생성 억제 활성을 보임을 확인하였다. 상기 10종류의 구슬꽃나무 잎 추출물의 분획물과 7종 화합물의 50%의 NO 생성 억제 활성을 보이는 IC₅₀을 하기 표 4에 나타내었다.

[표 4]

실시예 5. 구슬꽃나무 잎 추출물의 분획물 및 화합물의 염증성 사이토카인 생성 억제 검증

5-1. IL- 1β 생성 억제 확인

실시예 1-2의 방법으로 분리한 7종 화합물의 사이토카인 생성 억제 효과를 검증하기 위해 실시예 1-9의 방법으로 ELISA를 이용하여 단백질 수준에서 IL-1β의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, LPS만 처리한 경우(Con)와 비교하여 7종의 화합물을 처리한 경우 6종류의 화합물(1, 2, 3, 4, 5, 및 7)에서 EGCG를 처리한 양성대조군보다는 낮은 수준이지만 IL-1β의 생성이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.

5-2. IL-6 생성 억제 확인

실시예 1-2의 방법으로 분리한 7종 화합물의 사이토카인 생성 억제 효과를 검증하기 위해 실시예 1-9의 방법으로 ELISA를 이용하여 단백질 수준에서 IL-6의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 7종의 화합물을 처리한 경우 실시예 7-1의 결과와 마찬가지로 6종의 화합물(1, 2, 3, 4, 5, 및 7)에서 모두 IL-6의 생성이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.

5-3. TNF -α 생성 억제 확인

실시예 1-2의 방법으로 분리한 7종 화합물의 사이토카인 생성 억제 효과를 검증하기 위해 실시예 1-9의 방법으로 ELISA를 이용하여 단백질 수준에서 TNF-α의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 7종의 화합물을 처리한 경우 화합물 1번과 4번 화합물을 제외한 5종의 화합물(2, 3, 5, 6, 및 7)에서 LPS만 처리한 대조군(con)에 비하여 TNF-α 생성이 유의하게 감소한 것을 확인하였다.

상기 본 발명의 구슬꽃나무 잎 추출물 유래 화합물에 의한 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α 생성억제 결과를 통해 상기 화합물의 항염증 효과를 확인하였다.

실시예 6. 구슬꽃나무 잎 추출물의 분획물에서 분리한 화합물의 전립선 비대증 개선 효과 검증

실시예 1-2의 방법으로 분리한 7종 화합물의 전립선비대증 개선 효과를 검증하기 위해 테스토스테론(testosterone)을 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone)으로 전환하는데 작용하는 효소인 5-알파환원효소(5-α reductase)에 대한 억제활성을 확인하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 시판되고 있는 전립선비대증 치료제인 피나스테리드(Finasteride) 및 상기 화합물을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 화합물 2번 및 7번을 처리한 군에서 피나스테리드(Finasteride)를 처리한 군보다 테스토스테론이 더 많이 존재함을 확인하여 높은 5-알파환원효소 억제 활성을 보이는 것을 알 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

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하기 화학식 7로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 전립선비대증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
[화학식 7]
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제13항에 있어서,
상기 화합물은 구슬꽃나무 잎 추출물로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제13항에 있어서,
상기 조성물은 5-알파환원효소(5-α reductase)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
하기 화학식 7로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 전립선비대증의 개선용 건강기능성 식품 조성물.
[화학식 7]
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