KR101454532B1

KR101454532B1 - 황칠나무 추출물 또는 상기 추출물 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101454532B1
Application number: KR1020130001478A
Authority: KR
Inventors: 최철희; 문영숙; 한주희; 이경인; 김현정
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2012-07-18
Filing date: 2013-01-07
Publication date: 2014-10-23
Also published as: US20150182571A1; KR20140011239A; US10130668B2

Abstract

본 발명은 전립선 비대증의 예방 및 치료제로서 황칠나무 추출물의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 황칠나무 추출물 및 상기 추출물로부터 분리 및 정제한 화합물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 조성물과 전립선 비대증의 예방 및 개선용 기능성 건강식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 황칠나무 추출물 및 상기 추출물로부터 분리한 화합물은 전립선 비대 효과를 유발시키는 안드로젠 수용체 시그럴닝을 억제하는 기전을 통해 전립선 비대증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 규명하였다. 따라서 본 발명에 따른 황칠나무 추출물 및 상기 추출물로부터 분리된 화합물은 전립선 비대증 및 전립선암을 예방, 치료 및 개선할 수 있는 의약품 및 기능성 식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

황칠나무 추출물 또는 상기 추출물 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 조성물{Composition for Preventing and Treating Benign Prostatic Hyperplasia Comprising an Extract or compound from Dendropanax Morbifera}

본 발명은 황칠나무 추출물 또는 상기 추출물 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

전립선비대증(BPH, Benign Prostatic Hyperplasia)은 남성에게 가장 흔한 질병중의 하나로, 최근 그 발병이 급속히 늘어나고 있다. BPH는 60대에서는 약 50%, 85세 이상이 되면 약 90%가 겪게되며 흔히 야간뇨, 지연뇨, 빈뇨, 뇨실금 등 하단부 요로장애(LUTS, lower urinary tract symptoms)가 발생하게 되고 반복적인 요로감염, 요로폐색 등이 오면 수술을 해야 된다(Bertaccini, Vassallo et al. 2001; Wei, Calhoun et al. 2005). 이처럼 BPH는 치명적인 질환은 아니나 삶의 질을 저하시킨다는 점에서 고령화 되어가는 현 사회의 중요한 의료문제로 대두되고 있다.

일반적으로 성인의 전립선의 크기는 ~ 20 g(± 6 g) 이나 비정상적인 상태가 되면 40 ~ 400 g까지 커질 수 있다(Foster 2000; Thorpe and Neal 2003). BPH는 전립선내에 정상세포의 수가 증가하여 비대해진 조직학적 질환(histologic disease)으로, 전립선이 비 정상적인 크기로 커지게 되면 가까이 있는 요로(proximal urethra)를 누르게 되어 LUTS를 초래하게 된다(Jacobsen, Girman et al. 2001; Thorpe and Neal 2003; Liu, Lee et al. 2006). 특히 BPH는 전립선 전이지역(prostatic transition zone), 근위 요도(proximal urethra)를 둘러싼 지역에 있는 간질세포(stromal cell)에 큰 변화가 생기게 되는데(Foster 2000; Committee 2003), 정상인 경우 2.7 : 1 의 비율인 반면 BPH 증상을 보이는 경우 간질세포와 상피세포의 비율은 4.6 : 1 이다 (Foster 2000). 이들 간질세포는 아드레날린 신경계(adrenergic nerve system)의 조절을 받아 성장이 조절되는데, 이와 관련한 α1a subtype receptor는 전립선 내부 간질조직(stromal tissue)에서 가장 많이 발견되는 adrenergic receptor로 알려져 있다(Foster 2000; Thorpe and Neal 2003).

한편, BPH가 발병하는 원인에 대하여 명확하게 밝혀지지는 않았으나, 노화에 따른 남성호르몬 변화로 인한 것으로 알려져 있다(Isaacs and Coffey 1989). 정상적인 전립선의 경우 상피세포(epithelial cell)와 간질세포(stromal cell)가 밀접하게 상호작용을 하여, 전립선의 성장(growth)과 퇴화(regression)가 유기적으로 조절되나, BPH의 경우 세포사멸이 더 적어 전립선의 부피가 커지게 된다. 특히 epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) 및transforming growth factor β(TGFβ) 등이 관련되어 있다는 보고가 있다. EGF나 TGF-β는 강력한 유사분열 촉진인자이며, 전립선조직이나 전립선 액에는 다량의 EGF가 포함되어 있어 남성호르몬(androgen)에 의한 전립선 비대는 EGF에 의해 매개된다고 여겨진다(Lee 1996). TGFβ도 BPH에 있어 증가되어 있는데 아마도 교질세포(matrix cell)가 평활근 세포(smooth muscle cell)로 분화하는데 관여하는 것으로 여겨진다(Klingler, Bretland et al. 1999). bFGF는 강력한 세포 유사분열 촉진 인자로 역시 BPH에 과발현되어 있다. bFGF는 간질세포와 상피세포 모두에서 생성되며, 아마도 BPH 병변의 가장 중요한 인자일 것이라고 보고되고 있다(Saez, Gonzalez-Baena et al. 1999).

테스토스테론과 이의 활성 형태인 5α-dihydroxytestosterone (DHT) 역시 BPH 에 중요한 요인으로 작용한다. DHT는 5α-reductase type 2에 의해 테스토스테론으로부터 형성되어, BPH에서 과발현되어 있는 많은 양이 발견이 되며, 테스토스테론과 DHT 모두 전립선내의 간질세포의 성장을 자극하는 것으로 보고되고 있다(Lee, Seong et al. 2001; Thorpe and Neal 2003). 이외에 최근에는 식이섭취, 운동, 대사성질환 등과 관련하여 BPH의 원인을 찾고자 연구가 많이 진행되고 있다(Parsons 2007).

