KR102431553B1

KR102431553B1 - 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102431553B1
Application number: KR1020220006473A
Authority: KR
Inventors: 이훈
Original assignee: 이훈
Priority date: 2022-01-17
Filing date: 2022-01-17
Publication date: 2022-08-10

Abstract

본 발명은 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물에 관한 것으로, 친수성 및 소수성 생리활성 물질을 효과적으로 피부에 투과시켜 물질이 가진 기능성을 최대화 할 수 있으며 용매로 인해 피부에 야기되는 광독성 및 염증유발을 최소로 할 수 있도록 용매로서 메틸 피롤리돈 및 부틸렌글라이콜을 사용하여 탈모방지 또는 모발 성장 촉진에 효능을 지닌 우수한 콩제비꽃 전초, 호장근뿌리, 두충나뭇잎으로부터 천연원료를 추출하여 유효성분으로 함유하여 탈모 방지 및 모발 성장 촉진에 유용한 화장료 조성물을 제공한다.

Description

탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for preventing hair loss and promoting hair growth}

본 발명은 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 생리활성 물질을 효율적으로 추출할 수 있는 메틸 피롤리돈을 용매로 사용하여 탈모방지 또는 모발 성장 촉진에 효능을 지닌 콩제비꽃 전초, 호장근뿌리, 두충나뭇잎의 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 모발은 특정주기를 따르며 성장기(anagen phase), 퇴행기(catagen phase), 휴지기(telogen phase)의 3단계로 구성되어 성장하고 탈락한다.

모발의 성장기에는 새로운 모낭을 유도하는 propagating anagen phase와 세포 및 모발의 성장과 분화가 활발히 일어나는 autonomous anagen phase로 나누어 볼 수 있는데, 정상적인 모발의 성장주기는 약 20회 반복 되지만, 호르몬, 스트레스, 질병, 환경오염, 흡연 등의 요인에 의해 변형 및 단축된다.

탈모증 고민이 유행처럼 흔할 뿐만 아니라 피부과 진료분야 중 탈모질환의 비중이 갈수록 높아지고 있는 만큼 그에 따른 탈모 치료제 및 치료법 개발 등에 관심이 높아지고 있다. 현재까지 탈모의 기전 및 원인은 정확하게 밝혀지지 않았으며, 미국식품의약국(Food and Drug Administration, FDA)에 승인받은 탈모치료제는 minoxidil과 finasteride 두 가지가 있다. 상기 Finasteride의 작용기전은 대표적인 남성호르몬인 테스토스테론이 모낭에서 특정한 효소(5알파 환원제)에 의해 더욱 강력한 형태의 테스토스테론(DHT)으로 변화돼 탈모를 초래하므로, 5알파환원제의 작용을 선택적으로 억제하는 약물로 밝혀졌으며, 상기 minoxidil의 작용 기전은 정확하게 밝혀지지 않았다. 모발의 성장인자에는 VEGF(Vascular endothelial growth factor), EGF(Epidermal growth factor), IGF-1(Insulin-like growth factro) 등이 있는데 이들은 세포표면 수용체에 결합하여 신호를 세로 내로 전달하고, 단백질 인산화 같은 일련의 반응을 유도하여 모발성장에 필요한 유전자 발현을 조절하게 된다. 관련 연구에 따른 Minoxidil의 모발성장 효과는 혈관확장을 통한 영양공급 증가, K+ channel opening을 통한 모발성장 유도, 모유두세포의 extracellular signal-regulated kinase (ERK), Akt 경로의 활성화를 통한 세포증식 및 apoptosis억제 효과 등으로 보고되었다. 그러나 복용을 중단하게 되면 위와 같은 효과가 12개월 내에 사라진다. 5년 이상 장기간 치료할 경우에도 특별한 부작용이 없고 다른 약물과의 상호작용이나 간, 신장, 골수, 혈청 지질 수치에도 특별한 영향이 없다. 정자 형성에도 영향이 없으며 성욕감퇴, 발기부전 같은 부작용은 실험 초기에 소수에서 보고되고 있어 효과의 지속력이 높은 천연물을 이용한 치료제 개발 연구가 진행되고 있다.

이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-1965594호(참고문헌 1) 또는 대한민국 등록특허 제10-1443182호(참고문헌 2)에서 기술한 것처럼 일반적으로 탈모방지 및 발모촉진효과가 있는 콩이나 한방 약재 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 선택하여 추출하며, 용매로 사용하는 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올 등이 제안된 바 있다.

