KR101946526B1

KR101946526B1 - 하이드란제놀을 유효성분으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선을 위한 조성물

Info

Publication number: KR101946526B1
Application number: KR1020170175385A
Authority: KR
Inventors: 김지형; 이선희; 이근석; 김현재; 이경태; 신지선; 이승빈
Original assignee: 코스맥스바이오 주식회사
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2019-02-11
Also published as: US20200383892A1; WO2019124646A1

Abstract

본 발명은 하이드란제놀(Hydragenol), 바람직하게는 산수국(Hydrangea Serrata) 잎 추출물에서 유래한 하이드란제놀(Hydragenol)을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선을 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 피부세포에서 히알우론산(Hyaluronic acid) 및 프로콜라겐(Pro-collagen Type1)의 분비를 증가시키고, MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1)의 분비를 억제시킴으로써, 자외선에 의한 피부세포 손상의 예방 또는 개선 효과를 확인하였다. 따라서 본 명세서에 개시된 하이드란제놀을 포함하는 조성물은 의약외품, 의약품, 식품 또는 화장품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

하이드란제놀을 유효성분으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선을 위한 조성물{Composition of preventing or improving UV-induced skin damage comprising hydrangenol}

본 발명은 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 하이드란제놀, 바람직하게는 산수국 추출물에서 유래한 하이드란제놀을 유효성분으로 포함하여 자외선의 자극으로 인한 MMP-1 분비를 억제시키고, 히알우론산 및 프로콜라겐(pro-collagen)의 분비를 증가시킴으로써, 자외선 노출에 의해 생기는 피부 손상을 예방 또는 개선하는 조성물에 관한 것이다.

피부노화는 요인에 따라 내인성 노화(Intrinsic aging)와 외인성 노화(Extrinsic aging)로 구분할 수 있다. 내인성 노화는 나이에 따른 피부 표피 및 진피의 생리적 기능 변화가 원인이며, 외인성 노화는 대기오염, 자외선 노출, 스트레스 등의 환경으로부터 발생하는 피부의 생리적 기능 변화가 원인으로 알려져 있다. 이러한 노화의 메커니즘 중 UV에 의해 유도되는 산화적 스트레스(Oxidative Stress)는 체내의 자유라디칼(Free Radical)을 증가시키고, 콜라겐(Collagen)을 분해하는 MMP-1의 활성 증가 및 히알우론산(Hyaluronic acid)을 분해는 히알우론다제(Hyaluronidase)의 활성 증가로 피부 표피 및 진피 손상을 야기한다.

일상생활에서 우리는 햇빛에 항상 노출되어 있으며, 특히 UV-B 노출로 인해 발생하는 세포의 손상 및 피부암 유발은 일상생활에서 피할 수 없는 요소이다.

이에 따라, 최근 UV 노출에 의한 피부세포손상 예방 또는 개선에 대한 생화학적 효능, 효과를 나타내는 소재에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

산수국(Hydrangea serrata) 은 범의귀과의 넓은 잎 작은 키 나무로 식약처에서 고시한 식품원재료에 잎 부위가 식용가능부위로 명시되어 있다. 한방에서는 생약명으로 칠엽담이라고 하여 만성기관지염, 진해, 거담, 소염해독 등의 치료에 예로부터 사용되고 있다.

하이드란제놀은 hydrangea속 에서 발견되는 대표적인 성분으로서(일본공개특허 JP-0029934), 분자량은 256.25 g/mol이며 IUPAC명은 8-hydroxy-3- (4-hydroxyphenyl)-3,4-dihydroisochromen-1-one이다. 또한 이것의 유도체로는 (-)-hydrangenol 4'-O-glucoside, (+)-hydrangenol 4'-O-glucoside가 있다. 또한 이것의 기능성으로는 피부미백(일본공개특허 JP-0007546), 항염효과(Kim, H.J, et al., Hydrangenol inhibits lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in BV2 microglial cells by suppressing the NF-κB pathway and activating the Nrf2-mediated HO-1 pathway, International immunopharmacology v.35 ,pp. 61 - 69 , 2016 , 1567-5769)가 있는 것으로 보고된 바 있다.

