KR102545718B1 - 갯질경을 유효성분으로 포함하는 피부세포재생용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갯질경을 유효성분으로 포함하는 피부세포재생용 조성물에 관한 것이다.

Description

갯질경을 유효성분으로 포함하는 피부세포재생용 조성물{COMPOSITION FOR RECYLCE A SKIN CELL COMPRISING OF LIMONIUM TETRAGONUM}

본 발명은 갯질경을 유효성분으로 포함하는 피부세포재생용 조성물에 관한 것이다.

갯질경은, 쌍떡잎식물 초롱꽃목 갯길경과의 두해살이풀로서, 바닷가에서 자라고, 뿌리가 굵고 곧게 자란다. 잎은 뿌리에서 뭉쳐나고 사방으로 퍼지며 긴 타원형 주걱 모양이고 털이 없으며 가장자리가 밋밋하다.

꽃줄기는 30∼60cm로서 많은 가지가 갈라져 그 끝에 수상꽃차례의 꽃이삭이 달리는데 꽃이삭의 길이는 2∼4cm이다. 포는 녹색이고 타원형이며 몇 개의 꽃이 들어 있다. 꽃받침은 통 모양이고 끝이 5갈래로 갈라진다. 화관은 노란색이고 5갈래로 깊게 갈라지며 꽃받침보다 길다. 수술은 5개, 암술은 1개이며 5개의 암술대가 있다.

열매는 길이 2.5mm 정도로 방추형이다. 뿌리를 생으로 먹을 수 있으나 머리카락이 타는 냄새가 난다. 한국, 일본(남부), 중국 북동부 등지에 분포한다.

이러한 갯질경은 바닷물이 드나드는 갯벌과 소금기가 많은 토양에서 자라는 염색식물로, 잎과 뿌리에는 강력한 항산화 물질인 카테킨을 비롯한 플라보노이드의 일종인 미리세틴(myricetin) 등이 고농도로 함유되어 있다.

이러한 갯질경은 농촌진흥청이 게재한 Natural product sciendes, 2015년 3월호에 의하면, 갯질경을 먹인 쥐는 알코올만 먹인 쥐보다 혈중 알코올 농도가 5.34±0.38nM에서 2.41±0.36nM으로 55% 빠르게 감소한 정도로, 혈중 콜레스테롤의 정상화와 간 조직 내 중성지질의 감소에 효과가 있다고 알려져 있다.

한편, 항산화 및 항염증에 대한 효능을 가지는 조성물로서 다양한 조성물이 있으며, 이 중에서 지채, 비쑥 및 홍삼을 소개하고자 한다.

지채(Triglochin maritimum)는, 외떡잎식물 소생식물목 지채과의 여러해살이풀로서, 갯벌이나 바닷가에서 무리지어 자란다. 뿌리줄기는 굵고 짧으며 튼튼한 뿌리가나오고 오래 된 잎자루에서 남은 섬유가 겉을 덮고 있다. 꽃줄기는 곧게 서고가지가 갈라지지 않으며 높이가 15∼40cm이다.

잎은 뿌리에서 모여 나오고 줄 모양이며 길이가 10∼30cm, 폭이 2∼4mm이고 끝이둔하며 밑 부분이 잎집이 된다. 잎집은 흰색의 막질(膜質:얇은 종이처럼 반투명한것)이고 끝에 길이 3∼5mm의 잎혀가 있다.

꽃은 8∼9월에 자줏빛이 도는 녹색으로 피고 잎 사이에서 나온 꽃줄기 끝에 수상꽃차례를 이루며 달린다. 작은꽃자루는 길이가 2∼4mm이고, 꽃잎은 6개이며타원 모양이고 2줄로 달린다. 수술은 6개이고 수술대는 없으며, 암술은 암술대가매우 짧고 암술머리가 6개이다.

한방에서는 지채의 뿌리줄기를 포함한 전초를 말린 것을 지채라 하여 과실을 함께 약용하는데, 과실은 몸의 영양을 보하는 보자, 설사를 멈추게하는 지사, 통증을 멈추게하는 지통의 효능을 가지며, 눈이 아픈 목통을 다스리고, 뿌리를 포함한 전초는 열기를 식히고 열로 인해 고갈된 음액을 보충하여 회복시키는 청열양음과 몸안의 액체, 즉 체액을 생기게하는 생진액, 갈증을 멈추게 하는 지갈의 효능이 있다.