이러한 BPH를 치료하기 위한 방법으로 임상적 치료방법은 초기에는 거의 수술을 수행하였는데, 80년대 후반부터는 약물 투여방법으로 급속도로 변화하고 있다(Milroy 1990). 현재 BPH 치료에 사용되는 약물에는 아드레날린성 알파수용체억제제(α-adrenergic receptor antagonists, α-blockers), 5α-리덕타제 (reductase) 억제제 및 피토테라피(phytotherapy)가 있다. 초기에는 증상을 완화하여 수술까지의 시간을 늦춘다는 개념으로 약물투여를 실시하여 각각 환자에 맞춰 적합한 약물을 선택하여 투여하는 모노테라피(monotherapy)를 수행하였으나, α-blockers 와 5α-reductase 억제제를 동시에 투여하는 병용 치료를 수행하기도 한다. 약물 α-blockers는 주로 증상 완화효과를 보이며 즉각적인 효과를 보이는 장점이 있고, 5α 리덕타제 억제제들은 즉각 효과를 보기는 어려우나 수반되는 질병진행을 장기간 늦추어주는 장점이 있다. 현재 사용되는 α-blockers로는 alfuzosin, doxazosin, tamsulosin, 및 terazosin이 있다. 4가지 모두 효능이 거의 같으나 부작용은 각각 다른 것으로 보고 되어있다(Committee 2003). α-blockers의 작용은 전립선과 방광경부에 많이 발현되는 α1-adrenergic receptor를 차단하는 역할을 한다. α1-adrenergic receptor를 차단하면 전립선 근육을 이완시켜, 배뇨와 다른 LUTS 증상을 완화시켜 BPH로 인한 방광의 기능장애를 없애주는 역할을 한다(Wykretowicz, Guzik et al. 2008). 이 약물의 가장 흔한 부작용으로는 어지러움증, 무기력증, 코 충혈 및 기립성 저혈압 등이 있다(Committee 2003). 5α-reductase 억제제로 사용하는 dutasteride와 finasteride는 α-blockers 와는 다른 기전으로 작용한다. Dutasteride 는 5 α-reductase type 1 (주로 피부와 간에서 발현)과 type 2(생식기관에서 주로 발현) 모두에 억제작용을 하며, 반면 finasteride 는 type 2만 억제시킨다. 이러한 약물의 작용기전은 5 α-reductase 와 경쟁적으로 작용하여 DHT 형성을 억제하는 작용을 한다. 전립선의 비정상인 성장은 DHT의 양에 의존하므로 DHT의 양을 줄이면 점차 전립선의 크기는 줄어들게 되어 BPH 관련된 질환을 예방할 수 있게 된다(McConnell, Roehrborn et al. 2003). 그러나 이 약물을 이용하여 전립선의 크기를 줄여, 수반되는 질환이 호전되기까지는 적어도 2개월 에서 1년 정도 치료가 필요하다는 문제점이 있다(Gormley, Stoner et al. 1992; Kirby, Bryan et al. 1992; Roehrborn, Boyle et al. 2002). 또한 부작용으로 발기부전, 성욕감퇴 , 사정장애 및 남자의 유방 이상비대 등이 있게 되며, 복용중단 후 3개월이 지나면 치료 전 수준으로 돌아가게 된다. 현재 많이 복용되는 finasteride 사용시 전립선의 크기가 > 40 g 일 때 훨씬 효과가 있다는 보고들이 있어서 이 약물의 처방시에는 전립선 암의 screening factor 로 사용하는 PSA (prostate specific antigen) 를 사전에 test 하여 처방한다. 그리고 전립선의 크기가 >40 g 이상이며 PSA 가 > 4 ng/mL 인 경우 병용 치료를 하면 훨씬 효과적이라고 한다(Committee 2003).

이외에 BPH 치료에 식물유래 대체의약품들의 사용이 많이 시도되고 있는데 대표적인 것으로 쏘팔메토(saw palmetto), 호박 씨앗(pumpkin seeds), 쐐기풀 뿌리(nettle root) 등이 있다.

이처럼 전립선비대증의 중요성 만큼이나 많은 치료 약물들이 있으나 그 효능에 한계점이 있고, 안드로젠 시그날링을 억제할 경우 발기부전 등의 부작용이 문제가 될 수 있으므로 부작용이 적고 근본적인 치료효과를 보이는 새로운 치료제의 개발이 시급하다.

발기부전의 예방 및 치료방법중의 하나가 프로스타그란딘의 혈류증진효과를 이용하는 것이다 (Wolfson B, Pickett S, Scott NE, DeKernion JB, Rajfer J. 1993 Jul;42(1):73-5; Karabulut A, PeL, OzkardeH, AltuU, Erol D. Urol Int. 2001;67(2):160-2). 15-PGDH는 안드로젠 의존성 전립선암세포주인 LNCaP세포에서 테스토스테론과 DHT에 의해 시간 및 농도 의존적으로 유도되었으나, 안드로젠 비의존성 전림선암세포주 PC3 cells에서는 이러한 결과가 관찰되지 않았다(Tong M, Tai HH. 2000 Sep 16;276(1):77-81). 그러므로 안드로젠 시그날링을 억제하는 물질이 15-PGDH의 발현이나 활성을 억제하여 프로스타글란딘 E2을 증가시켜 남경의 혈류를 증가시킬 수 있다면 발기부전의 부작용을 줄여줄 가능성이 높을 것이다.

이에 본 발명에서는 황칠나무 추출물이 안드로젠 의존성 전립선 암 세포주인 LNCaPFGC에서 항 안드로젠 효과가 있음을 확인하였고, 또한 안드로젠 수용체의 타겟 유전자인 15-PGDH의 발현을 억제함으로써 프로스타글란딘 E2를 증가시켜 남경의 혈류를 증가시킬 수 있는 장점으로 발기부전의 부작용을 줄여줄 가능성이 높다고 착안하여, 최종적으로 테스토스테론으로 유도된 BPH 동물모델에서 황칠의 헥산 추출물 또는 상기 추출물 유래의 화합물을 또는 상기 추출물 유래의 화합물에 의한 BPH 치료 및 예방 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 318,019

그러므로 본 발명의 목적은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 황칠나무 추출물로부터 분리 및 정제한 9,16Sdihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid, 9,16Rdihydroxy 10,17octadecadiene12,14diynoic acid 또는 (9Z)16hydroxy9,17 octadecadiene12,14diynoic acid 화합물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 황칠나무 추출물, 상기 황칠나무 추출물로부터 분리 및 정제한 9,16Sdihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid, 9,16R- dihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid 또는 (9Z)16hydroxy 9,17octadecadiene12,14diynoic acid 화합물을 유효성분으로 포함하는 전립선암의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 황칠나무의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로부터 가용한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비극성용매 가용 추출물은 헥산, 클로로 포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 5α-리덕타아제 발현 억제 또는 안드로겐 수용체(AR) 발현 억제 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 황칠나무 추출물은 9,16Sdihydroxy 10,17 octadecadiene12,14diynoic acid, 9,16Rdihydroxy10,17octadecadiene 12,14diynoic acid 또는(9Z)16hydroxy9,17octadecadiene12,14 diynoic acid 화합물을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은, 9,16Sdihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid, 9,16Rdihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid 또는 (9Z) 16hydroxy9,17octadecadiene12,14diynoic acid 화합물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 황칠나무의 헥산 추출물로부터 분리 및 정제된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 PSA (prostate specific antigen) mRNA 발현, 15-PGDH mRNA 발현, 5αR-1 (5α-reductase type 1) 및 5αR-2 (5α-reductase type 2) mRNA 발현을 억제 및 감소시키는 활성을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 9,16Sdihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid, 9,16R dihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid 또는 (9Z)16hydroxy- -9,17octadecadiene12,14diynoic acid 화합물을 함유할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

