KR20140136261A

KR20140136261A - 두충, 자몽 및 감태 혼합물을 포함하는 지방전구세포 증식 및 분화 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20140136261A
Application number: KR1020130056580A
Authority: KR
Inventors: 김정환; 남수완; 김병우; 권현주; 김세원; 김육용; 유기환
Original assignee: 동의대학교 산학협력단; (주)아이에스푸드
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2014-11-28

Abstract

본 발명은 두충, 자몽 및 감태 혼합물을 유효 성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 두충, 자몽, 및 감태의 혼합 추출물은 세포 증식 관련 전사 활성인자인 CDK1과 CDK2 유전자의 발현을 억제하고, 지방세포형성 전사 활성인자인 AP(adipocyte fatty acid binding protein) 및 PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ) 유전자의 발현을 억제하며, 지방전구세포의 증식 및 분화를 억제하고, 비만의 예방 및 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

두충, 자몽 및 감태 혼합물을 포함하는 지방전구세포 증식 및 분화 억제용 조성물{Composition comprising Eucommia Ulmoides, Citrus Paradisi, and Ecklonia Cava mixture for inhibiting proliferation and differentiation of preadipocyte}

본 발명은 두충, 자몽, 및 감태의 혼합 추출물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 두충, 자몽, 및 감태의 혼합 추출물을 유효 성분으로 포함하는 지방전구세포의 증식 및 분화 억제용 조성물에 관한 것이다.

비만은 당뇨병, 고혈압, 및 심장병과 같은 세계적으로 발생하는 다양한 대사 질환의 직접적인 원인이다. 비만은 지방 세포 수의 증가와 지방 세포 크기의 증가로부터 야기되는 지방 조직 덩어리의 증가를 특징으로 한다. 지방 조직 덩어리의 양은 섬유아세포 지방전구세포로부터 성숙 지방세포로의 지방형성의 억제 및 지방 조직에서의 지방분해의 유도에 의해 조절될 수 있다. 따라서 지방형성 및 지방생합성의 조절에 의한 지방세포 분화는 항비만 전략의 목표였다.

3T3-L1 지방전구세포는 지방세포형성 분화를 연구하기 위해 사용되는 잘 확립된 세포주이다. 지방세포 분화는 형태, 호르몬 민감성, 및 유전자 발현에서의 변화가 수반되는 복잡한 과정이다. 융합 지방전구세포는 클론 증식, 성장 정지, 및 호르몬성 유도에 의한 지방세포 마커의 발현을 통해 지방세포가 된다. 몇몇 전사 인자는 지방세포 분화에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 지방세포 분화와 관련된 대표적인 전사인자로 알려진 AP(adipocyte fatty acid binding protein) 및 PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ) 단백질은 지방 수송 및 축적을 책임지는 다양한 유전자의 전사를 통해 지방세포형성 분화에서 필수적인 역할을 한다.

현재 사용되고 있는 비만의 치료방법에는 식사요법, 운동요법, 행동요법, 약물요법, 수술요법 등이 있다. 식사요법은 열량섭취를 제한하여 체내의 지방 소모를 도와 체중감량을 유도하고, 운동요법은 신체의 열량 소모를 증가시키며, 행동요법은 습관을 개선하여 체중 조절을 유도한다. 약물치료는 식용억제제, 음식물 흡수 억제제, 열생성 촉진제 등으로 체중을 감량시키는 것으로, 현재 다양한 약제가 체중감량을 위하여 사용되고 있다. 그 중, 식욕억제제는 중추신경계에 작용하여 영향을 미치는데, 중추신경의 카테콜아민계에 작용하는 약제와 세로토닌계에 작용하는 약제로 분류된다. 음식물 흡수 억제제는 위장에 작용하여 영양분의 흡수를 저하시키는데, 지방분해효소 억제제, 디사카리테이즈 억제제 등이 있다. 열생성 억제제는 신체의 대사율을 촉진시켜 칼로리 소비 증가를 통해 체중감소를 도모하는 것으로 갑상선 호르몬제제, 식욕억제제, 교감신경작용제 등이 있다. 현재 비만치료제 시장은 음식물 흡수 억제제인 제니칼과 식욕억제제인 리덕틸이 대부분을 차지하고 있다. 그러나, 현재 사용되고 있는 비만 치료제는 정도의 차이가 있으나, 모두 부작용이 있어 새로운 안정성이 확보된 비만 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 두충은 두충나무과에 속하는 두충나무(Eucommia ulmoides Oliver)의 껍질이나 잎을 말린 약재이다. 두충 껍질의 바깥 면은 회색 또는 어두운 회색이고 세포주름이 많고 작은 구멍인 피공이 있으며, 안쪽 면은 평활하고 어두운 갈색을 띤다. 두충은 맛이 달고 매우며, 잎이나 나무껍질에 실 같은 투명한 섬유질이 많아 꺾으면 끈기 있는 가늘고 흰 섬유질의 실이 생기는 특징이 있다. 두충의 약리작용으로는 혈압강하, 항노화, 콜레스테롤강하, 항염, 진정, 진통, 면역 조절, 혈액응고, 자궁수축, 항알레르기, 항균작용 등이 보고되고 있다. 한방에서는 간신기능 부족으로 인한 요통, 무릎통, 하복냉감, 태동불안, 자궁출혈 등을 치료하는데 효과가 있다고 알려져 있다.