비쑥(Artemisia scoparia Waldst. et Kit.)은, 쑥속(Artemisia) 식물로서, 봄철에 채집한 것을 ‘면인진(綿茵陳)’이라 칭하고, 가을철에 채집한 것을 ‘인진호(茵陳蒿)’라고 칭한다.

비쑥의 ‘인진호’란 약명은 《신농본초경(神農本草經)》에 상품으로 처음 기재되었으며 역대 본초서적에 대부분 기록되었다. 중국에서 전통적으로 사용되는 것은 이 종과 사철쑥(茵陳蒿, Artemisia capillaris Thunb.)이다. 《중국약전(中國藥典)》(2015년 판)에서는 이 종을 중약 인진의 법정기원식물로 수록하였다. 주요산지는 중국의 섬서, 하북 등지이다. 섬서에서 나는 것을 서인진(西茵陳)이라 부르는데 품질이 가장 우수하다. 《대한민국약전외한약(생약)규격집》(제4개정판)에는 인진호를 “사철쑥(Artemisia capillaris Thunberg, 국화과)의 지상부이다. 봄에 채취한 것을 ‘면인진’이라 하고, 가을에 채취한 것을 ‘인진호’라 한다”로 등재하고 있다.

비쑥의 유효성분으로는 주로 정유, 쿠마린, 플라보노이드, 크로몬 화합물 등을 함유하고 있다. 그중 여러 가지 성분은 보간이담(保肝利膽)의 활성이 있다. 《중국약전》에서는 고속액체크로마토그래피법을 이용하여 클로로겐산의 함량을 0.50% 이상, 스코파론의 함량을 0.20% 이상으로 약재의 규격을 정하고 있다.

약리연구를 통하여 비쑥에는 이담보간(利膽保肝), 소염, 진통, 이뇨, 항혈압, 항종양 등의 작용이 있는 것으로 알려져 있다.

한의학에서 인진은 청열이습(淸熱利濕), 이담퇴황(利膽退黃) 등의 효능이 있다.

홍삼은 한약의 일종으로, 두릅나무과에 속하는 인삼(Panax ginseng CA Meyer)의 뿌리를 증기로 찐 것으로 배당체, 인삼향성분, 항산화물질, 유기산 등이 함유되어 있으며 암세포의 성장을 억제하고 암발생을 예방하며, 노화예방과 피로회복, 숙취제거, 혈액순환 등에 효능이 있다. 또한 홍삼에 함유되어 있는 사포닌 성분은 당뇨 유발물질인 알록산과 스트렙토조토신을 제거해주어 당뇨에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

사포닌(Saponin)은 콩, 파, 더덕, 메밀, 도라지 등 다양한 식물에 소량 함유되어 있지만 홍삼에 함유되어 있는 사포닌은 약성이 온화하고 독성이 없을 뿐만 아니라 용혈 작용이 거의 없으며 타 식물에서 발견되는 사포닌과 화학구조가 전혀 다르다. 따라서 홍삼에 함유되어 있는 사포닌은 다른 식물계 사포닌과 구별하기 위해 진세노사이드(Ginsenoside)라고 부른다.

진세노사이드는 미량에 의해서도 강한 약리효과를 나타내는 것으로 보고되고 있는데 주요 약리작용은 중추신경계를 비롯하여, 내분비계, 면역계, 대사계 등에 영향을 미쳐 신체조절기능에 다양한 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다.

본 출원인은 상술된 효능을 기반으로 UV-B(ultraviolet-B) 등에 의해 콜라겐 또는 엘라스틴 등이 손상된 피부세포를 재생할 수 있는 조성물을 제안하고자 한다.

피부 세포 재생에 관련하여, 등록특허공보 제10-1652956호에는 항산화 기능 및 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물이 기재되어 있다.

등록특허공보 제10-1652956호(2016.08.31. 공고)

본 발명의 목적은, 갯질경을 유효성분으로 포함하는 피부세포재생용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 갯질경을 유효성분으로 함유하는 피부세포재생용 조성물로서,

상기 조성물은,

갯질경, 지채, 비쑥 및 홍삼을 이용한 추출물이고,

갯질경 : 지채 : 비쑥 : 홍삼의 비율을 2 : 1 : 1 : 2의 비율로 하되,

상기 비율을 100g으로 정량하여, 50%(v/v) 에탄올 2L를 넣어 실온에서 5일 동안 추출함으로써 혼합추출물을 획득하며,

상기 혼합추출물을 여과한 후, 감압농축기를 통해 농축하고, 동결건조기를 통해 건조하여 회수한 뒤, -20℃에 보관함으로써 획득된 복합추출물인 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 조성물은,

