KR102285164B1 - 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물을 포함하는 여성 갱년기 장애 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 장애 개선용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 장애 개선용 식품 조성물 및 여성 갱년기 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 그리고 상기 갱년기 장애 개선용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

Description

레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물을 포함하는 여성 갱년기 장애 개선용 조성물{COMPOSITION COMPRISING COMBINATION OF RED CLOVER EXTRACT AND HOPS EXTRACT FOR IMPROVEMENT OF MENOPAUSAL DISORDER}

본 발명은 레드클로버(red clover) 추출물 및 호프(hops) 추출물의 복합물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 장애 개선용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 장애 개선용 식품 조성물 및 여성 갱년기 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 그리고 상기 갱년기 장애 개선용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

여성의 폐경(menopause)이란 태어난 후 약 50년에 이르는 유전적으로 이미 결정된 난소의 기능이 수명을 다함으로써 나타나는 월경의 중단 현상으로, 생식능력의 소실을 의미하며 병적 현상이 아닌 생리적인 변화이다. 현재 우리나라 여성의 기대 수명은 85.4세 (2016년, 통계청)로 대한산부인과학회에서 규정한 한국 여성의 평균 폐경 연령을 50세로 가정한다면 여성 일생의 약 1/3 이상을 여성호르몬이 고갈된 상태로 산다는 것을 의미한다.

여성은 폐경을 맞이하면서 여성 호르몬의 분비 불균형 및 감소로 인해 혈관계, 근골격계, 비뇨생식기계 및 뇌신경 등 신체 전반에 걸쳐 변화가 일어난다. 즉 혈관 운동성증상과 심리적 증상인 안면 홍조, 야간 발한, 수면 장애, 피로감, 우울증, 불안감, 집중력 장애, 그리고 기억 장애와 비뇨생식계 위축에 의한 성교통, 빈뇨, 교원질 감소에 의한 피부탄력의 소실, 유방의 처짐, 그리고 심혈관 및 근골격계 증상, 치매 등의 다양한 질환 등이 동반된다.　갱년기　증상은 개인마다 차이가 있지만,　갱년기　증상을 많이 경험할수록, 정도가 심할수록, 그리고 기간이 길어질수록 여성의 삶의 질이 저하되는 것으로 보고되었을 뿐만 아니라,　갱년기　증상은 신체적인 노화와 함께 만성 질환으로 진행될 가능성이 높다.

이러한 갱년기 장애 개선을 위해 부족한 여성 호르몬을 보충하는 호르몬 요법이 이용되어 왔으나, 장기적인 사용시 자궁암, 유방암, 뇌졸중 및 폐 혈전색전증, 다양한 부작용이 초래되고 있어, 최근 식물 유래의 피토에스트로겐(phytoestrogen)이 대안으로 주목받고 있다. 피토에스트로겐은 에스트로겐과 구조적으로 유사하여, 에스트로겐 수용체 알파 및 베타 에 결합하여 약한 에스트로겐 유사 효과를 나타냄으로써, 여성의 폐경에 따른 다양한 대사증후군 억제 및 개선 효과와 함께 비교적 우수한 골량 보존효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 피토에스트로겐을 포함하는 식물로는 감초, 호프, 석류, 레드클로버 등이 알려져 있다. 이와 관련하여, 대한민국 공개특허공보 제 2016-0011756 호는 대두 이소플라본 추출물, 호프 추출물 및 감초 추출물을 포함하는 여성 갱년기 또는 폐경기 증상 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물을 개시하고 있으며, 그 외에도 다양한 피토에스트로겐 함유 식물들을 이용한 갱년기 장애 개선 연구가 수행되고 있다.

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본원에서는, 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물을 제공함으로써, 각각의 추출물을 단독으로 적용하는 경우에 비해 더욱 효과적으로 부작용 없이 여성의 갱년기 장애 및 갱년기 증상을 개선할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 제 1 측면은, 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 장애 개선용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제 2 측면은, 제 1 측면에 따른 조성물을 포함하는 여성 갱년기 장애 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제 3 측면은, 제 1 측면에 따른 조성물을 포함하는 여성 갱년기 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제 4 측면은, (a) 레드클로버 잎을 분쇄한 후 주정추출하여 레드클로버 추출물을 제조하는 단계; (b) 호프 꽃 및 호프 꽃봉오리를 주정추출하여 호프 추출물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 레드클로버 추출물 및 호프 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는, 여성 갱년기 장애 개선용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.

레드클로버 추출물 및 호프 추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은, 여성 갱년기 장애 개선에 있어서 각각의 추출물을 단독으로 적용하는 경우에 기대되는 효과 이상의 상승효과 (시너지 효과)를 나타냄으로써 대표적인 여성 갱년기 장애인 혈액순환 장애, 체중 증가, 안면홍조, 고지혈증 및 골다공증 등을 효과적으로 개선할 수 있다.

도 1은 레드클로버 추출물 내의 다이드제인, 제니스테인, 포르모노네틴 및 바이오체닌 A 함량을 분석한 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC) 결과이다.
도 2는 호프 추출물 내의 이소잔토휴몰 (IXN), 8-프레닐나린제닌 (8-PN) 및 잔토휴몰의 함량을 분석한 HPLC 결과이다.
도 3은 레드클로버 추출물 및 호프 추출물 복합물 내 바이오체닌 A 및 잔토휴몰 함량을 분석한 HPLC 결과이다.

