KR20200043886A - 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20200043886A
KR20200043886A KR1020190066987A KR20190066987A KR20200043886A KR 20200043886 A KR20200043886 A KR 20200043886A KR 1020190066987 A KR1020190066987 A KR 1020190066987A KR 20190066987 A KR20190066987 A KR 20190066987A KR 20200043886 A KR20200043886 A KR 20200043886A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
extract
genistein
sophoricoside
diglucoside
sophoravioside
Prior art date
Application number
KR1020190066987A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102127712B1 (ko
Inventor
권석형
이상준
정재철
이정래
이철기
Original Assignee
(주) 노바렉스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주) 노바렉스 filed Critical (주) 노바렉스
Publication of KR20200043886A publication Critical patent/KR20200043886A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102127712B1 publication Critical patent/KR102127712B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A61P5/30—Oestrogens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/302—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having a modulating effect on age

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 특정 성분비를 갖는 괴각 추출물은 세포 독성이 거의 없어 안전하고, 다른 용매 추출물과 비교하여 항산화 및 항염증 효과가 현저하므로, 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition for the preventing and treating female menopausal disease comprising the extract of Sophora japonica L. fruits}
본 발명은 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 대한 것이다.
폐경이란 난소 기능이 점차적으로 저하되어 월경이 끝나는 것을 말하며, 이 때 월경주기가 불규칙해지고 에스트로겐 감소 및 난포자극호르몬이 증가하는 등의 호르몬 변화가 주요 신호로 나타나는데, 이와 같은 폐경기의 에스트로겐 결핍은 골 손실을 가속화시켜 골다공증의 위험을 증가시키는 것으로 알려져 있는 바, 정상적인 몸 상태에서 에스트로겐은 골 흡수를 억제하고 골수에서 파골세포 전구체의 양을 증가시켜 골 흡수를 증가시키는 염증성 사이토카인의 감소를 촉진시키는 것으로 알려져 있다.
최근 문명의 발달과 과학의 진보로 현대를 살아가는 인간은 그 수명이 점차 연장되어 여성의 경우, 2002년에 평균수명이 80.4세로, 갱년기 증상이 서서히 시작되는 40대 이후부터 30~40여 년 동안 여성의 건강한 삶에 대한 특별한 관심이 필요하다. 갱년기 증상의 가장 큰 원인이 에스트로겐 부족 때문이므로, 치료법으로는 에스트로겐 대체요법이 여성갱년기 증상 개선을 위해 주로 사용되어졌다. 그러나, 갱년기 증상을 갖는 여성의 35~40%만이 에스트로겐 대체요법을 사용하며, 이들조차도 대부분 이 방법을 지속적으로 사용하는 것을 기피한다. 에스트로겐 대체요법은 인위적인 호르몬 투여를 기반으로 하기 때문에 그 자체에 대한 거부반응과 부작용이 따르기 때문이다. 에스트로겐 대체요법의 부작용으로 자궁출혈, 뇌졸중, 심장발작, 유방암, 자궁암 발생 위험이 증가될 수 있음에 대한 많은 연구결과들이 보고되고 있다.
이러한 문제점 때문에 식품형태로 섭취하는 자연적인 방법으로 에스트로겐 요법을 대체하고자 하는 관심이 높아지고 있으며, 부작용이 없으면서도 갱년기의 증상을 완화시키는 효과가 우수한 새로운 갱년기 증상 개선제의 개발이 요구되고 있어, 합성 에스트로겐의 대체물로서 식물성 에스트로겐과 같은 천연식물성 성분을 찾고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
이소플라본 중 특히 제니스테인과 다이드제인은 그들의 항암효과와 항산화 효과로 주목을 받아 왔으며 여러 가지 암뿐 아니라 각종 성인병의 예방과 치료 효과에도 기대가 크다. 암세포의 증식에 관여하는 효소의 작용을 저해하는 것으로 밝혀졌으며, 특히 전립선암 억제 등 발암억제 가능성이 여러 측면에서 보고되었다. 또한 에스트로겐 수용체(estrogen receptor)와 약하게 결합하여 에스트로겐 활성을 필요로 하는 유방암 세포의 발생을 억제한다는 연구결과가 있다.
생리활성을 나타내는 비배당체 형태인 제니스테인은 괴각에 극소량 함유되어 있어 괴각 내 제니스테인의 배당체 형태를 체내에서 비배당체 제니스테인 형태로 전환되도록 하는 것이 필요한 실정이었으며, 체외에서 배당체를 비배당체로 전환시키는 기술은 비용과 시간이 많이 소요되어 배당체 자체를 섭취하여 체내에서 자연스럽게 전환흡수되도록 하는 기술이 요구되고 있었다.
