KR101903732B1

KR101903732B1 - 배향초 추출물의 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR101903732B1
Application number: KR1020160183496A
Authority: KR
Inventors: 김선여; 김승현; 이택환; 박선주
Original assignee: 가천대학교 산학협력단; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2018-10-05
Also published as: KR20180078588A

Abstract

본 발명은 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze) 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 멜라닌 생성을 억제하고, 이로부터 분리된 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드 화합물이 SOX9의 발현억제를 통해 멜라닌 생성에 관여하는 유전자인 MITF, 타이로시네이즈, TRP-1 및 DCT를 하향조절하여 멜라닌 생성을 억제함을 규명한 바 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리된 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드 화합물 유효성분으로 함유하는 조성물은 피부 미백용 화장료 조성물로써, 피부 화이트닝 및 라이트닝을 위한 기능성 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

배향초 추출물의 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물{Composition for whitening comprising an ethyl acetate fraction of Agastache rugosa Fisch. and C.A.Mey.Kuntze or an active compound isolated from the plant}

본 발명은 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물, 과색소질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 피부 미백용 또는 과색소성 질환의 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

피부는 외부 환경과 직접 접하면서 인체를 보호하며 생화학적이고 물리적인 기능을 가지는 아주 중요한 조직이다. 이 조직은 크게 3가지 즉, 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하(hypodermis)로 나누어진다. 멜라닌은 피부의 표피층에 존재하는 색소로서 개체의 생육이나 발달에 필수적이지는 않지만, 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌세포로부터 생성된다. 멜라닌 합성 과정을 구체적으로 살펴보면, 멜라노사이트 내의 멜라노좀이라는 소포체에서 먼저 티로시나제(Tyrosinase) 라는 효소에 의해 타이로신이 도파(DOPA)를 거쳐 도파퀴논(DOPAquinone)으로 전환되고, 도파퀴논으로부터 도파크롬(DOPAchrome)을 거쳐 흑갈색의 공중합체인 멜라닌이 생성된다. 생성된 멜라닌은 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동, 개체의 피부색을 결정할 뿐 아니라 UV의 빛 에너지를 흡수하여 UV에 의한 손상으로부터 진피 이하의 피부 기관을 보호하며, 피부 생체 내에 생겨난 유해산소 및 프리라디칼 등을 잡아주는 등 외부 유해인자로부터 피부를 보호하는 역할을 수행한다.

상기의 멜라닌의 순기능에도 불구하고, 멜라닌세포(melanocyte)의 수 또는 활성이 증가는 멜라닌 축적을 유도하는데, 멜라닌의 비정상적인 과도한 축적은 염증성색소침착(post inflammatory hyperpigmentation), 기미(melisma), 일광흑자(solar lentigines) 및 노인성색소침착(geriatric pigment spots)등과 같은 과색소성 질환(Hyperpigmentary disorder)의 원인이 되는 경우가 빈번하다. 따라서, 멜라닌 생성을 억제, 비정상적인 과색소침착(hyperpigmenation)의 예방 및 치료를 위한 세포독성이 낮은 미백제의 개발에 대한 요구가 피부미용에 대한 관심의 증가와 더불어 급증하고 있다.

미백제의 개발과 관련한 연구에서 지금까지는 멜라닌 생성효소나 멜라노좀(melanosome) 전달(transfer)의 조절이 가장 일반적인 접근법이었다. 이 중에서도 타이로시네이즈(tyrosinase), TRP-1(tyrosinase-related protein 1), DCT(dopachrome tautomerase, tyrosinase-related protein 2(TRP-2)로도 불림) 또는 MITF(microphthalmia associated transcription factor)와 같은 멜라닌 생성효소의 억제를 통한 미백에 대하여 많은 연구 보고가 있었다. 타이로시네이즈, TRP-1 및 DCT는 멜라닌 생합성에 있어 핵심 효소로써 잘 알려져 있는데 이들은 멜라노좀(melanosome)이라는 세포기관(organelle)에서 작용한다. 타이로시네이즈는 L-타이로신을 3,4-디히드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine, L-DOPA)로 변환시키고, 이후 dopaquinone로 변환시킨다. DCT 및 TRP-1은 그 다음 단계들로써 도파크롬의 멜라닌 폴리머로의 변환에 관여한다. 타이로시네이즈, TRP-1 및 DCT와 같은 멜라닌 생성효소들은 멜라노사이트의 발생에 중요한 역할을 하나인 SOX 전사인자중의 하나인 SOX9(SRY type HMF box 9)에 의해 조절되는 것으로도 알려져 있는데 아직까지 SOX9 자체의 조절을 통해 멜라닌 합성을 조절할 수 있는 미백제에 대하여는 그 보고가 없다.

