KR101854960B1 - 발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물 - Google Patents

발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 발아 벼 왕겨 추출물은 혈중 포도당을 지방세포로 유입시켜 혈중 포도당 수준을 조절하는 효과가 있으므로 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 발아 벼 왕겨 추출물은 천연물질로서 체내에 안정한 특징이 있어 기능성 건강식품의 소재로도 사용될 수 있다.

Description

발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물{Composition for anti-diabete comprising extract of hull and sprout parts from germinated rough rice as an effective component}
본 발명은 발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물에 관한 것이다.
현재 우리나라는 급격한 경제성장으로 인해 서구화된 식이습관과 영양분의 과잉으로 질병의 양상이 크게 변화하고 있으며 과거와는 달리 동맥경화, 고혈압, 암, 비만 및 당뇨병 등의 만성 퇴행성 질환이 주요 사망 원인으로 대두되고 있다.
특히 당뇨병과 그로 인한 합병증의 발병율이 급격히 증가하고 있는 추세이다. 당뇨병 발병율은 1970년대 인구의 1% 미만이었던 것이 1990년대 이후에는 인구 10만 명당 17.2명이 당뇨병에 의해 사망하고 있으며, 앞으로도 당뇨병의 발병율은 계속 증가할 것으로 추정되고 있다. 당뇨병은 고혈당과 그로 인한 대사 장애가 장기간 지속되어 발병하는 만성 대사 질환으로서, 췌장 Langerhan's island β세포의 기능 이상에 의한 인슐린의 절대적 결핍으로 나타나는 인슐린 의존성 당뇨병과 인슐린의 분비능력이 감소하거나 반응속도가 느려져 나타나는 인슐린 비의존성 당뇨병으로 분류된다.
당뇨병은 대표적인 만성질환으로 포도당을 비롯한 여러 대사 장애로 망막, 신장 및 신경 등의 미세혈관 합병증과 중풍, 협심증, 심근경색증 및 말초 혈관 질환 등의 대혈관 합병증을 초래하는 만성적인 질병이다. 최근 당뇨병의 치료방법이 발달됨에 따라 당뇨병 환자의 평균 수명이 연장되고 급성 대사성 합병증으로 인한 사망률이 급격하게 감소되고는 있지만 당뇨병성 만성 합병증의 발생이 증가함으로 인해 당뇨병 합병증은 당뇨병 치료 그 자체보다 더 큰 문제점으로 지적되고 있다.
당뇨의 치료법은 약물요법, 운동요법 및 식이요법이 있으며 환자의 증상에 따라 인슐린 약재와 각종 혈당제가 사용되고 있다. 그러나 당뇨병은 간에서의 당 생성 과다, 인슐린 저항성, 근육과 지방 세포 등에서 당 처리 능력 감소 등의 특징을 나타내는 복합적인 질병이므로 특정 치료법만으로는 여러 가지 부작용의 유발을 막을 수 없다. 이 중 약물요법은 인슐린 및 화학물질을 사용하고 있어 약물 복용에 따라 부작용과 환자의 내성에 끊임없는 문제가 되고 있기 때문에, 최근에는 당뇨병 치료에 있어 식이가 가능하며 부작용이 적은 천연물을 이용하여 당뇨병을 치료하기 위한 연구가 필요한 실정이다.
한국등록특허 제1126677호 한국등록특허 제1193085호
이에 본 발명자들은 발아 벼 왕겨 추출물에 당뇨 및 당뇨합병증의 치료에 우수한 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 벼를 발아시키는 단계; (b) 발아된 벼를 건조시키는 단계; (c) 건조된 발아벼를 현미기를 사용하여 왕겨분획과 현미분획으로 나누어 분리한 뒤 왕겨분획을 선택하는 단계; 및 (d) 선택된 왕겨분획을 용매 추출하는 단계; 를 포함하는, 발아 벼 왕겨 추출물 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 발명으로 제조된 발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
나아가 본 발명의 목적은 상기 발명으로 제조된 발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 벼를 발아시키는 단계; (b) 발아된 벼를 건조시키는 단계; (c) 건조된 발아벼를 현미기를 사용하여 왕겨분획과 현미분획으로 나누어 분리한 뒤 왕겨분획을 선택하는 단계; 및 (d) 선택된 왕겨분획을 용매 추출하는 단계; 를 포함하는, 발아 벼 왕겨 추출물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a)단계의 발아는 1 ~ 6일 동안, 35 ~ 40℃의 온도에서, 80 ~ 90%의 습도를 유지시켜 발아시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (d)단계의 용매추출은 물, 메탄올, 에탄올, 헥산, 부탄올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 추출할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (d)단계의 용매추출은 C18 레진을 이용하여 칼럼 정제하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발아 벼 왕겨 추출물은 혈중 포도당을 지방세포로 유입시켜 혈중 포도당 수준을 조절할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증, 당뇨성 혈관합병증일 수 있다.