하지만 상기 성분은 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선에 대한 용도는 알려지지 않았으며 그에 대한 기전 연구도 이루어지지 않은 실정이다. 따라서 본 발명자들은 상기 성분이 가지는 자외선에 의한 항산화 효소 활성과 인간 표피세포 및 진피세포 손상 억제에 대한 직접적인 기초 효능 연구를 수행하였다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 연구한 결과, 산수국(Hydrangea serrata) 추출물에서 유래한 하이드란제놀을 유효성분으로 함유하는 조성물이 인간 표피세포 및 진피세포에서 히알우론산(Hyaluronic acid) 및 프로콜라겐(Pro-collagen Type1)의 분비를 증가시켰다. 또한, MMP-1를 감소시킴으로서, UV-B에 의한 피부 손상을 억제해 피부개선효과를 나타낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

JP

0007546

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0029934

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따라서, 본 발명의 주된 목적은 산수국 추출물에서 유래한 하이드란제놀을 유효성분으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 하이드란제놀을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에 있어서, 상기 피부 손상은 자외선에 의한 인간 표피세포 및 진피세포의 손상인 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명의 실험예에서는 하이드란제놀이 자외선으로 손상된 표피세포 및 진피세포에서 손상된 세포를 증식 또는 복구하고, MMP-1의 생성을 감소시키고, 프로콜라겐 생성량 및 히알우론산 생성량을 증가시킴으로써 자외선에 의한 피부손상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과가 있음을 증명하였다.

본 발명에 있어서, 피부의 “손상”이란 자외선에 의한 인간 피부세포의 사멸, 피부 세포 DNA 손상, 활성산소종 증가, 지질과산화 증가 등을 포함하며, 그 증상으로는 홍반, 일광화상, 색소침착, 광노화, 피부암 등을 포함할 수 있다. 또한, 손상의“예방”은 상기 자외선에 의한 피부세포의 손상을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 손상의 “개선”은 상기 자외선에 의한 피부세포의 손상 상태의 완화 또는 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 손상의 “치료”는 상기 자외선에 의한 피부세포의 손상 상태를 복구하여 정상적인 피부 상태를 유지하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 손상의 “개선”은 넓은 의미로 “치료”를 포함하는 개념으로 이해된다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드란제놀은 시중에서 화합물을 구입하여 사용할 수도 있으며, 천연물에서 분리 정제하여 사용할 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명은 산수국(Hydrangea Serrata) 추출물에서 분리한 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다. 산수국은 산수국 전체, 목본의 뿌리, 줄기, 가지, 잎, 종자 또는 열매로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 잎이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 산수국 추출물은 종래에 천연식물을 추출하기 위하여 이용된 열수추출, 용매추출, 증류추출, 초임계 추출 등 어떠한 추출방법으로도 추출될 수 있으며, 바람직하게는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출되는 것을 특징으로 한다. 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 예컨대 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 및 부탄올 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 에탄올이 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 발효주정이 사용될 수 있다(실시예 1 참조).

본 발명에 있어서, 하이드란제놀은 산수국 추출물의 분획물인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 산수국 에탄올 추출물을 가지고 이온교환 크로마토그래피 (예컨대,Diaion HP-20) 과 크기배제 크로마토그래피 (예컨대, Sephadex LH-20)을 순차적으로 이용하여 분리 정제한 분획물이다(도 1 참조). 상기 분획은 메탄올에서 재결정하여 무정형의 화합물(hydrangenol)을 순수하게 수득하였다.

본 발명의 실시예에서는 산수국 추출물로부터 분리 정제한 물질에 대하여 질량분석 (ESIMS) 및 NMR 분석 (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT NMR, HSQC NMR, HMBC NMR)을 실시하여 하기 상기 화학식 1의 구조를 갖는 하이드란제놀이라는 것을 밝혀냈다.