아래에서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서 전체에서, 용어 "개선" 또는 "치료"란, 조성물의 투여에 의해 여성 갱년기 장애를 호전시키거나 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미하며, "예방" 이란, 조성물의 투여에 의해 여성 갱년기 장애를 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

이하, 본원의 여성 갱년기 장애 개선용 조성물, 이를 포함하는 식품 조성물 및 약학적 조성물, 및 이의 제조방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본 발명이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제 1 측면은, 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 장애 개선용 조성물을 제공할 수 있다.

레드클로버 (Red clover, Trifolium pratense L)는 콩과의 여러해살이풀이며, 홍차축초 (紅車軸草), 붉은토끼풀, 홍삼엽, 또는 금화채라고도 한다. 지중해 연안과 서남아시아가 원산지이며, 전 세계에 널리 분포 재배되고 있는 직립형 목초이다. 레드클로버는 사료용으로 쓰이기도 하며, 봄에 어린 잎을 살짝 데쳐서 나물로 먹기도 한다. 레드클로버는 지상부 (aerial parts) 및 뿌리부로 나눌 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니지만 본 발명의 추출물로는 바람직하게는 레드클로버의 지상부, 예를 들어 잎 추출물을 이용할 수 있다.

호프 (Hops, Humulus lupulus)는 유럽, 호주 및 북미 등지에서 자생하는 덩굴줄기 식물로서, 호프 추출물에 존재하는 여러 화합물들은 항 암, 골다공증 개선, 항산화, 미백 등 다양한 생리활성을 나타내며, 이 중 8-프레닐나린제닌 (8-prenylnaringenin)을 비롯한 이소잔토휴몰 (isoxanthohumol) 등의 화합물이 에스트로겐 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 추출물로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 꽃 또는 꽃봉오리로부터 얻은 추출물을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 레드클로버 추출물과 호프 추출물을 10:1 내지 1:5의 중량비로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 중량비가 10:1 내지 1:2, 10:1 내지 1:1, 5:1 내지 1:5, 5:1 내지 1:1, 5:1 내지 2:1, 3:1 내지 1:5, 3:1 내지 1:1, 3:1 내지 2:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 또는 1:3일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 여성 갱년기 장애는 혈액순환장애, 체중증가, 안면홍조, 골다공증, 혈중 콜레스테롤 증가, 발한, 불면증, 신경과민, 우울증, 현기증, 집중력 결핍, 관절통, 두통, 심계항진, 질 건조감, 피로, 흥분, 수면장애, 기억상실, 기억력 장애, 건망증, 식은땀, 두근거림, 빈뇨, 근심 및 아테롬성 동맥경화증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 갱년기 증상을 나타내는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않을 수 있으며, 여성 호르몬 부족으로 인해 직간접적으로 유발되는 모든 갱년기 증상을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 레드클로버 추출물은 레드클로버 잎으로부터 추출된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 호프 추출물은 호프 꽃, 호프 꽃봉오리 또는 둘 모두로부터 추출된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 레드클로버 추출물 및 호프 추출물은 각각 레드클로버 추출 분말 및 호프 추출 분말일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 제 2 측면은, 제 1 측면에 따른 조성물을 포함하는 여성 갱년기 장애 개선용 식품 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 본 발명의 제 1 측면에 대해 설명한 내용은 본 발명의 제 2 측면에서 그 설명이 생략되었더라도 동일하게 적용될 수 있다.

레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물을 포함할 수 있는 식품 조성물로는, 예를 들어, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 또한 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다.

이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 복합물의 양은 전체 식품 중량의 약 0.01 내지 30 중량%일 수 있으며, 음료 조성물의 경우 100 ㎖를 기준으로 약 0.01 내지 30 g의 비율일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물의 복합물을 함유하는 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파탐 등)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 추출물의 복합물을 포함하는 음료 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g의 범위일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물을 포함하는 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 제 3 측면은, 제 1 측면에 따른 조성물을 포함하는 여성 갱년기 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 본 발명의 제 1 측면에 대해 설명한 내용은 본 발명의 제 3 측면에서 그 설명이 생략되었더라도 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 유효량의 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물을 단독으로 포함하거나, 또는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용가능한"이란, 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 "약학적 유효량"이란, 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 갱년기 장애의 예방 및/또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다.

여기서 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 활성 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의될 수 있으며, 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상적으로 사용되는 담체 중에서 제한 없이 선택되어 사용될 수 있다.

여기서 "부형제(excipient)"는 제제에 함유된 유효성분 이외의 물질로서 안정성, 안전성 및 균질성을 유지하고 품질 등의 유용성을 높이기 위하여 추가로 사용하는 불활성 물질을 말한다.

여기서 "희석제(diluent)"는 활성 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 활성 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의될 수 있다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용되고, 통상 사용되는 버퍼 용액은 체액의 염 상태를 모방하는 인산염 버퍼 식염수이나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어하기 때문에, 버퍼 희석제가 활성 화합물의 생물학적 활성을 변형하지 않을 수 있다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 드링크제 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여를 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 경구 투여를 위해 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 드링크제로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

예를 들어, 상기 약학적 조성물은 약 20 내지 1,000 mg/kg/일, 약 50 내지 1,000 mg/kg/일, 약 100 내지 1,000 mg/kg/일, 약 300 내지 1,000 mg/kg/일, 약 500 내지 1,000 mg/kg/일, 약 800 내지 1,000 mg/kg/일, 약 20 내지 100 mg/kg/일, 약 20 내지 200 mg/kg/일, 약 20 내지 500 mg/kg/일, 약 20 내지 800 mg/kg/일, 약 50 내지 500 mg/kg/일, 약 100 내지 500 mg/kg/일, 약 200 내지 500 mg/kg/일, 또는 약 250 내지 500 mg/kg/일의 용량으로 투여되기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 제 4 측면은, (a) 레드클로버 잎을 분쇄한 후 주정추출하여 레드클로버 추출물을 제조하는 단계; (b) 호프 꽃 및 호프 꽃봉오리를 주정추출하여 호프 추출물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 레드클로버 추출물 및 호프 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는, 여성 갱년기 장애 개선용 조성물의 제조방법을 제공할 수 있다.