일부 연구자들이 미생물을 이용하여 체외에서 소포리코시드를 비배당체 제니스테인으로 전환하는 기술을 개발하고 있었으나, 이러한 기술은 효모와 유산균을 이용하여 부가적인 공정을 거칠 필요가 있었다.(World J Microbiol Biotechnol (2015) 31:187--197)
제니스테인의 배당체 형태는 섭취시 소장에서 약 10% 정도로 자연스럽게 제니스테인으로 전환되는 것으로 알려져 있으며, 나머지는 대장에서 미생물에 의하여 제니스테인으로 전환된다.(Journal of Nutritional Biochemistry 17 (2006) 257-264)
또한, 비배당체 제니스테인은 소장에서 빠르게 흡수되지만 물에 대한 용해성이 낮아 생체이용률이 낮다. 따라서 제니스테인의 배당체를 섭취한 뒤 체내에서 전환되도록 하는 것이 생체이용률면에서 우수하다는 결과가 보고되어 있다.(International Journal of Pharmaceutics 337 (2007) 148-154)
그러나, 괴각 추출물 내 제니스테인의 배당체 형태가 어떠한 형태로 존재하는지 프로파일링한 결과가 밝혀진 바 없었으며, 여성 갱년기 질환에 대하여 우수한 효과를 나타내는 괴각 추출물 내에 존재하는 프로파일링된 배당체들의 최적의 비율에 대한 연구 또한 진행된 바 없었다.
이에 본 발명자들은 괴각 추출물 내 제니스테인으로 전환되는 배당체 형태를 프로파일링한 결과, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를확인하였고, 이러한 특정 배당체(제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드)에 대해서 특정 성분 비율을 가지면서 특정 함량 이상인 경우, 그러한 특징을 만족하는 괴각 추출물이 다른 괴각 추출물과 비교하여 여성 갱년기 질환의 개선 및 치료가 우수함을 확인하였는 바, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 식품 조성물, 또는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 식품 조성물, 또는 약학적 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
괴각(Sophora japonica L.)은 회화나무 열매로서, 회화나무는 콩과 식물에 속하는 낙엽교목이다. 우리나라와 중국이 원산지로 전국 각지에 분포하고 있으며, 관상용, 공업용, 식용, 약용으로 이용된다. 괴각의 주성분은 9개의 플라보노이드(flavonoid)와 이소플라보노이드(isoflavonoid) 화합물이 함유되어 있는데, 여기에는 소포라플라보노로지데지니스테인(sophoraflavonolosidegenistein), 소포라비오사이드(sophorabioside), 캠프레롤(kaemprerol), 루틴(rutin), 및 글루코사이드-C(glucoside-C) 등이 있으며, 어린 열매 속에 루틴의 함량이 1.76%에 달한다.
본 발명의 괴각 추출물은 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 것을 특징으로하며, 또한 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하는 것을 특징으로 한다.
이와 관련하여 본 발명자들은 일실시예에서 상기 성분들의 중량비 및 함량을 가진 괴각 추출물이 세포독성 없이 안전하며, 특이적으로 가장 우수한 항산화 및 항염증 효과를 나타내는 것을 확인한 바 있다. 뿐만아니라 in vivo 상에서도 다양한 갱년기 질환 증상에 대해서 현저히 우수한 예방 및/또는 치료 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
바람직한 추가의 실시 양태에서, 상기 본 발명의 괴각 추출물은 이소플라본 배당체를 300mg/g 이상 함유하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 300mg/g 내지 400mg/g 함유하는 것일 수 있다. 상기 이소플라본 배당체는 하기 화학식으로 나타나는 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 소포리코시드, 배당체 캠페롤-글루코시드, 및 소포라플라보놀로시드(sophoraflavonoloside)로 이루어진 것이다.
상기 제니스테인 디글루코시드(Genistein 4'-O,7-diglucoside)는 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 소포라비오시드(sophorabioside)는 바람직하게는 하기 화학식 2로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00002
상기 소포리코시드(sophoricoside)는 바람직하게는 하기 화학식 3으로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 3]
Figure pat00003
상기 배당체 캠페롤 글루코시드는 바람직하게는 kaempferol-3-o-beta-d-glucopyranoside-(1→3)β-D-glucopyranosyl-7-O-α-rhamnopyranoside 일 수 있다.
본 발명의 상기 괴각 추출물은, 추출물의 제조시 추출 효율을 증대시키기 위해 상기 원료에 대한 전처리 과정을 포함할 수 있으며, 예를 들어 괴각을 건조시킨 후 세절하여 사용할 수 있다.
상기 괴각 추출물은 공지의 천연물 추출법으로 추출될 수 있다. 예를 들어 냉침추출, 상온추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각 추출, 가열 추출법으로 추출할 수 있으며, 1회 내지 10회 반복 추출할 수 있다.
본 발명의 추출물은 물 및 탄소수 1~6의 유기용매로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 사용하여 추출되는 것일 수 있다. 본 발명에서 추출 용매는 식용 가능한 단수 또는 복수 종류의 용매일 수 있으나, 바람직하게는 물, 주정, 및 탄소수 1 내지 6의 알코올[메탄올(C1), 에탄올(C2), 프로판올(C3), 부탄올(C4), 펜탄올(C5), 헥산올(C6)]로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것을 사용할 수 있다. 더 바람직한 실시 양태에서, 본 발명에서는 물, 주정 및 탄소수 1 내지 4의 알코올[메탄올(C1), 에탄올(C2), 프로판올(C3), 부탄올(C4)]로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것을 추출용매로 이용하는 것일 수 있다.
