CN113226346A - 用于改善更年期疾病的包含红色三叶草提取物和蛇麻草提取物组合的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于改善女性更年期(绝经期)失调的组合物，其包含红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合作为有效成分，更具体地，涉及一种用于改善女性更年期疾病的食品组合物或用于预防或治疗女性更年期疾病的药物组合物，以及制备用于改善女性更年期疾病的所述组合物的方法，其中该组合物包含红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合作为活性成分。

Description

用于改善更年期疾病的包含红色三叶草提取物和蛇麻草提取 物组合的组合物

技术领域

本发明涉及一种用于改善女性更年期(绝经期)疾病的组合物，其包含红三叶草(red clover)提取物和蛇麻草(hops)提取物的组合作为有效成分，更具体地，涉及一种用于改善女性更年期疾病(women’s menopausal disorder)的食品组合物或用于预防或治疗女性更年期疾病的药物组合物，以及制备用于改善女性更年期疾病的所述组合物的方法，其中该组合物包含红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合作为活性成分。

这项研究由韩国中小企业与创业部(MSS)在韩国技术进步研究院(KIAT)监督下的“区域专业化产业发展计划(R&D，P0003019)”下提供资金支持。

背景技术

更年期(menopause)是月经的中断，其是在妇女出生后约50年由遗传决定的卵巢功能达到寿命终点时发生的。更年期意味着丧失生育能力，是一种生理变化，而不是病理现象。目前，韩国女性的预期寿命为85.4岁(2016年，韩国统计局)。假设韩国妇产科学院将韩国女性的平均绝经年龄定为50岁，这意味着女性一生中有三分之一以上的时间女性荷尔蒙枯竭。

更年期期间，由于分泌失衡和女性荷尔蒙减少，整个身体都会发生变化，包括血管系统、肌肉骨骼系统、泌尿生殖系统和颅神经。换言之，更年期伴随着多种疾病，包括血管舒缩症状和心理症状，例如潮热、盗汗、睡眠失调、疲劳、抑郁、焦虑、注意力不集中和记忆力减退；泌尿生殖器萎缩引起的排尿困难和尿频；胶原蛋白减少导致皮肤弹性丧失和乳房下垂；心血管和肌肉骨骼症状；以及痴呆症。尽管更年期(绝经期)症状因人而异，但有报道表明，更年期症状越多，疾病越严重，病程越长，妇女的生活质量越差。另外，绝经期症状随着身体衰老更容易发展成慢性疾病。

为了改善这些更年期疾病，已使用激素疗法来补充缺乏的雌激素，但长期使用已导致子宫癌、乳腺癌、中风、肺血栓栓塞和各种副作用。因此，近来，植物来源的植物雌激素作为替代物引起了关注。众所周知，植物雌激素在结构上与雌激素相似，并与雌激素受体ER-α和ER-β结合，显示出较弱的类似雌激素的作用，从而抑制和改善女性更年期的各种代谢综合症，并且显示出相对良好的骨质保持效果。甘草、蛇麻草、石榴和红三叶草为已知含有这种植物雌激素的植物。在这方面，韩国专利公开出版物第2016-0011756A号公开了一种用于预防和改善女性更年期或更年期症状的功能性食品组合物，其包括大豆异黄酮提取物、蛇麻草提取物和甘草提取物。另外，正在进行使用各种含植物雌激素的植物来改善更年期疾病的研究。

现有技术文件：

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发明内容

技术问题

本发明旨在提供一种红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合，从而提供一种可以改善妇女的更年期疾病和更年期症状而没有副作用，并且与单独使用两种提取物时相比更有效的组合物。

然而，本发明要解决的问题不限于上述问题，并且本领域技术人员将从以下描述中清楚地理解未提及的其他问题。

技术方案

本发明的第一方面涉及一种用于改善女性更年期疾病的组合物，其包含红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合作为活性成分。

本发明的第二方面涉及一种用于改善女性更年期疾病的食品组合物，其包含根据第一方面的组合物。

本发明的第三方面涉及一种用于预防或治疗女性更年期疾病的药物组合物，其包含根据第一方面的组合物。

本发明的第四方面涉及一种制备用于改善女性更年期疾病的组合物的方法，其包括以下步骤：(a)粉碎红三叶草的叶子，然后将其用醇提取以制备红三叶草的提取物；(b)用醇提取蛇麻草花和蛇麻草芽，以制备蛇麻草提取物；(c)将红三叶草提取物和蛇麻草提取物混合。

本发明的第五方面涉及一种红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合，其用于改善、预防或治疗女性更年期疾病。

本发明的第六方面涉及一种改善、预防或治疗个体中的女性更年期疾病的方法，其包括向个体施用有效量的红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合。

上述问题的解决方案仅是示例性的，不应解释为限制本发明。除了上述示例性实施例之外，在附图和本发明的详细描述中可能还存在其他实施例和示例。

本发明的有益效果

包含红三叶草提取物和蛇麻草提取物的本发明组合物在改善妇女更年期疾病方面，其协同作用(协同效应)大于单独使用两种提取物时的预期作用，从而能够有效改善典型的女性更年期疾病，例如血液循环疾病、体重增加、潮热、高脂血症和骨质疏松症。