100㎍/㎖ 이하의 농도에서는, 인간 유래 HaCat 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 것을 특징으로 하고,

인간 유래 HaCaT 세포의 배양액에 100㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 과산화물에 의한 세포손상시 복합추출물의 무첨가군 대비 높은 재생률을 가지는 것을 특징으로 하며,

인간 유래 HaCaT 세포의 배양액에 100㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, UV-B에 의한 콜라겐 손상으로부터 콜라겐 재생률이, 복합추출물의 무첨가군 대비 높은 재생률을 가지는 것을 특징으로 하고,

인간 유래 HaCaT 세포의 배양액에 100㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 인간 유래 HaCaT 세포에서 UV-B에 의한 콜라겐 손상으로부터 콜라겐 재생율이 증가하는 것을 특징으로 하며,

인간 유래 HaCaT 세포의 배양액에 100㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 인간 유래 HaCaT 세포에서 UV-B에 의한 콜라겐 손상으로부터 엘라스틴과 콜라겐 단백질의 생성량이 증가하는 것을 특징으로 하고,

UV-B에 의한 피부손상으로부터 표피부종 감소, 비만세포의 침윤 억제 및 피부 콜라겐 보호 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.

특히, 본 발명에 따른 조성물은 비타민 C를 참가하는 경우, 콜라겐 합성률이 증가하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 갯질경을 유효성분으로 포함하는 피부세포재생용 조성물에 의하면, 갯질경, 지채, 비쑥 및 홍삼의 유효성분을 함유하는 추출물에 기반한 피부세포재생용 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 실험예 1에 따른 세포배양 실험의 결과를 나타낸 것이다.
도 2 및 도 3은 실험예 2에 따른 세포배양 실험의 결과를 나타낸 것으로서, 도 2는 과산화물에 의한 세포손상으로부터 재생률을 확인한 것이고, 도 3은 UV-B에 의한 콜라겐 손상으로부터 콜라겐 재생률을 ELISA Kit를 통해 배양액으로 방출된 콜라겐의 양을 확인한 결과를 확인한 것이다.
도 4는 실험예 3에 따른 실험결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 4에 따른 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 5에 따른 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 5에 따른 결과의 확인을 위하여 조직학적 분석을 수행한 것이다.
도 8은 실험예 6에 따른 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 7에 따른 결과를 나타낸 것이다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시 예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

이하, 도면을 참조하여 설명하기에 앞서, 본 발명의 요지를 드러내기 위해서 필요하지 않은 사항 즉 통상의 지식을 가진 당업자가 자명하게 부가할 수 있는 공지 구성에 대해서는 도시하지 않거나, 구체적으로 기술하지 않았음을 밝혀둔다.

본 발명은 갯질경을 유효성분으로 포함하는 피부세포재생용 조성물에 관한 것이다.

이러한 본 발명에 따른 피부세포재생용 조성물은 갯질경, 지채, 비쑥 및 홍삼을 주요 조성물로 하며, 바람직하게는 갯질경 : 지채 : 비쑥 : 홍삼의 비율을 2 : 1 : 1 : 2의 비율로 하고,

상기 비율로 무게비 100g으로 정량하여, 50%(v/v) 에탄올 2L를 넣어 실온에서 5일 동안 추출하여 혼합추출물을 획득하도록 한다.

이때, 혼합추출물을 Advantec filter paper No. 2(Toyo Roshi Kaisha, Tokyo, Japan)를 사용하여 여과하고 감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)에서 농축한 다음 동결건조기(EYELA FDU- 2100, EYELA)에서 건조하여 회수한 후 -20℃에 보관함으로써 복합추출물을 획득하도록 하였다.

다만, 위 복합추출물을 획득하는 과정에서의 조건들은 본 발명에 제한되는 것은 아니다. 즉, 혼합추출물을 획득하는 조건과 획득된 혼합추출물을 여과한 후 농축하여 건조 및 회수를 통해 -20℃의 온도에서 보관하는 조건만 갖출 수 있다면 그 외의 조건은 제한없이 적용될 수 있는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물은, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨 토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따른 조성물은 경구투여를 목적으로 하는 기능식품으로 가공될 수도 있다.