하지만, 이러한 종래의 용매는 광독성 유발 또는 피부 세포독성이 매우 높기 때문에 기초화장품 제형이나 모발 화장품에 적용하기에는 제한적이다. 또한 부틸렌글라이콜이나 프로필렌글라이콜은 피부자극이 적고 화장품 보습제로서의 기능을 갖고 있어 광독성 유발물질 배제 추출물 제조방법으로 자주 사용되지만 피부 투과율이 현저히 낮고, 피부에서의 기능성이 낮은 친수성 생리활성 물질만 투과시켜 물질이 가진 기능성을 최대화하기 어렵다.

참고문헌 1 : 등록특허 제10-1965594호 참고문헌 2 : 등록특허 제10-1443182호

따라서 이와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 탈모예방과 모발 성장에 효과적인 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎의 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

특히 본 발명은 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎이 가지고 있는 우수한 생리활성 물질을 피부에 효과적으로 침투할 수 있도록 기능성을 최대화 하고 용매로 인해 피부에 야기되는 광독성 및 염증유발을 최소화할 수 있도록 용매로서 메틸 피롤리돈을 사용하여 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎의 추출물을 유용성분으로 함유하는 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

아울러 본 발명은 메틸 피롤리돈과 부틸렌글라이콜로 이루어지는 용매를 사용하여 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

이와 같은 기술적 과제를 해결하기 위해 본 발명은;

탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎을 메틸 피롤리돈을 포함하는 용매로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

이때, 상기 추출물은 콩제비꽃 전초 분말과 호장근뿌리 분말 및 두충나뭇잎 분말을 혼합하여 메틸 피롤리돈을 포함하는 용매로 추출한 혼합추출물인 것을 특징으로 한다.

그리고, 상기 혼합추출물은 콩제비꽃 전초 분말과 호장근뿌리 분말 및 두충나뭇잎 분말을 1 : 1 : 1의 중량비율로 혼합한 천연혼합물에 메틸 피롤리돈과 정제수를 포함하는 용매로 추출하며, 상기 천연혼합물과 메틸 피롤리돈 및 정제수는 1 : 2 : 8의 중량비율로 혼합하는 것을 특징으로 한다.

아울러, 상기 추출물은 콩제비꽃 전초 분말과 호장근뿌리 분말 및 두충나뭇잎 분말을 혼합하고 메틸 피롤리돈 및 부틸렌글라이콜을 포함하는 용매로 추출한 혼합추출물인 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 혼합추출물은 콩제비꽃 전초 분말과 호장근뿌리 분말 및 두충나뭇잎 분말을 1 : 1 : 1의 중량비율로 혼합한 천연혼합물에 메틸 피롤리돈과 부틸렌글라이콜 및 정제수를 포함하는 용매로 추출하며, 상기 천연혼합물, 메틸 피롤리돈, 부틸렌글라이콜 및 정제수는 1 : 1 : 2 : 7의 중량비율로 혼합하는 것을 특징으로 한다.

그리고, 상기 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물은 로션, 에센스, 크림, 팩, 샴푸, 린스, 헤어토닉으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 탈모방지 및 모발 생장 촉진 화장료 조성물은 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎의 추출물을 유효성분으로 포함하여 모발성장과 탈모 예방에 효과가 우수하다.

특히 본 발명에 따르면 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎을 메틸 피롤리돈과 부틸렌글라이콜을 용매로 선택하여 천연의 추출물을 추출하거나 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎을 설정 중량비율로 혼합하고 메틸 피롤리돈과 부틸렌글라이콜으로 혼합추출물을 추출함으로서 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎이 지니고 있는 우수한 생리활성 물질을 피부에 효과적으로 침투할 수 있도록 기능성을 최대화하고, 용매로 인해 피부에 야기되는 광독성 및 염증유발을 최소화하는 효과가 있다.

아울러 이러한 본 발명의 효과는 이에 한정되지 아니며 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함한다.

도 1은 본 발명의 비교예 1,2 및 실시예 1,2에 따른 모유두세포의 증식 효능을 평가한 결과이다.
도 2는 본 발명의 비교예 1,2 및 실시예 1,2의 ERK 인산화 증식 실험 결과이다.
도 3은 미녹시딜(Minoxidil) 대비 실시예 1의 ERK 인산화 유도 실험결과이다.
도 4는 본 발명의 비교예 1,2 및 실시예 1,2의 피부조직의 효소활성도 측정 결과이다.
도 5는 본 발명의 비교예 1,2 및 실시예 1,2의 추출물의 투명도 차이를 확인할 수 있는 사진이다.