附图说明

图1示出了红三叶草提取物中黄豆苷元、染料木黄酮、芒柄花黄素和鹰嘴豆芽素A的含量的高效液相色谱(HPLC)分析的结果。

图2示出了蛇麻草提取物中异黄腐酚(Isoxanthohumal)、8-异戊烯基柚皮素(8-Prenylnaringenin)和黄腐酚(Xanthohumol)的含量的HPLC分析结果。

图3示出了红三叶草提取物和蛇麻草提取物组合中鹰嘴豆芽素A和黄腐酚的含量的HPLC分析结果。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本发明的实施方式，以便本领域技术人员可以容易地实施本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式来实现，并且将不限于在此示出的实施例。

在整个说明书中，当部件被表述成“包括”某个部件时，这并不意味着该部件排除其他部件，而是意味着该部件可以进一步包括其他部件，除非另有说明。

在整个规范中，术语“改善”或“治疗”是指通过施用组合物减轻或有益地改变女性更年期疾病的任何作用，术语“预防”是指通过施用组合物来抑制或延迟妇女更年期疾病发作的任何作用。

在下文中，将参照实施例、示例和附图详细描述本发明的用于改善女性更年期疾病的组合物、食品组合物和包含该组合物的药物组合物及其制备方法。然而，本发明不限于这些实施例、示例和附图。

本发明的第一方面提供一种用于改善女性更年期疾病的组合物，其包含红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合作为活性成分。

红三叶草(Trifolium pretense L)是豆科植物的多年生植物，也被称为红茶竹草(Black Tea Chukcho)、红兔药草(red rabbit herb)、红参叶(red ginseng leaf)或金币药草(gold coin herb)。它原产于地中海沿岸和西南亚，是一种直立草本植物，在世界各地广泛分布和栽培。红三叶草也被用作饲料，并且在春季，将嫩叶煮沸后可以作为药草食用。红三叶草可分为地上部分和根部部分。作为本发明的提取物，可以优选使用红三叶草的地上部分，例如叶提取物，但是本发明不限于此。

蛇麻草(Homulus lupulus L)是一种藤本植物，原产于欧洲、澳大利亚和北美。蛇麻草提取物中存在的许多化合物表现出各种生理活性，例如抗癌、改善骨质疏松、抗氧化和增白，其中已知8-异戊烯基柚皮素、异黄腐酚(isoxanthohumol)等具有雌激素活性。作为本发明的提取物，可以使用从花或芽中获得的提取物，但是本发明不限于此。

根据本发明的实施例，该组合物可以包含重量比为10:1至1:5的红三叶草提取物和蛇麻草提取物，并且例如，该重量比可以是10:1至1:2、10:1至1:1、5:1至1:5、5:1至1:1、5:1至2:1、3:1至1:5、3:1至1:1、3:1至2:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2或1:3，但不限于此。

根据本发明的实施例，更年期疾病可以是以下的一种或多种更年期症状：血液循环疾病、体重增加、潮热、骨质疏松症、血胆固醇升高、出汗、失眠、神经质、抑郁、头晕、注意力不集中、关节痛、头痛、心悸、阴道干燥、疲劳、兴奋、睡眠失调、记忆力减退、记忆失调、健忘、冷汗、心脏狂跳、尿频、焦虑和动脉粥样硬化，但不限于此。更年期疾病可以包括由雌激素缺乏直接或间接引起的任何更年期症状。

根据本发明的一个实施方案，红三叶草提取物可以从红三叶草叶子中提取，但不限于此。

根据本发明的一个实施方案，蛇麻草提取物可以从蛇麻草花、蛇麻草芽或这两者中提取，但不限于此。

根据本发明的一个实施方案，红三叶草提取物和蛇麻草提取物可以分别是红三叶草提取物粉末和蛇麻草提取物粉末，但是可以不限于此。

本发明的第二方面提供一种用于改善女性更年期疾病的食品组合物，其包含根据第一方面的组合物。

省略了与本发明的第一方面重复的部分的详细描述，但是，即使对于本发明的第二方面省略了对本发明的第一方面说明的描述，也可以将其等同地应用于本发明的第二方面。

可以包含红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合的食品组合物包括，例如，各种食物、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、糖浆剂、饮料、树胶、茶、维生素复合物、保健功能食品等，但它们不限于此。该组合也可以添加到食品或饮料中。

食品或饮料中组合的量可以为食品总重量的约0.01％至30％，并且在饮料组合物的情况下，组合的量相对于100ml可以为0.01至30g左右，但不限于此。

当本发明的食品组合物是饮料组合物时，除了以上述比例包含上述提取物的组合作为基本成分外，对其他成分没有特别限制。像普通饮料一样，它可以包含各种调味剂或天然碳水化合物作为其他成分。上述天然碳水化合物的实例包括单糖，例如葡萄糖和果糖；双糖，例如麦芽糖和蔗糖；以及多糖，例如包括糊精和环糊精的常规糖，包括木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇的糖醇。作为上述调味剂以外的调味剂，可以使用天然调味剂(索马甜(tauumatin)、甜菊提取物(例如，莱鲍迪甙A、甘草甜素等))和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)，但不限于此。相对于每100ml包含本发明的提取物的组合的饮料组合物，天然碳水化合物的比例通常可以在约1至20g的范围内，但不限于此。

包含红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合的组合物可以包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、包括合成香料和天然香料的香料、着色剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等，但不限于此。