예를 들어, 상기 주정 추출은 약 50% 내지 90% 주정, 또는 약 60% 내지 70% 주정을 사용하여 수행 될 수 있으며, 레드클로버 추출을 위해서는 약 60% 주정이, 호프 추출을 위해서는 약 70% 주정이 바람직할 수 있다.

예를 들어, 상기 추출은 약 50 내지 90℃, 약 60 내지 80℃, 또는 약 70℃에서 수행될 수 있고, 추출이 1 회 이상, 예를 들어 2 회, 3 회, 4 회 또는 그 이상 수행될 수 있으며, 추출 시간은 약 1 시간 내지 10 시간, 약 2 시간 내지 6 시간, 또는 약 4 시간일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계 및 (b) 단계는 주정추출 후 추출물을 여과, 농축 및 건조하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 여과는 당업계에 알려진 여과 방식을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 필터 종이를 이용해 여과를 수행할 수 있다. 상기 농축 역시 당업계에 알려진 농축 방식을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 진공농축을 사용할 수 있다.

상기 추출물이 건조되는 경우, 최종적으로 추출물 분말이 제조될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실시예]

제조예　1: 레드클로버(red clover) 추출물 제조

레드클로버 잎을 분쇄기로 분쇄한 다음, 원물 1 kg에 60% 주정 (대한주정라이프(주), Korea) 10 L를 사용하여 70℃에서 4시간 동안 2회 환류추출하였다. 추출물은 필터 종이 (ADVANTEC 2, 280 mm, China)로 감압여과하고, 여과액을 진공농축 (rotavaper R-220SE, BUCHI, switzerland) 한 다음, 건조기 (Daeil engineering, Korea)에서 건조시켜 파우더 형태의 추출물을 수득하였다.

제조예 2: 호프(hops) 추출물 제조

잘 말려진 호프 꽃 및 꽃봉오리 1 kg을 10 L 70% 주정을 사용하여 70℃에서 4시간 동안 2회 환류추출하였다. 추출물은 필터 종이로 여과하고, 여과액을 진공농축 한 다음, 건조기에서 건조시켜 파우더 형태의 추출물을 수득하였다.

제조예 3: 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물 제조

제조예 1 및 제조예 2에서 각각 획득한 레드클로버 추출물 및 호프 추출물을 2:1 또는 3:1의 중량비로 혼합하여 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물을 제조하였다. 이를 후술하는 시험관시험 (in vitro) 및 동물시험 (in vivo) 효능 평가에 사용하였다.

실험예 1: 레드클로버 추출물의 HPLC 분석

레드클로버 추출물 내 주요성분의 함량을 Agilent HPLC 1200series/DAD detector (Agilent technologies, USA)를 사용하여 측정하였다. 포르모노네틴 (Formononetin, Wuhan Chemfaces Biochemical Co., Ltd. China), 바이오체닌 A (biochanin A, Sigma-aldrich, USA), 제니스테인 (genistein, Wuhan Chemfaces Biochemical Co., Ltd. China) 및 다이드제인 (daidzein, Wuhan Chemfaces Biochemical Co., Ltd. China)은 레드클로버에 포함된 대표적인 이소플라본이므로, 상기 4 가지 이소플라본에 대한 정량 분석을 실시하였다.

분석을 위해 C18 4.5×250 mm, 5 ㎛ 컬럼 (Phenomenex, USA), C-18 시큐리티 가드 카트리지 4.0×3.0 mm (Phenomenex, USA), 시큐리티 가드 카트리지 홀더 (Phenomenex, USA)를 사용하였고, 아세토니트릴 (ACN, HPLC용, J.T.Baker, USA) (A) 및 0.1% 인산 (phosphoric acid, sigma-aldrich, USA)가 함유된 증류수 (B)(aquaMAX^TM-ultra, 영린기기, Korea)를 이동상으로 사용하였다. 용매의 구배 조건은 아래의 표 1에 나타나 있다. 유속은 컬럼 온도 25℃에서 분당 0.8 ml 속도로 흘려주었고, 10 ㎕를 주입하여 260 nm에서 흡광도를 측정하였다.

[표 1]

표준품은 1 mg/1 ml의 농도로 100% 메탄올 (MeOH, HPLC용, J.T.Baker, USA)을 사용하여 10분 동안 초음파 (power sonic 520, Korea) 추출하였다. 각각의 표준품을 분주하여 -20℃ 냉동고에 보관 후 분석시 희석하여 사용하였다. 추출물 시료는 약 200 mg/50 ml의 농도가 되도록 50 ml 용량 플라스크에 넣고 100% 메탄올 40 ml을 가하여 20분 동안 초음파 추출하였다. 실온으로 냉각되었을 때 100% 메탄올로 플라스크의 표시선까지 가한 후 잘 섞었다. 이후 0.45 μm PTFE 필터 (Whatman, UK)로 여과한 다음 분석하였다. 지역별 및 계절별 레드클로버 추출물들의 주요성분의 HPLC 분석 결과가 아래의 표 2 및 도 1에 나타나 있다 (1: 다이드제인, 2: 제니스테인, 3: 포르모노네틴, 4: 바이오체닌 A).