나아가 본 발명은 상기 방법으로 제조된 발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품을 제공한다.
본 발명에 따른 발아 벼 왕겨 추출물은 혈중 포도당을 지방세포로 유입시켜 혈중 포도당 수준을 조절하는 효과가 있으므로 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 발아 벼 왕겨 추출물은 천연물질로서 체내에 안정한 특징이 있어 기능성 건강식품의 소재로도 사용될 수 있다.
도 1은 발아 유무, 부위 및 추출용매에 따른 발아 벼 추출물의 3T3-L1 지방세포에 대한 포도당 유입활성 정도를 측정한 결과이다.
도 2는 용매분획에 따른 발아 벼 왕겨 추출물의 3T3-L1 지방세포에 대한 포도당 유입활성 정도를 측정한 결과이다.
도 3은 칼럼 정제에 따른 발아 벼 왕겨 추출물의 3T3-L1 지방세포에 대한 포도당 유입활성 정도를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 발아 벼 왕겨 추출물이 실제로 당뇨병 동물모델에 미치는 영향을 확인한 결과이다(○: 정상대조군 (C57BLKS/J-db/m+ mice), ●: 양성대조군, ◆: C5 50 mg/kg 투여군, ■: C5 100 mg/kg 투여군, □: 비교대조군 (Pioglitazone 5mg/kg)).
도 5는 본 발명의 발아 벼 왕겨 추출물이 당뇨병 동물모델의 포도당 내성에 미치는 영향을 확인한 결과이다(○: 정상대조군 (C57BLKS/J-db/m+ mice), ●: 양성대조군, ◆: C5 50 mg/kg 투여군, ■: C5 100 mg/kg 투여군, □: 비교대조군 (Pioglitazone 5mg/kg)).
도 6은 본 발명의 발아 벼 왕겨 추출물을 처리 후 면역 형광법을 이용하여 glucose transprter 4 (GLUT-4) 전사인자의 발현량을 확인한 결과이다(A : control, B : pioglitazone 1 μg/mL, C : insulin 50 ng/mL, D, E and F : germinated rough rice extract (GIP-HS_E_H_C5) at concentrations of 1, 5 and 10 μg/mL, respectively).
도 7은 본 발명의 발아 벼 왕겨 추출물을 처리 후 면역 형광법을 이용한 activated insulin receptor substrate 1 (pIRS-1) 전사인자의 발현량을 확인한 결과이다(A : control, B : pioglitazone 1 μg/mL, C : insulin 50 ng/mL, D, E and F : germinated rough rice extract (GIP-HS_E_H_C5) at concentrations of 1, 5 and 10 μg/mL, respectively).
도 8은 본 발명의 발아 벼 왕겨 추출물을 처리 후 인슐린 관련 전사인자들의 발형량을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 발아 벼 왕겨 추출물 제조과정을 나타낸 공정도이다.