本发明的第三方面提供一种用于预防或治疗女性更年期疾病的药物组合物，其包含根据第一方面的组合物。

省略了与本发明的第一方面重复的部分的详细描述，但是，即使对于本发明的第三方面省略了对本发明的第一方面示出的描述，也可以将其等同地应用于本发明的第三方面。

根据本发明的药物组合物可以包含药学有效量的红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合，或者可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。术语“药学上可接受的”是指生理上可接受的无毒组合物，并且当施用于人时，不会抑制活性成分的作用，并且通常不会引起胃肠道失调，诸如头晕的过敏反应或任何类似反应。“药物有效量”是指表现出比阴性对照更高的反应的量，并且优选地是足以表现出预防和/或治疗更年期疾病的作用的量。

如本文所用，术语“载体”可以定义为有助于将活性化合物添加到细胞或组织中的化合物，并且可以不受限制地从有利于将许多有机化合物引入生物体的细胞或组织中的常用载体中选择和使用这些载体。

如本文所用，术语“赋形剂”可以定义为

如本文所用，术语“稀释剂”可以定义为不仅使活性化合物的生物学活性形式稳定而且还将其稀释在水中以溶解的化合物。溶解在缓冲溶液中的盐在本领域中用作稀释剂，并且通常使用的缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水，其模仿人体流体的盐状态，但不限于此。由于较低浓度的缓冲盐控制溶液的pH，因此缓冲液稀释剂可以不改变活性化合物的生物活性。

该载体、赋形剂和稀释剂可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉，阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、苯甲酸甲酯、苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。可以使用稀释剂或赋形剂，例如常用的填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等来制备制剂。

根据本发明的药物组合物可以以口服制剂的形式使用，例如片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂或饮料；口服制剂；外部准备；栓剂；以及无菌注射溶液，每种均根据常规方法配制。

根据本发明的一个实施例，药物组合物可以用于口服给药、腹膜内给药、静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、皮内给药、鼻内给药、肺部给药或直肠给药，但不限于此。

用于口服的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且这些固体制剂可以通过将上述提取物与至少一种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶混合来制备。除了简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石粉。用于口服的液体制剂包括混悬剂、口服溶液剂、乳剂、糖浆剂等，并且可以包含水，水是常用的简单稀释剂；液体石蜡；以及各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂。肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶液、悬浮液、乳剂、冻干制剂和栓剂。对于非水溶液和悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、例如橄榄油的植物油、可注射酯如油酸乙酯等。对于栓剂的基质，可以使用维比索尔(witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂精脂(laurin butter)、甘油明胶等。

根据本发明的一个实施例，可以将药物组合物配制成用于口服给药的片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂或饮料剂，但不限于此。

本发明药物组合物的优选剂量根据患者的状况和体重、疾病的程度、药物的形式、给药途径和持续时间而变化，并且可以由本领域技术人员适当地选择。

例如，药物组合物可以是约20至1000mg/kg/天、约50至1000mg/kg/天、约100至1000mg/kg/天、约300至1000mg/kg/天、约500至1000mg/kg/天、约800至1000mg/kg/天、约20至100mg/kg/天、约20至200mg/kg/天、约20至500mg/kg/天、约20至800mg/kg/天、约50至500mg/kg/天、约100至500mg/kg/天、约200至500mg/kg/天或约250至500mg/kg/天，但不限于此。药物组合物可以每天给药一次或可以分成几部分并给药数次。上述剂量在任何方面均不限制本发明的范围。

本发明的第四方面提供一种制备用于改善女性更年期疾病的组合物的方法，其包括以下步骤：(a)粉碎红三叶草的叶子，然后将其用醇(alcohol)提取以制备红三叶草的提取物；(b)醇用醇提取蛇麻草花和蛇麻草芽，以制备蛇麻草提取物；和(c)将红三叶草提取物和蛇麻草提取物混合。

例如，醇提取可以使用约50％至90％的醇(alcohol)或约60％至70％的醇(alcohol)进行，对于红三叶草的提取，约60％的醇可能是优选的，对于蛇麻草的提取，约70％的醇可能是优选的。

例如，提取可以在约50至90℃、约60至80℃或约70℃下进行，并且提取进行至少一次，例如两次、三次、四次或更多次。提取时间可以为约1小时至10小时、约2小时至6小时或约4小时。

根据本发明的一个实施例，步骤(a)和(b)可以进一步包括在醇提取之后过滤、浓缩和干燥提取物的附加步骤，但不限于此。

过滤步骤可以通过本领域已知的任何过滤方法来进行，而没有限制，并且例如，可以使用滤纸来进行。浓缩步骤也可以通过本领域已知的任何浓缩方法进行，而没有限制，例如可以使用真空浓缩。

当提取物被干燥时，可以最终制备提取物粉末。

本发明的第五方面提供一种红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合，其用于改善、预防或治疗女性更年期疾病。

本发明的第六方面通过一种改善、预防或治疗个体中的女性更年期疾病的方法，其包括向个体施用有效量的红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合。

即使在本文中省略了对本发明的第一至第三方面的示出的详细描述，也可以将这些描述等同地应用于本发明的第五和第六方面。

在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明，但是提供以下实施例仅用于说明性目的，并不旨在限制本发明的范围。