더욱 바람직하게는 주정을 사용하는 것일 수 있다. 상기 주정은 바람직하게는 1%(v/v) 내지 99%(v/v)의 농도를 가질 수 있으며, 더 바람직하게는 40%(v/v) 이상의 농도를 가질 수 있고, 가장 바람직하게는 50%(v/v) 내지 70%(v/v)의 농도를 가질 수 있다.
본 발명의 추출물은 여과 및/또는 농축하여 액상으로 사용할 수 있고, 분무건조 또는 동결건조 등 통상의 건조 공정을 통하여 고형화하여 사용할 수 있다. 상기 건조 공정에서는 분무건조 또는 동결건조 전 덱스트린 등을 혼합하여 건조할 수 있다.
본 발명에서 대상으로 하는 질환인 갱년기(climacterium)란, 폐경기라고도 하며, 여성의 생식기능이 소실하는 징후로 나타나는 월경폐지의 시기를 의미한다. 갱년기가 되면 난소 기능의 실조로 월경의 양이나 주기가 불규칙하게 되고, 수개월에서 3년에 걸친 여포호르몬(에스트로겐)의 분비저하로 월경이 폐지되며, 간뇌의 자율신경중추에 작용하여 자율신경계의 실조를 일으켜 갱년기장애의 원인이 된다. 또한 뇌하수체 전엽의 기능실조로 부신피질 기능을 항진시켜 남성화를 보이며, 갑상선호르몬의 영향으로 갑상선 기능에 이상을 가져와 비만을 초래하는 등 갱년기 특유의 기능실조가 나타난다. 예컨대, 일과성열감(一過性熱感), 동계(動悸:심장의 고동이 보통 때 보다 심하여 가슴이 울렁거리는 일), 현기, 이명(耳鳴), 고혈압, 소화기장애, 두통, 기억력감퇴, 우울증 등의 증세가 나타날 수 있다.
따라서, 본 발명의 여성 갱년기 질환은 안면홍조, 발한, 피부건조, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 및 골다공증으으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공한다.
상기 항산화는 산화과정을 늦추거나, 차단 또는 예방할 수 있는 효능을 의미한다. 더욱 구체적으로 활성산소종 라디칼 소거능을 의미할 수 있다.
또한 본 발명은 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물(식품 조성물, 또는 약학적 조성물)을 제공한다.
하나의 실시 양태에서 본 발명은, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
하나의 실시 양태에서 본 발명은, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 및/또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
추가의 실시 양태에서, 본 발명은 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것일 수 있다.
또 다른 추가의 실시 양태에서, 본 발명은 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및/또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 염증성 질환은 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니나, 하나의 실시 양태에서, 상기 염증성 질환은 간염, 지방간염, 알레르기 비염, 관상동맥 질환 또는 류마티스 관절염 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 괴각 추출물을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 1,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 여성 갱년기 질환을 예방 및 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 괴각 추출물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화 하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 괴각 추출물을 여성 갱년기 질환에 대하여 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 식품 조성물은 괴각 추출물 성분 이외에 미량 의 미네랄, 비타민, 지질, 당류 및 공지의 항알레르기 활성을 가진 성분 등을 추가로 함유할 수 있다. 상기 미네랄로는 칼슘, 철 등 성장기에 필요한 영양성분이 함유될 수 있으며 비타민으로는 비타민 C, 비타민 E, 비타민B1, 비타민 B2, 비타민 B6 등이 함유될 수 있다. 지질로는 알콕시글리세롤 또는 레시틴 등이 함유될 수 있으며 당류로는 프락토올리고당 등이 함유될 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 괴각 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 괴각 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 괴각 추출물의 바람직한 함량은 식품 조성물 총 중량에 대하여 식품의 전체 중량을 기준으로 0.01 ~ 90%, 바람직하게는 0.1 ~ 50%의 비율로 함유될 수 있다.
본 발명에 따른 제니스테인 배당체의 특정 성분비를 가질 뿐만 아니라 특정 함량 이상을 갖는 괴각 추출물은, 세포 독성이 거의 없어 안전하고, 다른 용매 추출물과 비교하여 항산화 및 항염증 효과가 현저하므로, 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 용매별 괴각 추출물의 LDH 세포독성 시험 결과를 나타낸다.
도 2는 용매별 괴각 추출물의 DPPH 소거능 시험 결과를 나타낸다.
도 3은 용매별 괴각 추출물의 히드록시 라디칼 소거능 시험 결과를 나타낸다.
