KR101160575B1

KR101160575B1 - 소맥엽 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR101160575B1
Application number: KR1020110110385A
Authority: KR
Inventors: 이영미; 김대기; 서주원; 이선희
Original assignee: 원광대학교산학협력단; 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2012-06-28
Anticipated expiration: 2031-10-27
Also published as: WO2013062349A3; US20140295011A1; WO2013062349A2

Abstract

본 발명은 소맥(Triticum aestivum Lamarck) 잎의 알콜 추출물을 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 계통분획하여 얻은 분획물 중 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 또는 지방간증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.

Description

소맥엽 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물{COMPOSITION CONTAINING TRITICUM AESTIVUM LAMARCK EXTRACTS OR FRACTION THEROF AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 소맥엽 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.

비알콜성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease)은 가장 일반적인 간질환으로서 중성지질(triglyceride)의 함량이 전체 간 무게의 5%을 초과할 경우로 정의된다. 특히 비만이나 제2형 당뇨병은 비알콜성 지방간을 유도하는 가장 중요한 위험인자로 작용하기 때문에 지방세포의 분화에 대한 관심이 더욱 집중되고 있다. 비만은 에너지 섭취와 에너지 소비간의 불균형에 의해 에너지 섭취가 소비를 능가할 때 과도하게 체지방이 축적되는 현상으로 지방세포의 수와 크기가 증가하는 것으로 알려져 있다. 비만은 내장과 복부 지방의 축적에 따른 체형의 변화뿐만 아니라 인슐린 저항성, 이상지질혈증, 고혈압, 당뇨병, 동맥경화증 등 각종 질환의 발병률을 증가시키는 위험요소이다.

지방세포는 생물체의 일생을 통해 지방전구세포에서 지방세포로 지속적으로 분화된다. 지방세포 분화를 유도하는 외부 신호 중 인슐린은 가장 널리 알려져 있는 호르몬으로 지방세포의 대사조절에 중추적인 역할을 담당하고 있다. 인슐린은 또한 당질의 흡수와 중성지방의 합성을 증가시켜 지질의 형태로 에너지를 저장한다. 지방세포 내의 지방구(lipid droplet)는 지질의 대사 및 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 분화된 지방세포에서 중성지방의 합성과 이로 인한 세포내 지방의 축적을 조절한다. 이와 같이 지방세포 형성(Adipogenesis)은 세포 형태의 변화, 호르몬 민감성의 변화, 유전자 발현의 변화 및 단백질 발현의 변화 등의 복합적인 과정을 통해 일어나며, 비만, 당뇨 등의 대사성질환과 연계되어 있다. 지방세포의 형성은, CCAAT/enhancer binding proteins (C/EBPs)와 peroxidase proliferator-activated receptor-gamma(PPAR-g) 등의 전사인자의 발현이 증가하고 이들에 의해 지방산합성효소(FAS)가 유도되어 세포내 지질 축적이 조절되는 과정을 통해 이루어진다고 보고되고 있다.

소맥(Triticum aestivum Lamarck)은 화본과 식물로 주로 온대지방에서 재배되며 세계적으로 주식이용률과 생산량이 높은 작물이다. 소맥엽 주스가 암세포의 세포자살을 유도하여 항암치료에 효과가 있다고 알려져 항암치료에 이용하기도 하였고, 발암성 물질 7,2-dimethylbenz(a)anthracene의 활성을 억제한다는 보고가 있다. 또한 대장암 진행을 조절하거나 항염증 및 항산화 효과가 있다는 다양한 약리학적 효능이 보고되었다. 그러나 소맥엽 추출물과 지방세포의 지질 생성과의 관련성에 대해서는 아직 보고된 바 없다.

본 발명자들은 소맥엽 추출물을 이용하여 지방세포의 지질 축적 억제 효과를 조사하여 본 발명을 완성하였다.

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본 발명의 목적은 소맥엽 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 또는 지방간증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 소맥엽 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 소맥(Triticum aestivum Lamarck) 잎의 알콜 추출물을 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 계통분획하여 얻은 분획물 중 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 또는 지방간증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 알코올 추출물은 50% 에탄올 추출물일 수 있다.

상기 디클로로메탄 분획물은 PPARγ 단백질의 발현을 억제할 수 있다.

상기 디클로로메탄 분획물은 FAS 단백질의 발현을 억제할 수 있다.