实施例：

制备例1：红三叶草提取物的制备

通过研磨机将红三叶草粉磨碎，然后使用10L 60％的醇(alcohol)(DaehanAlcohol Life Co.,Ltd.,韩国)在70℃下回流提取两次，持续4小时，以提取1千克原料。通过滤纸(ADVANTEC 2，280mm，中国)在减压下过滤提取物，将滤液真空浓缩(rotavaper R-220SE,BUCHI,瑞士)，并且在干燥器(Daeil Engineering，韩国)中干燥以获得粉末形式的提取物。

制备例2：蛇麻草提取物的制备

使用10L的70％醇在70℃下回流提取两次，持续4小时，以提取1kg充分干燥的蛇麻草花和芽。通过滤纸过滤提取物，将滤液在真空中浓缩并在干燥器中干燥以获得粉末形式的提取物。

制备例3：红三叶草提取物和蛇麻草提取物组合的制备

将分别在制备例1和制备例2中获得的红三叶草提取物和蛇麻草提取物以2:1或3:1的重量比混合以制备红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合。这些组合用于下述体外测试和体内测试的功效评价。

实验例1：红三叶草提取物的HPLC分析

使用Agilent HPLC 1200系列/DAD检测器(Aligent Technologies，美国)测量红三叶草提取物中的主要成分含量。芒柄花黄素(Wuhan Chemfaces Biochemical Co.，Ltd.中国)、鹰嘴豆芽素A(Sigma-aldrich，美国)、金雀异黄素(Wuhan Chemfaces BiochemicalCo.，Ltd.中国)和黄豆苷元(Wuhan Chemfaces Biochemical Co.，Ltd.中国)是红三叶草中包含的代表性异黄酮。因此，对四种异黄酮进行了定量分析。

分析使用了C184.5×250mm、5μm色谱柱(Phenomenex，美国)、C-18保护柱芯(Security Guard Cartridge)4.0×3.0mm(Phenomenex，美国)、保护柱芯套(SecurityGuard Cartridge Holder)(Phenomenex，USA)。(A)乙腈(用于HPLC的ACN，J.T.Baker，美国)和(B)含0.1％磷酸(Sigma-Aldrich，美国)的蒸馏水(aquaMAX^TM-ultra，YoungRinMachinery，韩国)用作流动相。溶剂的梯度条件在下面的表1中示出。在25℃的柱温下，使溶剂以每分钟0.8ml的速度流动，注入10μl，并且在260nm下测定吸光度。

表1

时间(分钟)	A％	B％
			0	25	75
30	70	30
			32	25	75
40	25	75

使用浓度为1mg/1ml的100％甲醇(MeOH，用于HPLC，J.T.Baker，美国)，通过超声波(power sonic 520，韩国)提取标准品10分钟。将每种标准品等分(aliquoted)并存储在-20℃的冰箱中，并稀释用于分析。将提取物样品置于50ml容量瓶中，使其浓度约为200mg/50ml，并通过加入40ml的100％甲醇进行超声处理20分钟。当冷却至室温时，向烧瓶中加入100％甲醇至指示线并充分混合。然后，将提取物样品通过0.45μm的PTFE过滤器(Whatman,英国)过滤并进行分析。区域和季节性红三叶草提取物主要成分的HPLC分析结果示于下表2和图1中(1：黄豆苷元，2：染料木黄酮，3：芒柄花黄素，4：鹰嘴豆芽素A)。

表2

*：红三叶草提取物样品，**：商业产品样品

实验例2:蛇麻草提取物的HPLC分析

使用Agilent HPLC/PDA系统测量蛇麻草提取物中三种主要成分的含量。蛇麻草的代表性成分有异黄腐酚(IXN)(Wuhan Chemfaces Biochemical Co.,Ltd.中国)、8-异戊烯基柚皮素(8-PN)(Wuhan Chemfaces Biochemical Co.,Ltd.中国)和黄腐酚(Sigma-Aldrich,美国)。分析使用Luna C18 4.5×250mm、5μm色谱柱、C-18保护柱芯4.0×3.0mm和保护柱芯套。(A)100％ACN和(B)含有0.25％甲酸的蒸馏水(Wako，日本)用作流动相。溶剂的梯度条件在下面的表3中示出。在30℃的柱温下，使溶剂以每分钟1ml的速度流动，注入10μl，并且在370nm下测定吸光度。

表3

时间(分钟)	A％	B％
			0	25	75
3	25	75
			33	70	30
40	90	10
			45	90	10
45.5	25	75
			50	25	75

使用浓度为1mg/1ml的100％甲醇，通过超声波提取标准品10分钟。将每种标准品等分并存储在-20℃的冰箱中，并稀释以用于分析。将提取物样品置于50ml容量瓶中，使其浓度约为500mg/50ml，并通过加入40ml的100％甲醇进行超声处理20分钟。当冷却至室温时，向烧瓶中加入100％甲醇至指示线并充分混合。然后，将提取物样品通过0.45μm的PTFE过滤器过滤并进行分析。蛇麻草提取物主要成分的HPLC分析结果列于下表4和图2中(1：异黄腐酚(IXN)；2：8-异戊烯基柚皮素(8-PN)；3：黄腐酚)。

表4

编号	IXN％	黄腐酚％	8-PN％
				PJH-20180210	0.18	0.21
PJH-20180412	0.15	0.17
				PJH-20180131	0.09	0.18
PJH-20180210	0.13	0.17
				Hopstainer	0.14	1.81	0.014