[표 2]

* 레드클로버 내부 추출물 시료, ** 시판 시료

실험예 2: 호프 추출물의 HPLC 분석

호프 추출물 내 3 가지 주요성분의 함량을 Agilent HPLC/PDA 시스템을 사용하여 측정하였다. 이소잔토휴몰 (Isoxanthohumol (IXN), Wuhan Chemfaces Biochemical Co., Ltd. China), 8-프레닐나린제닌 (8-prenylnaringenin (8-PN), Wuhan Chemfaces Biochemical Co., Ltd. China) 및 잔토휴몰 (xanthohumol, Sigma-aldrich, USA)은 호프의 대표적인 성분이다. 분석을 위해 Luna C18 4.5×250 mm, 5㎛ 컬럼, C-18 시큐리티 가드 카트리지 4.0×3.0 mm, 시큐리티 가드 카트리지 홀더를 사용하였다. 100% ACN (A) 및 0.25% 포름산 (Wako, Japan)이 함유된 증류수 (B)를 이동상으로 사용하였다. 용매의 구배 조건은 아래의 표 3에 나타나 있다. 유속은 컬럼 온도 30℃에서 분당 1 ml 속도로 흘려주었고, 10 ㎕ 주입하여 370 nm에서 흡광도를 측정하였다.

[표 3]

표준품은 1 mg/1 ml의 농도로 100% 메탄올을 사용하여 10분 동안 초음파 추출하였다. 각각 표준품을 분주하여 -20℃ 냉동고에 보관 후 분석시 희석하여 사용하였다. 추출물 시료는 약 500 mg/50 ml의 농도가 되도록 50 ml 용량 플라스크에 넣고 100% 메탄올 40 ml을 가하여 20분 동안 초음파 추출하였다. 실온으로 냉각되었을 때 100% 메탄올로 플라스크의 표시선까지 가한 후 잘 섞었다. 추출 후 0.45 μm PTFE 필터로 여과한 다음 분석하였다. 호프 추출물의 주요성분의 HPLC 분석 결과가 아래의 표 4 및 도 2에 나타나 있다 (1: 이소잔토휴몰 (IXN), 2: 8-프레닐나린제닌 (8-PN), 3: 잔토휴몰).

[표 4]

실험예 3: 레드클로버 추출물 및 호프 추출물 복합물의 HPLC 분석

레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 3:1 및 2:1 복합물 각각의 유효성분 함량을 분석하기 위한 분석법으로서, 개별 물질의 대표 성분을 각각 설정하여 하나의 분석법으로 개발하여 사용하였다. 레드클로버 추출물은 바이오체닌 A를, 호프 추출물은 잔토휴몰을 선택하여 분석하였다. 분석을 위해 Luna C18 4.5×250 mm, 5 ㎛ 컬럼, C-18 시큐리티 가드 카트리지 4.0×3.0mm, 시큐리티 가드 카트리지 홀더를 사용 하였다. 100% ACN (A) 및 0.25% 포름산이 함유된 증류수 (B)를 이동상으로 사용하였다. 용매의 구배 조건은 아래의 표 5에 나타나 있다. 유속은 컬럼 온도 30℃에서 분당 1 ml 속도로 흘려주었고 10 ㎕ 주입하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다.

[표 5]

표준품은 각각 1 mg/1 ml의 농도로 100% 메탄올을 사용하여 10분 동안 초음파 추출하였다. 각각 표준품을 분주하여 -20℃ 냉동고에 보관 후 분석 시 희석하여 사용하였다. 추출물 시료는 600 mg/50 ml의 농도가 되도록 하여 50 ml 용량 플라스크에 넣고 100% 메탄올 40 ml을 가하여 20분 동안 초음파 추출하였다. 실온으로 냉각되었을 때 100% 메탄올로 플라스크의 표시선까지 가한 후 잘 섞었다. 추출 후 0.45 μm PTFE 필터로 여과한 다음 분석하였다. 레드클로버 추출물 및 호프 추출물 복합물 내 바이오체닌A (1) 잔토휴몰 (2)의 HPLC 분석 결과는 도 3에 나타나 있다.

실시예 1: 에스트로겐 수용체 결합능 (ERα-, ERβ-결합) 측정

복합물의 에스트로겐 수용체 결합능은 PolarScreen^TM ER Alpha, Beta Competitor Assay, Green Kit (Life Technologies Inc.)를 사용하여 측정하였다. 형광편광도 (fluorescence polarization)를 측정하여 두 물질간의 결합력을 측정하는 방법으로써 Fluormone^TM ES2 Green이 에스트로겐 수용체 (ER)에 결합하게 되면 분자량이 증가하면서 형광편광도도 증가하고, 다른 물질이 Fluormone^TM ES2 Green와 경쟁적으로 작용하면 ER과의 결합능이 약해져 해리되면서 분자량이 감소하고 그에 따라 형광편광도도 감소하므로, 이 원리를 이용하여 생체물질간의 상호작용을 해석할 수 있다. 시료를 0.13 - 100 ㎍/ml까지 농도별로 처리하여 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더 (Microplate reader)를 이용하여 485/535 nm 파장에서 형광편광도를 측정하였다. 결과값은 최대 형광편광도값 (Max) 대비 백분율로 저해율(inhibition rate)을 나타내어 비교 분석하였다. 약물 대조군으로는 E₂ (17β-estradiol, sigma Chem. Co., USA)를 사용하였다.