또한 본 발명은 소맥( Triticum aestivum Lamarck ) 잎의 알코올 추출물을 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 계통분획하여 얻은 분획물 중 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 소맥엽 추출물 또는 이의 분획물을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

상기 소맥엽 추출물 또는 이의 분획물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 소맥엽 추출물 또는 이의 분획물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 소맥엽 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 분획물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 소맥엽 추출물의 양을 기준으로 0.1 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 30 내지 80 ㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 60 mg/kg이며, 하루 1 ~6 회 투여될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 분획물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 소맥엽 추출물 또는 이의 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 고지혈증의 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 소맥엽 추출물 또는 이의 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 지방간증의 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 소맥엽 추출물 또는 이의 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 고지혈증의 예방 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 소맥엽 추출물 또는 이의 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 지방간증의 예방 방법을 제공한다.

이 때, 상기 약학적으로 유효한 양이란 바람직하게는 0.1 내지 500 mg/kg 더욱 바람직하게는 1 내지 100 mg/kg이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 소맥엽 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 소맥엽 추출물 또는 이의 분획물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 추출물 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강식품 조성물은 건강음료 형태도 포함한다. 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 추출물 또는 분획물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물 또는 분획물은 천연 과일쥬스, 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다

본 명세서에서, 상기 "비만"이란, 그것이 유전적 요인에 의한 비만이든 또는 환경적 요인에 의한 비만이든 지방조직이 비정상적으로 증가된 상태를 의미하며, 체질량지수의 구분에 따른 비만(BMI이 30.0 이상인 경우)과 과체중(BMI이 25~30인 경우)을 포함하는 의미이다.

또한 본 명세서에서, 상기 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또한 본 명세서에서, 상기 "비만 개선"이란 비만의 예방, 비만의 치료를 포함하여, 체지방의 감소 및/또는 체중의 감소를 포함하는 의미이다.

본 발명의 비만 개선제 조성물은 그 유효성분을 비만 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.990 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 비만 개선 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 고지혈증 또는 지방간증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 효과가 있다. 또한 본 발명의 조성물은 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 소맥엽 추출물 및 분획물을 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2은 다양한 농도의 H₂O(a), 50% EtOH(b) 및 100% EtOH(c) 소맥엽 추출물로 처리한 3T3-L1 지방전구세포의 세포생존률을 나타내는 그래프이다.
도 3은 소맥엽의 H₂O, 50% EtOH 및 100% EtOH 추출물이 3T3-L1 지방세포의 지방축적에 끼치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 4는 소맥엽의 50% EtOH 추출물의 CH₂Cl₂, EtOAc, 및 BuOH 분획물이 3T3-L1 지방세포의 지방축적에 끼지는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 소맥엽의 50% EtOH 추출물의 CH₂Cl₂분획물이 3T3-L1 지방전구세포의 분화에 끼치는 영향을 나타낸 것이다.
도 6은 소맥엽의 50% EtOH 추출물의 CH₂Cl₂분획물이 분화된 3T3-L1 지방세포의 triglyceride 함량에 끼치는 영향을 나타낸 것이다.
도 7은 소맥엽의 50% EtOH 추출물의 CH₂Cl₂분획물이 3T3-L1 세포에서 FAS(fatty acid synthase) 및 PPAR-g(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블랏법으로 확인한 것이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

1-1: 실험 재료

금강 우리밀 품종을 국립식량과학원에서 공급받아 일정 온도(평균 20±2℃)를 유지하며 무균 유기농 발아용 피트머스 위에서 발아, 재배하였다. 발아 후 2주간 재배된 소맥엽을 수확하여 동결건조하고, 일정 크기로 분쇄하여 분말화하였다.

3T3-L1 지방전구세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 분양받았다. 세포배양을 위한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Media) 및 FBS(fetal bovine serum)는 Hyclone (Logan, UT, USA)에서 구입하였고, penicillin (100 unots/ml)-streptomycine(100 μg/ml)은 WelGENE(Daegu, Korea)에서 구입하였다. 세포증식 분석시약 CCK-8(Cell Counting Kit-8)은 Dojindo사 (Tokyo, Japan)에서 구입하였으며 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 위하여 사용된 insulin, dexamethasone 및 IBMX와 지방세포 내 triglyceride 생성을 확인하기 위하여 사용된 Oil Red O는 Sigma-Aldrich (St. Luis, MO, USA)에서 구입하였다.