实验例3：红三叶草提取物和蛇麻草提取物组合的HPLC分析

为了分析红三叶草提取物和蛇麻草提取物的每种3∶1和2∶1组合的活性成分含量，为每种物质选择一种代表性的活性成分，并且开发了一种分析方法并使用了该方法。选择并分析红三叶草提取物的鹰嘴豆芽素A和蛇麻草提取物的黄腐酚。分析使用Luna C18 4.5×250mm、5μm色谱柱、C-18保护柱芯4.0×3.0mm和保护柱芯套。(A)100％ACN和(B)含有0.25％甲酸的蒸馏水用作流动相。溶剂的梯度条件在下面的表5中示出。在30℃的柱温下，使溶剂以每分钟1ml的速度流动，注入10μl，并且在320nm下测定吸光度。

表5

时间(分钟)	A％	B％
			0	35	65
5	35	65
			34	60	40
40	90	10
			45	90	10
47	35	65
			55	35	65

使用100％浓度为1mg/l ml的甲醇，通过超声波分别提取标准品10分钟。将每种标准品等分并存储在-20℃的冰箱中，并稀释用于分析。将提取物样品置于50ml容量瓶中，使其浓度约为600mg/50ml，并通过加入40ml的100％甲醇进行超声处理20分钟。当冷却至室温时，向烧瓶中加入100％甲醇至指示线并充分混合。然后，将提取物样品通过0.45μm的PTFE过滤器过滤并进行分析。红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合中的(1)鹰嘴豆芽素A和(2)黄腐酚的HPLC分析结果如图3所示。

实施例1：雌激素受体结合能力的测定(ERα-、ERβ-结合)

使用PolarScreen^TM ER Alpha，Beta Competitor Assay，Green Kit(LifeTechnologies Inc.)测量该组合的雌激素受体结合能力。Fluormone^TM ES2 Green被用作竞争物者来测量荧光偏振。当Fluormone^TM ES2 Green与雌激素受体(ER)结合时，分子量增加，从而荧光偏振增加。当其他物质与Fluormone^TM ES2 Green竞争时，它们与ER的结合能力减弱并解离，并且因此分子量降低，从而荧光偏振降低。该原理可用于解释生物物质之间的相互作用。利用0.13至100μg/ml范围内的每种浓度的样品处理ER，在室温下反应2小时，并使用酶标仪在485/535nm的波长下测量荧光偏振。将观察到的结果表示为相对于最大荧光偏振值(Max)的抑制百分率，并进行比较。E2(17β-雌二醇，Sigma Chem.Co.，美国)用作阳性对照。

测量根据样品浓度的荧光值，并且将呈现最大荧光值的一半的浓度确定为IC₅₀值，并在下表6中示出。

表6

IC50(μg/ml)	雌二醇	3∶1	2∶1	红三叶草	蛇麻草
						ERα	0.001948	5.96	8.64	5.86	30.87
ERβ	0.001874	1.66	1.85	1.27	27.35

3∶1和2∶1组合样品的IC₅₀值对于ERα分别为5.96和8.64μg/ml，对于ERβ分别为1.66和1.85μg/ml。因此，发现两种样品都具有相对较强的与ERβ的结合能力。

另外，为了确认组合样品的协同作用，使用Colby等式(Colby,S.R.Calculationof the synergistic and antagonistic response of herbicide combinations.Weeds1967,15,20-22)计算出该组合物预期的抑制作用。Colby等式如下。

Colby期望值＝A+B-(A×B/100)

A＝活性成分A与组合中所用浓度相同的活性成分A的功效的观察值

B＝活性成分B与组合中所用浓度相同的活性成分B的功效的观察值

结果，如表7所示，在2:1和3:1组合样品中均证实了大于累加作用的协同作用，并且观察到组合样品显示出比单个样品更强的结合能力，尤其是在低浓度下。

表7

实验例4:MCF-7和HUVEC细胞培养

MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)获自Korea Cell Line Bank并被使用。将含有10％FBS(Gibco,美国)和1％青霉素-链霉素(Gibco,美国)的RPMI(Gibco,美国)培养基用作细胞培养基，并且将细胞在5％CO₂、37℃的培养箱中培养。每两天更换一次培养基，并且每隔4-5天对细胞进行传代培养。HUVEC(人脐静脉内皮细胞)从LONZA获得并被使用。使用含有LSGSkit(Gibco,USA)的M200(Gibco,USA)作为细胞培养基，并且仅将第3-5代的细胞用于实验。

实施例2:MCF-7细胞增殖实验

实验中使用了无雌激素的培养基，该培养基通过将无酚红的RPMI(Gibco,美国)利用5％葡聚糖包被的炭剥离的FBS(dextran-coated charcoal-stripped FBS)(TCB,美国)和1％的青霉素-链霉素稀释而制备。细胞在无雌激素的培养基中反应3天后，将它们以1.5×10⁴个细胞/孔的浓度接种到96孔板中，并在5％CO₂、37℃恒温箱中孵育24小时，然后利用样品处理，使得最终DMSO浓度为0.1％。E2用作阳性对照，并且ICI 182,780(SigmaChem.Co.,美国)用作阴性对照。在样品处理72小时之后，使用CellTiter

Aqueous OneSolution(Promega，德国)试剂进行MTS分析。每个孔利用20μl的MTS试剂处理，在5％CO₂、37℃恒温箱中反应3小时，并且使用酶标仪在490nm下测量吸光度。