나아가 본 발명은, 황칠나무 추출물, 상기 황칠나무 추출물로부터 분리 및 정제한 9,16Sdihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid, 9,16R dihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid 또는 (9Z)16 hydroxy9,17octadecadiene12,14diynoic acid 화합물을 유효성분으로 포함하는 전립선암의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 조성물과 전립선 비대증의 예방 및 개선용 기능성 건강 식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 황칠나무 추출물은 전립선 비대 효과를 유발시키는 안드로젠 수용체 시그럴닝을 억제하는 기전을 통해 전립선 비대증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 규명하였고, 더불어 세포에 대해 독성을 유발하지 않아 세포 안전성을 갖는다는 사실을 규명하였다. 따라서 본 발명에 따른 황칠나무 추출물은 전립선 비대증을 예방, 치료 및 개선할 수 있는 의약품 및 기능성 식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 황칠나무 추출물을 제조하는 일 공정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 MTT 분석에 의한 LNCaPFGC 세포에서의 황칠나무 추출물의 세포 독성 평가 그래프이다.
도 3은 LNCaPFGC 세포에서 황칠나무 추출물의 PSA (prostate specific antigen) mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 LNCaPFGC 세포에서 황칠나무 추출물의 5α-R 1/2 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5는 LNCaPFGC 세포에서 DMHE 및 플루타미드의 AR, 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (15-PGDH) 및 PSA mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 LNCaPFGC 세포에서 AR 및 DHT에 의해 유도되는 이들의 타겟 유전자 (15-PGDH 및 PSA) mRNA의 과발현에 미치는 DMHE 농도-의존적 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 DMHE에 의한 AR의 타겟 유전자인 PSA mRNA 억제 효과가 고농도의 DHT에 의하여 회복되는 효과를 보여준 그래프로 AR 에 대하여 DHT 와 경쟁적으로 억제함을 보여준 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에서 제작한 전립선 비대증 동물모델의 전립성 비대 정도를 육안으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 9는 전립선 비대증이 유발된 마우스 모델을 대상으로 본 발명의 황칠나무 추출물 처리에 따른 전립선의 크기 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 LNCaPFGC 세포를 대상으로 본 발명의 황칠나무 추출물 처리에 따른 안드로겐 수용체의 전사 활성도를 루시퍼라제 어세이를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 전립선 비대증이 유발된 마우스 모델을 대상으로 본 발명의 황칠나무 추출물 처리에 따른 상기 마우스 혈액 내의 PSA 농도를 측정하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에서 황칠 헥산 추출물을 대상으로 HPLC 크로마토그래프 분석을 통해 단일 화합물을 분리한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 황칠 헥산 추출물로부터 전립선 비대증 치료 효과를 갖는 3가지 단일 화합물을 분리 및 정제하는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명에 따른 황칠 헥산 추출물과 상기 추출물 유래의 3가지 단일 화합물을 대상으로 전립선 암 세포주(LNCaP·FGC)에서의 PSA mRNA 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명에 따른 황칠 헥산 추출물과 상기 추출물 유래의 3가지 단일 화합물을 대상으로 전립선 암 세포주(LNCaP·FGC)에서의 15-PGDH mRNA 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 황칠 용매 추출물과 황칠 헥산 추출물로부터 분리한 3가지 단일 화합물을 대상으로 전립선 암 세포주(LNCaP·FGC)에서의 5aR-1 mRNA 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 황칠 용매 추출물과 황칠 헥산 추출물로부터 분리한 3가지 단일 화합물을 대상으로 전립선 암 세포주(LNCaP·FGC)에서의 5aR-2 mRNA 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 안드로젠 리셉터 발현 세포주로 AR 시그럴닝연구에 사용하는 HFDPC (human hair dermal papilla cell)를 대상으로 본 발명의 황칠나무 헥산 추출물의 농도별 처리에 따른 5αR1의 mRNA 발현정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다(Min: 미녹시딜 처리 군, DMHE: 본 발명의 황칠나무 헥산 추출물 처리군).
도 19은 HFDPC (human hair dermal papilla cell)를 대상으로 본 발명의 황칠나무 헥산 추출물의 농도별 처리에 따른 5αR2의 mRNA 발현정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다(Min: 미녹시딜 처리 군, DMHE: 본 발명의 황칠나무 헥산 추출물 처리군).
도 20은 HFDPC (human hair dermal papilla cell)를 대상으로 본 발명의 황칠나무 헥산 추출물의 농도별 처리에 따른 안드로젠 수용체(AR)의 mRNA 발현정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다(Min: 미녹시딜 처리 군, DMHE: 본 발명의 황칠나무 헥산 추출물 처리군).
도 21은 HFDPC (human hair dermal papilla cell)를 대상으로 본 발명의 황칠나무 헥산 추출물의 농도별 처리에 따른 15-PGDH의 mRNA 발현정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다(Min: 미녹시딜 처리 군, DMHE: 본 발명의 황칠나무 헥산 추출물 처리군).

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"추출물"은 황칠나무의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.

"조추출물"은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 메탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 메탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

"극성용매 가용 추출물"은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 물 또는 메탄올, 보다 바람직하게는 메탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

"비극성용매 가용 추출물"은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는, 헥산 또는 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물을 포함한다.

"약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 본 발명의 황칠나무 추출물과 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다.

"담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.

"희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.

"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명은 황칠나무 추출물의 용도에 관한 것으로, 황칠나무 추출물이 내포하고 있는 특정 생리활성 및 기능의 발휘에 관한 것이다.

황칠나무(Dendropanox morbifera LEV.)는 두릅나무에 속하는 상록 활엽교목으로 우리나라의 제주도와 완도, 보길도, 해남 등 남ㆍ서해안 일대에 자생하고 있는 우리나라 특산 수종이다. 황칠나무에 함유된 정향성분은 소량의 터펜(Terpene)류와 다량의 세스퀴터펜(Sesquiterpene)류가 포함되어 있는데, 채취시기나 장소에 따라서 차이가 있지만 germacrene-d, β-selinene,α-amorphene, α-selinene, δ-cadinene,γ-cadinene, T-muurolol, β-elemene, bicyclo [4,4,0] dec- 1 -en - 2 - isopropyl - 5 - methyl - 9-methylene, β-cadinene, germacrene-B, α-copaene, α-humulene, α-cadinene과 소량의 linalool L, α-terpinene, α-cubebene, α-ylangene,(+)-calarene, 3,7-guaiadine, (-)-isoledene, β-cubebene, limonene, aromadendrene, cadina-1,4-diene 등이 함유되어 있다(Jeollanam do, 1996).

본 발명에서 사용할 수 있는 황칠나무의 부위는 잎, 줄기, 수피 등 제한이 없으나, 바람직하게는 잎을 사용할 수 있다.