1-2: 추출물 제조

실시예 1-1에서 얻은 소맥엽을 이용한 추출물은 도 1과 같이 3가지(물, 50% 에탄올, 100% 에탄올)로 제조하였다. 물 추출물은 소맥엽 동결 분말 시료(30 g)를 1 L의 정제수로 1 시간 동안 가온 추출하여 여과한 후, 회전감압농축기(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축 하여 3.2 g을 얻었다. 50% 에탄올과 100% 에탄올 추출물은 소맥엽 동결 분말 시료(30 g)를 50% 에탄올, 100% 에탄올로 1 시간 초음파 추출하여 여과한 후 회전감압농축기(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축하여 각각 10 g, 4.5 g을 얻었다. 이 중 50% 에탄올 추출 건조물 10 g을 3번 증류한 순수한 물에 현탁시킨 다음 계통분획법에 의하여 디클로로메탄(CH₂Cl₂)(0.75 g), 에틸아세테이트(EtOAc)(3 g), 부탄올(BuOH)(5 g) 분획물을 얻었다. 보다 완전한 건조를 위해 동결건조를 실시하고, 생산된 소맥엽 추출물 및 분획물은 실험 직전까지 빛으로 부터 차단된 4℃에 보관하였다.

1-3: 3T3-L1 세포배양과 분화 유도

3T3-L1 지방전구세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD)의 배양과 유지는 10% BCS(bovine calf serum)을 넣은 DMEM 배지로 5% CO2, 37℃에서 60% 세포가 자랐을 때 계대배양을 하도록 하였다. 세포를 탈착시켜 24-웰 플레이트에 웰 당 2×10⁴ 세포를 분주하여 세포가 100% 밀집되게 배양하였다. 이러한 조건하에서 3T3-L1은 전구지방세포(preadipocyte) 상태를 유지한다고 알려져 있다. 3T3-L1 세포가 confluent stage에 도달하면 2일 후 10% FBS와 MDI 용액(0.5 mM IBMX, 0.1 μM dexamethasone, 10 μg/mL insulin)을 포함한 DMEM 배지를 2일 동안 처리하였고 다시 10% FBS와 10 μg/mL 인슐린을 포함한 DMEM을 2일 동안 처리하였다. 그 후 10% FBS를 포함한 DMEM으로 교환하고 모두 8일 동안 배양하여 세포 내 지방구의 형성을 근거하여 지방세포로 분화를 확인하였다.

1-4: 세포생존률 분석

추출물에 의한 3T3-L1 지방전구세포의 세포독성을 확인하기 위해 CCK-8 키트를 사용하였다. 세포를 96 웰 플레이트에 5×10³ cells/well로 분주하여 24 시간 동안 안정화시킨 후, 시료를 농도별로 희석한 배지를 처리하여 5% CO₂, 37℃ 조건의 인큐베이터에서 48 시간을 배양하였다. 배양 후 CCK-8 시액 10 μl를 각 웰에 첨가하여 다시 1 시간 배양하고 그 배양액을 450 nm에서 흡광도 측정하였다.

1-5: Oil red O 염색

세포 내 지방구 생성을 확인하기 위하여 중성지방과 반응하는 Oil Red O 염색을 실시하였다. 분화 시작일로부터 8일째 되던 날 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 상온에서 1시간 동안 4% 포름알데히드로 세포를 고정하고, 60% 이소프로판올로 세척하였다. Oil red O 시액으로 20분간 염색시킨 후 증류수로 3회 세척한 다음 염색된 세포를 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 또한 정량적 분석을 위하여 100% 이소프로판올을 이용하여 지방을 추출한 후 96 웰 플레이트에 200 μl씩 옮겨서 ELISA 리더로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Oil red O 시액으로 지방 함량은 대조군의 평균 흡광도에 상대적인 백분율로 나타내었다.

1-6: FAS 및 PPAR-g 발현량 분석

분화된 지방세포에 발현하는 지방합성효소(fatty acid synthetase, FAS)를 확인하기 위해 웨스턴 블랏법으로 분석하였다. 3T3-L1 세포를 MDI 존재하에서 48시간 배양후 PBS 용액으로 2회 세척한다. PRO-PREP 단백질 추출 용액(iNtRON Biotech., Gyeonggi-do, Korea)을 넣고 4℃에서 20분간 용해시킨 후 4℃에서 20분간 원심분리하여 세포 용해물인인 상층액를 수거하여 단백질을 정량하였다. 각각의 세포 시료에서 단백질 30 μg를 취하여 SDS 로딩 버퍼와 혼합 후 10% 또는 7.5% SDS 폴리아미드 겔에 로딩하여 전기영동하고 PVDF 막에 트랜스퍼하였다. 항원-항체반응을 실시하기 위해 5% 스킴 밀크 용액에 1 시간 블랏킹하고 1차 항체로 rabbit anti-fatty acid synthase (FAS) mAb 또는 rabbit anti-PPARg mAb (Cell Signaling, Danvers, MA)를 사용하여 4℃에서 18 시간 반응시켰다. 이후 막을 세척하고 2차항체로 HRP가 결합된 goat anti-rabbit IgG polyAb로 40분간 반응시켜 Chemiluminescent detection kit (Invitrogen Co., CA, USA)를 넣고 특정 단백질을 발색시켰다.