방아풀로도 알려진 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze)은 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀로 한국민트라고 불려지고 있는 식물이다. 양지쪽 자갈밭에서 자라며 높이는 40∼100cm이다. 줄기는 곧게 서고 윗부분에서 가지가 갈라지며 네모진다. 잎은 마주나고 달걀 모양이며 길이 5∼10cm, 나비 3∼7cm이다. 끝이 뾰족하고 밑은 둥글며 길이 1∼4cm의 긴 잎자루가 있으며 가장자리에 둔한 톱니가 있다. 꽃은 입술 모양이며 7∼9월에 피고 자줏빛이 돌며 윤산꽃차례[輪傘花序]에 달리고 향기가 있다. 꽃차례는 이삭 모양으로서 길이 5∼15cm이다. 꽃받침은 5개로 갈라지고 화관은 길이 8∼10mm로서 윗입술 모양 꽃잎은 작고 아랫입술은 크며 5개로 갈라진다. 4개의 수술 중 2개는 길다. 열매는 분열과로서 납작하고 달걀 모양의 타원형이다. 어린순을 나물로 하고 관상용으로 가꾸기도 한다. 중국에서는 곽향(藿香)이라 적고 있으며, 우리나라에서는 성숙한 배초향을 곽향이라 하여 약재로 사용한다. 한국·일본·타이완·중국 등지에 분포하며, 항균활성, 항진균활성, 항아테로제닉(anti-atherogenic) 활성을 가지는 것으로 보고되어 있다.

본 발명에서는 배초향의 멜라닌 합성에 대한 효과를 분석한 결과 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 멜라닌 합성을 현저하게 저하시킴을 확인하고, 이 분획물로부터 분리한 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드화합물이 SOX9 억제를 통해 멜라닌 합성을 억제하는 것을 규명하여 미백제로 상기 화합물을 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

삭제

Lee, T. H.; Seo, J. O.; Baek, S. H.; Kim, S. Y. Inhibitory effects of resveratrol on melanin synthesis in ultraviolet B-induced pigmentation in Guinea pig skin. Biomol. Ther. 2014, 22, 35-40. Tseng, T. S.; Tsai, K. C.; Chen, W. C.; Wang, Y. T.; Lee, Y. C.; Lu, C. K.; Don, M. J.; Chang, C. Y.; Lee, C. H.; Lin, H. H.; Hsu, H. J.; Hsiao, N. W. Discovery of potent cysteine-containing dipeptide inhibitors against tyrosinase: a comprehensive investigation of 20 × 20 dipeptides in inhibiting dopachrome formation. J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 6181-6188. Passeron, T.; Valencia, J. C.; Bertolotto, C.; Hoashi, T.; Le Pape, E.; Takahashi, K.; Ballotti, R.; Hearing, V. J. SOX9 is a key player in ultraviolet B-induced melanocyte differentiation and pigmentation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007, 104, 13984-13989. Jang, B.-G.; Lee, D.-H.; Lee, J.-S. Production of antibacterial substance against bovine pneumoniae bacteria from Agastache rugosa. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 2005, 33, 142-147.

본 발명의 목적은 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물, 과색소질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 피부 미백용 또는 과색소성 질환의 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze) 추출물의 에틸아세테이트 분획물 또는 하기 화학식 1로 기재되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

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또한, 본 발명은 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze ) 추출물의 에틸아세테이트 분획물 또는 하기 화학식 1로 기재되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 과색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

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또한, 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze) 추출물의 에틸아세테이트 분획물 또는 하기 화학식 1로 기재되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 또는 과색소성 질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다:

[화학식 1]

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본 발명은 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze) 추출물의 에틸아세테이트 분획물 또는 하기의 화학식 1로 기재되는 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드는 세포독성이 없으며, SOX9 억제를 통해 멜라닌 생성에 관여하는 유전자인 타이로시네이즈, TRP-1, DCT 및 MITF의 발현을 억제하여 멜라닌(mealnin) 생성을 저해하므로 미백용 또는 과색소질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다:

[화학식 1]