시료 농도에 따른 형광도 값을 측정하여 최대 형광도 값의 절반이 되는 농도를 IC₅₀ 값으로 하여 아래의 표 6에 나타내었다.

[표 6]

3:1, 2:1 복합 시료의 IC₅₀ 값은 ERα의 경우 각각 5.96, 8.64 ㎍/ml, ERβ의 경우 각각 1.66, 1.85 ㎍/ml으로 나타나, 두 시료 모두 ERβ에 좀 더 강한 결합능을 가짐을 확인하였다.

한편, 복합시료의 상승효과를 확인하기 위하여 Colby 방정식을 사용하여 복합물로부터 예상되는 저해 효과를 계산하였다 (Colby, S. R. Calculation of the synergistic and antagonistic response of herbicide combinations. Weeds 1967, 15, 20-22). Colby 방정식은 하기와 같다.

Colby 예상치 = A + B - (A x B/100)

A = 혼합물에 사용된 것과 동일한 농도의 활성 성분 A의 효능 관찰치

B = 혼합물에 사용된 것과 동일한 농도의 활성 성분 B의 효능 관찰치

그 결과 아래의 표 7에 표시된 바와 같이 2:1 및 3:1 복합물 시료 모두에서 상가효과 이상의 상승효과가 확인되었으며, 특히 저농도에서 단독시료보다 혼합시료가 더 강한 결합능을 나타내는 것이 관찰되었다.

[표 7]

실험예 4: MCF-7 및 HUVEC 세포 배양

MCF-7 세포 (human breast cancer cell)는 한국세포주은행에서 분양 받아 사용하였다. 세포 배양 배지로는 10% FBS (Gibco, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, USA)이 함유된 RPMI (Gibco, USA) 배지를 사용하였고, 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양된 세포는 2일 마다 배양액을 교체하고 4-5일 간격으로 계대배양 하였다. HUVEC 세포 (human umbilical vein endothelial cell)은 LONZA에서 분양 받아 사용하였다. 세포 배양 배지로는 M200 (Gicco, USA)에 LSGS 키트 (Gicco, USA)를 첨가하여 배양하였고, 패시지 (passage) 3-5 세포만 실험에 사용하였다.

실시예 2: MCF-7 세포 증식 측정 (MCF-7 cells proliferation assay)

무-페놀 레드 RPMI (Phenol red-free RPMI, Gibco, USA)에 5% 차콜-덱스트란 처리된 FBS (dextran-coated charcoal-stripped FBS, TCB, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 희석하여 만든 무-에스트로겐 (estrogen-free) 배양액을 실험에 사용하였다. 무-에스트로겐 배양액에 3일 동안 반응시킨 세포를 96-웰 플레이트에 1.5×10⁴ 세포/웰 농도로 분주하여 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 시료를 처리하였다. 시료의 최종 DMSO 농도는 0.1% 가 되도록 처리하였고, 양성 대조군은 E2를, 음성 대조군은 ICI 182,780 (sigma Chem. Co., USA)을 사용하였다. 시료 처리 후 72시간 반응 후에 CellTiter 96^®Aqueous One Solution (Promega, Germany) 시약을 이용하여 MTS 분석을 수행하였다. 각각의 웰에 MTS 시약 20 ㎕을 처리하고, 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 3시간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 490 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

에스트로겐 활성을 평가하기 위해 MCF-7 세포를 이용하여 세포 증식 효과를 측정한 결과가 아래의 표 8 및 표 9에 나타나 있다. 표 8에 따르면, 대조군에 비하여 3:1 복합물, 2:1 복합물 및 레드클로버 처리시에 세포가 증식한 것을 확인하였다. 특히, 레드클로버 또는 호프를 단독으로 처리한 경우에 비해 3:1 복합물 또는 2:1 복합물 처리시 더욱 큰 증식 효과가 확인되어, 두 종의 추출물이 서로 상승효과를 보이는 것으로 나타났다. 표 9는 각각의 시료가 에스트로겐 수용체에 작용하여 세포증식 효과를 나타내는지 확인하기 위해 에스트로겐 수용체 저해제인 ICI 182,780을 함께 처리하여 실험한 결과이다. 에스트로겐 수용체 저해제를 시료와 함께 처리했을 때 세포 증식 효과가 억제되었으므로, 표 8에서 확인된 MCF-7 세포 증식 효과는 각각의 시료가 에스트로겐 수용체를 활성화시킨 것에 기인한 것으로 확인되었다.

[표 8]

[표 9]

실시예 3: 산화질소 ( NO ) 및 엔도텔린 -1 ( Endothelin -1, ET -1) 생성 측정

복합물의 혈액순환개선 효과를 평가하기 위하여, 혈관이완관련 바이오마커 중 하나인 산화질소 (NO) 및 혈관수축관련 바이오마커 중 하나인 엔도텔린-1 (Endothelin-1)의 생성을 HUVEC 세포를 이용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트에 3×10⁴ 세포/웰 농도로 세포를 분주하여 24시간 배양한 후 4시간 동안 배지에 혈청이 없는 상태에서 (serum starvation) 유지하였다. 그 후 5% 차콜-덱스트란 처리된 FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 무-페놀 레드 M200 배지에 시료를 최종 DMSO 농도가 0.5%가 되도록 희석하여 처리하였다. 24시간 반응 후 세포배양액을 얻어 총 산화질소 분석 키트 (R&D systems, USA) 및 엔도텔린-1 Quantikine ELISA 키트 (R&D systems, USA)를 사용해 배양액 내로 분비된 NO 수준 (표 10 및 11) 및 ET-1 수준 (표 12, 13 및 14)을 측정하였다.