이때, 기능식품에 특별한 제한은 없다. 상술된 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험재료

Dulbecoos modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS)과 RIPA buffer는 Invitrogen사 (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. EZ-Cytox는 Dogenbio사 (Seoul, Korea)에서 구입하였다.

type1 collagen 및 elastin 항체와 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. β-actin 항체는 BD Biosciences사 (CA, USA)에서 구입하였다.

제조예 1. 피부세포재생용 조성물

본 발명에 사용된 염생식물은 새만금 및 고창군 갯벌에서 채취한 후 실험에 사용 하였다. 각각의 식물을 갯질경 2: 지채 1: 비쑥 1: 홍삼 2의 비율로 100g 정량 후 50%에탄올 2L를 넣고 실온에서 5일동안 추출하여 혼합추출물을 획득하였다.

상기 혼합추출물을 Advantec filter paper No. 2(Toyo Roshi Kaisha, Tokyo, Japan)를 사용하여 여과하고 감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)에서 농축한 다음 동결건조기(EYELA FDU- 2100, EYELA)에서 건조하여 회수한 후 -20℃에 보관하여 복합추출물을 획득하였다.

실험예 1. 세포배양 실험

HaCaT 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)사 로부터 구입하여 사용하였다.

B16/F10 세포와 HaCaT 세포는 10% FBS와 1% antibiotics (penicillin & streptomycin)가 함유된 DMEM배지를 사용하여 습도가 충분하고 37℃가 유지되는 5% CO2 배양기에서 배양 하였다.

해당 실험에 따른 결과는 첨부된 도면의 도 1을 참조할 수 있다.

도 1은 실험예 1에 따른 세포배양 실험의 결과를 나타낸 것이다.

첨부된 도면의 도 1에 따르면, 인간 유래 HaCat 세포에서는 위 제조예 1에 따른 복합추출물 25~400㎍/㎖의 농도까지 세포독성을 확인한 결과, 100㎍/㎖ 이하에서는 세포생존율에 영향을 미치지 않았음을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 세포독성 평가

HaCaT 세포를 각각 96 well plates에 2×10⁵ cells/ml의 농도로 분주하여 배양한 후 농도별로 정량한 각각의 복합추출물을 주입한 후 20시간 동안 배양한 후 EZ-Cytox 10㎍ 주입 후 4시간뒤 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 복합추출물의 무첨가군 대비 백분율로 계산하였다.

해당 실험에 따른 결과는 첨부된 도면의 도 2 및 도 3을 참조할 수 있다.

도 2 및 도 3은 실험예 2에 따른 세포배양 실험의 결과를 나타낸 것으로서, 도 2는 과산화물에 의한 세포손상으로부터 재생률을 확인한 것이고, 도 3은 UV-B에 의한 콜라겐 손상으로부터 콜라겐 재생률을 ELISA Kit를 통해 배양액으로 방출된 콜라겐의 양을 확인한 결과를 확인한 것이다.

첨부된 도면의 도 2에 따르면, 인간 유래 HaCat 세포에서는 과산화물에 의해 세포손상으로부터 재생률을 확인한 결과, 제조예 1에 따른 복합추출물을 세포배양액에 100㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 양성대조군 대비 약 25% 이상의 재생률을 보여 세포 재생 효과가 있었음을 확인하였다.

또한, 첨부된 도면의 도 3에 따르면, 인간 유래 HaCat 세포에서 UV-B에 의한 콜라겐 손상으로부터 콜라겐 재생률을 ELISA-Kit를 통해 배양액으로 방출된 콜라겐의 양을 확인한 결과, 추출물을 배양액에 100㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 양성대조군 대비 약 28% 이상의 생성양을 보여 콜라겐 생성증가 효과가 있었음을 확인하였다.

실험예 3. 면역형광염색

HaCaT세포를 slide glass에 2×10⁵ cells/ml의 농도로 분주하여 24시간 배양한 후 각각의 추출물을 100㎍/㎖의 농도로 주입 후 1시간뒤 UV-B(20 mJ/cm²)조사 후 24시간 배양한 후 세포를 methanol로 고정한 뒤 1% BSA가 함유된 PBS로 blocking한 뒤 collagenI 항체를 주입 후 4℃에서 16시간 반응 시켰다.

PBST로 10분간 3회 세척 후 2차 항체로 Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488를 사용하여 반응 시킨 후 DAPI가 포함된 mounting 용액으로 mounting 하였다. slide 24시간 건조 후 형광현미경을 사용하여 이미지를 얻었다.

이는 첨부된 도면의 도 4를 참조하도록 한다.