使用MCF-7细胞评估雌激素活性的细胞增殖作用的测量结果示于下表8和9中。表8显示与对照组相比，在使用3:1组合、2:1组合和红三叶草的处理中观察到细胞增殖。特别地，当与红三叶草和蛇麻草单独处理相比时，在用3:1组合或2:1组合的处理中观察到更大的增殖作用，这表明两种提取物显示出协同作用。为了确定每个样品是否作用于雌激素受体以显示细胞增殖作用，将样品与雌激素受体抑制ICI 182,780一起处理，并且结果示于表9。表9示出当与雌激素受体抑制剂一起处理样品时，细胞增殖作用被抑制。因此，证实了表8中所示的MCF-7细胞增殖作用是由于每个样品激活了雌激素受体。

表8

^*，p＜0.05vs对照组

表9

实施例3：一氧化氮(NO)和内皮素1(ET-1)生成的测量

为了评估该组合的血液循环改善效果，使用HUVEC测量了与血管松弛相关的生物标记物之一的一氧化氮(NO)和与血管收缩相关的生物标记物之一的内皮素1的生成。将3×10⁴细胞接种在96孔板中，培养24小时，然后在血清饥饿条件下在培养基中保持4小时。在含有5％炭-葡聚糖处理过的FBS和1％青霉素-链霉素的无酚红M200培养基中，利用样品处理细胞。DMSO的最终浓度为0.5％。反应24小时后获得培养上层清液。使用一氧化氮分析试剂盒(R&D systems，美国)和内皮素-1Quantikine ELISA试剂盒(R&D systems，美国)，测量分泌到培养上层清液中的NO水平(表10和11)和ET-1水平(表12、13和14)

如下表10所示，作为测量NO水平的结果，与对照组相比，当利用3∶1组合或2∶1组合处理时，培养上层清液中的NO水平显著增加。为了确认有协同作用，将组合物中所含的100μg/ml的3∶1组合、75μg/ml的红三叶草和25μg/ml的蛇麻草分别进行处理，比较功效。如下表11所示，3∶1组合组显示出比单个样品组显著更高的增加效果。

表10

^*，p＜0.05vs对照组

表11

样品	浓度(μg/ml)	NO(％)
			对照组	0	100.0±1.5
3∶1	100	150.0±2.8
			红三叶草	75	124.9±4.3<sup>*</sup>
蛇麻草	25	117.6±3.1<sup>*</sup>

^*，p＜0.05vs 3∶1

此外，测量的内皮素1水平如下表12所示，与对照组相比，当利用3∶1组合或2∶1组合处理时，培养上层清液中的内皮素-1水平显著降低。

表12

^*，p＜0.05vs对照组

为了确认有协同作用，将组合物中所含的100μg/ml的3∶1组合、75μg/ml的红三叶草和25μg/ml的蛇麻草分别进行处理，比较功效。如下表13所示，3∶1组合组显示出比单个样品组显著更高的减小作用。

表13

样品	浓度(μg/ml)	内皮素-1(％)
			对照组	0	100.00±2.9
3∶1	100	83.1±1.6
			红三叶草	75	95.4±2.4<sup>*</sup>
蛇麻草	25	100.2±2.3<sup>*</sup>

^*，ρ＜0.05vs 3∶1

为了确认组合样品的协同作用，使用Colby等式计算了组合所期望的抑制作用。如下表14所示，内皮素-1生成抑制率的Colby估计值为4.44％，而实际观察值为16.9％。因此，证实了与单独施用红三叶草样品和蛇麻草样品时相比，3∶1组合样品对抑制内皮素-1的生成具有协同作用。

表14

实施例4：测量eNOS表达水平

为了确定组合的提高NO的水平的机制，使用HUVEC测量了内皮一氧化氮合酶(eNOS)蛋白的表达水平。将细胞以1.5×10⁵个细胞/孔的浓度接种到24孔板中，培养24小时，然后在无血清条件下在培养基中保持4小时。在含有5％炭-葡聚糖处理过的FBS和1％青霉素-链霉素的无酚红M200培养基中，用样品处理细胞。DMSO的最终浓度为0.5％。反应24小时后获得细胞裂解物(lysate)，并使用人类eNOS DuoSet ELISA试剂盒(R&D systems，美国)测量eNOS蛋白的表达水平。

作为测量eNOS蛋白表达水平的结果，如下表15所示，证实了与对照组相比当利用3∶1组合或2∶1组合处理时，eNOS蛋白表达显著增加。为了确认有协同作用，将组合物中所含的100μg/ml的3∶1组合、75μg/ml的红三叶草和25μg/ml的蛇麻草分别进行处理，比较功效。如下表16所示，3∶1组合组显示出比单个样品组显著更高的增加效果。

表15

^*，p＜0.05vs对照组

表16

样品	浓度(μg/ml)	eNOS(％)
			对照组	0	100.00±3.6
3∶1	100	148.4±9.5
			红三叶草	75	123.3±11.1<sup>*</sup>
蛇麻草	25	115.0±10.6<sup>*</sup>