황칠나무 추출물은 당업계에 알려진 방법, 이의 변형된 방법 또는 본 발명에 의한 방법으로 제조하여 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 이하와 같은 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명의 황칠나무 추출물 또는 조추출물은 황칠나무 중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배 부피량 (w/v%)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 에탄올을 가하여, 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 10 내지 60 시간, 바람직하게는 30 내지 50 시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 또는 가열추출법 등의 추출방법으로, 바람직하게는 열수추출법으로 추출한 후 여과하고 감압 농축하여 본 발명의 황칠나무 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 50~100% 에탄올 조추출물 중량의 약 1 내지 150배, 바람직하게는 5 내지 100배 부피(w/v%)의 물을 분산시킨 후, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 물의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 1 내지 5배의 부피를 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 본 발명의 극성 용매 및 비극성용매 가용 추출물을 수득할 수 있다. 바람직하게는 헥산 추출물을 수득하여 사용할 수 있다.

상기 추출물들의 농축액을 -80℃ 동결건조 혹은 50℃ 진공감압을 통하여 분말상태로도 얻을 수 있다.

본 발명은 상기 황칠나무 추출물을 제조하는 방법을 포함한다. 상기 제조방법은 그것의 예시적인 방법에 지나지 않으며, 당해 분야의 기술에 근간한 다양한 방법들에 의해 적절히 변형시켜 사용할 수 있다.예를 들면, 본 발명에 따른 비-예시된 추출방법은 당분야의 숙련가에게 명백한 변형에 의해 성공적으로 수행될 수 있다.

본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명에 따른 황칠나무 추출물의 제조를 위한 구체적인 반응조건 등을 추후 설명하는 실시예들을 통해 확인할 수 있으므로, 그에 대한 자세한 설명은 생략한다.

한편, 발명은 본 발명의 황칠나무 추출물이 AR의 단백질 합성을 억제하는 항 안드로겐 특성을 가지고 있음을 규명하였는데, 즉 본 발명의 황칠나무 추출물은 AR 시그널링 억제에 관여하고 있는 것으로 확인되었다. 5α-리덕타제는 테스토스테론을 5α디하이드록시테스토스테론(DHT)로 전환시켜 AR 에 대한 시그널링을 가속화시키는 중요한 효소이며, 5α-리덕타제 억제제는 전립선 비대증 치료제로 사용되고 있다.

이러한 점에서 볼 때, 본 발명의 황칠나무 추출물은 5α-리덕타제 1, 2 와 AR 유전자 발현감소 및 AR 수용체 차단에 의한 AR 시그널링을 억제시키며, 특히 과다 합성된 DHT는 전립선 세포에 있는 AR에 결합하여 전립선 비대, 더 나아가 전립선 암을 유발하기도 하므로 따라서 본 발명의 황칠나무 추출물은 AR 시그널링을 억제시키는 기작을 통해 전립성 비대증을 예방 및 치료할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 황칠나무 추출물이 안드로젠 의존성 전립선 암 세포주인 LNCaPFGC에서 항 안드로젠 효과가 있음을 확인하였고, 안드로젠 수용체의 타겟 유전자인 15-PGDH의 발현을 억제함으로써 프로스타글란딘 E₂를 증가시킨다는 사실을 확인하였다.

안드로젠 신호 경로를 억제하는 안드로젠 억제제의 경우, 그 부작용으로 발기부전이 발생한다는 보고가 발표되고 있는데, 최근에 미국 보스턴 의과대학 비뇨기과전문의 압둘마게드 트라이시박사(Traish AM, 2011 Mar; 8(3):872-84)는 남성 호르몬인 안드로젠을 차단하여 전립선비대증을 치료할 수 있는 치료제인 Avodart (dutasteride)와 Proscar, Propecia(finasteride)가 발기부전을 유발할 수 있으며 일부 환자의 경우 약을 끊어도 발기부전이 회복되지 않을 수 있다고 하였다.

한편, 본 발명에 따른 황칠나무 추출물은 안드로젠 수용체의 타겟유전자인 15-PGDH의 발현을 억제하고 프로스타글란딘 E₂를 증가시켜 남경의 혈류를 증가시킬 수 있으므로 종래 문제시 되고 있는 발기부전의 부작용을 줄여줄 수 있는 특징이 있다.

또한, 본 발명의 황칠나무 추출물은 5α-리덕타제 유전자 발현을 억제하고, 안드로겐 수용체(AR)의 단백질 합성을 억제하며, 실험동물에서 독성을 나타내지 않으므로, 이러한 분자적 메커니즘을 기반으로 전립성 비대증 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

나아가 본 발명자들은 황칠나무 추출물이 갖는 전립성 비대증 질환 효과를 확인하고, 상기 추출물에 함유된 약리학적 활성 성분을 규명하기 위해 활성 성분을 분리 및 정제하였다.

그 결과, 본 발명의 일실시예에 의하면, 황칠의 헥산 추출물로부터 단일 화합물인 9,16Sdihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid (HS3)와 9,16Rdihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid (HS5) 및 (9Z)16hydroxy9,17octadecadiene12,14diynoic acid (HS7)을 분리 및 정제하였고, 상기 화합물들이 전립선 비대증 및 전립선 암과 관련된 신호전달 기작인 AR 시그널링에서 PSA mRNA의 발현을 억제하는 활성이 있음을 확인하였고, 15-PGDH mRNA의 발현 뿐만 아니라 1 5aR-1/-2 mRNA 발현 역시 모두 억제하는 활성이 있음을 확인하였다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 황칠 추출물 뿐만 아니라 상기 추출물에 함유된 9,16Sdihydroxy10,17 octadecadiene 12,14 diynoic acid (HS3)와 9,16Rdihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid (HS5) 또는 (9Z)16hydroxy9,17octadecadiene12,14diynoicacid (HS7) 화합물 역시 전립선 비대증을 치료할 수 있는 치료제 및 전립선 암 치료제로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있으며, 또한, 9,16S dihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid (HS3)와 9,16R dihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoicacid(HS5) 또는 (9Z)16 hydroxy9,17octadecadiene12,14diynoicacid(HS7) 화합물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

뿐만 아니라 본 발명은 상기 황칠나무 추출물 또는 상기 추출물 유래 분리 및 정제된 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 전립선 암의 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분인 황칠나무 추출물, 상기 HS3, HS5 또는 HS7 화합물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제, 주사 가능한 액제 등이 될 수 있으며, 또한, 요도내 크림(intraurethral cream), 직장용 좌약(rectal suppository)이나 경피용(percutaneous)제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 황칠나무 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 ~ 30 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 전립선 비대증 및 전립선 암을 예방 및 개선할 수 있는 기능성 식품 조성물로도 사용할 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 황칠나무 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 황칠나무 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 황칠나무 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 전립선 비대증을 개선 및 예방하기 위한 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