[화학식 1]

본 발명에 있어서, 상기 하이드란제놀은 조성물 총 중량대비 0.0001 내지 10중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드란제놀은 자외선에 의해 손상된 피부세포를 증식시키고, MMP-1의 생성을 감소시키고, 프로콜라겐의 생성을 증가시키고, 히알우론산의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 자외선으로부터 자극된 피부의 보습 또는 주름개선용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명의 실시예에서 MMP-1의 생성을 감소시키고, 프로콜라겐의 생성을 증가시키고, 히알우론산의 생성을 증가시키는 효과는 본 발명의 조성물이 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용뿐만 아니라, 자외선으로부터 자극된 피부의 보습 또는 주름개선 용도로도 사용될 수 있다는 것을 알려준다

본 발명의 실험예에 따르면, 산수국 추출물에서 유래한 하이드란제놀이 피부의 UV-B노출에 의해 생기는 손상을 예방 및 개선할 수 있음을 알 수 있다(실험예 1 내지 4 참조).

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 정제, 과립제, 환제, 캡슐제, 액상형, 젤리 또는 껌으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형을 갖는 것으로서, 구강 섭취용 인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 유연화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 수분 크림, 스팟, 젤 로션 또는 연고로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형을 갖는 것으로서, 피부 외용제용 인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 산수국 추출물에서 유래한 하이드란제놀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 다양한 용도로 사용될 수 있으며, 예컨대 의약외품, 화장료 조성물, 약학적 조성물, 건강기능 식품 조성물 등으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 또는 희석제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘스테아레이트, 및 광물유 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적 하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 0.01μg/kg/일 내지 20,OOOμg/kg/일, 보다 구체적으로는 1μg/kg/일 내지 10,000μg/kg/일이다.

이상 설명한 바와 같이, 본원발명의 산수국 추출물에서 유래한 하이드란제놀을 함유하는 조성물은 UV-B노출에 의해 생성되는 MMP-1의 분비를 감소시키고, 히알우론산 및 프로콜라겐의 분비를 증가시킴으로써 자외선에 의한 피부노화를 방지하고 피부탄력을 유지시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 약학, 식품 또는 화장품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 산수국 잎으로부터 하이드란제놀의 분리정제과정을 도식화한 것이다.
도 2는 하이드란제놀의 ESIMS (positive-ion mode) 스펙트럼이다.
도 3은 하이드란제놀의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 4는 하이드란제놀의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.
도 5는 하이드란제놀의 DEPT NMR 스펙트럼이다.
도 6은 하이드란제놀의 HSQC NMR 스펙트럼이다.
도 7은 하이드란제놀의 HMBC NMR 스펙트럼이다.
도 8는 자외선으로 손상이 야기된 표피세포 및 진피세포에서 용매별 산수국 추출물의 세포 증식율을 비교한 그래프이다. (392-45A: 산수국, EGCG: 양성대조군, HaCaT: 표피세포, Hs68: 진피세포)
도 9는 자외선으로 손상이 야기된 표피세포 및 진피세포에서 하이드란제놀의 세포 증식율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 자외선으로 손상이 야기된 표피세포 및 진피세포에서 용매별 산수국 추출물의 MMP-1 억제효능을 비교한 그래프이다.
도 11은 자외선으로 손상이 야기된 표피세포 및 진피세포에서 하이드란제놀의 MMP-1 억제효능을 나타낸 그래프이다.
도 12는 자외선으로 손상이 야기된 진피세포에서 용매별 산수국 추출물의 프로콜라겐 생성량을 비교한 그래프이다.
도 13은 자외선으로 손상이 야기된 진피세포에서 하이드란제놀의 프로콜라겐 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 14는 자외선으로 손상이 야기된 표피세포 및 진피세포에서 용매별 산수국 추출물의 히알우론산 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 15는 자외선으로 손상이 야기된 표피세포 및 진피세포에서 하이드란제놀의 히알우론산 생성량을 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이러한 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 산수국 추출물 제조

본 발명의 조성물 중 산수국 추출물은 다음과 같은 과정에 의해 제조된다. 우선, 산수국 잎은 제주도에서 채집하여 4-5일 동안 건조시킨 후 세절하여 추출재료로 이용하였다. 세절한 산수국 25 g을 열수와 30%, 50%, 70% 에탄올 175mL(7배, v/v)을 사용하여 50℃에서 3시간 동안 환류 추출하였다. 추출에 의해 얻어진 물질은 상온에서 와트만(No 2.) 추출 용매 여과지를 사용하여 불용성 물질을 제거하였다. 그 후, 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 감압농축 하면서 용매를 완전히 제거하였다. 산수국 추출물을 완전히 건조 후 추출 수율을 측정한 결과 20%의 수율을 나타내었다.