본 발명은 발아 벼 왕겨 추출물의 신규 용도에 관한 것으로서, 발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
벼(Oryza sativa L.)는 세계 3대 작물 중 하나이며, 벼를 도정한 쌀은 세계인구 절반 이상이 주식으로 이용하고 있다. 쌀은 세계적으로 주요한 당질 급원으로 다양한 영양분의 공급원은 아니지만 특히 아시아와 같이 쌀을 주식으로 하는 나라에서 쌀에 의존하는 영양분 비중측면에서 중요한 주곡 작물이다. 벼의 종자는 씨눈과 배젖에 있는 비활성 상태의 DNA 유전정보와 각종 효소, 영양소 등이 외적환경 여건이 좋아지면 활성화되어 발아되는데, 일반적으로 발아가 진행됨에 따라 다양한 성분들이 증가되거나 생성되고 그에 따라 다양한 생리활성이 증가되는 경향이 있다고 보고되고 있다. 특히 발아된 현미는 γ-oryzanol이나 arabinoxylane, γ-aminobutyric acid, vitamin E 등의 생리활성 성분들이 증가하고 발아 중에 효소가 활성화되어 영양성분들의 체내 흡수가 용이하게 되는 것으로 보고되었다.
기존 현미에 항당뇨 효과가 있다는 내용에 대해서는 알려진 바 있으나 벼 전곡을 발아시키는 과정에서 왕겨와 쌀겨에서 발생하는 다양한 변화들의 측정 및 발아 벼 왕겨 추출물에서 항당뇨 효과가 있다는 내용에 대해서는 전혀 개시된 바가 없다.
따라서 본 발명은 발아 벼 왕겨 추출물에 혈당을 낮추고, 혈중 포도당을 지방세포로 유입시켜 혈중 포도당 수준을 조절하는 효과가 있음을 확인함으로써, 이를 통해 당뇨 및 당뇨 합병증을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였다.
따라서 본 발명은 발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 및 당뇨 합병증을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 발아 벼 왕겨 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 ‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 발아 벼 왕겨로부터 추출한 것이며, 예를들어, 발아 벼 왕겨의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다.
상기 발아 벼 왕겨로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 물 또는 에탄올(주정)을 사용할 수 있다.
추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 발아 벼 왕겨추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 발아 벼 왕겨 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.
따라서 본 발명에 있어서 발아 벼 왕겨 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 일실시예에 따른 발아 벼 왕겨 추출물을 제조하는 방법을 조금 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
본 발명에서는 일반 벼 품종인 일품 벼를 사용하고, 발아는 벼를 20℃의 물로 수세하고 3일간 침지시킨 다음 발아기(WGC 450 Dahan Inc, Korea)로 발아시킨다. 발아 온도는 35 ~ 40℃, 습도는 80 ~ 90%를 유지시키면서 발아시키고, 물은 1일 1회씩 교환하며, 1일 3회씩 10분간 물주기를 하면서 발아한다. 발아기간은 1 ~ 6일로 하고, 발아된 벼는 50 ~ 60℃의 열풍건조기 에서 2일간 건조시킬 수 있다.
건조된 발아 벼는 현미기를 사용하여 왕겨분획(hull & sprout)과 현미분획(Brown rice)으로 나누어 분리한 뒤, 분쇄기(Micro hammer cutter mill type-3, Culatti AG, Zurich, Swtzerland)를 사용하여 40 ~ 80 mesh의 크기로 분쇄한 후 -20℃에서 보관하면서 사용할 수 있고, 시료 중에 함유된 유용성분을 추출하기 위해 물 및 에탄올 추출물을 제조하여 사용할 수 있다.
상기 방법으로 제조된 발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수,멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 발아 벼 왕겨 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 10 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 발아 벼 왕겨 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 발아 벼 왕겨 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 발아 벼 왕겨 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 당뇨병 및 당뇨 합병증의 예방 또는 치료 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈당 조절용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 혈당 조절을 위한 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 '건강기능식품'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 발아 벼 왕겨 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 발아 벼 왕겨 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 발아 벼 왕겨 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 발아 벼 왕겨 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 발아 벼 왕겨 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 하기 실시예에서도 확인한 바와 같이 혈중 포도당을 지방세포로 유입시켜 혈중 포도당 수준을 조절할 수 있기 때문에 혈당 조절에 효과적이다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
또한 본 발명은 포유동물에게 발아 벼 왕겨 추출물을 투여하는 것을 포함하는 당뇨 및 당뇨 합병증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
여기서 사용된 용어 ‘포유동물’은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 '치료상 유효량'은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 발아 벼 왕겨 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여 시, 1㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 발아 벼 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 경피, 국소, 안구 내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
실험 재료 및 발아 방법
본 발명에서는 일반 벼 품종인 일품 벼(Oryza sativa L.)를 농가로부터 구매하여 사용하였다. 발아는 벼를 20℃의 물로 수세하고 3일간 침지시킨 다음 발아기(WGC 450 Dahan Inc, Korea)로 발아시켰다. 발아 온도는 37℃, 습도는 85%를 유지시키면서 발아시켰으며, 물은 1일 1회씩 교환해주었고, 1일 3회씩 10분간 물주기를 하면서 발아시켰다. 발아기간은 1-6일로 하였고, 발아시키지 않은 벼를 대조구로 하였다. 발아된 벼는 55℃의 열풍건조기 에서 2일간 건조시켰다.