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도 1A는 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze) 추출물의 분획물을 처리한 멜라닌-a 세포에서 멜라닌 함량을 나타낸 도이다.
도 1B는 멜라닌-a세포에서 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze) 추출물의 분획물 처리에 따른 세포독성을 나타낸 도이다.
도 2는 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드의 다양한 구조적 유사체들을 처리한 멜라닌-a세포의 멜라닌 함량 및 그 처리에 따른 세포독성을 나타낸 도이다.
도 3은 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드(Compound 1)를 처리한 인간표피멜라닌세포(normal human epidermal melanocyte, NHEM)에서 타이로시네이즈 활성(in situ tyrosinase activity)를 나타낸 도이다.
도 4A는 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드(1)를 처리한 인간표피멜라닌세포에서 염색된 멜라닌 세포의 면적을 나타낸 도이다
도 4B는 인간표피멜라닌세포에서 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드(1)를 처리에 따른 세포독성을 나타낸 도이다
도 5는 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드(Compound 1) 처리에 따른 멜라닌 합성관련 유전자의 발현량을 RT-PCR의 방법으로 확인하고(도 5A), 이를 정량하여 도식화한 것(도 5B 내지 5F)을 나타낸 도이다.
도 6은 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드(Compound 1)를 처리한 인간표피멜라닌세포에서 다양한 멜라닌 생성관련유전자를 면역형광법(immunofluorescence)으로 분석한 도이다.
도 7은 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드(Compound 1)를 처리한 인공피부조직인 멜라노덤(MelanoDerm, MatTek Ashland, MA)에서 멜라닌 생성으로 인한 검은색으로의 색깔 변화정도 및 (도 7A) 면역조직화학 분석 결과를 나타낸 도이다(도 7B).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze) 추출물의 에틸아세테이트 분획물 또는 하기 화학식 1로 기재되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

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또한, 본 발명은 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze) 추출물의 에틸아세테이트 분획물 또는 하기 화학식 1로 기재되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 과색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

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상기 배초향 추출물 또는 이의 분획물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 배초향에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하여 배초향의 추출물을 제조하는 단계; 및

4) 단계 3)의 배초향 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 배초향 분획물을 제조하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 배초향는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 배초향은 잎, 줄기 또는 뿌리가 모두 이용가능하며, 이들의 둘 이상의 혼합물도 이용가능하다.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C₁ 내지 C₄ 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올, 메탄올 또는 프로필알코올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 건조된 배초향 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 2 내지 3배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 100℃인 것이 바람직하고, 20℃ 내지 40℃인 것이 더욱 바람직하고, 실온인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10 내지 48시간인 것이 바람직하며, 15 내지 30시간인 것이 더욱 바람직하고, 24시간인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3 내지 4회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하고, 3회인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 유기용매는 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 배초향 추출물을 물에 현탁시킨 후 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나인 것이 바람직하며, 에틸아세테이트 분획물임이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 상기 배초향 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명은 상기 화학식 1 로 표시되는 화합물뿐만 아니라, 이의 프로드럭(prodrug), 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세이체 또는 입체이성질체를 모두 포함한다.

상기 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 멜라닌 생성을 억제하며, 상기 화학식 1로 기재되는 화합물은 멜라닌 생성과 관련된 유전자인 타이로시네이즈, TRP-1, DCT, MITF 및 SOX9 유전자의 발현을 억제하는 기능을 나타낸다.

상기 과색소성질환은 기미, 주근깨, 반점, 일광흑자, 약물성 색소침착, 염증성 색소침착, 노인성 색소침착 및 임신성 색소침착으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze) 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드을 처리하였을 때, 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 멜라닌 생성을 억제하고, 이로부터 분리된 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드 화합물은 SOX9의 발현억제를 통해 멜라닌 생성에 관여하는 유전자인 MITF , 타이로시네이즈, TRP-1 및 DCT를 하향조절하여 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다. 인공피부조직인 멜라노덤(MelanoDerm, MatTek Ashland, MA)을 이용한 실험에서도 상기 화합물이 세포 독성 없이 표피에서 멜라닌을 감소시킨다는 것을 확인함으로써, 상기 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze) 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드는 피부 미백용 화장료 조성물 또는 과색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

통상적인 화장료 조성물에 본 발명의 본 발명의 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드가 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드를 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze) 추출물의 에틸아세테이트 분획물 또는 하기 화학식 1로 기재되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 또는 과색소성 질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다:

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본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드을 처리하였을 때, 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 멜라닌 생성을 억제하고, 이로부터 분리된 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드 화합물은 SOX9의 발현억제를 통해 멜라닌 생성에 관여하는 유전자인 MITF , 타이로시네이즈, TRP-1 및 DCT를 하향조절하여 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 확인한 바 상기 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드는 피부 미백용 또는 과색소성 질환의 개선용 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있는데, 일반적으로, 상기 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량으로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품의 예로는 기능성 혼합차, 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드는 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 배초향 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리한 메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

배초향 추출물, 분획물의 제조

건조된 배초향의 잎(4.0 kg)을 10 L의 100% 메탄올로 4시간동안 3회 반복 초음파 추출한 뒤, 추출액을 여과 후 진공 농축기로 감압 농축하여 메탄올 조추출물 400.0g을 수득하였다.