실시예 2: 산수국 추출물에서 유래한 하이드란제놀 제조

실시예 1로 얻어진 70% 에탄올 추출물 5.66g을 Diaion HP-20을 이용하여 gel filtration을 실시하였다. 전개용매는 30%, 50%, 70%, 100% 메탄올과 CH2Cl2-MeOH(1:1, v/v)의 혼합용액을 각각 2L씩 사용하여 용매분획 하였으며 5개의 소분획(392-70EDia1~5)으로 나누었다. 소분획 392-70EDia4(357.4mg)는 Sephadex LH-20을 사용하여 메탄올을 전개용매로 하여 7개의 소분획(392-70EDia4a~4g)으로 나누었고, 이중 392-70EDia4d 분획은 메탄올에서 재결정하여 무정형의 화합물 1(hydrangenol) 31.1mg을 순수하게 수득하였다.

상기 실시예 2의 구조를 확인하기 위하여, 먼저 ESIMS (positive-ion mode)를 확인한 결과 m/z = 257 [M+H]+로 나타났다(도 2 참조). ¹H-NMR(도 3참조)에서, 고자장에서 나타나는 δH 5.50에서의 methine proton(H-3)과 δH 3.30과 3.06에서의 methylene proton(H-4)이 서로 vicinal coupling한다는 점과 chemical shift 값으로 C ring에서 기인하는 proton이라는 것을 알 수 있었다. B-ring의 p-substituted benzene ring에서 기인하는 H-2′, 3′과 H-6′, 5′은 서로 ortho coupling하여 doublet(J = 8.4 Hz)으로 나타나고, H-2′과 H-6′의 피크와 H-3′과 H-5′의 피크들도 서로 ortho coupling을 하여 doublet으로 나타나 hydroxy기를 중심으로 서로 대칭구조임을 알 수 있었다. A-ring의 1,2,3-trisubstituted benzene에서는 H-5와 7번 수소는 각각 H-6 수소와 coupling하여 H-5와 7번 수소는 ortho coupling으로 doublet, H-6 proton은 ortho 와 meta coupling으로 double of doublets로 나타나며, 모두 하나의 수소에 해당하는 피크임을 알 수 있었다.

13C-NMR에서(도 4 참조)는 para-치환체를 포함하여 총 15개의 피크가 나타나고 있었다. δC 172에서의 quarternary 탄소는 화합물 1번 탄소인 carbonyl group에서 기인한 피크이며, δC 116.9(C-3′,5′)과 129.6(C-2′,6′)는 aromatic ring의 파라 치환체에서 기인한 피크이며, δC 36.1과 83.1의 피크는 각각 aliphatic carbon과 oxygenated carbon에서 기인한 것을 예상할 수 있었다. 또한 DEPT NMR(도 5 참조)에서는 7개의 protonated carbons을 확인할 수 있었으며, δC 36.1의 피크는 C-4에서 기인한 methylene group임을 알 수 있었다. 이들의 정확한 구조를 분석하기 위하여 2D NMR을 분석하였다. HSQC(도 6 참조)로부터 피크들의 정확한 위치를 동정하였으며, HMBC(도 7 참조)로부터 치환기가 결합된 위치를 알 수 있었다. 즉, δH 7.26 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2′,6′)의 피크는 δC 36.1의C-4와 상관관계가 나타나고 H-4에서 기인한 δH 3.06과 3.30의 피크들은 δC 83.1 (C-3), 119.8 (C-5), 110.0 (C-9), 142.2 (C-10)의 피크와 상관관계가 나타나고 있다. 이상의 결과를 종합하여 문헌과 비교하여 실시예 2가 하이드란제놀이라는 것을 확인하였다(Yoshikawa M., Matsuda H., Shimoda H., Shimada H., Harada E., Naitoh Y., Miki A., Yamahara J., Murakami N. Development of Bioactive Functions in Hydrangeae Dulcis Folium. V. On the Antiallergic and Antimicrobial Principles of Hydrangeae Dulcis Folium. (2). Thunberginols C, D, and E, Thunberginol G 3'-O-Glucoside, (-)-Hydrangenol 4'-O-Glucoside, and (+)-Hydrangenol 4'-O-Glucoside. Chem. Pharm. Bull. 1996, 44: 1440-1447).