또한, 자몽(grape fruit)은 감귤속(Citrus)에 속하는 그레이프 프루트 나무의 열매로서 원산지는 서인도제도의 자메이카이다. 모양은 둥글고 지름은 10 내지 15 cm이며 겉껍질은 가죽질이고 표면이 매끄러우며 노란색이다. 또한, 속껍질은 얇고 부드러우며, 과육은 옅은 노란색으로 즙액이 풍부하고 맛은 시면서도 단맛이 강하고 쓴맛도 조금 섞여 있다. 이러한 자몽은 감기예방, 피로회복, 숙취에 좋고, 한방에서는 피지 조절과 세균 감염을 예방하면서 여드름에 의한 모공확대 및 염증악화를 억제하는 효과가 있다고 알려져 있다.

그리고, 감태는 갈조식물 다시마목 다시마과의 여러해살이 해조류로 줄기는 길이 1~2 m이며 원기둥 모양이다. 몸 아래쪽은 둥근 기둥 모양이고 위로 갈수록 편평하며 넓어진다. 몸에서 양쪽으로 가지를 내며 밑동은 뿌리 모양이다. 가운데 부분은 굵고 어릴 때는 속이 차 있으나 다 자란 뒤에는 속이 비는 개체도 있다. 줄기 끝에는 겹잎조각 모양의 납작한 가운데 잎이 1개 달린다. 가운데 잎은 갈색을 띠는데, 길이 1 m 정도이고 양쪽에 깃꼴 모양의 작은 잎이 달리고, 이를 말리면 검은빛을 띤다. 감태는 조간대 하부나 그보다 깊은 바다의 암석에 붙어 자라며 이형세대교번(유성세대와 무성세대가 규칙적으로 교대하여 나타나는 세대교번 때 한쪽 세대의 식물체가 다른 세대의 것과 형상 및 크기가 현저하게 다른 생식체계)을 반복한다. 포자체의 엽상(잎꼴)부는 2년째 가을에 가운데 잎에 만들어진 포자를 방출한 뒤 잎은 떨어져 나가고 줄기만 있다가 잎 자리에 새로운 가운데 잎이 달려 3~4년간 자란다. 전복과 소라 등의 먹이가 되며 우리나라에서는 주로 남해안 및 제주도 해안 일대에 분포하였으나 수온 상승으로 울릉군 해안에서도 서식하고 있다. 이러한 감태는 알긴산이나 요오드 칼륨을 만드는 주요 원료로 쓰이며 당뇨 및 심혈관계 질환 등의 예방에 좋아 식용으로 이용되고 있다.