도 4는 괴각 물 추출물 또는 이를 이용한 괴각 효소분해 추출물 처리에 의하여, 골형성 촉진 인자인 TGF-β 발현 정도를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다(R-G: 괴각 물 추출물 처리군, R-A: 괴각 효소분해 추출물 처리군, S-S: 대두 엑스분말 처리군, E: 17-β 에스트라디올(estradiol) 처리군).
도 5는 갱년기 동물 모델(난소 적출 마우스)에 있어서, 괴각 물 추출물 또는 이를 이용한 괴각 효소분해 추출물 처리에 의하여 경골의 소주골(Trabecular bone) 면적 변화 양상을 확인한 결과를 나타낸다(R-G: 괴각 물 추출물 처리군, R-A: 괴각 효소분해 추출물 처리군, S-S: 대두 엑스분말 처리군, E: 17-β 에스트라디올(estradiol) 처리군).
도 6은 갱년기 동물 모델(난소 적출 마우스)에 있어서, 괴각 물 추출물 또는 이를 이용한 괴각 효소분해 추출물 처리에 의하여 요추 소주골 면적 변화 양상을 확인한 결과를 나타낸다(R-G: 괴각 물 추출물 처리군, R-A: 괴각 효소분해 추출물 처리군, S-S: 대두 엑스분말 처리군, E: 17-β 에스트라디올(estradiol) 처리군).
도 7은 용매별 괴각 추출물의 iNOS 유전자 발현 억제능을 비교한 것이다.
도 8은 용매별 괴각 추출물의 GM-CSF 유전자 발현 억제능을 비교한 것이다.
도 9는 주정 농도별 괴각 추출물의 히드록시 라디칼 소거능 시험 결과를 나타낸다.
도 10은 주정 농도별 괴각 추출물의 IL-6 유전자 발현 억제능을 나타낸다.
도 11은 주정 농도별 괴각 추출물의 nitric oxide synthase 유전자 발현 억제능을 나타낸다.
도 12는 주정 농도별 괴각 추출물의 일산화질소 생성량 시험 결과를 나타낸다.
도 13은 본 발명 특유의 괴각 추출물(Rex)의 갱년기 혈관 운동 증상에 대한 효과를 비교적으로 나타낸다.
도 14는 본 발명 특유의 괴각 추출물(Rex)의 갱년기 비뇨기계 상피세포 변화에 대한 효과를 알아보기 위한 실험으로, 질(vagina) 상피세포를 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 15는 상기 도 14에서 관찰된 질 각질화 세포수를 정량화 하여 나타낸 것으로, 질 점막 세포 중의 각화 상피세포의 비율이 높다는 것은 질 각질화 수준이 감소하고 질 점막이 유연한 것으로 간주한다.
도 16은 갱년기 혈액 인자 변화 중 간염이나 지방 간염을 나타내는 ALT 수치 변화에 있어서, 본 발명 특유의 괴각 추출물(Rex)의 효과를 비교적으로 나타낸다.
도 17은 갱년기 혈액 인자 변화 중 혈액 순환을 방해하는 LDL 수치 변화에 있어서, 본 발명 특유의 괴각 추출물(Rex)의 효과를 비교적으로 나타낸다.
도 18은 갱년기 골질환과 관련된 골세포 주요 유전자 발현 변화 중 RANKL 발현 변화에 있어서, 본 발명 특유의 괴각 추출물(Rex)의 효과를 비교적으로 나타낸다.
도 19는 갱년기 골질환과 관련된 골세포 주요 유전자 발현 변화 중 골형성 촉진인자인 TGF-β 발현 변화에 있어서, 본 발명 특유의 괴각 추출물(Rex)의 효과를 비교적으로 나타낸다.
도 20은 갱년기 대사성 질환과 관련한 변화 중 특히 비만과 관련된 Leptin 발현 변화에 있어서, 본 발명 특유의 괴각 추출물(Rex)의 효과를 비교적으로 나타낸다.
도 21은 갱년기 대사성 질환과 관련한 변화 중 염증 유발성 사이토카인 IL-6의 발현 변화에 있어서, 본 발명 특유의 괴각 추출물(Rex)의 효과를 비교적으로 나타낸다.
도 22는 갱년기 대사성 질환과 관련한 변화 중 염증 유발성 사이토카인 TNF-α의 발현 변화에 있어서, 본 발명 특유의 괴각 추출물(Rex)의 효과를 비교적으로 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 괴각 추출물의 용매별 성분 분석
회화나무열매(괴각)의 유효성분인 이소플라본 배당체(Isoflavone glycoside)와 비배당체 Isoflavone aglycon의 대표물질인 Genistein 함량을 확인하였다.
먼저, 회화나무열매(괴각) 원물 20 g을 분쇄기를 이용하여 50 mesh의 크기로 분쇄하였다. 분쇄한 괴각을 플라스크에 넣고, 하기 표 1에 기재된 각각의 용매를 원물 중량의 9 배수(180 g) 첨가 하여 4시간 동안 환류하고, 40℃로 냉각한 후 filter paper (75 ㎛ cartridge)를 이용하여 여과 한다. 여액을 감압농축(55~58℃)하여 잔류 용매를 제거하고 60 brix까지 농축을 시켰다. 잔사를 95℃에서 30분간 살균한 후 분무건조(액온 75~80℃, 송풍온도 180℃, atomizer 18,000 rpm)하여 회화나무열매(괴각) 추출물 분말을 제조하였다.