실험예 1: 하이드란제놀의 UV-B에 의한 손상된 세포의 증식 확인

상기 실시예 1 및 실시예 2에서 얻은 시료에 대하여 UV-B에 노출시킨 피부세포의 손상을 복구할 수 있는지 측정하였다. 본 실험에서 표피세포로 HaCaT keratinocyte 및 진피세포로 HS68 fibroblast를 사용하였다. 자외선에 의한 피부세포 손상 예방 또는 개선의 효능이 있는지 확인하기 위해, 1.0 X 10⁴cells/well 의 농도로 각각의 세포들을 96-웰 플레이트 상에 24시간동안 부착시켜 안정화 시켰다. 이후 각 농도 시료를 처리한 배지로 교환하여 24시간동안 배양하였다. UV-B를 조사하기 위해, 기존 배지를 제거하고, PBS 세척을 한 후 15mJ/cm²으로 UV-B를 처리하였다. 이후 시료를 처리한 배지를 이용해 24시간 배양 후, MTT 어세이를 통해 세포 생존 정도를 측정하였다. MTT 어세이는 살아있는 세포의 미토콘드리아에 의해 환원된 MTT로부터 형성된 포마잔의 양을 측정하는 방법이다. 더 자세하게는, 5mg/ml MTT 용액을 50㎕ 씩 각각의 세포에 처리하고 4시간동안 배양한 후, 용액을 완전히 제거하고 DMSO로 용해시킨 플레이트를 540nm의 흡광도에서 측정하였다.

도 8에 도시된 것과 같이, 15mJ/cm²UV-B로부터 손상이 야기된 표피세포 및 진피세포에서 실시예 1의 모든 추출물이 세포독성을 나타내지 않았으며, 대부분의 추출물들에서 세포증식 효과를 확인하였다. 특히 진피세포에서는 양성대조군인 10μM의 EGCG(Epigallocatechin Gallate)와 유사한 세포 증식효과를 보였다. EGCG가 단일 물질인 것을 고려할 때, 실시예 1의 모든 추출물에서 자외선에 의한 피부 손상 개선에 더욱 효과적인 유효 성분이 있을 것이라고 판단했다. 도 9에 도시된 것과 같이, 15mJ/cm²UV-B로부터 손상이 야기된 표피세포 및 진피세포에서 실시예 2의 하이드란제놀은 세포독성을 나타내지 않았으며, 세포증식 효과를 확인하였다. 특히 10μM의 EGCG와 1μM의 하이드란제놀은 유사한 세포증식효과를 보였다. EGCG가 10μM이라는 것을 고려한다면, 낮은농도로도 우수한 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선 효능을 가진다는 것을 알 수 있었다.

실험예 2: MMP-1의 함량 분석

상기 실시예 1 또는 실시예 2에서 얻은 시료에 대하여 표피세포 HaCaT keratinocyte 및 진피세포 Hs68 fibroblast에서 MMP-1의 분비를 억제시킬 수 있는지 측정하였다. 물질처리에 따라 MMP-1이 감소할 수 있는지 확인하기 위해, 1.0 X 10⁵cells/well의 농도로 각각의 세포들을 24-웰 플레이트 상에 분주하고 24시간동안 안정화시켰다. 이후 각 농도 시료를 처리한 배지로 교환하여 24시간동안 배양하였다. UV-B를 조사하기 위해, 기존 배지를 제거하고, PBS 세척을 한 후 15 mJ/cm²으로 UV-B를 처리하였다. 이후 시료를 처리한 배지를 이용해 48시간 배양 후 상층액에서 MMP-1 Human ELISA Kit(ab100603, abcam, US)를 사용하여 MMP-1의 분비 정도를 측정하였다.