그러므로 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증 및 전립선 암을 개선 및 예방하기 위한 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 전립선 비대증 및 전립선 암을 개선 및 예방하기 위한 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 황칠나무 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 황칠나무 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 황칠나무 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 황칠나무 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 황칠나무 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 황칠나무 추출물을 투여하는 것을 포함하는 전립선 비대증 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 황칠나무 추출물, 또는 상기 추출물 유래의 본 발명의 화합물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 1㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 황칠나무 추출물 또는 상기 추출물 유래의 본 발명의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있으며, 또한, 요도내 크림(intraurethral cream), 직장용 좌약(rectal suppository)이나 경피용(percutaneous)제형으로 제조된 약제 형태로도 사용 가능하다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 또한, 각 실험들은 3번 이상 수행하였고, 각 데이터들을 평균 ± SE로 표시하였다. 통계적 유의성은 Student's t test에 의해 결정하였다. P < 0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실시예 1 : 황칠나무잎 추출물 제조

(1) 추출물 제조

한국 무안군(읍) 성암리에 위치한 곡우 농원에서 황칠 나무(Dendropanax morbifera)의 잎을 수득한 후 잎을 상온의 그늘진 곳에서 건조시켰다.

건조된 잎들을 상온에서 메탄올로 3회 추출하였다. 상기 메탄올 추출물을 와트만 넘버 1 여과지를 이용하여 여과하고, 상기 결합된 메탄올 추출물을 회전식 증발농축기로 진공에서 농축시켰다. 메탄올 추출물을 수 중 현탁시키고 이어서 헥산, 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트, n-부탄올 및 물로 극성에 따라 각각 분획하였다. 각 추출물들을 회전식 진공 증발농축기로 농축하였으며, 이러한 공정을 도 1에 도시하였다.

(2) 분획화 및 분리 공정

그래디언트 용매 시스템 [CHCl3 (0.1% HCOOH) 100% through CHCl3 (0.1% HCOOH) MeOH (0.1% HCOOH)/55:45 for 120 min]을 이용하여 Isolera Flash Purification system (BIOTAGE, Sweden)으로 헥산 추출물의 활성 유도 분획법(Activityguided fractionation)을 254 및 280 nm 하에 수행하여 10 분획을 수득하였고(DEE01DEE10), 각 분획을 그래디언트 MeCNH₂O (0.1% HCOOH) 용매 시스템에서 HPLC을 이용하여 모니터링하고 각 화합물을 검출하였다.

또한, UV광(254 nm)하에서 얇은 층 크로마토그래피에 의해 스팟들을 검출하거나 바닐린H₂SO₄ 으로 스프레이한 후 110℃로 가열하였다.

0.1% 포름산(30:70 → 100% MeCN)을 함유하는 MeCN/H₂O의 그래디언트 용매 시스템으로 SunFire™ Prep C18 (10 x 250 mm 및 19 x 150 mm, 5 μm) 컬럼을 이용하여 반복적인 semi-preparative HPLC 실험을 40분 동안 수행하고, 이러한 분획으로부터 주요한 성분들로서 화합물들을 최종적으로 분리하였다.

(3) 결과

추출 용매에 따른 황칠나무 추출물의 수율은 하기 표 1에 기재하였다.

추출 용매에 따른 황칠나무 추출물의 수율

용매	최종산물(g)	수율(%)
메탄올	230.1	13.6
n-헥산	34.6	2.1
에틸아세테이트	31.0	1.9
n-부탄올	46.6	2.8
물	98.4	5.8

추출 결과, 수율은 메탄올 추출물이 가장 높게 나타난 반면, 에틸 아세테이트를 이용한 수율은 다소 낮게 나타났다.

실시예 2 : 황칠나무잎 추출물의 세포 독성 및 항안드로젠 활성 분석

본 발명자들은 본 발명의 황칠나무의 잎 추출물이 세포에 대해 세포 안정성을 가지고 있는지와 항안드로겐 활성을 가지는지 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 세포 독성 실험을 위해 LNCaPFGC (androgendependent prostate cancer) 세포를, RPMI 배지로 37 ℃ 하 습한 5% CO₂ 배양기에서 배양하였고, 배지들은 10% 가열 불활성화된 FBS 및 100 μg/m L 페니실린으로 보충되어 있는 것을 사용하였다. 세포 생존능 평가는 MTT 분석(Mosmann, 1983)에 의해 수행하였는데, 96 웰 플레이트에 DMEM 배지 90 μL 당 LNCaPFGC 세포 (4 x 10⁴/mL)들을 씨딩하였다. 밤새 배양 후 , 황칠나무 추출물을 72시간 동안 처리하고, MTT (5 mg/mL stock solution) 10 μL로 4시간 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 DMSO 150 μL를 첨가하여 포마잔을 용해시켰다. ELISA microplate reader (PerkinElmer, Calif ornia, USA)을 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.

항안드로젠 활성 분석을 위해서는 LNCaPFGC 세포, 안드로겐-의존성 전립선 암세포주를 사용하였고, 전립선암에서 AR 표적 유전자 중 하나인 PSA(Prostate s pecific antigen)의 mRNA 수준을 측정하였다.

황칠나무 추출용매에 따른 LNCaPFGC 세포독성검사

용매	LNCaPFGC 세포에 대한 IC₅₀ (ug/mL)
메탄올	152
n-헥산	169
에틸아세테이트	88.3
n-부탄올	562
물	>800

그 결과, 도 2 및 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 황칠나무의 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올 및 물 추출물의 IC₅₀ 는 LNCaPFGC 세포에서 88 μg/mL ~ > 800 μg/mL로 나타났으며, 이는 본 발명의 황칠나무 추출물이 세포 생존능에는 치명적인 유해작용을 보이지 않는 정도임을 확인함에 따라 세포 독성을 가지지 않는다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3 : 안드로젠 수용체 시그럴닝 억제 효과

또한, 안드로젠(androgen)-의존성 세포인 LNCaPFGC 전립선암 세포주를 통하여 항안드로젠 활성에 미치는 영향을 분석한 결과, 본 발명의 황칠나무 추출물은 PSA mRNA의 DHT-유도된 발현을 저해하였고 저해 정도는 n-Hex, EA, n-But 및 H₂O 추출물 순으로 나타났고(도 3 참조), 플루타미드가 아닌 DMHE는 또한 DHT 합성에서 5αRI/2 효소를 감소시킴으로써, PSA 및 15-PGDH 발현을 포함하는 표적 유전자를 농도 의존적으로 감소시켰다(도 4 및 도 5 참조). 이는 다량의 DHT 첨가에 의해 억제되었고, 이러한 결과는 DMHE의 항안드로겐 효과가 AR상에서 DHT와 경쟁적인 기작으로부터 비롯됨을 시사한다(도 7 참조). 또한, AR의 DMHE 하향 조절된 유전자 발현 또한 플루타미드-처리된 세포에서 관찰되었다(도 5 참조).