사용된 용매 종류별 괴각 추출물에 대하여, 분말 1 g 당 성분 함량 분석 결과를 표 1 및 표 2에 나타내었다. 3회 반복 시험한 결과이다.
번호 용매 시험 제니스테인 배당체 함량(mg/g)**
G-1 S-7 S-8
1 주정 95% 평균 32.79 106.24 147.23
비율 1.0 3.24 4.50
2 주정 85% 평균 31.25 96.53 140.61
비율 1.0 3.09 4.50
3 주정 75% 평균 34.60 109.53 153.03
비율 1.0 3.17 4.42
4 주정 65% 평균 35.64 105.45 143.89
비율 1.0 2.96 4.04
5 주정 55% 평균 25.22 78.01 101.97
비율 1.0 3.09 4.04
6 주정 45% 평균 25.00 84.42 112.62
비율 1.0 3.38 4.50
7 주정 35% 평균 18.19 65.40 94.42
비율 1.0 3.60 5.19
8 주정 25% 평균 18.62 57.76 69.11
비율 1.0 3.10 3.71
9 물 평균 25.23 70.70 55.20
비율 1.0 2.80 2.19
10 메탄올 평균 39.09 110.77 156.98
비율 1.0 2.83 4.02
11 아세톤 평균 5.59 62.39 115.56
비율 1.0 11.16 20.67
12 에틸아세테이트 평균 0.71 30.92 68.13
비율 1.0 43.35 95.96
13 클로로포름 평균 N/D 0.30 0.55
비율 - -
14 핵산 평균 N/D 0.40 0.63
비율 - -
* 실험값은 3반복 결과의 평균값임, G-1을 기준으로 다른 성분의 상대적 비율은 소수 셋째자리에서 반올림하여 계산됨
** G-1 : Genistein 4'-O,7-diglucoside
S-7 : Sophorabioside
S-8 : Sophoricoside
번호 용매 Isoflavone glycoside 함량(mg/g)** Genistein(mg/g)*** (G-1)+(S-7)+ (S-8)의 합(mg/g) 수율(%)
1 주정 95% 422.33 0.36 286.26 9.8
2 주정 85% 394.49 0.32 268.39 10.4
3 주정 75% 435.91 0.39 297.16 10.1
4 주정 65% 422.36 0.38 284.98 11.2
5 주정 55% 305.56 0.35 205.20 10.8
6 주정 45% 327.25 0.40 222.04 10.2
7 주정 35% 253.74 0.49 178.01 10.5
8 주정 25% 221.46 0.59 145.49 9.5
9 물 242.07 0.34 151.13 -
10 메탄올 449.30 0.36 306.84 -
11 아세톤 235.39 1.98 183.54 -
12 에틸아세테이트 103.88 2.18 99.76 -
13 클로로포름 2.49 N/D 0.85 -
14 핵산 2.76 N/D 1.03 -
* 실험값은 3반복 결과의 평균값임
** 배당체 Isoflavone glycoside 함량은 Genistein 4'-O,7-diglucoside(G-1), 배당체 Kaempferol-glucoside, Sophoraflavonoloside, Sophorabioside(S-7), 그리고 Sophoricoside(S-8)의 합이다.
본 발명자들이 괴각 추출물 내에서 제니스테인으로 변환하는 구조를 가진 배당체가 무엇인지, 그 구조가 어떻게 되는지 프로파일링한 결과, 배당체 형태로 존재하는 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 소포리코시드의 구조가 체내 효소에 의하여 자연적으로 제니스테인으로 변환되는 구조를 갖는 것을 확인하였다.
실시예 2 : 용매별 괴각 추출물의 세포독성 시험
각 추출물들의 세포 독성을 확인하기 위하여 LDH(lactate dehydrogenase) 측정방법을 사용하였다. 일반적으로 세포괴사의 지표로 널리 사용되고 있는 것중에 대표적인 것이 세포막의 붕괴이다. 그러므로 세포막이 어느 정도 손상되었는가를 측정함으로써 세포의 괴사정도를 알수 있다. LDH는 세포내부의 세포질에 존재하는 안정한 효소로서 세포막이 손상되는 정도에 따라 세포외부로 배출된다. 즉 세포의 독성도에 따라 세포가 가지고 있는 LDH의 양을 측정 비교하여 보면 세포가 훼손된 정도를 유추할 수 있다.
구체적으로, 세포독성도를 평가하기 위하여 세포(105/96-well)를 4시간 동안 37℃에서 95%의 산소와 5%의 이산화탄소를 주입해 준 배양기에서 배양한다. 배양한 후 표준군, 대조군 그리고 시험군의 세포 배양액에 있는 LDH의 양을 측정하기 위하여 미국의 Promega 회사의 제품인 LDH 분석 용액을(제품번호: G1780)을 사용하여 반응시킨후 SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (Molecular Devices, USA)를 사용하여 측정하였다.