도 10에 도시된 것과 같이, 15mJ/cm²의 UV-B부터 손상이 야기된 표피세포 및 진피세포에서 실시예 1의 모든 추출물들이 MMP-1 생성을 농도 의존적으로 감소시켰다. 도 11에 도시된 것과 같이, 15mJ/cm²UV-B로부터 손상이 야기된 표피세포 및 진피세포에서 실시예 2의 하이드란제놀은 MMP-1 생성을 농도 의존적으로 억제시켰다. 특히 진피세포에서, 같은 농도의 하이드란제놀과 EGCG를 비교해 보았을 때, 하이드란제놀의 MMP-1 생성 억제 능력이 더욱 우수하다는 것을 알 수 있었다. 이로써, 실시예2가 자외선으로부터 생성되는 MMP-1 생성을 억제시켜 자외선으로 인한 피부 손상 개선에 효과적이라는 것을 확인하였다.

실험예 3: 프로콜라겐 타입 1의 함량 분석

상기 실시예 1 또는 실시예 2에서 얻은 시료에 대하여 진피세포 Hs68 fibroblast에서 프로콜라겐 타입1을 증가시킬 수 있는지 측정하였다. 물질처리에 따라 프로콜라겐 타입1의 분비양이 증가할 수 있는지 확인하기 위해, 1.0 X 10⁵ cells/well의 농도로 각각의 세포들을 24-웰 플레이트 상에 분주하고 24시간동안 안정화시켰다. 이후 각 농도 시료를 처리한 배지로 교환하여 24시간동안 배양하였다. UV-B를 조사하기 위해, 기존 배지를 제거하고, PBS 세척을 한 후 15mJ/cm²으로 UV-B를 처리하였다. 이후 시료를 처리한 배지를 이용해 48시간 배양 후 상층액에서 Procollagen Type I C-peptide(PIP) EIA kit(Mk101, Takara, japan)를 사용하여 프로콜라겐타입1의 분비 정도를 측정하였다.

도 12에 도시된 것과 같이, 15mJ/cm²UV-B로부터 손상이 야기된 진피세포에서 실시예 1의 모든 추출물이 프로콜라겐 생성량을 증가시켰다. 특히 50% 및 70% 추출물은 단일물질인 EGCG보다 프로콜라겐 생성 효능이 우수했다(도 12-b 참조). 이러한 점을 고려하였을 때, 실시예 1의 모든 추출물에 피부 탄력에 더욱 효과적인 유효 성분이 있을 것이라고 판단했다. 도 13에 도시된 것과 같이, 15mJ/cm²UV-B로부터 손상이 야기된 진피세포에서 실시예 2의 하이드란제놀은 프로콜라겐 생성량을 증가시켰다. 특히 10μM의 EGCG와 1μM의 하이드란제놀은 유사한 프로콜라겐 생성 효과를 보였다. EGCG가 10μM이라는 것을 고려한다면, 낮은농도로도 우수한 프로콜라겐 생성 효과를 나타낼 수 있음을 확인했다. 이로써, 실시예 2가 프로콜라겐의 생성을 증가시켜 자외선으로부터 분해된 콜라겐 섬유들의 재생을 도와 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선한다는 것을 확인하였다.

실험예 4: 히알우론산(Hyaluronic Acid) 함량 분석

상기 실시예 1 또는 실시예 2에서 얻은 시료에 대하여 표피세포 HaCaT keratinocyte 및 진피세포 Hs68 fibroblast에서 히알우론산을 증가시킬 수 있는지 측정하였다. 물질처리에 따라 히알우론산 함량이 증가되는지 확인하기 위해, 1.0 X 10⁵cells/well의 농도로 각각의 세포들을 24-웰 플레이트 상에 분주하고 24시간동안 안정화시켰다. 이후 각 농도 시료를 처리한 배지로 교환하여 24시간동안 배양하였다. UV-B를 조사하기 위해, 기존 배지를 제거하고, PBS 세척을 한 후 15 mJ/cm²으로 UV-B를 처리하였다. 이후 시료를 처리한 배지를 이용해 24시간 배양 후, 상층액에서 TECO^ⓡ Hyaluronic Acid PLUS ELISA Kit(TE 1018-2, TECO medical Group, US)를 사용하여 히알우론산의 분비 정도를 측정하였다.