이하 본 발명에 따른 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물을 첨부된 도면을 참고로 하여 상세히 기술되는 실시 예들에 의해 그 특징들을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 실시 예들을 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에 따른 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물은 모발성장을 촉진하고 모유두세포를 증식시켜줄 수 있는 우수한 소재인 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎으로부터 추출한 추출물을 함유하면서도, 추출물은 피부 투과 촉진과 광독성 및 염증 유발을 최소화할 수 있도록 용매로서 메틸 피롤리돈 및 부틸렌글라이콜을 사용하여 추출한다.

즉 본 발명에서는 탈모예방과 모발 성장에 효과적인 화장료 조성물을 개발하기 위하여 우수한 소재들을 자료조사를 통하여 선별하고 선별된 소재들을 친수성 생리활성 물질에 대한 피부 흡수능 실험을 수행하여 메틸 피롤리돈 및 부틸렌글라이콜을 용매로 사용하여 모발성장을 촉진하고 모유두세포를 증식시키는데 우수한 효능이 있는 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎에서 추출물을 추출하여 화장료 조성물에 함유하거나 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎을 혼합한 천연혼합물에서 혼합추출물을 추출하여 화장료 조성물에 함유함이 바람직하다.

이와 같은 본 발명의 화장료 조성물은 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎을 설정비율로 혼합한 천연혼합물을 메틸 피롤리돈을 용매로 사용하여 추출하거나, 메틸 피롤리돈 및 부틸렌글라이콜을 용매로 사용하여 추출한 혼합추출물을 유효성분으로 함유한다.

이는 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎의 혼합추출물이 탈모 및 두피 환경 개선에 영향을 미칠 것으로 판단하고 메틸 피롤리돈(N-methlyl-2-Pyrrolidone, N.M.P)을 용매로 추출한 혼합추출물이 세포증식 및 관련 신호전달 인자에 미치는 영향을 평가하여 탈모 치료에 효과적인 화장료 조성물을 제안한다.

이러한 상기 메틸 피롤리돈은 피부 투과 촉진기능이 우수하여 친수성 및 소수성 생리활성 물질을 효과적으로 피부에 투과시켜 물질이 가진 기능성을 최대화 할 수 있으며 용매로 인해 피부에 야기되는 광독성 및 염증유발을 최소화할 수 있다.

피롤리돈(Pyrrolidone) 유도체 중 가장 많은 수요를 보이고 있는 메틸 피롤리돈 NMP(N-Methyl-pyrrolidone)은 환경친화적인 장점으로 인해 수요증가가 기대되고 있다. NMP는 열과 약품에 안정하고 용해력이 우수하며, 회수 및 재생이 용이해 장기적인 비용절감을 기대할 수 있다. 또한 인체에 미치는 독성이 타 용제에 비해 낮고 무엇보다도 생분해성이 우수해 환경에 친화적인 것 등을 장점으로 꼽고 있다.

한편, 상기 콩제비꽃(Viola verecunda A.Gray var. verecunda)은 콩오랑캐, 조개나물, 조갑지나물로도 불리우며 제비꽃과에 속하는 여러해살이풀로서, 높이는 20cm 안팎이다. 짧은 뿌리줄기로부터 몇 개의 가는 줄기가 거의 곧게 뻗어나와 있다. 잎은 마치 콩팥과 비슷한 달걀 모양으로 긴 잎자루를 가지고 있다. 꽃은 흰색으로, 봄에서 초여름에 걸쳐 차례차례 핀다. 열매는 달걀 모양의 삭과로 익으면 3부분으로 갈라진다. 주로 들에서 자라며 한국 각지에 분포하고 있다. 한방에서는 뿌리를 제외한 식물체 전체를 소독약(消毒藥)이라는 약재로 쓰는데, 종기·악창·외상에 효과가 있다.

또한, 상기 호장근(Fallopia japonica (Hott) RonseDecr.)은 마디풀과에 속하는 다년생 초본식물로서 우리 나라 각처의 산과 들에서 자라고 있으며, 줄기의 속은 비었으며, 어릴 때의 줄기에는 붉은 자주색의 반점이 산재한다. 어릴 때 줄기의 생김새가 호피를 닮아서 호장근이라는 이름이 붙었다. 뿌리줄기는 약재로 이용되고 있다.