^*，p＜0.05vs 3∶1

实验例5：动物试验评价方法

在该实验中，使用双侧卵巢切除大鼠模型(OVX)评估了红三叶草和蛇麻草提取物的组合对更年期疾病增加生理活性的作用。具体而言，将250和500mg/kg/天的红三叶草提取物和蛇麻草提取物的2∶1(w/w)组合和3∶1(w/w)组合溶解或分散在无菌蒸馏水中，并在卵巢切除后(手术后第4天)每天一次以10ml/kg的剂量口服给大鼠，共56天(8周)。评估了这些组合对体重、尾部皮肤温度(TST)、血清脂质谱、骨代谢、抗氧化剂、血管舒张标志物和子宫内膜的影响。

(1)实验动物

获得雌性未受孕Sprague-Dawley大鼠(11周大，OrientBio，Seungam，Korea)并在适应1周之后使用。该实验是在自然科技动物实验伦理委员会(批准号UIK21702)的批准下进行的。

(2)实验方法

为了诱发由于雌激素偏转引起的更年期疾病，随机选择除假手术对照组以外的所有实验动物并进行双侧卵巢切除术。除了切除卵巢之外，假手术的对照组进行了相同的外科手术。对于包括假手术对照组的所有实验动物，在手术后3或4天测量临床症状和体重，并选择无异常的动物并根据其体重进行随机分组。

每个实验组都有以下名称：

假手术组：假手术对照组

OVX：双侧卵巢切除组

2:1(500)：以500mg/kg/天的剂量服用红三叶草提取物和蛇麻草提取物的2:1(w/w)组合样品的组

2:1(250)：以250mg/kg/天的剂量服用红三叶草提取物和蛇麻草提取物的2:1(w/w)组合样品的组

3:1(500)：以500mg/kg/天的剂量服用红三叶草提取物和蛇麻草提取物的3:1(w/w)组合样品的组

3:1(250)：以250mg/kg/天的剂量服用红三叶草提取物和蛇麻草提取物的3:1(w/w)组合样品的组

与每个实验组有关的信息示于下表17中。

表17

实施例5:服用红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合8周后体重和体重增加的变化结果

将红三叶草提取物和蛇麻草提取物的2:1组合和3:1组合口服给予OVX大鼠8周，观察到体重变化和体重增加变化。因此，在两种组合的500mg/kg剂量组中观察到体重增加的显著抑制。对于增加体重，观察到在2:1组合的500mg/kg剂量组中以及在3:1组合的250mg/kg和500mg/kg剂量组中体重增加被显著抑制(表18)。

表18

实施例6:饲料效率变化(feed efficiency change)的测量

计算给药期间大鼠的平均体重增长(体重增加)和平均饲料摄入，并将其转化为FER(食物功效比)，其示于下表19中。根据表19，在500mg/kg剂量组中2:1组合可显著降低FER，在250mg/kg和500mg/kg剂量组中3:1组合可显著降低FER。

表19

实施例7:尾部皮肤温度(TST)的测量

由于动物模型中的TST与改善潮热的效果有关，潮热是更年期的主要症状之一。给药8周后，所有动物的TST用红外测温仪(Bioseb,USA)进行测量，并且在两种组合的500mg/kg剂量组中，尾部皮肤温度的升高均得到了显著抑制(表20)。

表20

实施例8:器官重量的变化

在实验结束时，对所有禁食超过16小时的动物进行解剖，收集血液样本并提取器官，并测量湿器官的重量(表21)。在两种组合的500mg/kg剂量组中观察到禁食体重显著降低，与实验期间观察到的相同。

与假手术对照组相比，OVX组的子宫重量明显减少，并且即使给予两种组合，这种降低也没有明显改变。

另一方面，作为测量腹部脂肪团的湿重的结果，在两种组合的500mg/kg剂量组中观察到重量显著降低，与体重变化中所观察到结果的相同。因此，可以认为2:1组合和3:1组合的减肥效果是由于内脏脂肪蓄积的抑制。

表21

实施例9:血脂变化

测量的实验动物的血脂的结果是，在红三叶草提取物和蛇麻草提取物2:1组合的500mg/kg剂量组以及在3:1组合的250mg/kg和500mg/kg剂量组中观察到低密度脂蛋白(LDL)的显著降低。就总胆固醇(TC)而言，2:1组合给药组呈下降趋势，尽管不明显，而3:1组合的250mg/kg和500mg/kg剂量组呈显著下降趋势(表22)。

表22

实施例10:血液中骨钙素、ALP和CTX-1的变化

已知血液中骨钙素、ALP和CTX-1的水平是反映骨代谢的指标，其中骨钙素和ALP是反映骨形成的指标，而CTX-1是反映骨吸收的指标。绝经后妇女显示出骨密度显著降低以及上述三个指标明显更高的水平。因此，这些指标的降低意味着通过红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合改善了骨骼代谢。在该实验中，观察到红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合对血液中骨钙素和ALP含量的影响。

与假手术对照组相比，OVX对照组的血液中骨钙素和血液ALP含量显著增加，而在以三叶草提取物和蛇麻草提取物的2:1组合和3:1组合给药的组中，观察到血液中骨钙素和血液ALP含量显著下降(表23)。

表23

另外，观察到红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合对血液中CTX-1含量的影响。分析实验动物中CTX-1的血药浓度后，在红三叶草提取物和蛇麻草提取物的2:1组合和3:1组合中，在500mg/kg剂量组中观察到血液CTX-1显著降低(表24)。

表24

实施例11:血液内皮素-1和NO变化

在该实施例中，观察到红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合对血液内皮素-1和NO含量的影响。