또한 건조된 배초향의 잎(100g)을 500mL의 100% 에탄올, 100% 프로필알콜로 4시간동안 3회 반복 초음파 추출한 뒤, 추출액을 여과 후 진공 농축기로 감압 농축하여 조추출물 11.0g, 9.0g을 각각 수득하였다.

배초향의 에틸아세테이트 분획물로부터 화합물의 분리

상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 배초향 잎의 메탄올 추출물을 물에 재현탁시킨 후 클로로포름(CHCl3) 및 에틸아세테이트(EtOAc)로 순차적으로 분획하여 클로로포름 분획물(119.8g, AR1), 에틸아세테이트 분획물(156.3g, AR2) 및 수용성 분획물(130.0g, AR3)을 수득하고 에틸아세테이트 분획물(AR2)에 대해 실리카 겔(Kieselgel 60, Merck, Darmstadt, Germany, CAS No. 7631-86-9) 컬럼 크로마토그라피(이동상으로 클로로포름:메탄올 20 : 1 → 1 : 1, v/v, 16 mL /분)를 수행하여 총 5개의 분획물(AR1A 11.4 g, AR1B 8.7 g, AR1C 3.5 g, AR1D 3.9 g 및 AR1E 55.8 g)을 수득하였다. AR1C 분획물에 대하여 상기와 동일한 방법을 수행하여 다시 3개의 분획물(AR1C1 1.7 g, AR1C2 1.0 g 및 AR1C3 0.8 g)을 수득하였다.

AR1C2 분획물을 하기 표 3의 조건으로 HPLC를 실시하여 화합물 5 (6.2 mg), 및 화합물 6 (7.5 mg)을 수득하였다.

Item	동작조건
HPLC system
컬럼	J'sphere ODS H-80 (250 mm X 20 mm, 4 ㎛, 8 nm)- YMC, Milford, MA
용매	25% auqueous acetonitrile
검출	_?
유속	3 ml/min

AR1C2 분획물을 하기 표 3의 조건으로 HPLC를 실시하여 화합물 2 (7.0 mg), 3 (6.1 mg) 및 4 (2.9 mg)을 수득하였다.

Item	동작조건
HPLC system
컬럼	J'sphere ODS H-80 (250 mm X 20 mm, 4 ㎛, 8 nm)- YMC, Milford, MA
용매	22% auqueous acetonitrile
검출
유속	3 ml/min

또한 AR1E 분획물에 대해 실리카 겔(Kieselgel 60, Merck, Darmstadt, Germany, CAS No. 7631-86-9) 컬럼 크로마토그라피(이동상으로 클로로포름:메탄올 6 : 1, v/v, 2 mL/분)를 수행하여 화합물 1 (3.3 mg) 및 화합물 7 (4.8 mg)을 수득하였다.

상기 화합물들에 대하여 1D NMR, 2D NMR 및 MS 데이터등 분광학적 분석결과 화합물 1(화학식 1)은 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드(demethyleugenol β-D-glucopyranoside), 화합물 2(화학식 2)는 5β,6α-디히드록시-3β-(β-글루코피라노실옥시)-7-메가스티그멘-9-원( 5β,6α-dihydroxy-3β-(β-glucopyranosyloxy)-7-megastigmen-9-one), 화합물 3(화학식 3)은 E)-4-[3'-(β-글루코피라노실옥시)부틸리덴]-3,5,5-트리메틸-2-시클로헥센-1-원((E)-4-[3'-(β- glucopyranosyloxy) butylidene]-3,5,5-trimethyl-2-cyclohexen-1-one), 화합물 4(화학식 4)는 (6R,9R)-3-옥소-α-이오놀-9-O-β-글루코피라노사이드((6R,9R)-3-oxo-α-ionol-9-O-β-glucopyranoside), 화합물 5(화학식 5)는 벤질 β-글루코피라노사이드(benzyl β-glucopyranoside), 화합물 6(화학식 6)은 살리드로사이드(salidroside), 화합물 7(화학식 7)은 시트루신 C(citrusin C)로 확인되었다.

디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드(demethyleugenol β-D-glucopyranoside);

5β,6α-디히드록시-3β-(β-글루코피라노실옥시)-7-메가스티그멘-9-원( 5β,6α-dihydroxy-3β-(β-glucopyranosyloxy)-7-megastigmen-9-one);

(E)-4-[3'-(β-글루코피라노실옥시)부틸리덴]-3,5,5-트리메틸-2-시클로헥센-1-원((E)-4-[3'-(β- glucopyranosyloxy)butylidene]-3,5,5-trimethyl-2-cyclohexen-1-one);

(6R,9R)-3-옥소-α-이오놀-9-O-β-글루코피라노사이드((6R,9R)-3-oxo-α-ionol-9-O-β-glucopyranoside);

벤질 β-글루코피라노사이드(benzyl β-glucopyranoside);

살리드로사이드(salidroside);

시트루신 C(citrusin C).