그리고 상기 두충나무(Eucommia ulmoides OLIVER.)는 꽃이은 4월에 피고 열매는 10월에 맺는다. 열매는 납작하게 생겼다. 씨는 열매 중앙에 1개 들어있다. 잎은 타원형으로 어긋나며, 끝이 갑자기 좁아져서 뾰족해진다. 길이 5 ∼ 6cm, 너비 2 ∼ 7cm로서 양면에 털이 거의 없고, 가장자리에 예리한 톱니가 있다. 나무의 껍질은 말려서 약재로도 쓰인다. 주요 효능은 무릎. 넓게 보면 관절에 좋다. 차로 내어 마시거나 두충나무껍질과 오가피, 우슬 등을 물에 넣고 끓인 뒤 식히고 냉장고에 넣어 차게해서 일반 생수대용으로 마셔도 된다. 두충차는 내장지방을 분해·연소해, 비만 방지에 효과가 있다고 한다.

이러한 본 발명의 화장료 조성물은 탈모 방지 및 모발 성장 촉진 효과를 높히기 위해 화장료 조성물 총 중량(100중량%기준)에서 유효성분으로 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎의 천연혼합물에서 메틸 피롤리돈을 용매로 사용하여 추출한 혼합추출물을 1.0 ~ 20.0중량%를 포함한다.

이때 상기 혼합추출물은 콩제비꽃 전초 분말, 호장근뿌리 분말 및 두충나뭇잎 분말을 1 : 1 : 1의 중량비율로 혼합한 천연혼합물에 메틸 피롤리돈을 투입하여 추출하며, 상기 혼합추출물은 상기 천연혼합물과 메틸 피롤리돈을 1 : 2의 중량비율로 혼합하여 추출한다. 바림직하게는 상기 혼합추출물 추출시 정제수를 더 포함할 수 있으며, 이 경우 상기 천연혼합물과 메틸 피롤리돈 및 정제수를 1 : 2 : 8의 중량비율로 혼합하여 추출한다.

여기서 상기 메틸 피롤리돈을 용매로 사용하여 추출한 혼합추출물은 화장료 조성물 총 중량(100중량%기준)에서 1.0 중량% 미만일 경우에도 생리활성에 대한 피부 침투 효과가 거의 없으며, 20 중량%를 초과하면 물에 대한 용해도가 낮아 안정성이 떨어지고 피부자극을 유발할 가능성이 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 탈모 방지 및 모발 성장 촉진 효과를 높히기 위해 화장료 조성물 총 중량(100중량%기준)에서 유효성분으로 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎의 혼합물에서 메틸 피롤리돈 및 부틸렌글라이콜을 용매로 사용하여 추출한 혼합추출물을 1.0 ~ 30.0중량%를 포함한다.

이때 상기 혼합추출물은 콩제비꽃 전초 분말, 호장근뿌리 분말 및 두충나뭇잎 분말을 1 : 1 : 1의 중량비율로 혼합한 천연혼합물에 메틸 피롤리돈을 투입하여 추출하며, 상기 혼합추출물은 상기 천연혼합물과 메틸 피롤리돈 및 부틸렌글라이콜을 1 : 1 : 2의 중량비율로 혼합하여 추출한다. 바림직하게는 상기 혼합추출물 추출시 정제수를 더 포함할 수 있으며, 이 경우 상기 천연혼합물, 메틸 피롤리돈, 부틸렌글라이콜 및 정제수를 1 : 1 : 2 : 7의 중량비율로 혼합하여 추출한다.

여기서 상기 메틸 피롤리돈 및 부틸렌글라이콜을 용매로 사용하여 추출한 혼합추출물은 화장료 조성물 총 중량(100중량%기준)에서 1.0 중량% 미만일 경우에도 생리활성에 대한 피부 침투 효과가 거의 없으며, 30 중량%를 초과하면 물에 대한 용해도가 낮아 안정성이 떨어지고 피부자극을 유발할 가능성이 있다.

이러한 혼합추출물이 유효성분으로 함유되는 본 발명의 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물은 다양한 화장품 제형에 사용할 수 있다. 예를 들어 로션, 에센스, 크림, 팩, 샴푸, 린스, 헤어토닉으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명에 따른 화장료 조성물의 효능 실험에 대해 설명한다.