그러나 상기 두충, 자몽 및 감태 혼합물이 지방전구세포와 같은 지방세포의 증식 및 분화에 어떠한 영향을 미치는가에 관한 연구는 전혀 보고된 바가 없을 뿐만 아니라, 두충, 자몽 및 감태 혼합물의 지방전구세포 증식 및 분화 억제용 조성물에의 적용 가능성에 대한 실험적으로 뒷받침된 사례 역시 전혀 제시된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 자연계에서 손쉽게 구할 수 있고, 부작용이 적으며, 임상 현장에서 적용할 만큼 지방전구세포 증식 및 분화 억제효과가 뛰어나 비만 예방 및 억제에 효과적인 천연물 소재를 찾기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 두충, 자몽 및 감태의 혼합 추출물이 비만의 원인이 되는 지방전구세포의 증식 및 분화 억제에 탁월한 효과가 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 비만의 원인이 되는 지방전구세포의 증식 및 분화 억제에 효과가 있는 두충, 자몽 및 감태의 혼합 추출물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 두충, 자몽 및 감태의 혼합 추출물을 이용하여 지방전구세포의 증식 및 분화를 억제하고 이를 통해 비만을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 두충, 자몽 및 감태의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 두충, 자몽 및 감태의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방전구세포 증식 및 분화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 두충, 자몽 및 감태의 혼합 추출물의 지방전구세포 증식 및 분화 억제효과를 확인하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포형성 분화 양태를 면밀히 분석하였고, 이를 통해 두충, 자몽 및 감태 혼합물의 지방전구세포 증식 및 분화 억제효과를 세포 및 분자 수준에서의 확인하였다. 그 결과, 두충, 자몽 및 감태 혼합물이 지질 소적의 축적을 감소시키고 지방세포형성 전사 활성인자를 하향조절하며 지방전구세포의 증식과 분화를 차단시킴을 확인할 수 있었고, 이를 통해 두충, 자몽 및 감태 혼합물이 비만의 예방과 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 세포 증식 관련 전사 활성인자인 CDK1과 CDK2 유전자의 발현을 억제시켜 지방전구세포의 증식 및 분화를 억제시키는 작용을 수행한다.

또한, 본 발명의 조성물은 지방세포형성 전사 활성인자인 AP(adipocyte fatty acid binding protein) 및 PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ) 유전자의 발현을 억제시켜 지방전구세포의 증식 및 분화를 억제시키는 작용을 수행한다.

본 발명에서, 상기 두충, 자몽 및 감태는 여러 상업적 공급원으로부터 손쉽게 입수 가능하다. 본 발명의 상기 혼합 추출물은 두충, 자몽, 및 감태 원재료를 혼합하여 추출할 수도 있고, 두충, 자몽, 및 감태 원재료를 각각 추출하여 이들을 혼합하여 사용할 수도 있다.

두충, 자몽, 및 감태를 각각 추출하여 이들을 혼합하여 사용하는 경우에는, 각각 같은 당도로 농축된 두충 추출물 25-40 중량%, 자몽 추출물 25-40 중량%, 및 감태 추출물 25-40 중량%를 혼합하여 사용하는 경우에 지방전구세포의 증식과 분화를 억제하는 효과가 높고, 비만을 예방하거나 치료하는 효과가 높아 바람직하다.

또한, 두충, 자몽, 및 감태를 각각 추출하여 혼합 사용하는 경우, 두충, 자몽, 및 감태 추출물의 당도를 5 내지 40 Brix의 범위에서 농축하여 추출하는 것이 바람직한데, 이는 지방전구세포의 증식과 분화 억제에 효과가 있는 유효 성분이 상기 당도 범위에서 충분하게 용출되어 충분하게 비만을 예방하거나 치료하는 효과를 보이기 때문이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 30 Brix로 농축한 두충, 자몽, 및 감태 추출물을 1:1:1의 비율로 혼합하여 사용한 혼합추출물(100 mg/ml)의 지방전구세포 증식 및 분화 억제 효과가 가장 높은 것으로 나타났다.

본 발명의 조성물에서, 상기 혼합 추출물은 비만을 충분하게 예방하거나 치료하는 효과를 달성하기 위해 전체 조성물 중량의 0.01 내지 20 중량부로 함유되는 것이 바람직하다. 상기 혼합 추출물의 함량이 0.01 중량부 미만인 경우에는 비만 예방 및 치료 효과가 미미하고, 20 중량부를 초과하는 경우에는 증가되는 함량에 비해 비만 예방 및 치료 효과의 증가치가 높지 않기 때문에 경제성이 없어 바람직하지 않다.

본 발명에 따른 혼합 추출물은 두충과 자몽 및 감태를 물 또는 유기용매, 또는 물과 유기용매의 혼합용매로 추출하여 얻을 수 있다. 상기 유기용매로는 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 헥산 등을 사용할 수 있고, 상기 저급 알콜로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 사용할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 혼합 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 극성 용매로 추출할 수 있다.

물을 용매로 하여 열수 추출하는 구체적인 조건으로는 각각 미세하게 분쇄한 두충, 자몽 및 감태에 이들 중량의 5 내지 15배, 바람직하게는 10배의 물을 첨가하고 25 내지 100℃, 바람직하게는 70 내지 95℃의 온도에서 30 분 내지 72 시간, 바람직하게는 1 내지 6 시간 동안 추출한 후 여과하여 열수 추출물을 제조한다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 경로로 다양하게 투여될 수 있고, 이는 당업자에게 용이하게 예상될 수 있다. 예를 들면, 비경구로 투여되는 경우, 직장 주사, 정맥 주사, 근육내 주사, 복강 주사, 피하 주사, 자궁내 경막 주사 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있고, 그 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있다.