먼저 NO 수준을 측정한 결과, 아래의 표 10에 나타난 바와 같이 3:1 복합물 또는 2:1 복합물 처리시 대조군에 비하여 배양액 내 NO 수준이 유의적으로 증가하였다. 상승효과를 보기 위하여 3:1 100 μg/ml과 그 안에 혼합되어 있는 레드클로버 75 μg/ml과 호프 25 μg/ml을 각각 처리 하여 효능을 비교하였을 시 표 11에 표시된 바와 같이 단독시료군 보다 3:1 군이 유의적으로 더 높은 증가 효과를 나타내었다.

[표 10]

[표 11]

또한, 엔도텔린-1의 수준을 측정한 결과, 아래의 표 12에 나타난 바와 같이 3:1 복합물 또는 2:1 복합물 처리시 대조군에 비하여 배양액 내 엔도텔린-1 수준이 유의적으로 감소하였다.

[표 12]

한편, 상승효과를 보기 위하여 3:1 100 μg/ml과 그 안에 혼합되어 있는 레드클로버 75 μg/ml과 호프 25 μg/ml을 각각 처리 하여 효능을 비교하였을 시 하기 표 13에 표시된 바와 같이 단독시료군 보다 3:1 군이 유의적으로 더 높은 감소효과를 나타내었다.

[표 13]

복합시료의 상승효과를 확인하기 위하여 Colby 방정식을 사용하여 복합물로부터 예상되는 저해 효과를 계산하였다. Colby 방정식 대입 결과 표 14에 표시된 바와 같이 endothelin-1 생성 억제률에 대한 Colby 예상치는 4.4%인 반면 실제 관찰수치는 16.9%였으므로 3:1복합물 시료는 레드클로버 또는 호프 단독 시료에 비해 endothelin-1 생성 억제에 상승효과가 있는 것으로 확인되었다.

[표 14]

실시예 4: eNOS 발현 수준 측정

복합물의 NO 수준 증가 효과 기전을 확인하기 위하여, NO 생성 단백질인 eNOS 단백질의 발현 수준을 HUVEC 세포를 이용하여 측정하였다. 24-웰 플레이트에 1.5×10⁵ 세포/웰 농도로 세포를 분주하여 24시간 배양한 후 4시간 동안 배지에 혈청이 없는 상태에서 유지하였다. 그 후 5% 차콜-덱스트란 처리된 FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 무-페놀 레드 M200 배지에 시료를 최종 DMSO 농도가 0.5%가 되도록 희석하여 처리하였다. 24시간 반응 후 세포 용출물 (cell lysate)을 얻어 인간 eNOS DuoSet ELISA kit (R&D systems, USA)를 사용하여 eNOS 단백질의 발현 수준을 측정하였다.

eNOS 단백질의 발현량을 측정한 결과, 아래의 표 15에 나타난 바와 같이 3:1 복합물 또는 2:1 복합물 처리시 대조군에 비하여 eNOS 단백질 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 상승효과를 보기 위하여 3:1 100 μg/ml과 그 안에 혼합되어 있는 레드클로버 75 μg/ml과 호프 25 μg/ml을 각각 처리 하여 효능을 비교하였을 시 표16에 표시된 바와 같이 단독시료군 보다 3:1 군이 유의적으로 더 높은 증가 효과를 나타내었다.

[표 15]

[표 16]

실험예 5: 동물실험 평가 방법

본 실험예에서는 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물이 가지는 갱년기 장애에 대한 생리활성 증대효과를 양측 난소적출 래트 모델(OVX, bi-lateral ovarioectomized rat model)을 이용하여 평가하였다. 구체적으로, 난소적출 후 (수술 4일 후)의 래트에 레드클로버 추출물:호프 추출물 2:1 (w/w) 및 3:1 (w/w) 복합물 250 및 500 mg/kg/일을 멸균증류수에 용해 또는 분산하여 10 ml/kg의 용량으로 매일 1회씩 56일 (8주) 동안 경구투여하였다. 상기 복합물이 체중, 꼬리 피부 온도(TST), 혈중 지질 프로파일, 골 대사, 항산화, 혈관이완 마커 및 자궁 내막에 미치는 효과를 분석하였다.

(1) 실험동물

Female virgin Sprague-Dawley Rat (11주령, OrientBio, Seungam, Korea)을 도입하여 1주일간 순화 후 사용하였으며 본 실험은 네이처텍 동물실험윤리위원회의 심의/승인 하에 진행되었다 (승인번호 UIK21702).

(2) 실험 방법

난소적출 (OVX)에 의한 갱년기 장애유발을 위해, 위수술 대조군을 제외한 모든 실험동물을 무작위로 선정하여 양쪽 난소를 완전히 절제하여 갱년기 증상을 유발하였다. 위수술군에서는 동일한 방법으로 양쪽 난소를 확인 후 절제하지 않고 복강을 다시 폐쇄하였다. 위수술군을 포함한 모든 실험동물은 수술 3~4일 후 임상증상 및 체중을 측정하고 이상이 없는 동물을 선별하여 체중에 따라 무작위배정을 통해 군분리를 하였다.