<제조예>

① 비교예 1: 에탄올 용매에 의한 혼합추출물 제조

콩제비꽃 전초 건조 분말과 호장근뿌리 건조 분말, 두충나뭇잎 건조 분말을 각각 50g씩 1 : 1 : 1의 중량비율로 혼합하고, 그 천연혼합물에 용매로서 10배 가량의 70%에탄올을 넣어 50℃에서 4시간 동안 환류추출하였다. 즉 즉, 천연혼합물과 70%에탄올을 1 : 10의 중량비율로 혼합하여 혼합추출물을 제조하였다.

이 추출액을 여과지(Whatman, Dassel, Germany)로 여과한 후, 통상의 농축기(EYELA, Japan)를 사용하여 60℃에서 감압 농축하였다. 이후 농축액을 동결 건조하여 건조 중량으로 85.4g을 얻은 다음, 이를 하기의 실험용 시료로 사용하였다.

② 비교예 2: 정제수에 의한 혼합추출물 제조

콩제비꽃 전초 건조 분말과 호장근뿌리 건조 분말, 두충나뭇잎 건조 분말을 각각 50g씩 1 : 1 : 1의 중량비율로 혼합하고, 그 천연혼합물에 용매로서 10배 가량의 정제수를 넣어 50℃에서 4시간 동안 환류추출하였다. 즉, 천연혼합물과 정제수를 1 : 10의 중량비율로 혼합하여 혼합추출물을 제조하였다.

이 추출액을 여과지(Whatman, Dassel, Germany)로 여과한 후, 통상의 농축기(EYELA, Japan)를 사용하여 60℃에서 감압 농축하였다. 이후 농축액을 동결 건조하여 건조 중량으로 75.3g을 얻은 다음, 이를 하기의 실험용 시료로 사용하였다.

③ 실시예 1: 메틸 피롤리돈 용매에 의한 혼합추출물 제조

콩제비꽃 전초 건조 분말과 호장근뿌리 건조 분말, 두충나뭇잎 건조 분말을 각각 50g씩 1 : 1 : 1의 중량비율로 혼합하고, 그 천연혼합물에 용매로서 2배 가량의 메틸 피롤리돈과 8배 가량의 정제수를 넣어 50℃에서 4시간 동안 환류추출하였다. 즉, 천연혼합물과 메틸 피롤리돈 및 정제수를 1 : 2 : 8의 중량비율로 혼합하여 혼합추출물을 제조하였다.

이 추출액을 여과지(Whatman, Dassel, Germany)로 여과한 후, 통상의 농축기(EYELA, Japan)를 사용하여 60℃에서 감압 농축하였다. 이후 농축액을 동결 건조하여 건조 중량으로 93.3g을 얻은 다음, 이를 하기의 실험용 시료로 사용하였다.

④ 실시예 2: 메틸 피롤리돈과 부틸렌글라이콜 용매에 의한 추출물 제조

콩제비꽃 전초 건조 분말과 호장근뿌리 건조 분말, 두충나뭇잎 건조 분말을 각각 50g씩 1 : 1 : 1의 중량비율로 혼합하고 이들 혼합물에 용매로서 1배 가량의 메틸 피롤리돈과 2배 가량의 부틸렌글라이콜과 7배가량의 정제수를 넣어 50℃에서 4시간 동안 환류추출하였다. 즉, 천연혼합물, 메틸 피롤리돈, 부틸렌글라이콜 및 정제수를 1 : 1 : 2 : 7의 중량비율로 혼합하여 혼합추출물을 제조하였다.

이 추출액을 여과지(Whatman, Dassel, Germany)로 여과한 후, 통상의 농축기(EYELA, Japan)를 사용하여 60℃에서 감압 농축하였다. 이후 농축액을 동결 건조하여 건조 중량으로 95.3g을 얻은 다음, 이를 하기의 실험용 시료로 사용하였다.