도 4는 실험예 3에 따른 실험결과를 나타낸 것이다.

첨부된 도면의 도 4에 따르면, 인간 유래 HaCaT 세포에서 UV-B에 의한 콜라겐 손상으로부터 콜라겐 재생율을 면역형광염색을 통해 확인한 결과, 제조예 1에 따른 복합추출물을 세포배양액에 100㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 콜라겐 합성률이 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 4. Western blot analysis

HaCaT 세포를 6well plates에 2×10⁵ cells/ml의 농도로 분주하여 24시간 배양한 후 각각의 추출물을 100 μg/ml의 농도로 주입 후 1시간뒤 UVB(20 mJ/cm²)조사 후 24시간 배양한 후 세포를 PBS로 2회 원심세척 후 RIPA buffer를 주입 후 12,000RPM으로 원심분리 하여 단백질을 추출하였다.

추출한 단백질은 Bradford protein assay reagent를 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분리 후 100V로 1시간동안 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (Bio-Rad)에 transfer하였다. Membrane은 5% BSA가 함유된 Tris buffered saline with 1% Tween20(TBST)에 실온에서 blocking후 TBST로 10분간 3회 세척후 1차항체로 anti-MMP1, anti-collagenI, anti-β-actin을 사용 하여 4℃ 16시간 반응 시켰다.

그 후, TBST로 10분간 3회 세척 후 2차항체 (goat anti-rabbit IgG HRP, rabbit anti-mouse IgG HRP)를 5% BSA에서 실온에서 2시간 반응 후 TBST로 10분간 3회 세척 후 하였다.

이는 첨부된 도면의 도 5를 첨부하여 결과를 확인하도록 한다.

도 5는 실험예 4에 따른 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 인간 유래 HaCaT 세포에서 UV-B에 의한 콜라겐 손상으로부터 세포 내 엘라스틴과 콜라겐 단백질 발현을 알아보기 위하여 이들 분자에 특이적으로 작용하는 항체를 활용하여 Western blot로 확인한 결과로서, 두 단백질 모두 추출물을 세포배양액에 100㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 생성량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5. 동물실험

무균환경에서 사육된 7주령의 수컷 C57/BL과 ICR 마우스는 오리엔트바이오사(익산, 대한민국)에서 구입하였고, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일 간 순화시킨 후 실험에 사용하였다.

사육환경은 낮과 밤의 주기를 12시간씩 하였고, 온도 (20~22℃)와 습도 (50~60%)는 일정하게 유지하였다. 그 후 매일 추출물을 200mg/kg 농도로 제조예 1에 따른 복합추출물을 경구투여 하면서 3일 간격으로 UVB(300mJ/cm²)를 조사 하였다. 2주동안 실험을 진행 후 각각의 분석법에 따라 결과를 분석하였다.

실험 최종일인 14일째 마우스를 희생시키고 피부조직을 절취하여 10% 중성 포르말린(pH 7.4)으로 24시간 고정 한 후 50~100% 에탄올을 사용하여 탈수하고 xylene으로 세척하는 등 일련의 과정을 거쳐 파라핀메몰표본을 제작 하였다

제작된 각 실험군의 파라핀메몰 표본은 5μm 두께로 절편한 후 silane-coated micro slides에 부착하여 hematoxylin & eosin (H&E), toluidine blue 및 trichrome 염색한 다음 광학현미경으로 100배 및 400배 시야에서 검경하였다.

첨부된 도면의 도 6을 참조하면 수컷 마우스의 UV-B에 의한 피부손상으로부터 복합추출물의 보호효과를 확인하였다.

도 6은 실험예 5에 따른 결과를 나타낸 것이다.

첨부된 도면의 도 6에 따른 결과, 복합추출물을 200mg/kg의 농도로 2주간 경구 투여하였을 때, 도 6과 같이 보호효과를 확인했으며, 표피 두께 감소효과도 확인되었다.

첨부된 도면의 도 6의 보호효과를 확인하기 위하여 조직학적 분석을 수행하였고, 이는 첨부된 도면의 도 7에 나타냈다.

도 7은 실험예 5에 따른 결과의 확인을 위하여 조직학적 분석을 수행한 것이다.

첨부된 도면의 도 7에서와 같이, 제조예 1에 따른 복합추출물의 표피부종 감소효과를 H&E Staining을 통해 확인(도 7의 1열)하였고, toluidine blue 염색을 통해 비만세포의 침윤을 억제하는 것도 확인(도 7의 2열)하였다.