< 실시예 2>
부위별 분리 및 추출물 제조 방법
건조된 무발아 및 발아 벼는 현미기를 사용하여 왕겨분획(hull & sprout)과 현미분획(Brown rice)으로 나누어 분리한 뒤, 분쇄기(Micro hammer cutter mill type-3, Culatti AG, Zurich, Swtzerland)를 사용하여 60 mesh의 크기로 분쇄한 후 -20℃에서 보관하면서 사용하였다. 시료 중에 함유된 유용성분을 추출하기 위해 물 및 에탄올 추출물을 제조하였다. 물 추출물 및 에탄올 추출물은 각각 시료 중량 대비 10배의 증류수와 80% 에탄올(v/v)를 첨가하여 상온에서 24시간동안 교반추출하고, 이 추출물을 감압여과 한 후 농축하여 동결건조한 다음 -20℃에서 보관하면서 시료로 사용하였다.
< 실시예 3>
용매분획물 및 칼럼정제분획물 제조 방법
발아 벼의 왕겨분획 에탄올 추출물을 헥산(hexane), 클로로폼(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol) 및 물(water)로 순차적 용매분획한 후 이들을 각각 여과 및 농축하여 용매분획물을 제조하였다. 에탄올 추출물의 헥산 분획물을 메탄올로 활성화시킨 C18 레진이 충진된 칼럼에 주입한 후 물과 메탄올로 극성물질을 제거한 후 헥산으로 세척하여 활성분획을 제조하였다.
< 실시예 4>
3 T3 - L1 지방세포의 배양/분화유도 및 포도당 유입활성 측정 방법
3T3-L1 전지방세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, 세포의 배양과 유지는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 10% BCS(bovine calf serum)와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 조건에서 2～3일에 한 번씩 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
3T3-L1 지방전구세포가 80∼90% 밀집(confluence)되면 0.25% trypsin- EDTA를 처리하여 세포를 분리하고 원심분리기에서 세포를 모은 후 suspension 용액을 만들어 세포 배양용 6-웰 플레이트에서 confluent 상태까지 배양한 후 포화상태에 이른 것을 확인한 다음 48시간 더 배양하였다. 세포가 post-confluent하게 되면 IBMX(0.5 mM)와 덱사메타손(0.25 μM), 인슐린(5 μg/mL), 10% FBS를 첨가된 differentiation medium을 처리하여 분화를 유도하였다. 분화유도 2일 후에는 5 μg/mL의 인슐린이 함유된 10% FBS DMEM으로 이틀 동안 배양하였다. 그 후 4, 6일째 10% FBS DMEM으로 배양액을 교체하여 지방세포 분화를 유도하였다.
배양용기 바닥을 완전히 채운 지 2일 후에 유도 분화 물질을 넣어 3일 동안 배양한 후 2일에 한번씩 10% FBS를 함유한 고농도 포도당 DMEM 용액으로 교환하면서 지방세포로 완전히 전환된 7～10일 사이에 포도당 흡수 실험을 포도당 유입 실험을 하였다. 분화가 유도된 지방세포를 PBS로 세척한 후 Serum-free DMEM으로 37℃에서 6시간 동안 배양한 후 Krebs Ringer Phospate Hepes(KRPH) buffer(1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 1.3 mM CaCl2, 118 mM NaCl, 5 mM KCl, 30 mM Hepes, pH 7.5)로 세척한 후에 2% BSA를 함유한 KRPH buffer에 대조구 및 시료를 희석하여 3T3-L1 지방세포내로의 2-Deoxyglucose(2DG) Uptake Measurement kit(COSMO BIO CO., LTD, TOKYO, JAPAN)롤 사용하여 측정하였다.