< 실험예 1> 배초향 추출물의 분획물이 멜라닌 생성에 미치는 효과

멜라닌-a 세포에 상기 실시예의 방법으로 제조된 추출물 및 분획물을 처리하여 항멜라닌 생성 효능을 조사하였다.

멜라닌-a 세포는 아모레퍼시픽주식회사의 피부연구소 이병곤박사로부터 제공받았으며 10% FBS, 1% PS(penicillin/streptomycin, research and diagnostic technology) 및 200 nM TPA(phorbol 12-myristate 13-acetate, sigma aldrich)를 포함하는 RPMI1640(회사, cat#) 배지에서 배양하였다. 멜라닌 함량 측정을 위해 먼저 24웰 플레이트에 상기 세포를 1x10⁵/well의 밀도로 분주하고 24시간 후에 신선한 배지로 교체한 후 배초향 추출물의 분획물을 1, 10ug/ml 농도로 처리하였다. 24시간후 신선한 배지로 교체하고 각 분획물을 상기와 동일한 방법으로 처리하였다. 이렇게 시료를 총 3일간 처리한 후 멜라닌 함량 측정을 진행하였다. 멜라닌 함량의 측정은 Kumar et al.(Kumar, K. J.; Yang, J. C.; Chu, F. H.; Chang, S. T.; Wang, S. Y., Lucidone, a novel melanin inhibitor from the fruit of Lindera erythrocarpa Makino. Phytother Res 2010, 24, 1158-65.)에 기재된 방법으로 수행하였다. 간략히 설명하면 세포에서 배지를 제거하고 PBS로 두 번 세척한 다음 멜라닌을 용해시키기 위해 H₂O₂(1ml, 1N)를 처리하였다. 이후 ELISA 마이크로플레이트 리더기(Molecular Devices 사, 미국)으로 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 MTT 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로 세포에서 배지를 제거하고 PBS로 세척한 다음 400㎕의 0.1% 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, MTT; sigma) 용액을 처리하고 1 시간 동안 배양하였다. 이후 상기 용액을 제거한 후 DMSO를 추가한 후, ELISA 마이크로플레이트 리더기(Molecular Devices 사, 미국)으로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 각 실험그룹간 통계학적 비교는 터키의 다중 비교테스트(Tukey' multiple comparisons test)와 함께 일원분산분석(one-way analysis of variance (ANOVA))을 이용하여 수행하였다. 통계학적 유의성의 수준은 *P <0.05, **P < 0.01, 및 ***P < 0.001이다.

그 결과, 배초향 잎의 에탄올추출물, 프로필알코올 추출물 또는 에틸아세테이트의 분획물이 10mg/ml의 농도에서 세포 독성 없이 현저한 멜라닌 합성 억제 활성을 나타냄을 확인하였다 (도 1A 및 1B).

< 실험예 2> 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 화합물이 멜라닌 생성에 대해 미치는 효과

상기 <실험예 1>의 결과로부터, 에틸아세테이트 분획물내에서 멜라닌 합성 억제에 관여하는 화합물을 발굴하기 위하여, 상기 <실시예 2>의 방법으로 분리한 총 7개의 화합물이 멜라닌 합성에 미치는 효과를 상기 <실험예 1>에 기재된 것과 동일한 방법으로 확인하였다. 양성대조군 약물로는 Phenylthiourea (PTU)를 시그마-알드리치사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

그 결과, 화합물 1인 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드가 10μM 의 농도에서 세포독성 없이 비처리군에 비해 멜라닌합성을 유의하게 억제하는 것을 확인하였다(표 3).

	멜라닌 함량	세포 생존능 (cell viability)
음성대조군	100.0±3.4	100.0±0.8
화합물 1	61.6±0.1	103.6±3.8
화합물 2	114.1±4.5	92.4±0.4
화합물 3	105.8±4.7	75.9±5.3
화합물 4	107.4±0.2	79.7±2.9
화합물 5	109.9±2.7	96.0±3.2
화합물 6	98.0±6.8	87.4±3.0
화합물 7	120.8±2.7	97.8±3.1
PTU	68.8±5.2	97.9±0.6

< 실험예 3> 디메틸유게놀 β-D- 글루코피라노시드 유사체의 멜라닌 생성에 대해 미치는 효과

상기 <실험예 2>의 결과로부터, 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드가 세포독성없이 비처리군에 비해 멜라닌합성을 유의하게 억제하는 것을 확인한 바 하기 화학식 8 내지 12의 어느 하나로 기재되는 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드의 다양한 유사체들도 동일한 활성을 지니는지 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 확인하였다.