안드로젠(androgen)-의존성 세포인 LNCaPFGC 전립선암 세포주를 통하여 확인된 황칠 추출물의 항안드로젠 효과를 다음과 같은 실험을 통해 다시 한번 확인하였는데, 즉, 안드로젠 리셉터(androgen receptor, AR)를 지니고 있어서 AR 시그럴닝 연구에 사용되는 세포인 Primary Human Follicle Dermal Papilla Cells (HFDPC) (Cat. No. C-12071, PromoCell)을 PromoCell (Heidelberg, Germany)에서 구입하여 사용하였고, 이것은 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)에 양성반응으로 염색된다. 본 실험에 사용된 primary HFDPC은 모두 34 passage를 거친 것이며, Follicle Dermal Papilla Cell 성장 배지(C-26501, PromoCell, Germany)를 이용하여 5% CO₂ _, 수분 공급된 37˚C 배양기에서 배양하였다. 배양된 HFDPC (5 x 10 ⁵/ 6 well)을 종분하여 세포가 부착한 뒤 본 발명의 DMHE을 24 시간 투여하였다. 그 후 세포내 AR 타겟 유전자인 15-PGDH 및 테스토스테론을 DHT 로 전환하여 AR 에 대한 민감도 증폭에 관여하는 5αR-1 및 5αR-2 및 AR 의 mRNA 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과, 본 발명의 황칠 추출물은 5αR-1, 5α-R2, AR 및 15-PGDH 의 발현 억제하는 것으로 나타났다(도 18 - 도 21).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 황칠나무 추출물이 AR 시그럴닝의 과활성화로 발생하는 전립선 비대증의 발병 기전을 억제할 수 있는 우수한 효능을 지닌 물질로서 전립선 비대증의 치료에 쓰일 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

실시예 4 : In vivo 실험을 통한 황칠나무 추출물의 전립선 비대증 치료 효과 분석

본 발명자들은 앞서 수행한 황칠나무 추출물의 전립선 비대증 치료 효과를 in vitro에서 확인하였고, 나아가 전립선 비대증이 유발된 동물 모델을 제작 후, 이를 대상으로 황칠나무 추출물의 전립선 비대증 치료 효과를 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다.

먼저 실험에 사용한 동물은 11주령의 수컷 Sprague Dawley 계 쥐로 Damul Science Co. (대전, 한국)로부터 구입하였다. 고형사료와 물은 상시 공급하고 1주 동안의 실험실 환경에 적응 기간을 거친 후 실험에 사용하였으며, 본 동물실험은 전남대학교 동물실험 윤리위원회(IRB)의 승인(CNU IACUC-YB-R-2012-9)을 얻어 수행하였다.

<4-1> 전립선 비대증 마우스 동물모델 준비

수컷 Sprague Dawley 계 쥐를 대상으로, 다음과 같이 각 군을 나누었는데, 실험군인 vehicle control 군 (V-CTL), 테스토스테론만 투여한 군(TP-CTL)과, 테스토스테론에 양성대조군으로 finasteride를 투여한 군(TP + FS) 과 황칠을 투여한 군(TP + DMH)으로 나누어 실험을 수행하였고, 각 그룹당 n = 4 로 하였으며, 전체적인 실험수행 과정은 표 3과 같다. 2주일동안 테스토스테론을 피하주사로 투입하여 전립선 비대를 유발하였고 2주일 후 적출을 통하여 전립선 비대가 충분히 유발되었음을 확인한 후, 계속적인 테스토스테론을 주입하여 전립선 비대 상황을 유지하면서, 매일 본 발명의 황칠나무 추출물을 경구 투여하여 전립선 비대 진행이 억제되는지 확인하였다. 이때 양성대조군으로 finasteride (2 mg/kg/day)를 사용하였고, 황칠추출물의 경우 2 그룹으로 (0.5와 2 mg/kg) 나누어 약물을 투여하였다. 약물 투여 3주일이 지난 후 쥐를 희생하여 그 결과를 관찰하였다.

전립선 비대증 동물모델의 전반적인 실험 스케줄

Group 0 day 14 day 35 day
V-CTL	Corn oil (s.c.)/day	Corn oil (s.c.)/ day + CMC (p.o.)/day
TP-CTL (3 mg/kg)	TP(s.c.)/ day	TP (s.c.)/ /day + CMC (p.o.)/day
TP +FS (2 mg/kg)	TP(s.c.)/ day	TP (s.c.)/ day + Fina (p.o., 2 g/kg)/day
TP + DMHE (0.5 mg/kg)	TP(s.c.)/ day	TP (s.c.)/ day + DMH (p.o., 0.5 mg/kg)/day
TP + DMHE (2 mg/kg)	TP(s.c.)/ day	TP (s.c.)/ day + DMH (p.o., 2 mg/kg)/day

V, vehicle 투여군; CTL, 대조군(control); TP, testosterone-propionate 투여군; FS, finasteride 투여군; DMHE, Dendropanax morbifera hexane extracts 투여군; CMC,carboxymethylcellulose 투여군.

2주 동안 TP를 피하주사로 매일 투여하여 전립선이 비대해 지도록 유도하였고, 2주 지난 후 vehicle 대조군과 TP 대조군을 해부하여 전립선 비대가 제대로 유도되었는지 확인하였는데, 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 전립선의 크기는 대조군에 비하여 189%의 크기로 비대해져 있는 것으로 확인되었다.

<4-2> 전립선 크기, 체중당 전립선 비율의 변화 분석

앞서 기술한 실험 스케줄에서 마지막 투여가 끝난 다음 날 체중 측정을 한 후, 희생을 하여 채혈 및 전립선을 적출하였다. 적출된 전립선은 주변의 지방 및 이물질을 깨끗이 제거한 후 무게를 측정하였고, 체중당 전립선의 무게 비율은 다음 식을 이용하여 계산하였고, 결과를 표 4에 나타내었다.

Prostate weight (g) /body weight (g) x 100

전립선 유발 모델에서 약물의 투여가 전립선에 미치는 영향

그룹	전립선 무게	%전립선/체중 (w/w)	%V-CTL 비율	%TP-CTL 비율
V-CTL	0.55 ±0.04	0.12 ±0.008	100.0 ±6.2
TP-CTL	1.22±0.12	0.30 ±0.019	249.9 ±19.4	100.0 ±7.8
TP+ FS (2 mg/kg)	0.95 ±0.12	^*0.22 ±0.018	185.7 ±15.1	74.3 ±3.2
TP + DMHE (0.5 mg/kg)	1.14 ±0.06	0.27 ±0.021	226.6 ±17.6	90.7 ±7.0
TP + DMHE (2 mg/kg)	1.03±0.07	^*0.24 ±0.019	203.9±15.9	81.6±6.3

V, vehicle 투여군; CTL, 대조군(control); TP, testosterone-propionate 투여군; FS, finasteride 투여군; DMHE, Dendropanax morbifera hexane extracts 투여군. P < 0.05.