세포독성 및 항산화 효능 시험 대상
번호 추출용매
1 물
2 아세톤
3 주정-95%
4 주정-65%
5 주정-45%
6 에틸아세테이트
7 헥산
그 결과, 도 1에 나타나듯이, #2(아세톤 추출물), #6(에틸아세테이트 추출물), 및 #7(헥산 추출물)은 세포내 LDH 손실시켜, mild 내지 moderatet 수준의 세포 독성이 있는 것으로 측정되었는 바, 안전한 생약 소재로 이용하기에 적절하지 않은 것으로 판단된다.
실시예 3 : 용매별 괴각 추출물의 항산화 효과 비교
실시예 3-1 : DPPH 소거능 평가
2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)은 화학적으로 안정화된 수용성 free radical로서 517 nm에서 특징적인 광 흡수를 나타내는 보라색 화합물이며, 이 라디칼은 알코올 등의 유기용매에서 매우 안정하며 항산화활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주면서 최초 용액의 보라색 빛깔에서 노란색으로 색깔이 변화하여 산화 활성을 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있는 대표적인 항산화 활성실험법이다. DPPH 0.3 mM을 함유한 methanol 용액을 제조하여 10, 25, 50μg/mL의 시험 물질(표 3 참조)을 혼합한 후 실온에서 10분간 반응 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 실험 물질 간 radical scavenging activity를 비교 분석하였다. 양성대조군으로는 항산화 효과가 우수한 ascorbic acid(150 μM)를 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타나듯이, #1, #3, #4, #5는 10 μg/mL의 저용량에서부터 유의적인 항산화 효능을 보였으며 50μg/mL의 용량은 대조 물질로 사용한 ascorbic acid와 동등한 수준의 라디칼 소거능이 확인되었다. 나아가, #4 샘플의 경우 25 μg/mL 용량 처리 시 DPPH 라디칼을 66% 저해하는 것으로 나타나 총괄분석에서 다른 시험 물질 보다 우수한 항산화 효능을 가지는 것을 확인되었다.
특히 에스트로겐이 항산화제 역할을 하여 저밀도지단백 콜레스테롤의 산화를 억제하여 심혈관계 질환을 조절한다는 점에서 #4 시험물질이 가지는 강력한 항산화 효과는 심혈관계질환의 위험성을 낮추는 역할뿐 아니라, 적절한 활성산소종 제거 효능으로부터 파골세포 분화를 효과적으로 조절하여 골다공증과 같은 골 관련 질환을 효과적으로 제어할 것으로 사료된다.
반면, #2, #6, #7은 10μg/mL 용량에서 라디칼 소거능을 거의 나타내지 않았으며, #6, #7의 경우 고용량을 처리한 경우에도 라디칼 소거능을 나타내지 않아 항산화 효과를 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 3-2 : Hydroxyl radical scavenging assay
Reactive oxygen species(ROS)에 의한 손상으로부터 단백질이나 효소를 보호하는 항산화 물질의 효과를 금속이온촉매반응을 이용해 확인하는 방법으로서, Cu2 +(1mM),H2O2(10mM)를 반응하여 생성시킨 hydroxyl radical에 시험 물질(표 3 참조)을 혼합 및 반응 후 타겟 단백질로 BSA(bovine serum albumin, Sigma-Aldrich, USA)를 적용하였다. 이를 10% sodium dodecyl sulfate(SDS)-polyacryamide gel에 전기영동하여 BSA 단백질 파괴 저해 수준을 확인하였다. 양성대조군으로서 항산화 효과가 우수한 ascorbic acid(150 μM)를 사용하였다.
세포 호흡의 결과 나타나는 강력한 활성산소종인 hydroxyl radical(하이드록시 라디칼, OH·)은 갱년기 증상을 포함한 뼈 건강 및 노화 진행에 매우 유해한 물질로 분류되며, 특히 하이드로시 라디칼 생성 후 적절한 소거가 되지 않을 경우 지질과산화 및 단백질 변성 등을 통해 각종 질병을 유발하는 것으로 알려져있다. 따라서, 샘플의 생리활성 중 하이드록시 라디칼 소거능을 가지는 것은 매우 유용하다.
도 3에 나타난 바와 같이, Cu2 +(1mM),H2O2(10mM)의 반응으로 생성된 하이드록시 라디칼에 대한 각 샘플의 단백질 보호 효능 분석 결과, #7을 제외하고 표준 농도인 25 μg/mL 반응 시 완전한 수준의 단백질 보호 효능이 관찰되었고, 보다 낮은 농도인 10 μg/mL과 반응시켰을 때 #1, #3, #4, #5 샘플에서만 우수한 단백질 보호 효능이 관찰되어 항산화력이 우수한 결과를 보였다.