# 실험예 1: 모유두세포의 증식 효능 평가

모유두세포 증식률은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 동결된 쥐 모유두세포를 10% FBS (Fetal Bovine Serum)와 100 units/㎖ penicillin,100 ㎍/㎖ Streptomycin이 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 2-3회 계대배양 후 실험에 사용하였다. 24 well plate에 모유두세포 (2 x 10⁴cells/㎖)를 1 ㎖씩 분주하여 37℃, 5% CO2 조건으로 24시간 배양한 후, FBS가 포함되지 않은 DMEM과 함께 비교예 1,2와 실시예 1,2를 농도별(0.1, 1, 10, 100 ㎍/㎖)로 처리하였으며 음성대조군으로 Methanol을 처리하고 양성대조군으로 미녹시딜 10 μM을 처리하였다. 쥐 모유두세포는 48시간 배양한 후 FBS에 녹인 5 ㎎/㎖의 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide 시약 100 ㎕ 넣어 37℃, 5% CO₂에서 3시간 동안 배양하였다. 3시간 후 상층액을 제거하고 DMSO 100 ㎕를 넣어 Formazan을 녹이고 96 well plate에 50 ㎕씩 분주하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포증식률은 각 시험군에 대한 평균 흡광도 값을 대조군의 흡광도 값과 비교하여 모유두세포 증식정도를 조사하였다. 증식 정도를 조사한 결과는 하기의 [표 1] 및 도 1와 같다.

모유두세포 증식 효능 실험

구분	농도(㎍/㎖)	Cell Proliferation(% of control)
비교예1	Con	100
	MXD	107
	0.1	100
	1	105
	10	106
	100	65
비교예2	Con	100
	MXD	101
	0.1	91
	1	95
	10	94
	100	94
실시예1	Con	100
	MXD	101
	0.1	95
	1	100
	10	105
	100	109
실시예2	Con	100
	MXD	102
	0.1	104
	1	111
	10	136
	100	140

위 [표 1]에서 확인되는 바와 같이 비교예 1은 10 ㎍/㎖까지는 소량 증가하였으나 100 ㎍/㎖에서 급격히 감소함을 알 수 있고 이를 통해 고농도로 갈수록 모두유세포 증식보다 독성에 의한 세포의 성장을 억제한다는 것을 알 수 있다. 비교예 2에서는 농도의존적으로 증가하였으나 증가량은 실시예 1과 실시예 2에 비해 낮은 수준이다. 반면 실시예 1과 실시예 2는 농도가 증가할수록 매우 큰 폭의 세포증식 효과가 나타남을 알 수 있었다. 즉, 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 화장료 조성물은 모유두세포의 증식 효능이 가장 뛰어난 것을 확인하였다.

# 실험예 2: ERK 인산화에 미치는 영향

세포의 성장과 분화, Apoptosis에 관여하는 단백질 중 상위단계에 위치한 Akt와 ERK의 발현과 인산화에 영향을 미치는지 알아보았다. ERK(Extracellular signal-related kinase)는 성장인자, 호르몬, 사이토카인 등의 다양한 세포 반응을 조절하는 mitogen-activated protein kinase(MAPK)의 신호전달기전 중 하나로 알려져 있다.

모유두세포의 증식을 촉진하는 신호전달 기전을 조사하기 위하여 시료를 처리한 뒤 western blot분석으로 ERK 인산화를 조사하였다.

모유두세포를 10 cm 배양용기에 5×10⁵개씩 분주하여 24시간 배양한 후 시료를 농도별(10, 20 μg/ml)로 처리하고 30분간 배양하였다. 배양 후 PBS로 세척하여 cell scraper로 수거하고, 1×buffer(1×RIPA buffer 1 ml, 1 mM PMSF, 1 μg/ml aprotinin, 1 μg/ml leupeptin, 2 mM DTT)로 30분간 용해시켜 15,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. Bradford 시약으로 단백질을 정량하고, 2×sample buffer(1 ml glycerol, 0.5 ml β-mercaptoethanol, 3 ml 10% SDS, 1.25 ml 1 M Tris-HCl, 1~2 μg bromophenol blue)를 이용하여 동량으로 혼합한 후 10-12% SDS polyacrylamide gel에서 전기영동 하였다. 분리된 단백질을 PVDF membrane으로 전이시키고 5% nonfat skim milk와 3% BSA로 blocking한 후 1,2차 항체를 부착시켰다. 1차 antibody는 1 : 1000, 2차 antibody는 1 : 5000의 비율로 사용하였다. ECL 용액으로 발색 후 ChemiDoc(Hercules, CA,USA)을 이용하여 각 band의 사진을 촬영하였다.