2-히드록시-5-(2-히드록시에틸)페닐-β-D-글루코피라노시드(2-Hydroxy-5-(2-hydroxyethyl)phenyl-β-D-glucopyranoside);

(E)-4-히드록시시나밀 알콜 4-β-D-D-글루코피라노시드 ((E)-4-Hydroxycinnamyl alcohol 4-β-D-glucopyranoside);

2-(4-히드록시페닐)-에틸-β-D-글루코피라노시드(2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl-β-D-glucopyranoside);

벤질 β-D-글루코피라노시드(benzyl β-d-glucopyranoside);

유게닐-O-β-D-글루코피라노시드(eugenyl-O-β-D-glucopyranoside).

그 결과, 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드만이 멜라닌합성을 유의하게 억제하는 것을 확인하였으며, 상기의 화학식 12로 표시되는 유게닐-O-β-D-글루코피라노시드는 오히려 멜라닌 합성을 증가시키는 등 유사한 구조라 하더라도 그 활성이 상이하게 나타날 수 있음을 확인할 수 있었다(도 2).

< 실험예 4> 인간표피멜라닌세포 (human epidermal melanocyte )에서 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드의 타이로시네이즈 활성의 억제

디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드가 정상 세포에서도 색소침착 저감 활성을 가지는 지를 정상 인간표피멜라닌세포(normal human epidermal melanocyte, NHEM)를 이용하여 확인하였다.

CEFObio 사로부터 구입한 NHEM를 멜라닌세포 생장 배지(CEFObio corporation, Seoul, Korea)에서 배양하고, in situ로 타이로시테이즈 활성을 관찰하기 위해 L-DOPA를 처리하고 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드를 처리유무에 따라 (Newton et alNewton, R. A.; Cook, A. L.; Roberts, D. W.; Leonard, J. H.; Sturm, R. A., Post-transcriptional regulation of melanin biosynthetic enzymes by cAMP and resveratrol in human melanocytes. J Invest Dermatol , 2007, 127, 2216-27.)에 기재된 방법으로 분석하였다. 구체적으로, NHEM 세포를 커버 슬립(cover slips)에 부착시키고, 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드 5μM 및 10μM을 처리하였다. 48시간 후에, PBS로 세척하고 4% 파라포름알데하이드(in PBS)로 15분 동안 상온에서 고정하였다. 커버 슬립을 슬라이드에 올린 후, 세포막을 0.1% Triton-X-100으로 처리하고 PBS로 세척하였다. 이후 0.1% L-DOPA를 37℃에서 3시간 동안 처리하고, 현미경으로 분석하였다. 세포 독성은 상기 <실험예 1>에 기재된 방법과 동일하게 측정하였다. 양성대조군 약물로는 Phenylthiourea (PTU)를 사용하였다. 각 실험그룹간 통계학적 비교는 터키의 다중 비교테스트(Tukey' multiple comparisons test)와 함께 일원분산분석(one-way analysis of variance (ANOVA))을 이용하여 수행하였다. 통계학적 유의성의 수준은 *P <0.05, **P < 0.01, 및 ***P < 0.001이다.

그 결과, 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드은 5μM 및 10μM 의 농도에서 세포독성 없이 타이로시네이즈의 활성을 억제하였다 (도 3, 도 4A, 도 4B). 이 결과는 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드에 의한 멜라닌 합성의 감소가 타이로시네이즈 효소의 조절을 통해 일어남을 제시한다.