본 발명 조성물의 경구용 또는 비경구용 제제로의 제형화는 당업계의 통상적인 제형화 기술에 의해 이루어질 수 있는데, 경구용 제제의 경우, 경질 캅셀제, 연질 캅셀제, 정제, 과립제, 환제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 또는 엘릭시르제(elixirs) 등의 다양한 제제로 제형화 될 수 있고, 예를 들어, 캅셀제, 정제, 과립제 등은 유당, 포도당, 만니톨 등의 부형제, 전분, 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아린산마그네슘, 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알콜, 히드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산 에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로 사용하여 제형화 될 수 있다.

또한, 비경구 투여용 제제로의 제형화는 피하주사제, 정맥주사제, 근육 내 주사제, 흉부 내 주사제, 또는 경피 흡수제 등의 다양한 제제로 제형화 될 수 있고, 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제형화 할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 식품, 특히 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 두충, 자몽 및 감태의 혼합 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등), 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 본 발명의 조성물은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 음료수, 차, 향신료, 껌, 과자류, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적 의미의 건강식품을 모두 포함한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 두충, 자몽, 및 감태의 혼합 추출물은 세포 증식 관련 전사 활성인자인 CDK1과 CDK2 유전자의 발현을 억제하고, 지방세포형성 전사 활성인자인 AP(adipocyte fatty acid binding protein) 및 PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ) 유전자의 발현을 억제하며, 지방전구세포의 증식 및 분화를 억제함으로써, 비만의 예방 및 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 두충, 자몽 및 감태 혼합물의 지방전구세포 증식 억제 효과를 보여주는 도면이다.
도 2는 지방전구세포의 군락형성 분석 결과로 두충, 자몽 및 감태 혼합물이 지방전구세포의 세포 증식을 효과적으로 억제함을 보여주는 도면이다.
도 3은 두충, 자몽 및 감태 혼합물이 세포 증식 관련 전사 활성인자의 발현을 감소시킴을 보여주는 도면이다.
도 4는 두충, 자몽 및 감태 혼합물이 세포질에서의 지질 소적 축적을 억제함을 보여주는 도면이다.
도 5는 두충, 자몽 및 감태 혼합물이 지방세포형성 전사 활성인자를 약화시키는 것을 보여주는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 재료 및 실험 방법

1-1 두충, 자몽 및 감태 혼합물

건조된 두충 껍질 500g을 증류수 5 L에 넣고 90℃에서 1시간 동안 열수추출한 후 실온까지 서서히 냉각하였다. 냉각 후에 여과지를 이용하여 여과하고(Whatman No.5, Whatman International Ltd, 영국), 여과액에 당분해 효소(Viscozyme 0.3%)를 첨가하여 50℃에서 3시간 동안 반응시켜 두충 추출액을 제조하였다.

건조된 자몽 500g을 분쇄한 후, 증류수 5L에 넣고, 90℃에서 2시간 동안 열수추출한 후 실온까지 서서히 냉각하였다. 냉각 후에 여과지를 이용하여 여과하고(Whatman No.5, Whatman International Ltd, 영국), 여과액에 당분해 효소(Citrozyme Ultra L 0.2%)를 첨가하고 50℃에서 3시간 동안 반응시켜 자몽 추출액을 제조하였다.

건조된 감태 500g를 분쇄한 후, 증류수 5L에 넣고, 120℃에서 3시간 동안 열수추출하고, 60 mesh 체로 조여과한 후 퍼라이트(40 micron)로 감압여과하여 추출액을 제조하였다.

이렇게 얻은 두충, 자몽 및 감태 추출액을 각각 대형농축기로 농축하여, 30 Brix로 농축된 농축액을 수득하고 질량을 측정하였다. 두충, 자몽 및 감태 농축액의 저장 용액(stock solution)으로는 증류수를 사용하여 제조하였으며, 4℃에서 보관하였다. 저장 용액은 사용 전에 작업 농도로 희석하였다.

1-2 지방전구세포의 배양

마우스 3T3-L1 지방전구세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)는 10% 소 혈청과, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 들어간 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지를 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

1-3 화합물 처리

두충, 자몽 및 감태의 최적 처리 농도는 각 시약의 넓은 범위의 세포독성과 생존 효과에 관련된 예비 실험에 따라 선택하였다.