각각의 실험군에는 아래와 같은 명칭을 부여하였다:

Sham : 위수술 대조군 (Sham operated control group)

OVX : 양측난소절제술 (bi-lateral ovarioectomized group) 수행군

2:1(500) : 레드클로버 및 호프 추출물 2:1 (w/w) 혼합시료 500 mg/kg/일 투여군

2:1(250) : 레드클로버 및 호프 추출물 2:1 (w/w) 혼합시료 250 mg/kg/일 투여군

3:1(500) : 레드클로버 및 호프 추출물 3:1 (w/w) 혼합시료 500 mg/kg/일 투여군

3:1(250) = 레드클로버 및 호프 추출물 3:1 (w/w) 혼합시료 250 mg/kg/일 투여군

각각의 실험군과 관련된 정보는 아래 표 17에 나타나 있다.

[표 17]

실시예 5: 레드클로버 및 호프 추출물 복합물 투여 8주 후 체중 및 증체량 변화 결과

레드클로버 및 호프 추출물 2:1 복합물 및 3:1 복합물을 OVX 래트에 8주간 경구투여하고 체중 변화 및 증체량을 관찰한 결과, 500 mg/kg 투여군에서 두 종의 복합물 모두에서 유의한 체중 증가 억제가 관찰되었다. 증체량의 경우, 2:1복합물은 500 mg/kg 투여군에서, 그리고 3:1복합물은 250 및 500 mg/kg 투여군에서 체중 증가가 유의하게 억제된 것으로 나타났다 (표 18).

[표 18]

실시예 6: 사료효율 변화 측정

투여기간동안 래트의 평균 체중증가량 (증체량) 및 평균사료섭취량을 산정하고 이를 통하여 FER (food efficacy ratio)를 환산하여 아래의 표 19에 나타내었다. 표 19에 따르면, 2:1복합물은 500 mg/kg 투여군에서, 3:1복합물은 250 및 500 mg/kg 투여군 모두에서 FER이 유의하게 감소되는 것을 확인하였다.

[표 19]

실시예 7: 꼬리피부온도(tail skin temperature, TST) 변화 측정

여성갱년기의 주요 증상 중 하나인 안면홍조개선효과와 관련된 동물실험마커로서 꼬리 피부 온도(TST)를 측정하였다. 투여 8주 후 실험동물의 각 꼬리 피부 온도를 적외선온도계(Bioseb, USA)로 측정한 결과, 500 mg/kg 투여군에서 두 가지 복합물 모두에서 유의하게 꼬리피부온도의 상승이 억제되었다 (표 20).

[표 20]

실시예 8: 장기무게 변화

모든 실험동물은 실험 종료1일전 16시간 절식시키고 부검하여 사후 분석을 위한 혈액샘플 채취 및 장기를 적출하고 습장기의 무게를 측정하였다 (표 21). 절식 체중은 시험기간 동안 관찰한 결과와 동일하게 500 mg/kg 용량을 투여한 두 가지 복합물 투여군 모두에서 유의한 감소를 나타내었다.

자궁무게는 OVX 군에서 위수술 대조군에 비하여 현저한 감소가 나타났으며 이 변화는 두 가지 복합물을 투여할 경우에도 별다른 변화를 보이지 않았다.

반면 복부지방량의 습중량을 측정한 결과 체중 변화와 마찬가지로 500 mg/kg 용량으로 투여한 두 종의 복합물 투여군들에서 유의한 감소를 나타내었으므로, 2:1 복합물 및 3:1 복합물에 의한 체중감소 효과는 내장지방 축적을 억제함으로써 나타난 것으로 유추할 수 있다.

[표 21]

실시예 9: 혈중지질 변화

실험동물의 혈중 지질을 측정한 결과, 레드클로버 추출물:호프 추출물의 2:1 복합물 500 mg/kg 투여군과 3:1 복합물 250 및 500 mg/kg 투여군에서 LDL (Low density lipoprotein)의 유의한 감소가 관찰 되었고, 총 콜레스테롤 (TC, Total cholesterol)은 2:1 복합물 투여군에서 유의성은 나타나지 않았으나 감소경향이 관찰되었으며, 3:1 복합물 250 및 500 mg/kg 투여군에서 유의한 감소가 관찰되었다 (표 22).

[표 22]

실시예 10: 혈중 오스테오칼신, ALP 및 CTX-1 함량 변화

혈중 오스테오칼신 (osteocalcin), ALP 및 CTX-1의 함량은 골대사를 반영하는 혈중 지표이며, 이중 오스테오칼신과 ALP는 골형성을 반영하는 지표이고, CTX-1은 골흡수를 반영하는 지표로 알려져 있다. 폐경후 여성에서 골밀도의 유의한 감소와 더불어 위의 3가지 지표가 유의하게 높게 나타나므로, 이들 지표의 감소는 레드클로버 및 추출물 복합물의 골대사 개선을 의미한다. 이에 본 실시예에서는 레드클로버 및 호프 추출물 복합물의 혈중 오스테오칼신 및 ALP 함량에 대한 효과를 관찰하였다.

OVX 대조군에서는 위수술 대조군에 비해 유의성 있는 혈중 오스테오칼신 및 혈중 ALP 함량의 증가가 관찰된 반면, 레드클로버 추출물:호프 추출물 2:1 복합물 및 3:1 복합물 투여군에서는 유의성있는 혈중 오스테오칼신 및 혈중 ALP 함량의 감소가 관찰되었다 (표 23).

[표 23]

한편, 레드클로버 및 호프 추출물 복합물의 혈중 CTX-1 함량에 대한 효과를 관찰하였다. 실험동물에서 CTX-1의 혈중농도를 분석한 결과, 레드클로버 추출물:호프 추출물 2:1 복합물 및 3:1 복합물의 500 mg/kg 투여군에서 유의성 있는 혈중 CTX-1의 감소가 관찰되었다 (표 24).