즉, 2% BSA를 함유한 KRPH buffer에 시료와 1 uM 인슐린, 1 mM 2DG를 같이 분화가 유도된 지방세포에 처리한 후 37℃에서 20분동안 배양한 다음 배지를 제거한 후 200 uM phloretin이 포함된 cooled PBS로 세척하였다. 그 후, 10 mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)을 각 well에 3 mL 넣은 뒤 세포를 파쇄하였다. Cell lyssate를 tube로 모아준 후 80℃에서 15분동안 열처리를 실시한 다음 4℃ 15000*g로 20 분동안 원심분리를 실시한 후 상등액을 새로운 tube에 옮겨준 후 상등액을 1Xsample diluent buffer(1:4)로 희석한 다음 kit 안의 solution을 사용해 2-Deoxyglucose (2DG) Uptake Measurement kit (COSMO BIO CO., LTD, TOKYO, JAPAN) 방법에 준하여 실험을 순차적으로 진행한 다음 420 nm, 25∼30℃의 조건에서 30분동안 5분간격의 kinetic 반응으로 흡광도를 측정하였다.
< 실시예 5>
당뇨모델 마우스를 이용한 항당뇨 효능 평가 방법
6주령 수컷 C57BLKS/J-db/db 마우스와 C57BLKS/J-db/m+ 마우스 (Shizuoka Laboratory Animal Center; SLC, Shizuoka, Japan)를 중앙실험동물(주)로부터 공급받아 약 1주간 검역순화과정을 거치고, 3주간 1회/주 혈당을 측정하여 모든 C57BLKS/J-db/db 마우스의 공복혈당이 평균 150 mg/dL에 도달한 것을 확인한 후, 동물이 10주령이 되는 시점에 군분리를 실시하였다.
동물은 마우스용 사육상자 (220× 200× 145 mm3)에 2～3마리씩 수용하였으며, 사육환경은 온도 22± 3°C, 상대습도 50± 20%, 환기횟수 10～15회/시간, 조명주기 12시간/일 (07:00～19:00) 및 조도 150～300 Lux로 조절하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(Teklad certified irradiated global 18% protein rodent diet, Harlan Laboratories, Inc., U.S.A.)를 급여하여 자유섭취하게 하였고, 음수는 충북대학교 실험동물연구지원센터에서 공급되는 멸균 정제수를 자유섭취하게 하였다. 본 시험은 충북대학교 실험동물연구지원센터의 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다(승인번호 : CBNUA-623-13-01).
제 2형 당뇨가 유발되는 C57BLKS/J-db/db 마우스의 혈당이 평균 150 mg/dL에 도달한 것을 확인한 후에 다음과 같이 5군으로 군분리 하였다. 1) 정상대조군, 2) 양성대조군, 3) C5 50 mg/kg 투여군, 4) C5 100 mg/kg 투여군, 5) 비교대조군 (pioglitazone 5 mg/kg 투여군). 정상대조군에는 당뇨증상이 나타나지 않은 C57BLKS/J-db/m+ 마우스를 6마리, 그 외의 군은 C57BLKS/J-db/db 마우스를 음성대조군 및 용량별 C5 투여군은 각각 10마리씩, 비교대조군은 7마리로 설정하였다(표 1 참조). 시험물질인 C5는 각 용량별로 부형제인 5% cremophor EL 용액에 고르게 현탁되도록 혼합하여 투여하였으며, 피오글리타존(pioglitazone)은 100 mg/mL의 용량으로 다이메틸설폭시화물(Sigma-Aldrich Inc., U.S.A.)에 용해한 후에 이를 부형제 1 mL에 5 μL씩의 비율로 용해하여 투여하였다. 정상대조군 및 음성대조군은 5% cremophor EL 용액을 투여하였으며, 투여액량은 10 mL/kg으로 설정하여 개체별 투여액량은 투여 일에 가깝게 측정된 체중을 기준으로 산출하였다. 투여는 경구투여용 존데를 이용하여 1회/일 9주간 반복 경구투여하였다.