1-7: 통계 처리

실험결과는 평균(mean)ㅁ표준편차(SD)로 나타내었고 통계적 유의성은 Student's t-test를 이용하여 그룹간의 차이를 통계처리한 후 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.

실시예 2: 세포독성 시험

3T3-L1 지방전구세포를 이용하여 소맥엽 물 추출물, 50% 에탄올 추출물 및 100% 에탄올 추출물의 세포독성 범위를 확인하기 위하여, 세포증식 분석용 CCK-8 키트를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다(도 2). 추출물 각각 0, 0.05, 0.5 및 5 mg/mL 농도에서 세포와 48시간 배양하여 측정한 결과 모든 추출물에서 0.5 mg/mL의 농도까지 세포의 생존율에 영향을 미치지 않았다. 따라서 이후의 3T3-L1 지방전구세포의 분화 유도실험에서는 세포독성이 없는 농도범위인 0.5 mg/mL까지 사용하였다.

실시예 3: 지방생성 억제효과

3T3-L1 지방전구세포에 소맥엽 물 추출물, 50% 에탄올 추출물 또는 100% 에탄올 추출물을 0.5 mg/mL에서 처리한 후, 실시예1-1의 방법에 따라 세포 분화를 유도하고 세포 내의 지방구 및 중성지방의 축적에 미치는 영향을 확인하기 위해 Oil-Red O 시약으로 염색하였다. 그 결과 MDI 분화유도제만 처리한 세포에서 배양4일째부터 지방구 형성이 관찰되었으며 Oil Red O 염색에 의해 중성지방 축적이 확인되었다. 도 3에서 같이 MDI 존재 하에서 물 추출물와 100% 에탄올 추출물을 처리한 세포에서는 지방세포 분화에 영향을 미치지 않았다. 그러나 세포 50% 에탄올 추출물 처리군에서만 3T3-L1 의 지방세포로의 분화를 억제하였으며 Oil Red O에 의해 염색된 중성지방의 함량이 미분화 세포 수준으로 현저히 억제하였다. 따라서 소맥엽 50% 에탄올 추출물에 지방세포 분화를 억제하는 활성물질이 존재한다고 생각되어, 이를 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(BuOH)순으로 분획물을 취하고, 각각에 대한 지방세포 분화에 미치는 영향을 조사하였다. 우선 각각의 분획에 대한 세포독성을 확인하기 위해 소맥엽 50% 에탄올 추출물에서 시행한 방법과 동일하게 0, 5, 50, 500 mg/mL 농도에서 세포 생존률을 확인하였다. 그 결과는 에틸아세테이트과 부탄올 분획물들은 최고 농도에서 세포의 생존율에 영향을 미치지 않았지만 디클로로메탄 분획물은 50 mg/mL 농도까지 세포의 생존율에 영향을 미치지 않았다. 따라서 3T3-L1 지방전구세포의 분화 유도실험에서 세포독성이 없는 농도범위인 50 mg/mL 농도에서 지방세포 분화 억제효과를 조사하였다(도 4). 그 결과 50% 에탄올 추출물 유래 50 mg/mL 디클로로메탄 분획물을 처리한 세포에서 세포분화를 유의적으로 억제함을 관찰하였다. 또한 MDI에 의해 분화가 유도된 세포에서 Oil Red O에 의해 염색된 중성지방의 함량과 비교해서 디클로로메탄 분획물을 처리한 세포 내에서 중성지방 상대함량이 88%의 감소를 나타내었다. 반면에 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물은 전혀 영향을 미치지 않았다. 한편 Oil-Red O 염색에 대한 현미경적 관찰에서도 디클로로메탄 분획물이 0, 10, 25 또는 50 mg/mL의 농도범위에서 농도 의존적으로 3T3-L1세포의 지방 축적을 억제하는 것으로 확인 되었다(도 5).