[표 24]

실시예 11: 혈중 Endothelin -1 및 NO 변화

본 실시예에서는 레드클로버 및 호프 추출물 복합물의 혈중 Endothelin-1 및NO 함량에 대한 효과를 관찰하였다.

실험동물에서 Endothelin-1 및 NO의 혈중농도를 분석한 결과, 레드클로버 추출물:호프 추출물 3:1 복합물의 250 및 500 mg/kg 투여군에서 유의성 있는 혈중 Endothelin-1의 감소와 NO의 증가가 관찰되었다 (표 25).

[표 25]

실시예 12: 혈중 SOD 및 MDA 변화

본 실시예에서는 레드클로버 및 호프 추출물 복합물의 혈중 SOD(superoxide dismutase) 및 MDA(malondialdehyde) 함량에 대한 효과를 관찰하였다. SOD는 체내에 쌓인 과잉의 활성산소를 제거하는 항산화효소이며, MDS는 지질과산화지표를 나타낸다.

실험동물에서 SOD 및 MDA의 혈중농도를 분석한 결과, 레드클로버 추출물:호프 추출물 3:1 복합물의 250 및 500 mg/kg 투여군에서 유의성 있는 혈중 SOD의 증가 및 MDA의 감소가 관찰되었다 (표 26).

[표 26]

실시예 13: 자궁내막높이의 변화

본 실시예에서는 레드클로버 및 호프 추출물 복합물의 자궁내막높이에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 부검 후 적출된 자궁조직을 염색하여 자궁내막의 높이를 측정하였다.

OVX 대조군에서는 위수술 대조군에 비하여 자궁내막 상피세포의 높이가 유의하게 감소되어 있었으며, 레드클로버 추출물:호프 추출물 3:1 복합물의 250 및 500 mg/kg 투여군의 경우 OVX 대조군과 별다를 차이를 보이지 않았다 (표 27).

[표 27]

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

1. 레드클로버(red clover) 추출물 및 호프(hops) 추출물의 복합물을 유효성분으로 포함하고,
   상기 복합물이 레드클로버 추출물과 호프 추출물을 1:1 내지 7:1의 중량비로 포함하는 것인, 여성 갱년기 장애 개선용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 복합물이 레드클로버 추출물과 호프 추출물을 3:1 내지 2:1의 중량비로 포함하는 것인, 여성 갱년기 장애 개선용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 여성 갱년기 장애가 혈액순환장애, 체중증가, 안면홍조, 골다공증, 혈중 콜레스테롤 증가, 발한, 불면증, 신경과민, 우울증, 현기증, 집중력 결핍, 관절통, 두통, 심계항진, 질 건조감, 피로, 흥분, 수면장애, 기억상실, 기억력 장애, 건망증, 식은땀, 두근거림, 빈뇨, 근심 및 아테롬성 동맥경화증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 갱년기 증상을 나타내는 것인, 여성 갱년기 장애 개선용 조성물.
4. 제1항에 있어서, 레드클로버 추출물이 레드클로버 잎으로부터 추출된 것인, 여성 갱년기 장애 개선용 조성물.
5. 제1항에 있어서, 호프 추출물이 호프 꽃, 호프 꽃봉오리 또는 둘 모두로부터 추출된 것인, 여성 갱년기 장애 개선용 조성물.
6. 제1항에 있어서, 레드클로버 추출물 및 호프 추출물이 각각 레드클로버 추출 분말 및 호프 추출 분말인, 여성 갱년기 장애 개선용 조성물.
7. 제1항에 있어서, 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물이 레드클로버 추출물 및 호프 추출물을 개별적으로 투여한 경우에 비해 상승효과를 나타내는, 여성 갱년기 장애 개선용 조성물.
8. 제1항에 있어서, 레드클로버 추출물 및 호프 추출물의 복합물이 하나 이상의 하기 활성을 나타내는, 여성 갱년기 장애 개선용 조성물:
   (1) 에스트로겐 수용체 결합;
   (2) 에스트로겐 활성 증진;
   (3) 혈중 산화질소(NO) 수준 증가;
   (4) 혈중 eNOS 단백질 발현 수준 증가;
   (5) 혈중 엔도텔린-1(Endothelin-1) 수준 감소;
   (6) 내장지방 축적 억제;
   (7) 혈중 지질 감소:
   (8) 혈중 오스테오칼신, ALP 및 CTX-1 함량 감소;
   (9) 혈중 SOD 증가 및 MDA 감소; 및
   (10) 래트의 꼬리 피부 온도(TST) 상승 억제.
9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 여성 갱년기 장애 개선용 식품 조성물.
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 여성 갱년기 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
11. 제10항에 있어서, 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여를 위한, 여성 갱년기 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
12. 제11항에 있어서, 경구 투여를 위해 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 드링크제로 제형화된, 여성 갱년기 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
13. (a) 레드클로버 잎을 분쇄한 후 주정추출하여 레드클로버 추출물을 제조하는 단계;
    (b) 호프 꽃 및 호프 꽃봉오리를 주정추출하여 호프 추출물을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 레드클로버 추출물 및 호프 추출물을 혼합하는 단계;를 포함하고,
    상기 레드클로버 추출물과 상기 호프 추출물을 1:1 내지 7:1의 중량비로 포함하는 것인, 여성 갱년기 장애 개선용 조성물의 제조방법.
14. 제13항에 있어서, (a) 단계 및 (b) 단계는 주정추출 후 추출물을 여과, 농축 및 건조하는 단계를 더 포함하는, 여성 갱년기 장애 개선용 조성물의 제조방법.
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