분석 결과, 실험이 끝난 지점인 TP 5주간 투여에 의해 V-CTL 대비 TP-CTL의 경우, 전립선의 크기는 249 % 로 증가하였다. 이렇게 커진 전립선의 약물에 의한 무게 감소는, FS 처치군(3 mg/kg/day)과 황칠나무 추출물 처치군 (2 mg/kg)에서 TP-CTL와 비교할 때, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(P < 0.05). 체중을 고려한 무게 비의 경우 TP-CTL에 대비하였을 때, FS 그룹이 74.3% 크기로 작아지는 효과를 보였으며, 황칠나무 추출물을 0.5 mg/Kg과 2 mg/Kg을 투여한 군에서는 각각 90.7%와 81.6%로 각각 작아지는 것으로 나타났다(도 9 참조).

<4-3> 혈액 중 PSA ( prostate specific antigen )의 함량 분석

상기 실시 예에서 사용한 희생 쥐로부터 혈액 중 혈장을 분리하고 PSA 함량을 측정하였다. PSA 측정은 ELISA(MyBiosource, Arizona, USA)를 이용하여 제조자의 실험방법대로 수행하였으며 pg/mL 함량으로 표시하여 나타내었다.

전립선 비대를 유도한 쥐의 혈액 내 PSA 농도에 미치는 DMHE 의 효과

샘플	PSA (pg/mL)	% Vehicle control	% T P control
TP (3 mg/kg)	931.3 ± 166.6	54.2 ± 9.8	100
TP + FS (2 mg/kg)	^*323.0 ± 85.0	18.7 ± 5.0	34.6
TP + DMHE (0.5 mg/kg)	818.0 ± 220.0	47.7 ± 12.8	87.9
TP + DMHE (2 mg/kg)	^*404.3 ± 353.3	23.5 ± 20.6	43.4

TP:testosterone propionate, FS: finasteride, DMHE: D. morbiafera hexane extract. P < 0.05.

그 결과, 상기 표 5 및 도 11에 나타낸 바와 같이, TP만 투여한 군(3 mg/kg)에 비하여 황칠 헥산추출물(DMHE)을 처치한 군에서 PSA 농도는 DMHE (0.5 mg/kg)이 87.9%, DMHE (2 mg/kg) 군에서는 43.4%로 각각 나타났으며, 이러한 결과는 양성대조군으로 전립선비대치료제로 쓰이는 FS (finasteride) (2 mg/kg)가 34.6% 의 PSA 농도를 나타내 보인 것과 비교할 때 치료 효과가 매우 큰 것으로 나타났다.

실시예 5 : 안드로젠 수용체 전사 활성에 미치는 황칠추출물의 영향 분석

안드로젠 수용체(AR)의 전사 활성에 황칠추출물이 직접적으로 영향을 미치는지 알아보기 위해 리포터 유전자 어세이를 수행하였다. AR 수용체 리포터 유전자 어세이는 Cignal ^TMReporter assay kit (Qiagen, CA, USA)를 이용하였다. GFP 구조물을 함유한 복합물을 이용하여 안드로젠 의존성 세포인 LNCaPFGC에 Polyplus transfection reagent (Polyplus, New York, USA)를 사용하여 트랜스팩션 조건을 잡은 다음, 정상적으로 리포터 유전자가 활성화 되는 것을 확인한 후, 이후 실험을 수행하였다. LNCaPFGC 세포를 25x10⁴ /12well에 분주한 후 AR 리포터(100 ng), 음성 대조군(100 ng)를 각각 트랜스팩션한 후, 16 hr 때에 배지를 어세이 배지(Opti-MEM + 1% FBS + 0.1 mM NEAA)로 바꾸고, 트랜스팩션 후 24 시간 되는 때에 효능(agonistic) 활성도를 측정하기 위해 DHT를 처치하였다. 또한 황칠 추출물에 의한 길항(antagonistic) 활성 측정을 위하여, DHT 와 동시에 여러 가지 농도의 DMHE를 처치하여 18 hr 동안 배양 후 세포를 수득하였다. 수득한 세포들은 PBS (pH 7.4) buffer 로 3회 씻은 후 passive lysis buffer (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 용해하였다. Cell lysates는 96 well plate luminometer(Berthold Detection system, Pforzheim, Germany)를 사용하여 바로 분석하였다. Firefly luciferase 와 Renilla luciferase 의 양은 Dual-luciferse 리포터 어세이 시스템 키트(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 분석하였다. 각 실험군의 루시퍼라제 값은 Renilla 루시퍼라제 활성으로 정상화 하여 상대적인 전사 활성인 fold 값으로 나타내었다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, DHT에 의하여 활성화된 AR 수용체 리포터 유전자는 DMHE 농도 의존적으로 전사 활성이 억제됨을 알 수 있었다. 따라서 황칠추출물에 의한 LNCaPFGC 세포의 타겟 유전자인 PSA의 mRNA 감소가, AR 유전자의 길항효과에 의한 억제임을 다시 한번 확인할 수 있었다.

실시예 6 : 황칠 헥산 추출물로부터 전립선 비대증 치료 효과를 갖는 화합물의 분리 및 동정

본 발명자들은 상기 실시예들을 통해 황칠 헥산 추출물이 전립선 비대증을 치료할 수 있는 효과가 있음을 알 수 있었고, 이에 상기 황칠 헥산 추출물로부터 전립선 비대증을 치료할 수 있는 유효성분을 동정하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.

즉, 상기 항안드로젠 활성을 갖는 황칠 헥산 추출물을 HPLC를 이용하여 MeCNH₂O (0.1% HCOOH) 기울기 용매 시스템[MeCN-H2O(0.1% HCOOH), 30:70 → 100:0 (40 min), 100% MeCN (10 min), PDA 검출기] 조건에서 주요성분의 화학구조에 대한 예비조사를 한 결과, 폴리아세틸렌계(polyacetylene) 물질이 주를 이루고 있는 것으로 나타났다(도 12 참조). 이에 상기 황칠 헥산 추출물 일부(4.79 g)를 역상 중압크로마토그래피[Isolera Flash Purification system (BIOTAGE, Sweden)]에서 기울기 용매 조건 [MeCN-H2O(0.1% HCOOH), 30:70 (5 min), 30:70 → 67:33 (80 min), 67:33 → 100% MeCN (5 min), 100% MeCN (30 min)]을 이용하여 헥산 추출물의 분획 11 종을 수득하였고, 그 중 분획 3 (112.3 mg), 5 (117.4 mg) 및 7(120.2 mg)에 대하여 HPLC를 이용한 분리 및 정제를 수행하여 각각 단일물질 HS3 (2.9 mg), HS5 (8.4 mg) 및 HS7 (30.0 mg)을 MeCNH₂O (0.1%HCOOH)기울기 용매 시스템에서 모니터링하고 검출 및 분리하였다.