分析实验动物中内皮素1和一氧化氮的血药浓度后，在红三叶草提取物和蛇麻草提取物的3:1组合的250mg/kg和500mg/kg剂量组中，观察到血液内皮素-1的显著降低以及血液NO的显著增加(表25)。

表25

实施例12:血液中SOD和MDA的变化

在该实施例中，观察到红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合对血液中SOD含量和MDA含量的影响。

分析实验动物血液中SOD和MDA的血液浓度的结果为，在红三叶草提取物和蛇麻草提取物的3:1组合的250mg/kg和500mg/kg剂量组中，观察到血液SOD显著增加和血液MDA显著降低(表26)。

表26

实施例13:子宫内膜高度的变化

在该实施例中，为了观察红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合对子宫内膜高度的影响，将尸体解剖后提取的子宫组织染色以测量子宫内膜的高度。

与假手术对照组相比，OVX对照组的子宫内膜上皮细胞高度明显降低，红三叶草提取物和蛇麻草提取物的3:1组合的250mg/kg和500mg/kg剂量组与OVX对照组相比无显著差异(表27)。

表27

本发明的前述描述旨在用于说明，并且本领域技术人员应当理解，在不改变本发明的技术概念或基本特征的情况下，可以容易地在其他特定实施方案中对本发明进行修改。因此，应当理解，上述示例是示例性的，而不是限制性的。例如，描述为单一类型的每个组分(component)可以以分开的方式(separate manner)实施，并且类似地，描述为分开的(being separated)组分可以以组合的形式(combined form)实施。

本发明的范围由所附权利要求书而不是上面的详细描述表示，并且从权利要求书的含义和范围及其等同方案得出的所有改变或修改应被解释为包括在本发明的范围内。

Claims (17)

1.一种用于改善女性更年期疾病的组合物，所述组合物包含红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合作为活性成分。

2.根据权利要求1所述的用于改善女性更年期疾病的组合物，其中所述组合包含重量比为10:1至1:5的所述红三叶草提取物和所述蛇麻草提取物。

3.根据权利要求2所述的用于改善女性更年期疾病的组合物，其中所述组合包含重量比为3:1至2:1的所述红三叶草提取物和所述蛇麻草提取物。

4.根据权利要求1所述的用于改善女性更年期疾病的组合物，其中所述更年期疾病表现为血液循环疾病、体重增加、潮热、骨质疏松症、血胆固醇升高、出汗、失眠、神经质、抑郁、头晕、注意力不集中、关节痛、头痛、心悸、阴道干燥、疲劳、兴奋、睡眠失调、记忆力减退、记忆失调、健忘、冷汗、心脏狂跳、尿频、焦虑和动脉粥样硬化中的一种或多种更年期症状。

5.根据权利要求1所述的用于改善女性更年期疾病的组合物，其中所述红三叶草提取物是从红三叶草叶中提取的。

6.根据权利要求1所述的用于改善女性更年期疾病的组合物，其中所述蛇麻草提取物是从蛇麻草花、蛇麻草芽或这两者中提取的。

7.根据权利要求1所述的用于改善女性更年期疾病的组合物，其中所述红三叶草提取物和所述蛇麻草提取物分别是红三叶草提取物粉末和蛇麻草提取物粉末。

8.根据权利要求1所述的用于改善女性更年期疾病的组合物，其中与单独施用所述红三叶草提取物或所述蛇麻草提取物相比，所述红三叶草提取物和所述蛇麻草提取物的组合显示出协同作用。

9.根据权利要求1所述的用于改善女性更年期疾病的组合物，其中所述红三叶草提取物和所述蛇麻草提取物的组合显示以下一种或多种活性：

(1)结合雌激素受体

(2)改善雌激素活性

(3)提高血液一氧化氮(NO)水平

(4)提高血液eNOS蛋白表达水平

(5)降低血液内皮素-1水平

(6)抑制内脏脂肪积聚

(7)降低血脂

(8)降低血液骨钙素、ALP和CTX-1含量

(9)提高血液SOD而降低血液MDA

(10)抑制大鼠尾部皮肤温度即TST的升高。

10.一种用于改善女性更年期疾病的食品组合物，所述食品组合物包含根据权利要求1至9中任一项所述的组合物。

11.一种用于预防或治疗女性更年期疾病的药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的组合物。

12.根据权利要求11所述的用于预防或治疗女性更年期疾病的药物组合物，其中所述药物组合物用于口服给药、腹膜内给药、静脉内给药、肌内给药、皮下给药、皮内给药、鼻内给药、肺部给药或直肠给药。

13.根据权利要求12所述的用于预防或治疗女性更年期疾病的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成用于口服的片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂或饮料。

14.一种制备用于改善女性更年期疾病的组合物的方法，其包括以下步骤：

(a)粉碎红三叶草的叶子，然后将其用醇提取以制备红三叶草提取物；

(b)用醇提取蛇麻草花和蛇麻草芽，以制备蛇麻草提取物；并且

(c)将所述红三叶草提取物和所述蛇麻草提取物混合。

15.根据权利要求14所述的制备用于改善女性更年期疾病的组合物的方法，其中步骤(a)和(b)可进一步包括在醇提取之后过滤、浓缩和干燥提取物的附加步骤。

16.一种红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合，所述组合用于改善、预防或治疗女性更年期疾病。

17.一种改善、预防或治疗个体的女性更年期疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的红三叶草提取物和蛇麻草提取物的组合。

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