혈당은 군분리후 시험물질 투여 0주(시험물질투여 전), 1주, 3주, 5주, 7주 및 9주차에 총 6회 측정하였다. 측정 방법은 모든 동물을 혈당 측정 전 약 16시간 이상 절식시키고, 시험물질을 투여한 후, 약 1시간 후에 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 간이혈당측정기 (GlucoDr PlusTM AGM-3000, Allmedicus Co., Ltd., Anyang, Korea)를 사용하여 측정하였다.
시험물질 투여 8주에 마우스를 약 16시간 절식시킨 후 수행하였다. 각 군별로 부형제, 시험물질 및 양성대조물질을 투여하고 1시간 후에 포도당(1 g/kg, Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO. U.S.A.)을 경구로 투여하였다. 포도당 투여 0(투여전), 30, 60, 90 및 120분에 꼬리정맥에서 채혈하여 간이혈당측정기를 이용하여 측정하였다.
< 실시예 6>
웨스턴 블롯 분석을 통한 전사인자들의 발현량 평가 방법
계대 배양한 후 3T3-L1 섬유아세포를 75 cm2 flask에 완전히 채워질 때까지 배양하고, 2일 후에 분화유도 물질을 넣고 7일간 배양하였다. 2일에 한번씩 10% FBS를 함유한 high glucose DMEM 배지를 교환하면서 지방세포로 완전히 전환된 시점에서 실험을 실시하였다.
지방세포로 완전히 분화된 세포를 serum free DMEM 배지에 3% bovine serum albumin (BSA)를 첨가하여 12시간 배양한 뒤, 시험물질을 5시간 처리 하였다. 5시간 후 인슐린을 1과 50 μg/mL의 농도로 10분간 처리하였다. 처리가 끝난 세포를 phosphate buffer saline (PBS)로 세척한 후 lysis buffer (50mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.02% sodium azide, 100 μg/mL PMSF, 1 μg/mL Aprotinin, 1% Triton X-100)로 세포를 용해시킨 후 12,000 rpm에서 원심분리 하여 상층액을 얻었다. Bradford법을 이용하여 단백질 정량을 실시하고, 30 μg의 단백질을 10% SDS-PAGE gel에서 전기영동 한 후, 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인에 80 V로 1시간동안 트랜스퍼(transfer)하였다. 그 후에 5% skim milk in TBS-Tween 20를 사용하여 1시간동안 실온에서 블락킹(blocking)하였다.
IRS-1, pIRS-1( Tyr632 ) (Santa cruz biotechnology, Inc. Dallas, Texas), PI3 kinase, AKT, pAKT(Ser473), PPAR-γ (Cell signalling technology. Beverly, MA), GLUT4 (Santa cruz biotechnology, Inc. Dallas, Texas)을 1차 항체(antibody)로 이용하여 실온에서 1시간 30분 동안 반응시켰고, HRP-conjugated anti-mouse, anti-rabbit IgG (1:2000), anti-goat (1:3000)를 2차 항체로 사용하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, ECL Kit (WEST-oneTM, iNtRONBiotechnology)로 검출하였다.
< 실험예 1>
발아 유무, 부위 및 추출용매에 따른 포도당 유입활성 평가 결과
발아 유무, 부위 및 추출용매에 따른 일품 벼 추출물의 3T3-L1 지방세포에 대한 포도당 유입활성을 500 μg/mL의 농도에서 평가한 결과, 왕겨분획 에탄올 추출물만이 발아 전후에 40.97%에서 157.53%로 증가하였다. 부위와 추출용매에 따라서는 일품 무발아 에탄올 추출물을 제외하고 큰 차이를 보이지 않았으며, 대체적으로 물 추출물의 포도당 유입활성이 높게 나타났다. 그러나 일품 발아 왕겨와 싹을 포함한 분획의 에탄올 추출물이 가장 높은 활성을 나타냈기 때문에 이후 추가적인 정제 실험에 이용하였다(도 1 참조).