< 실험예 5> 멜라닌-a 세포에서 디메틸유게놀 β-D- 글루코피라노시드에 의한 멜라닌 합성 유전자의 하향 조절

타이로시네이즈, TRP-1 및 DCT가 멜라닌 생합성에 있어 핵심 효소로써 잘 알려져 있는데 이들은 멜라노좀(melanosome)이라는 세포기관(organelle)에서 기능한다. 타이로시네이즈는 먼저 L-타이로신을 3,4-디히드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine, L-DOPA)로 변환시키고, 이후 dopaquinone로 변환시킨다. DCT 및 TRP-1은 그 다음 단계들로써 도파크롬의 멜라닌 폴리머로의 변환에 관여한다. MITF(microphthalmia transcription factor)는 상기 세 종류의 멜라닌 생성 효소의 발현을 조절하는 전사인자로 잘 알려져 있다. 한편 최근의 연구는 SOX 패밀리 단백질이 MITF의 조절을 통해 멜라닌 세포의 발생이나 멜라닌형성(melanogenesis)에 관여한다는 것을 보고하고 있다. 일례로 SOX5는 인간 멜라닌세포에서 MITF의 정교한 조절에 관여하며, SOX10은 멜라닌 생성과 관련하여 잘 알려진 유전자로써 MITF의 전사를 직접적으로 활성화한다. SOX10 돌연변이 동물에서는 색소성 결합이 관찰되었다. 최근 SOX9이 SOX10을 조절하지 않음에도 불구하고, siRNA로 SOX9의 발현을 녹다운(knock-down)하였을 때 MITF의 발현 또한 감소시킨다는 것이 또한 보고된 바 있다.

디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드에 의한 타이로시네이즈의 활성 억제의 기전을 확인하고자 타이로시네이즈, TRP-1, DCT, MITF 및 SOX9 유전자에 대하여 RT-PCR을 수행하였다. 구체적으로, 멜라닌-a 세포로부터 TRIZOL Reagent(Invitrogen)를 이용하여 매뉴얼에 따라 시행하여 RNA를 분리하고, 1 ㎍의 total RNA로부터 MMLV 역전사 효소(reverse transcriptase)(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 RT-PCR를 수행하였다. cDNA와 하기 [표 4]에 기재한 각각의 프라이머(primer)를 이용하여 타이로시네이즈, TRP-1, DCT, MITF 및 SOX9 cDNA를 증폭한 후 아가로즈 젤(agarose gel)에 전기 영동하여 결과를 얻었다. 각 실험그룹간 통계학적 비교는 터키의 다중 비교테스트(Tukey' multiple comparisons test)와 함께 일원분산분석(one-way analysis of variance (ANOVA))을 이용하여 수행하였다. 통계학적 유의성의 수준은 *P <0.05, **P < 0.01, 및 ***P < 0.001이다.

타이로시네이즈	Forward	5'-GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT - 3'( 서열번호: 1)
	Reverse	5'-TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC - 3'( 서열번호: 2)
TRP-1	Forward	5'-GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC - 3'( 서열번호: 3)
	Reverse	5'-AAG ACG CTG GTC T - 3'( 서열번호: 4)
DCT	Forward	5'-TAC CAT CTG TTG TGG CTG GA- 3'( 서열번호: 5)
	Reverse	5'-TGG CAC TGC TGG TCA TCT TGT CTT GCT G - 3'( 서열번호: 6)
MITF	Forward	5'-CTA GAG CGC ATG GAC TTT CC - 3'( 서열번호: 7)
	Reverse	5'-AAG TTG GAG CCC ATC TTC CT - 3'( 서열번호: 8)
SOX9	Forward	5'-AGC TCA CCA GAC CCT GAG AA - 3'( 서열번호: 9)
	Reverse	5'-CTC CAG CAA TCG TTA CCT TC - 3'( 서열번호: 10)

그 결과, 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드을 10μM 의 농도로 처리시, SOX9을 비롯하여 핵심 멜라닌 생성유전자의 발현을 억제함을 확인하였다(도 5).

< 실험예 6> 인간표피멜라닌세포 (human epidermal melanocyte )에서 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드처리에 의한 SOX9의 하향 조절

상기 <실험예 2>와 유사하게, 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드가 정상 세포주에서도 동일하게 타이로시네이즈, TRP-1, DCT(TRP-2), MITF 및 SOX9의 발현 조절에 관여하는지 정상인간표피멜라닌세포(normal human epidermal melanocyte, NHEM)를 이용, 면역형광법(immunofluorescence)으로 분석하였다.

구체적으로, NHEM 세포를 커버 슬립(cover slips)에 부착시키고, 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드 10μM을 처리하였다. 48시간 후에, PBS로 세척하고 4% 파라포름알데하이드(in PBS)로 15분 동안 고정하였다. 커버 슬립을 슬라이드에 올린 후, 세포막을 항체가 침투가능(permeabilization)하게 만들고 항체의 비특이적결합을 억제하기 위해 0.1% Triton-X-100 및 1% 말혈청(horse serum)을 포함하는 PBS로 상온에서 30분동안 처리하였다. 이후, 1차 항체와 반응시키고, 형광이 결합된 2차 항체와 반응시켰다. 이후 슬라이드를 공초점 현미경으로 분석하였다.