두충, 자몽 및 감태 혼합물의 지방전구세포 증식 억제 효과를 조사하기 위하여, 배양되는 3T3-L1 세포는 10cm 배양 접시에 5 X 10⁵개의 밀도로 깔고, 5% 소혈청이 첨가된 DMEM에서 24시간 동안 안정화시켰다. 그리고 세포들은 지정된 시간(24시간과 48시간) 동안 각각 100mg/ml 농도의 두충 추출액과 자몽 추출액 및 감태 추출액을 1:1:1 비율로 혼합한 두충과 자몽 및 감태 혼합추출액으로 처리되었다.

1-4 트리판 블루 배제 테스트

세포 증식능은 트리판 블루 배제 테스트(Trypan blue exclusion test)와 함께 시각적 세포 카운트에 의해 평가하였다. 모든 증식능 분석에서는, 각 조건에 대해 세 벌의 웰(well)을 사용하였으며, 각 실험을 적어도 3회 반복하였다.

1-5 군락형성 세포 분석( Colony - forming cell ( CFU ) assay )

3T3-L1 지방전구세포를 3.5 X 10³개의 밀도로 10cm 배양 접시에 배양을 하였고, 24시간 동안 5% 소 혈청이 함유된 DMEM에서 안정화시켰다. 무혈청 DMEM에서 추가적으로 24시간 동안 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1)로 세포를 자극한 후, 배지는 10% 소 혈청이 함유된 배지로 교체되었다. 교체 후 15일에, 세포를 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 고정시키고, 1% PFA 내 0.1% 톨루이딘 블루를 사용하여 염색하였다, 그런 다음, 세포 증식 효율은 육안으로 보이는 군락(colonies)을 세어서 결정하였다.

1-6 RNA 추출 및 역전사 PCR

3T3-L1 지방전구세포는 상기에서 기술한 것처럼 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1)을 처리하였고, 회수하여, 전체 RNA는 제조사의 프로토콜(RNeasy kit, Qiagen, La Jolla, CA)에 따라 추출하였다. 추출된 전체 RNA는 상보적 DNA(complementary DNA) 합성을 위해 AMV 역전사효소(Amersham Corp., Arlington Heights, IL)에 의한 무작위 헥사머를 적용하였다. 그런 다음, 마스터사이클러(Mastercycler, Eppendorf, Hamburg, Germany) 기계를 이용하여 20pM의 프라이머 농도를 이용하여 PCR을 수행하였다[PCR 조건: 1 X(94℃ 3분); 35 X(94℃ 45초, 56.5℃ 45초, 72℃ 1분); 및 1 X(72℃ 10분)]. 증폭된 PCR 산물은 6 x 젤 로딩 염료(Bioneer)를 사용하여 EtBr(ethidium bromide)이 포함된 1% 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하였다.

1-7 지방분화 억제 효과 분석

3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화할 때 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1)의 분화 억제 효과를 검증하기 위해 Oil Red O staining을 시행하였다. 먼저 3T3-L1 지방전구세포를 12웰 플레이트에 배양한 뒤 컨플루언트(confluent) 상태가 되게 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 컨플루언트 상태로 10% FBS, 0.1% 젠타마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 2일 더 배양하였다. 그 후 분화배지(10% FBS, 0.1% gentamycin, 10μg/ml insulin, 0.5μM dexamethasone, 0.5mM 3-isobuthyl-1-methylxanthine)로 교환할 때 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1)을 함께 처리하였다. 3일 배양 후에도 역시 10μg/ml 인슐린이 포함된 DMEM 배지에 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1)을 처리하여 3 ~ 5일간 배양하였다. 그리고 난 후 Oil Red O staining을 시행하였다.

1-8 통계적 분석

모든 데이터는 5개 이상의 독립적인 실험으로부터 평균 ± S.E.M.으로 제시하였다. 그룹 간의 차이의 통계적 유의성은 스튜던츠 투 테일드 t-테스트(Student's two tailed t-test)를 이용하여 계산하였다.