도 2는 상기 조성물들이 ERK 단백질 인산화에 미치는 영향을 나타낸 것으로 비교예 1과 비교예 2는 대조군 대비 증가률이 없으나 실시예 1과 실시예 2는 각각 대조군의 약 2.5배, 1.5배 증가하였음을 알 수 있었다. 도3은 실시예 1과 양성대조군으로 minoxidil(10 μm)을 비교 실험한 것으로 도 3의 A는 minoxidil이 약 3.1배 증가한 것과 실시예1이 동일한 효과를 보였으며 도3의 B는 시료의 ERK인산화 촉진효과를 ERK 억제제인 PD98059를 처리하였을 때 PD98059dp 의해 실시예 1의 ERK 인산화가 억제됨을 확인하였다. 그러므로 실시예 1은 minoxidil과 유사한 작용기전을 갖고 있으며 모유두세포의 증식을 촉진하는 신호전달기전임을 확인 할 수 있었다.

# 실험예 3 : 피부조직의 효소활성도 측정

모발주기에는 다양한 인자들이 작용함으로써 모발의 성장과 탈모를 유발시킨다. γ-glutamyl transpeptidase (γ-GT)는 모발이 성장기로 유도될 때 효소 활성이 증가함으로써 발모의 지표인자로 사용되고 있다(Hattori & Ogawa, 1983).

실험쥐의 사육 온도는 22±1℃, 상대습도 50±5%, 조명주기 12시간씩 밤낮을 유지하였고, 실험 전 기간 동안 사료와 물은 자유로이 공급하였다. 실험쥐 처치는 3주차와 4주차 날에 ether 마취하에 피부를 적출 후 즉시 액체질소에 동결 시킨 후 deep freezer에 냉동 보관하여 효소측정 및 유 전자 발현 검사에 사용하였다.

γ-Glutamyl transpeptidase (γ-GT)는glutathione 물질대사와 세포막을 통한 아미노산 또는 펩타이드의 흡수 또는 분비의 기능을 하는 membrane-bounded 효소이다. γ-GT는 glutathione tripeptide로부터 cysteine moiety 방출을 촉진시키고 모낭에서 cysteine을 얻어 케라틴을 합성하는 것으로 알려져 있는데, 모낭의 내/외모근초에만 존재하고 증식과 분열이 활발한 세포내에서 많이 발현되며, 휴지기에 접어들면 감소했다가 성장기에는 증가하는 양상을 보이는 것으로 보고되었다. γ-GT의 효소 활성도 측정은 PBS(phosphate buffer solution)를 피부조직의 4배량 첨가한 후 homogenizer를 이용 마쇄하고 원심분리기를 이용하여 12,000 rpm, 4C, 20분간 원심분리하여 얻은 상층액을 생화학 분석기를 이용하여 분석하였다. 시약으로 γ-GT는 Thermo社(Finland)의 제품을 사용하였으며 auto biochemistry analyzer (Thermo, Konelab 20XT, Finland)로 측정한 결과를 [표 2] 및 도 4에 나타내었다.

γ-GT의 수치는 실험 3주 후 실시예 1은 비교예 1과 비교예 2, 실시예 2에 비해 각각 약 177%, 177%, 153% 유의하게 높게 나타났고, 실험 4주 후 비교예 1과 비교예 2에 비해 각각 약 315%, 165% 유의하게 높았다. 또한, 실시예 2는 3주차까지는 큰 변화가 없다가 4주후에 비교예 1과 비교예 2에 비해 각각 약 340%, 180% 유의하게 높게 나타났으며(p/0.05), 실시예 1에 비해 약 6% 높았으나 유의성은 없었다.

이상의 실험예 1 ~ 실험예 3의 결과에서 보듯이 비교예 1 및 비교예 2 보다 실시예 1 및 실시예 2에서 우수한 효능이 나타남을 확인 할 수 있었다. 또한 도 5의 사진에서 보듯이 실시예 1(C) 및 실시예 2(D)의 추출물이 비교예 1(A) 및 비교예 2(B)보다 불투명함으로서 더 많은 생리활성 물질들을 함유하고 있음을 알 수 있다.

< 제조실시예 1 : 헤어토닉 >

상기 실시예 1의 혼합추출물을 유효성분으로 함유한 화장료 조성물인 헤어토닉의 조성은 하기 [표 3]과 같다.