이 후 각 단일물질에 대한 NMR, UV 및 MS 분석을 통해 그 화학구조를 분석한 결과, 3종 모두 diacetylene계 물질로서, 9,16Sdihydroxy10,17 octadeca- diene12,14diynoic acid (HS3), 9,16Rdihydroxy10,17octadecadiene 12,14diynoic acid (HS5) 및 (9Z)16hydroxy9,17octadecadiene12,14 diynoicacid (HS7)인 것으로 확인되었다.

상기 본 발명의 방법으로 분리 및 정제한 상기 3개의 화합물의 정제 과정 및 각 화합물의 구조식은 도 13에 나타내었다.

실시예 7 : 황칠 헥산 추출물로부터 분리한 화합물의 전립선 비대증 치료 효과 규명

상기 실시예 6에서 분리 및 동정한 3개의 화합물이 전립선 비대증 치료 효과가 있는지 규명하기 위해 AR 시그널링에 미치는 영향을 조사하기 위해, 상기 화합물을 처리하였을 경우, PSA mRNA 발현에 미치는 영향, 15-PGDH mRNA 발현에 미치는 영향, 5aR-1/-2 mRNA 발현에 미치는 영향을 각각 조사하였다.

이들 분석은 LNCaP _˙ FGC 세포에 본 발명의 황칠 용매 추출물, 상기 추출물로부터 분리 및 동정된 3개의 단일 화합물 및 양성대조군으로서 flutamide (40 μM)를 각각 48시간 처리한 뒤, 각각 상기 유전자들의 mRNA 발현양을 측정하였다.

<7-1> PSA mRNA 발현수준 분석 결과

PSA mRNA 발현수준 분석 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 9,16Sdihydroxy 10,17octadecadiene12,14diynoic acid (HS3)와 9,16R dihydroxy10,17 octadecadiene12,14diynoic acid (HS5) 및 (9Z)16- hydroxy9,17 octadecadiene12,14diynoic acid (HS7)은 모두가 AR 의 타겟 유전자인 PSA mRNA 발현을 억제하는 것으로 나타났으며, 특히 (9Z)16 hydroxy9,17 octadecadiene12,14diynoic acid(HS7)이 가장 효과적으로 PSA mRNA 발현을 억제하는 것으로 나타났다.

<7-2> 15- PGDH mRNA 발현수준 분석 결과

15-PGDH mRNA 발현수준 분석 결과, AR 시그럴닝의 타겟 유전자인 15-PGDH mRNA 발현 역시 본 발명에서 분리 및 동정한 상기 3개의 화합물 모두에 의해 억제되는 것으로 나타났으며, 특히 (9Z)16hydroxy9,17octadecadiene- -12,14diynoic acid (HS7)가 가장 효과적으로 15-PGDH mRNA 발현을 억제하는 것으로 나타났다(도 15 참조).

<7-3> 5 aR -1/-2 mRNA 발현수준 분석 결과

나아가 5aR-1/-2 mRNA 발현수준 분석 결과, 본 발명에 따른 황칠 추출물 및 상기 3개의 화합물 모두 5aR-1/-2 mRNA의 발현수준을 억제하는 것으로 나타났다(도 16 및 도 17 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 황칠 헥산 추출물 및 상기 추출물 유래의 단일 화합물인 9,16Sdihydroxy10,17octadecadiene 12,14diynoic acid(HS3)와 9,16Rdihydroxy10,17octadecadiene 12,14diynoic acid(HS5) 및 (9Z)16hydroxy9,17octadecadiene 12,14diynoic acid(HS7) 모두가 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 전립선비대의 예방 및 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

< 제제예 1> 약학적 제제의 제조

1. 정제의 제조

상기 실시예에서 수득한 본 발명의 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 정제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

락토오스, 전분 및 전젤라틴화 옥수수 전분을 황칠나무 추출물과 혼합한 후, 적합한 용적의 정제수를 첨가하고 분말로 과립화 시켰다. 과립을 건조시킨 후 스테아르산 마그네슘과 혼합하고 압착하여 정제를 얻었다.

상기 정제의 구성성분은 하기와 같다.

황칠나무 추출물 5.0 ㎎

락토오스 BP 150.0 ㎎

전분 BP 30.0 ㎎

전젤라틴화 옥수수 전분 BP 15.0 ㎎

스테아르산 마그네슘 1.0 ㎎

2. 캡슐제의 제조

본 발명의 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 캡슐제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

상기 본 발명의 황칠나무 추출물을 일정량의 부형제 및 스테아르산 마그네슘과 혼합하였다. 얻어진 혼합물을 젤라틴 캡슐 중에 충전하여 캡슐을 수득하였다.

상기 캡슐제의 구성성분은 하기와 같다.

황칠나무 추출물 5.0 ㎎

전분 1500 100.0 ㎎

스테아르산마그네슘 BP 1.0 ㎎

3. 주사액제의 제조

본 발명의 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 주사액제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 상기 식물 추출물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 이어서 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 이어서 120 ℃로 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 얻었다.

상기 주사액제의 구성성분은 하기와 같다.

황칠나무 추출물 100 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

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9,16S디히드록시-10,17옥타데카디엔12,14디노익산(9,16Sdihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid); 9,16R디히드록시10,17 옥타데카디엔12,14디노익산( 9,16R dihydroxy10,17octadecadiene 12,14diynoic acid); 또는 (9Z)16히드록시9,17옥타데카디엔 12,14디노익산( (9Z)16hydroxy9,17octadecadiene12,14diynoic acid) 화합물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 화합물은 황칠나무의 헥산 추출물로부터 분리 및 정제된 것을 특징으로 하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 화합물은 PSA (prostate specific antigen) mRNA 발현, 15-PGDH mRNA 발현, 5αR-1(5α-reductase type 1) 및 5αR-2(5α-reductase type 2) mRNA 발현을 억제 및 감소시키는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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9,16S디히드록시- 10,17옥타데카디엔12,14디노익산(9,16Sdihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid); 9,16R디히드록시10,17옥타데카디엔12,14 디노익산(9,16Rdihydroxy10,17octadecadiene12,14diynoic acid); 또는 (9Z)16 히드록시9,17옥타데카디엔12,14디노익산((9Z)16 hydroxy9,17octadecadiene12,14diynoic acid) 화합물을 유효성분으로 포함하는 전립선암의 예방 및 치료용 약학적 조성물.