따라서, 세포독성 및 항산화 시험 결과에 따라 독성을 나타낼 뿐만 아니라, 항산화 효과가 거의 없는 #2(아세톤 추출물), #6(에틸아세테이트 추출물), #7(핵산 추출물)을 제외하고, 이하의 실시예들에서 물 추출물 및 주정 추출물에 대하여 이들의 효능 차이를 면밀히 분석하였다.
실시예 4: 괴각 물 추출물의 갱년기 골대사성 질환에 대한 효과 확인
실시예 4-1: 괴각 물 추출물 및 이를 이용한 괴각 효소분해 추출물의 제조
먼저, 가장 일반적으로 사용되는 용매인 물을 이용하여 괴각 추출물을 제조하였을 때(즉, 괴각 물 추출물), 어떤 효과를 보유하는지 알아보았다. 또한 괴각 물 추출물에 효소를 첨가하고 반응시켜 괴각 효소분해 추출물을 제조하고, 이를 이용해 괴각 물 추출물과 효과 상의 차이 여부를 확인하였다. 괴각 효소분해 추출물의 제조 방법은, 구체적으로 다음과 같다. 분쇄한 괴각 20g에 원물 중량의 9배수의 물을 첨가하여 4시간동안 환류하고 40℃로 냉각한 후 filter paper(75 ㎛ cartridge)를 이용하여 여과 하였다. 이렇게 수득한 여과액에 0.5%(v/v)의 농도가 되도록 아밀라아제를 첨가하여 50℃에서 16시간 동안 효소반응을 수행하였다. 상기 반응액을 농축기를 이용하여 1/5의 부피가 되도록 농축함으로써 괴각 효소분해 추출물을 제조하였다. 이것을, 상기와 동일한 방법으로 분무건조기를 이용하여 분무건조하여 분말화한 것을 실험에 사용하였다. 상기 실시예 1에서 수행했던 것과 동일한 방법으로, 분말 1 g 당 성분 함량 분석을 하였으며, 이를 하기 표 4에 나타내었다.
구 분 시험 제니스테인 배당체 함량(mg/g) 배당체 합
(mg/g)		 Genistein
(mg/g)
G-1* S-7** S-8***
괴각
효소분해 추출물		 3반복 평균 31.87 74.61 42.78 149.26 10.25
중량 비율 1 2.34 1.34
*G-1 : Genistein 4’-O, 7-diglucoside
**S-7 : Sophorabioside
***S-8 : Sophoricoside
(* 실험값은 3반복 결과의 평균값임/ G-1을 기준으로 다른 성분의 상대적 비율은 소수 셋째자리에서 반올림하여 계산됨/ 배당체 합은 (G-1)+(S-7)+(S-8) 값)
실시예 4-2: 골형성 촉진인자 TGF-β 발현에 대한 효과 확인
TGF-β는 조골세포의 복제(replication)를 자극시키고 콜라겐 및 기질합성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 특히, TGF-β는 파골세포의 기능을 억제하고 파골세포의 세포사멸(apotopsis)을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, TGF-β가 증가됨에 따라 골 재흡수는 감소하게 된다.
MG-63 사람 조골세포-유사 세포에 괴각 물 추출물(R-G군), 괴각 효소분해 추출물(R-A군) 각각을 세포 배양용 배지로 희석하여 10-8%(w/v)의 농도로 처리한 다음 72시간이 경과한 후 RT-PCR을 통해 TGF-β의 발현량을 측정하였다. 이때, 비교군으로는 대두 엑스분말(S-S군, 신동방 社로부터 구입) 및 에스트라디올(E)을 동일한 방법으로 처리하였으며, 대조군에는 세포 배양용 배지를 첨가하였다.
MG-63 사람 조골세포-유사 세포를 서울대학교 의과대학의 한국세포주은행에서 분양 받아 계대배양 후 사용하였다. 상기 동결 MG-63 사람 조골세포-유사 세포는 37℃ 수욕(water bath)에서 약 1분간 해동시킨 후 1300rpm에서 5분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하였다. 수득한 펠렛을 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 재현탁한 후 25cm3 배양용 플라스크에 분주하여 배양하였다. 세포의 안정화를 위해 약 2주간의 배양기간을 두었고 세포가 안정하게 단일층(monolayer)을 이루는지 현미경으로 확인한 후 실험에 사용하였다.