< 실험예 2>
용매분획에 따른 포도당 유입활성 평가 결과
에탄올 추출물을 순차용매분획한 후 그 분획물들의 3T3-L1 지방세포에 대한 포도당 유입활성을 100 μg/mL의 농도에서 평가한 결과, 에탄올 추출물의 경우 500 μg/mL의 농도에서 대조구에 대하여 153.86%로 포도당 유입을 증가시켰으며, 용매분획물의 경우 100 μg/mL의 농도에서 물 층(101.21%)을 제외한 모든 분획물이 활성증가를 보였으며, 특히 헥산, 클로로포름 및 부탄올의 경우 각각 169.29, 145.41 및 145.41%로 유의적으로 높은 포도당 유입활성 증가를 보였다(p<0.05)(도 2 참조). 용매분획물 중 활성이 가장 높았던 일품 발아 왕겨와 싹을 포함한 분획의 에탄올 추출물 중 엑산 분획물을 이후의 정제 실험에서 시료로 사용하였다.
< 실험예 3>
C18 칼럼 정제에 따른 포도당 유입활성 평가 결과
헥산 분획물을 칼럼 정제한 후 그 분획물들의 3T3-L1 지방세포에 대한 포도당 유입활성을 10 μg/mL의 농도에서 평가한 결과, C5분획에서 194.69%로 유의적으로 높은 포도당 유입을 증가시켰으며, 이후의 in vivo 항당뇨 효능 평가 실험에서 시료로 사용하였다(도 3 참조).
< 실험예 4>
당뇨모델 마우스를 이용한 활성분획( C5 ) 항당뇨 효능 평가 결과
시험기간 동안 정상대조군의 혈당은 평균 70.2～85.0 mg/dL의 변동을 나타내었고, 양성대조군의 혈당은 평균 175.2～512.9 mg/dL의 변동을 나타내어 양성대조군에서 통계학적으로 유의하게 높은 것으로 확인되었다(도 4 참조, p<0.01). 50 용량의 C5 투여군의 혈당은 평균 174.0～499.3 mg/dL의 변동을 나타내었으며, 양성대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이가 확인되지 않았고, 100 mg/kg 용량의 C5 투여군의 혈당은 평균 176.5～315.7 mg/dL의 변동을 나타내었으며, 양성대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하게 낮은 것으로 확인되었다(p<0.05: 7주 및 9주). 5 mg/kg 용량의 피오글리타존(pioglitazone) 투여군의 혈당은 평균 181.1～182.7 mg/dL의 변동을 나타내었으며, 양성대조군과 비교하여 투여 1주부터 9주까지 통계학적으로 유의하게 낮아진 것으로 확인되었다(p<0.05: 1주, p<0.01: 3주-9주).
시험물질 투여 8주차에 실시한 포도당내성 검사에서 정상대조군의 glucose 투여 0분(투여전), 30 분, 60분, 90분 및 120분의 혈당농도는 각각 평균 70.3 mg/dL, 155.3 mg/dL, 126.5 mg/dL, 119.3 mg/dL 및 102.2 mg/dL로 측정되었으며, 양성대조군의 혈당농도는 각각 평균 547.2 mg/dL, 737.2 mg/dL, 712.5 mg/dL, 654.6 mg/dL 및 636.0 mg/dL로 측정되어 양성대조군의 혈당농도가 모든 시점에서 통계학적으로 유의하게 높은 것으로 나타내었다(도 5 참조, p<0.01). 50 mg/mL 용량의 C5 투여군의 혈당은 각 시점별로 평균 475.1 mg/dL, 757.1 mg/dL, 675.0 mg/dL, 635.7 mg/dL 및 615.6 mg/dL로 측정되었고, 100 mg/kg 용량의 C5 투여군의 혈당은 각 시점별로 평균 419.1 mg/dL, 628.3 mg/dL, 585.6 mg/dL, 560.8 mg/dL 및 527.4 mg/dL로 측정되었으며, 양성대조군과 비교하여 다소 감소하였으나 통계학적으로 유의한 차이는 확인되지 않았다. 5 mg/kg 용량의 피오글리타존 투여군의 혈당은 각 시점별로 평균 256.1 mg/dL, 385.1 mg/dL, 368.1 mg/dL, 364.1 mg/dL 및 349.1 mg/dL로 측정되었으며, 양성대조군과 비교하여 투여 0분 및 120분에서 통계학적으로 유의하게 혈당이 낮은 것으로 확인되었다(p<0.05).