실시예 4: 지방세포 분화 억제 효과

지방세포에 중성지방(triglyceride)이 축적되는 과정은, 세포 내로 유입되는 포도당의 대사 과정과 세포내 de novo 지방산 합성과정 등으로 인해 계속적으로 중성지방이 생성되어 지방구에 축적되어 시간이 지날수록 지방구끼리 결합하여 그 크기가 점점 증가하게 된다. 지방세포의 지방구는 중성지방과 perilipin A등과 같은 지질, 단백질로 구성되어 있기 때문에 중성지방의 감소를 세밀하게 확인하기 위해 triglyceride의 함량을 효소분석법으로 측정하였다(도 6). Oil Red O 염색법에 의한 결과와 마찬가지로 10-50 μg/mL의 농도에서 분화된 3T3-L1세포내의 중성지방의 함량이 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다.

지방세포분화의 첫 단계는 인슐린의 반응에 의하여 전사인자 발현으로 C/EBPβ와 C/EBPδ의 발현에 이어C/EBPα, PPARγ가 연쇄적으로 유도된다고 알려져 있다. 이들 전사인자들의 반응은 지방세포 분화에 관여하는 단백질 합성을 유도하며, 중성지방을 합성하는 효소 FAS의 지속적인 발현을 자극한다. 지방세포가 분화하는 과정에서 PPARγ 및 FAS의 단백질 발현에 50% 에탄올 추출물 유래 디클로로메탄 분획물이 미치는 영향을 웨스턴 블랏법으로 조사하였다(도 7) 3T3-L1 지방전구세포에 MDI+10% FBS 존재하에서 2일간, insulin+10% FBS 존재 하에서 2일간 총 4일간 배양하고 분화되는 세포에서 PPARγ 및 FAS의 발현 수준을 분석한 결과 MDI 분화유도제만 처리한 세포에서 PPARγ 및 FAS의 단백질 발현이 현저히 증가하는 것을 확인되었다. MDI 존재하에서 디클로로메탄 분획물을 20 과 50 μg/mL 처리한 세포 내에서 농도 의존적으로 PPARγ 및 FAS 단백질 발현이 억제되었다. 특히 50% 에탄올 추출물 유래 디클로로메탄 분획물을 50 μg/mL 처리한 세포는 PPARγ 및 FAS 단백질 발현 수준이 음성대조군 3T3-L1 지방전구세포와 유사한 수준으로 억제되는 것을 확인하였다. 이와 같이 소맥엽의 50% 에탄올 추출물에서 디클로로메탄 분획물만이 현저하게 유의적인 지방 축적의 감소를 보인 것은 매우 흥미로운 발견이다. 50% 에탄올 추출물에만 지방세포 분화를 억제한 것은 2가지 가설이 가능하다. 첫째는 유효물질이 극성 물질로 알코올과 물에 양쪽에 잘 녹는 특성 있는 것으로 생각된다. 둘째는 100% 에탄올 및 물에 녹는 지방분화 억제물질을 중화 또는 세포보호물질들이 함유되어 있을 가능성 있다.

제제예 1: 약학적 제제의 제조

본 발명의 소맥엽 추출물의 디클로로메탄 분획물을 포함하는 약학적 제제는 다음과 같이 제조하였다.

1. 산제의 제조

실시예 1의 소맥엽 디클로로메탄 분획물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

실시예 1의 소맥엽 디클로로메탄 분획물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

실시예 1의 소맥엽 디클로로메탄 분획물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 환의 제조

실시예 1의 소맥엽 디클로로메탄 분획물 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환당 4 g이 되도록 제조하였다.

5. 과립의 제조

실시예 1의 소맥엽 디클로로메탄 분획물 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

제제예 2: 식품의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 본 발명의 실시예 1의 소맥엽 디클로로메탄 분획물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 소맥엽의 디클로로메탄 분획물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%),

종실류(들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%),

소맥엽의 디클로로메탄 분획물의 건조분말(3 중량%),

영지(0.5중량%),

지황(0.5중량%)

Claims

소맥(Triticum aestivum Lamarck) 잎의 알콜 추출물을 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 계통분획하여 얻은 분획물 중 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 또는 지방간증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 알코올 추출물은 50% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 고지혈증 또는 지방간증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 디클로로메탄 분획물은 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 또는 지방간증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 디클로로메탄 분획물은 FAS(fatty acid synthase) 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 또는 지방간증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
소맥(Triticum aestivum Lamarck) 잎의 알코올 추출물을 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 계통분획하여 얻은 분획물 중 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
제5항에 있어서, 상기 알코올 추출물은 50% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
제5항에 있어서, 상기 디클로로메탄 분획물은 PPARγ 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
제5항에 있어서, 상기 디클로로메탄 분획물은 FAS 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.