그 결과, SOX9 및 MITF는 원래 핵에서 높게 발현되었으나, 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드 처리시 그 발현정도가 감소하였다(도 6). 또한 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드은 세포질 구역(cytosolic region)에서 타이로시네이즈, TRP-1, DCT(TRP-2)의 발현을 억제하였다(도 6). 이 결과는 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드의 색소침착 저감활성이 SOX9 뿐 아니라 그 하위경로인 타이로시네이즈, TRP-1 및 DCT의 하향조절에 의해서도 일어남을 보여준다.

< 실험예 7> 인공피부에서 디메틸유게놀 β-D- 글루코피라노시드처리에 의한 색소침착저감

디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드가 인간 유래 in vivo 모델에서도 정말로 색소침착저감활성을 가지는지를 확인하기 위하여, 멜라닌 세포를 포함하는 인공피부조직인 멜라노덤(MelanoDerm, MatTek Ashland, MA)을 이용하여 실험을 수행하였다. 멜라노덤은 인간정상상피세포(normal human epidemal keratinocyte)와 멜라닌세포(melanocyte)로 구성된 인간 표피의 고도로 분화된 모델이다.

구체적으로 멜라노덤은 6-well 에서 5% CO₂및 37℃에서 PI-100-NMM(회사명, Cat# 배지 5 ml으로 배양되었다. 배지는 이틀에 한 번 교체해 주었다. 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드은 PBS와 프로필렌글리콜의 1:1(부피비,v:v) 혼합물에 용해시켜 14일동안 하루에 두 번 처리하였다. 상기 약물 처리가 끝난 후 조직을 수거, PBS로 세척하고 10% 포르말린으로 고정하였다. 고정된 조직을 파라핀으로 포매(embedding)하고 4 ㎛로 두께로 절단하였다. 절단된 조직 절편에 대해 헤마톡실린-에오신염색을 수행하였고 또한 폰타나-마손 은키트(Fontana-Masson silver kit, IHC WORLD, GA, USA)를 이용하여 제조자의 지침에 따라 염색을 수행하였다. 염색된 슬라이드는 광학현미경하에서 관찰하였다. 양성대조군 약물은 상기와 같이 Phenylthiourea (PTU)을 시그마-알드리치사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

그 결과 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드를 인공피부조직에 14일 동안 처리한 결과, 멜라닌 생성으로 인한 검은색으로의 색깔 변화정도가 대조군과 비교하여 억제되었으며, 이 효과는 미백 연구에서 널리 이용되고 있는 약물인 PTU와 유사한 정도임을 확인할 수 있었다(도 7A). 또한, 조직학적 분석에서 디메틸유게놀 β-D-글루코피라노시드는 조직에 어떠한 독성을 나타내지 않았으며, 표피에서 멜라닌을 감소시킨다는 것을 확인할 수 있었다(도 7B).

<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation <120> Composition for whitening comprising an ethyl acetate fraction of Agastache rugosa Fisch. and C.A.Mey.Kuntze or an active compound isolated from the plant <130> 2016P-05-021 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tyrosinase F <400> 1 ggccagcttt caggcagagg t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tyrosinase R <400> 2 tggtgcttca tgggcaaaat c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRP-1 F <400> 3 gctgcaggag ccttctttct c 21 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRP-1 R <400> 4 aagacgctgg tct 13 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DCT F <400> 5 taccatctgt tgtggctgga 20 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DCT R <400> 6 tggcactgct ggtcatcttg tcttgctg 28 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MITF F <400> 7 ctagagcgca tggactttcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MITF R <400> 8 aagttggagc ccatcttcct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9 F <400> 9 agctcaccag accctgagaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9 R <400> 10 ctccagcaat cgttaccttc 20

Claims

하기 화학식 1로 기재되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물:
[화학식 1]

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제 1항에 있어서, 상기 화합물은 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze) 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₄ 저급 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분획물은 배초향 추출물을 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물로 순차적으로 분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 멜라닌 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 타이로시네이즈, TRP-1, DCT, MITF 및 SOX9 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
하기 화학식 1로 기재되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 과색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]

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제 7항에 있어서, 상기 화합물은 배초향(Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.) Kuntze) 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 과색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
제 8항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₂ 저급 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출하는 것을 특징으로 하는 과색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
제 8항에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분획물은 배초향 추출물을 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물로 순차적으로 분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 하는 과색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
제 7항에 있어서, 상기 화합물은 멜라닌 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 과색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
제 7항에 있어서, 상기 화합물은 타이로시네이즈, TRP-1, DCT, MITF 및 SOX9 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 과색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
제 7항에 있어서, 상기 과색소성질환은 기미, 주근깨, 반점, 일광흑자, 약물성 색소침착, 염증성 색소침착, 노인성 색소침착 및 임신성 색소침착으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 과색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 기재되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 또는 과색소성 질환의 개선용 건강기능식품:
[화학식 1]

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