구분	제조실시예2	기능
정제수	To 100	용제
글리세린	2.00	보습제
다이프로필렌글라이콜	10.00	보습제
디소듐이디티에이	0.02	금속이온봉쇄제
베타인	1.00	보습제
에탄올	5.00	수렴제
폴리글리세릴-10 라우레이트	0.50	가용화제
토코페릴아세테이트	0.05	항산화제
향료	0.10	착향제
카프릴릴글라이콜	0.05	보습제
에칠헥실글리세린	0.05	보습제
실시예 1의 혼합추출물	30.0	탈모방지 및 모발성장 촉진제

<제조실시예 2 : 샴푸>

상기 실시예 1의 혼합추출물을 유효성분으로 함유한 화장료 조성물인 샴푸의 조성은 하기 [표 4]와 같다.

구분	제조실시예4	기능
정제수	To 100	용제
소듐라우레스 설페이트	30.00	계면활성제
소듐라우릴 설페이트	15.00	계면활성제
라우릴글루코사이드	10.00	계면활성제
소듐코코일글루코사이드	5.00	계면활성제
데실글루코사이드	2.00	계면활성제
프로판다이올	1.00	보습제
폴록사머407	0.70	점증제
판테놀	0.50	피부개선제
폴리쿼터늄-10	0.30	점증제
하이드록시아세토페논	0.10	보존제
다이소듐이디티에이	0.02	금속이온봉쇄제
향료	0.15	착향제
글리세린	0.50	보습제
실시예 1의 혼합추출물	10.00	탈모방지 및 모발성장 촉진제

< 제조실시예 3 : 헤어 트리트먼트 >

상기 실시예 1의 혼합추출물을 유효성분으로 함유한 화장료 조성물인 헤어 트리트먼트의 조성은 하기 [표 5]와 같다.

구분	제조실시예4	기능
정제수	To 100	용제
세틸알코올	6.00	유화안정제
디메치콘	6.00	피부컨디셔닝제
부틸렌글라이콜	5.50	보습제
스테아트리모늄클로라이드	2.00	대전방지제
향료	1.50	착향제
프로필렌글라이콜	1.00	보습제
코카미도프로필베타인	1.00	계면활성제
구아하이드록시프로필트리모늄클로라이드	0.50	대전방지제
비스(C13-15알콕시)피지-아모디메치콘	0.40	헤어컨디셔닝제
C14-15알코올	0.40	피부컨디셔닝제
아이소트라이데실알코올	0.30	피부컨디셔닝제
1,2-헥산디올	1.00	보습제
피이지-14M	1.20	용제
폴리쿼터늄-10	0.60	대전방지제
에칠헥실글리세린	0.05	보습제
다이소듐이디티에이	0.02	금속이온봉쇄제
실시예 1의 혼합추출물	30.00	탈모방지 및 모발성장 촉진제

이상과 같이 본 발명의 실시 예에 대하여 상세히 설명하였으나, 본 발명의 권리범위는 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 실시 예와 실질적으로 균등의 범위에 있는 것까지 본 발명의 권리범위가 미친다.

A: 비교예 1 B: 비교예 2
C: 실시예 1 D: 실시예 2

Claims

탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물에 있어서,
상기 화장료 조성물은 콩제비꽃 전초와 호장근뿌리 및 두충나뭇잎을 메틸 피롤리돈을 포함하는 용매로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 추출물은 콩제비꽃 전초 분말과 호장근뿌리 분말 및 두충나뭇잎 분말을 혼합하여 메틸 피롤리돈을 포함하는 용매로 추출한 혼합추출물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 혼합추출물은 콩제비꽃 전초 분말과 호장근뿌리 분말 및 두충나뭇잎 분말을 1 : 1 : 1의 중량비율로 혼합한 천연혼합물에 메틸 피롤리돈과 정제수를 포함하는 용매로 추출하며,
상기 천연혼합물과 메틸 피롤리돈 및 정제수는 1 : 2 : 8의 중량비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 추출물은 콩제비꽃 전초 분말과 호장근뿌리 분말 및 두충나뭇잎 분말을 혼합하고 메틸 피롤리돈 및 부틸렌글라이콜을 포함하는 용매로 추출한 혼합추출물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 혼합추출물은 콩제비꽃 전초 분말과 호장근뿌리 분말 및 두충나뭇잎 분말을 1 : 1 : 1의 중량비율로 혼합한 천연혼합물에 메틸 피롤리돈과 부틸렌글라이콜 및 정제수를 포함하는 용매로 추출하며,
상기 천연혼합물, 메틸 피롤리돈, 부틸렌글라이콜 및 정제수는 1 : 1 : 2 : 7의 중량비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물은 로션, 에센스, 크림, 팩, 샴푸, 린스, 헤어토닉으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 조성물.