또한, trichrome staining을 통해 피부 콜라겐 보호 효과를 확인(도 7의 3열)하였다.

실험예 6. UV-B에 의한 콜라겐 손상으로부터 피부에서의 엘라스틴과 콜라겐 단백질 발현

추가로, 동물실험에서 UV-B에 의한 콜라겐 손상으로부터 피부에서의 엘라스틴과 콜라겐 단백질 발현을 알아보기 위하여, 엘라스틴 및 콜라겐 분자 각각에 특이적으로 작용하는 것으로 알려진 항체를 활용하여, Western blot으로 확인하는 실험을 수행하였다.

이는 첨부된 도면의 도 8에 도시되어 있다.

도 8은 실험예 6에 따른 결과를 나타낸 것이다.

첨부된 도면의 도 8에 따르면, 콜라겐 및 엘라스틴 모두, 제조예 1에 따른 복합추출물을 생쥐에게 200mg/kg 농도로 경구투여 하였을 때, 콜라겐 및 엘라스틴의 생성량이 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 7. 인공피부에 따른 실험

실험에 사용한 인공피부는 테고사이언스(주)에서 구입 하였으며 제조사의 매뉴얼에 따라 배양 하였으며 각각의 추출물을 세포에 전처리 하였다.

실험종료 후 파라핀블록을 제조하여 5μm 두께로 절편한 후, trichrome 염색한 다음 광학현미경으로 100배 시야에서 검경하였다.

실험예 7에 따른 실험결과는 첨부된 도면의 도 9에서 나타내었다.

도 9는 실험예 7에 따른 결과를 나타낸 것이다.

첨부된 도면의 도 9에 따른 인공세포 배양실험을 통해 제조예 1의 복합추출물의 콜라겐 합성률 평가 결과에 따르면, 상기 혼합추출물 및 비타민 C를 첨가한 실험군에서 콜라겐 합성률의 증가 효과를 확인 할 수 있다.

상기에서 도면을 이용하여 서술한 것은, 본 발명의 주요 사항만을 서술한 것으로, 그 기술적 범위 내에서 다양한 설계가 가능한 만큼, 본 발명이 도면의 구성에 한정되는 것이 아님은 자명하다.

Claims (12)

1. 갯질경, 지채, 비쑥 및 홍삼을 이용한 추출물인 갯질경을 유효성분으로 함유하는 피부세포재생용 조성물로서,
   상기 조성물은,
   혼합→에탄올투여→추출→여과→농축→동결건조→영하보관의 순서로 제조되되,
   갯질경 : 지채 : 비쑥 : 홍삼을, 중량비 기준으로, 2 : 1 : 1 : 2의 비율로, 상기 비율을 100g으로 정량하여, 50%(v/v) 에탄올 2L를 넣어 실온에서 5일 동안 추출함으로써 혼합추출물을 획득하고, 상기 혼합추출물을 여과한 후, 감압농축기를 통해 농축하고, 동결건조기를 통해 건조하여 회수한 뒤, -20℃에 보관함으로써 획득된 복합추출물이고,
   상기 조성물은,
   - 100㎍/㎖ 이하의 농도에서는, 인간 유래 HaCaT 세포의 생존율에 영향을 미치지 않으며,
   - 인간 유래 HaCaT 세포의 배양액에 100㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 과산화물에 의한 세포손상시 복합추출물의 무첨가군 대비 높은 재생률을 가지고,
   - 인간 유래 HaCaT 세포의 배양액에 100㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, UV-B에 의한 콜라겐 손상으로부터 콜라겐 재생률이, 복합추출물의 무첨가군 대비 높은 재생률을 가지며,
   - 인간 유래 HaCaT 세포의 배양액에 100㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 인간 유래 HaCaT 세포에서 UV-B에 의한 콜라겐 손상으로부터 콜라겐 재생율이 증가하고,
   - 인간 유래 HaCaT 세포의 배양액에 100㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 인간 유래 HaCaT 세포에서 UV-B에 의한 콜라겐 손상으로부터 엘라스틴과 콜라겐 단백질의 생성량이 증가하며,
   - UV-B에 의한 피부손상으로부터 표피부종 감소, 비만세포의 침윤 억제 및 피부 콜라겐 보호 효과를 가지고,
   - 비타민 C를 첨가하는 경우, 콜라겐 합성률이 증가하는 것을 특징으로 하는, 갯질경을 유효성분으로 함유하는 피부세포재생용 조성물.
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