실시예 2. 지방전구세포 증식에 대한 두충, 자몽 및 감태 혼합물의 억제 효과

지방세포형성 과정은 지방전구세포 증식과 지방세포형성 분화를 포함한다. 두충, 자몽 및 감태 혼합물의 지방전구세포 증식 억제 효과를 조사하기 위하여, 배양되는 3T3-L1 세포는 10cm 배양 접시에 5 X 10⁵개의 밀도로 깔고, 5% 소 혈청이 첨가된 DMEM에서 24시간 동안 안정화시켰다. 그리고 세포들은 지정된 시간(24시간과 48시간) 동안 각각 100mg/ml 농도의 두충 추출액과 자몽 추출액 및 감태 추출액을 1:1:1 비율로 혼합한 두충과 자몽 및 감태 혼합추출액으로 처리되었다. 그 결과, 도 1에 도시한 바와 같이, 무처리 대조군의 3T3-L1 지방전구세포의 세포 수는 48시간까지 증가하였다. 그러나, 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1) 처리군에서는 48시간까지 세포 수가 유의하게 감소되어 본 발명의 혼합물이 지방전구세포 증식을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다(*, P<0.05).

지방전구세포 증식 억제에 관한 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1)의 억제능력을 검사하기 위하여 군락형성 분석법(clonogenic assay)을 수행한 결과, 도 2에 도시한 바와 같이, 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1) 처리된 세포는 무처리 대조군 세포에 비해 군락 형성을 약 30% 정도 감소시킴을 확인할 수 있었다.

이러한 감소 효과를 유전자 발현 측면에서 분석하기 위해 RT-PCR을 수행한 결과, 세포 증식 관련 전사 활성인자의 발현 양상에서도 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1) 처리된 세포의 경우 대조군 세포에 비해 세포 증식 관련 전사 활성인자인 CDK1과 CDK2 유전자의 발현이 유의하게 억제되고 있음을 확인할 수 있었다(도 3).

실시예 3. 지방전구세포 분화에 대한 두충, 자몽 및 감태 혼합물의 억제 효과

지방형성에 대한 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1)의 억제 효과를 확인하기 위하여, 현미경에 의해 명백히 보이는 세포내 지질 소적 축적에 의해 지방세포 분화를 모니터하였다.

3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화할 때 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1)의 분화 억제 효과를 알아보고자 Oil Red O staining을 시행하였다.

먼저 3T3-L1 지방전구세포를 12웰 플레이트에 배양한 뒤 컨플루언트(confluent) 상태가 되게 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 컨플루언트 상태로 10% FBS, 0.1% 젠타마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 2일 더 배양하였다. 그 후 분화배지(10% FBS, 0.1% gentamycin, 10μg/ml insulin, 0.5μM dexamethasone, 0.5mM 3-isobuthyl-1-methylxanthine)로 교환할 때 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1)을 함께 처리하였다. 3일 배양 후에도 역시 10μg/ml 인슐린이 포함된 DMEM 배지에 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1)을 처리하여 3~5일간 배양하였다. 그리고 난 후 Oil Red O staining을 시행하였다. 본 발명에서는, 천연 세포와 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1) 처리 세포 간의 지질 소적 형성 효율의 차이를 염색된 지질 소적의 개수를 결정하여 정량하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1)은 세포질에서의 지질 소적 축적을 명백히 억제함을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 본 발명의 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1)은 세포 생존능에 영향을 주지 않고, 대조군에 비하여, 최대 35%까지 세포내 지질 소적 축적을 억제함을 확인할 수 있었다(*, P<0.05).

마찬가지로 도 5의 RT-PCR 분석결과 지방세포형성 전사 활성인자의 발현 양상에서도 두충, 자몽 및 감태 혼합물(1:1:1) 처리된 세포의 경우 대조군 세포에 비해 대표적인 지방세포형성 전사 활성인자인 AP와 PPAR-γ의 발현을 유의성 있게 억제함을 확인할 수 있었다.

Claims

두충, 자몽 및 감태의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 세포 증식 관련 전사 활성인자인 CDK1과 CDK2 유전자의 발현을 억제시켜 지방전구세포의 증식 및 분화를 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 지방세포형성 전사 활성인자인 AP(adipocyte fatty acid binding protein) 및 PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ) 유전자의 발현을 억제시켜 지방전구세포의 증식 및 분화를 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 두충 추출물 25-40 중량%, 자몽 추출물 25-40 중량%, 및 감태 추출물 25-40 중량%로 첨가되어 혼합되되, 각각의 추출물은 같은 당도인 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 당도는 5 내지 40 Brix인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 전체 조성물 중량의 0.01 내지 20 중량부인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 극성 용매로 추출된 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 물을 용매로 하여 열수 추출된 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 정제, 환제, 경질 캅셀제, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 및 엘릭시르제(elixirs)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 경구용 제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 피하주사제, 정맥주사제, 근육 내 주사제, 흉부 내 주사제, 및 경피 흡수제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 비경구용 제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
두충, 자몽 및 감태의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방용 건강기능식품.