도 14에 도시된 것과 같이, 15mJ/cm²UV-B로부터 손상이 야기된 표피세포 및 진피세포에서 실시예 1의 모든 추출물이 히알우론산 생성량을 증가시켰다. 특히 진피세포에서 대부분의 추출물들이 가장 낮은 농도에서도 우수한 히알우론산 생성 효과를 보였다. 도 15에 도시된 것과 같이, 15mJ/cm²UV-B로부터 손상이 야기된 표피세포 및 진피세포에서 실시예 2의 하이드란제놀은 히알우론산 생성량을 증가시켰다. 특히 1μM의 하드란제놀에서 우수한 히알루론산 생성효과가 나타났다. 이로써 실시예 2가 히알우론산의 생성을 증가시켜 피부의 보습을 도와 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선한다는 것을 확인하였다.

제형예 1: 정제의 제조

상기 실시예 2에 대하여 통상의 정제 제조방법에 따라 하기 표 1의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.

원료명	단위중량 (mg)
실시예 2	10
옥수수 전분	100
유당	100
스테아린산	2

제형예 2: 캡슐제의 제조

상기 실시예 2에 대하여 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 하기 표 2의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 연질캡슐제를 제조한다.

원료명	단위중량 (mg)
실시예 2	2
비타민 E	2.25
비타민 C	2.25
팜유	0.5
식물성 경화유	2
황납	1
레시틴	2.25
연질캡슐충진액	387.75

제형예 3: 액제의 제조

상기 실시예 2에 대하여 기호에 적합한 음료 제조방법에 따라서 하기 표 3의 성분을 혼합하고 과병 또는 파우치에 충전하여 액제를 제조한다.

원료명	단위중량 (g)
실시예2	0.0205
산탄검	0.0075
프락토올리고당액	0.7500
코코넛꽃진액분말	1.0500
쌍화농축액	1.5000
홍삼향	0.0450
정제수	20.1425

제형예 4: 젤리의 제조

상기 실시예 2에 대하여 기호에 적합한 젤리 제조방법에 따라서 하기 표 4의 성분을 혼합하고 삼면포에 충전하여 젤리를 제조한다.

원료명	단위중량 (g)
실시예2	0.0200
푸드겔	0.3600
카라기난	0.0600
젖산칼슘	0.1000
구연산나트륨	0.0600
복합황금추출물	0.0200
효소처리스테비아	0.0440
프락토올리고당액	5.0000
적포도농축액	2.4000
정제수	13.9560

제형예 5 : 영양크림의 제조

상기 실시예 2에 대하여 영양크림을 통상의 방법에 따라 하기 표 5의 조성으로 제조하였다.

원 료	함 량 (%)
실시예2	0.01
시토 스테롤	4.0
폴리글리세릴 2-올레이트 3.0	3.0
세테아레스-4	2.0
콜레스테롤	3.0
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.0
선플라우어오일	22.0
카르복시비닐폴리머	0.5
트리에탄올아민	0.5
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

상기의 조성비는 일반적으로 적합한 성분을 혼합하여 제형예로 조성하였지만, 필요에 따라서 그 배합비 및 원료를 임의로 변경 실시하여도 무방하다.

본 발명의 추출물은 모든 제형예 시험 조건에서 안정하므로 제형의 안정성에는 문제가 없었다.

Claims

하기 화학식 1의 하이드란제놀을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
[화학식 1]
삭제
제1항에 있어서, 상기 하이드란제놀은 산수국(Hydrangea Serrata) 잎 추출물에서 분리한 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 하이드란제놀은 산수국(Hydrangea Serrata) 잎의 에탄올 추출물을 에탄올 혹은 메탄올 용매분획 한 후 재결정하여 수득한 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 하이드란제놀은 조성물 총 중량대비 0.0001 내지 10중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 하이드란제놀은 자외선에 의해 손상된 피부세포를 증식시키고, MMP-1(Matrix Metalloprotease-1)의 생성을 감소시키고, 프로콜라겐의 생성을 증가시키고, 히알우론산의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 자외선으로부터 자극된 피부의 보습 또는 주름개선용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
삭제
제1항, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 유연화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 수분 크림, 스팟, 젤, 로션, 연고로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
삭제