< 실험예 5>
웨스턴 블롯 분석을 통한 전사인자들의 발현량 평가 결과
인슐린 민감성 물질을 탐색하는데 3T3-L1 섬유아세포를 사용한 이유는 3T3-L1세포가 in vivo에 존재하는 대사성 피이드백 루프와 관려뇐 복잡한 문제와 연관되어 있지 않으면서 인슐린 수용체와 GLUT4를 세포질에 가지고 있어 인슐린에 민감하게 반응하기 때문에 인슐린을 처리하면 3T3-L1세포의 세포막에 존재하는 인슐린 수용체에 인슐린이 결합하고 이것은 인슐린 신호전달체계인 IRS-1 → PI3 kinase → AKT의 과정을 증폭시킨다. 이 결과로 GLUT-4가 세포막으로 translocation 되는 것이 증가하게 되어 포도당의 흡수를 증가시킨다.
일품 발아 벼로부터 추출된 활성분획(GIP-HS_E_H_C5)과 비교대조물질(pioglitazone)의 3T3-L1 지방세포에 대한 포도당 유입활성 증대를 통한 항당뇨 효능 메커니즘을 규명하고자 면역 형광법과 western blot을 이용하였다. 면역 형광 실험에서 보면 GLUT-4의 발현이 C5를 처리한 세포에서 증가함을 관찰할 수 있었으며(도 6 참조), 또한 pIRS-1의 발현도 C5의 처리에 의해 증가함이 관찰되었다(도 7 참조).
주요 전사인자에 대한 western blot을 통한 단백질의 발현에 있어서도 인슐린 1 ng/mL만을 처리한 세포에 비해 C5를 처리한 군에서 pIRS, PI3 kinase, pAKT, GLUT-4의 발현이 증가함을 확인되었다(도 8 참조). 이는 C5가 인슐린 수용체의 민감성을 증가시켜 나타난 결과로 생각된다. 또한 대조 물질로 사용한 피오글리타존(pioglitazone)은 대표적인 항당뇨 치료제로 PPAR-γ agonist로 작용하여 지방세포에서 포도당의 흡수를 증가시킨다고 알려져 있다. C5를 처리하였을 때 PPAR-γ의 발현이 증가됨은 인슐린 자극에 의한 포도당 흡수를 증가시키는 분획층로 정확한 물질은 밝히지 못하였지만 PPAR-γ의 활성을 향상시키는 것으로 판단된다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. (a) 벼를 발아시키는 단계;
    (b) 발아된 벼를 건조시키는 단계;
    (c) 건조된 발아벼를 현미기를 사용하여 왕겨분획과 현미분획으로 나누어 분리한 뒤 왕겨분획을 선택하는 단계;
    (d) 선택된 왕겨분획을 에탄올 추출하는 단계; 및
    (e) 상기 에탄올 추출물을 헥산으로 분획 및 농축시키는 단계를 포함하는, 발아 벼 왕겨 헥산 분획물을 포함하는 항당뇨 조성물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a)단계의 발아는 1 ~ 6일 동안, 35 ~ 40℃의 온도에서, 80 ~ 90%의 습도를 유지시켜 발아시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (e)단계 이후 C18 레진을 이용하여 칼럼 정제하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 100 mg/kg의 발아 벼 왕겨 헥산 분획물을 포함하는 조성물을 포함하며, 혈중 포도당을 지방세포로 유입시켜 혈중 포도당 수준을 조절하는 것인 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서,
    상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증, 당뇨성 혈관합병증인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 100 mg/kg의 발아 벼 왕겨 헥산 분획물을 포함하는 조성물을 포함하며, 혈중 포도당을 지방세포로 유입시켜 혈중 포도당 수준을 조절하는 것인 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품.
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Hyun Young Kim et al, ‘Antioxidant and Angiotensin Converting Enzyme I Inhibitory Activity on Different Parts of Germinated Rough Rice’, J Korean Soc Food Sci Nutr., 2011, Vol.40, No.6, 775-780*

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