RT-PCR은 간략하게 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 각 시료를 10-8%(w/v)의 농도로 처리한 MG-63 사람 조골세포-유사 세포로부터 총 RNA를 트리졸 방법(TRIZOL method)에 의해 추출하였다. 상기 총 RNA 2㎕를 역전사반응을 수행함으로써 각각의 상보적 DNA를 제조하였다. DEPC 증류수 12.85㎕에 총 RNA 5㎕, 10pM의 프라이머 각 1㎕씩을 첨가한 다음 72℃에서 10분간 변성시키고 여기에 역전사효소(5U) 0.15 ㎕를 첨가하고 42℃에서 10분간 반응을 수행하여 상보적 DNA를 제조하였다. 상기 상보적 DNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 이때 실험의 재연성 및 일관성을 위해 원 스톱 RT-PCR 프리믹스(Accupower, Bioneer)를 사용하였다. 상기 반응액을 PCR 시스템(Dual-bay DyadTM thermal cycler system, MJ Research)을 사용하여 95℃에서 5분, 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 60초를 1 사이클로 하여 총 35 사이클을 실시하였다. 표준 대조군으로는 GAPDH를 사용하였다. 증폭된 PCR 산물은 겔 분석기(gell documentation system)를 이용하여 정량하였으며, 발현정도를 대조군에 대해 상대적인 %로 나타내었다. 상기에서 RT-PCR에 사용한 프라이머 서열은 다음과 같다. TGF-β 의 센스 프라이머: 5'-CGC CCT GTT CGC TCT GGG TAT-3', TGF-β 의 안티센스 프라이머: 5'-AGG AGG TCC GCA TGC TCA CAG-3'.
TGF-β의 발현정도는 대조군에 대해 상대적인 %로 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, TGF-β는 에스트라디올 처리군(E 군)에 비해, 괴각 물 추출물 처리군(R-G군), 괴각 효소분해 추출물 처리군(R-A군)에서 매우 높게 발현되는 것으로 나타났다.
또한 추가의 실험에서 상기 시험물질들 처리에의한 조골세포 증식 정도를 비교하였으며, 그 결과 상기 괴각 물 추출물 처리군(R-G군)과 괴각 효소분해 추출물 처리군(R-A군)에서 유사한 정도의 조골세포 증식 효과가 나타났다(데이터 미도시).
실시예 4-3: in vivo 갱년기 동물 모델에서의 골관련 효과 확인
동물 실험을 통해 각 시험물질의 골다공증 예방 또는 치료효과를 조사하였다. 실험용 흰쥐의 난소를 적출하여 골다공증을 유발시킨 다음, 각 시험물질을 투여하여 골 관련 특성을 살펴보았다. 모든 실험군간의 비교는 ANOVA 테스트를 이용하였으며, 특정군간의 비교는 스튜던트 T-테스트(student-T test)를 이용하여 통계 처리한 후 신뢰구간(p value)이 0.05보다 작은 경우 통계적인 의의가 있는 것으로 판정하였다.
구체적으로 실험동물로는 체중이 230∼250g의 암컷 흰쥐(Sprague-Dawley)를 한림실험동물원(경기도)으로부터 구입하여 사용하였다. 상기 실험동물은 온도 23±1℃, 습도 40∼60% 및 명암주기 12시간의 조건으로 사육하였으며, 기본사료(고형사료, 한림실험동물연구소)와 식수는 제한 없이 공급하였다. 단, 채혈 전일에는 식수만 공급하였다. 난소적출 수술은 12주령의 흰쥐를 에테르 흡입 마취 후 등쪽 부위의 털을 면도기로 제거하고 70% 알코올로 수술부위를 소독한 다음 무균적으로 수술을 시행하였다. 한쪽 측배부 하단 부위 척추선을 따라 피부조직을 약 2∼3㎝ 정도 절개한 다음 난소가 위치하는 근육 및 복막을 1.5㎝ 절개하여 난소를 노출시켰다. 난관을 실크(silk)로 결찰한 후 난소를 절제하고 실크를 사용하여 복막, 근육 및 피부를 봉합하였다. 반대측에 대해서도 동일한 방법으로 난소를 적출하였다. 대조군으로는 복막까지만 동일하게 시술하고 난소는 적출하지 않은 채로 다시 봉합하는 가장수술(sham operation)을 시행하였다. 수술 후 1주일간의 회복기를 가졌다.
상기 각 실험군에 하기 표 5와 같은 투여량으로 시료를 투여하였으며, 시료의 투여기간은 난소적출 수술 후 1주일이 지난 13주령의 흰쥐를 사용하여 22주령까지 9주간으로 하였다.
그룹 시료 투여량 및 투여방법
정상군(난소비적출군) 시료 투여하지 않음
대조군 1(가장 수술군) 식수 1ml/day, 경구투여
대조군 2(난소 적출군) 식수 1ml/day, 경구투여
E 군 1μg/kg/day, 복강 내 주사
R-G군 0.556g/kg/day, 경구투여
R-A군 0.556g/kg/day, 경구투여
S-S군 0.556g/kg/day, 경구투여
골 관련 특성 중, 도 5 및 도 6에서는 대표적으로 경골 및 요추골의 소주골(trabecular bone) 면적을 측정한 결과를 보여준다. 갱년기 골질환에서 골밀도 특성을 제어하는 것은 매우 중요하다. 상기 소주골(trabecular bone)은 골대사 작용이 가장 활발하게 일어나는 곳으로서, 외부 효과에 의한 뼈의 생성 및 골 흡수 작용이 가장 빠르게 반응하여 나타나는 곳이다. 따라서, 소주골의 면적을 측정함으로써 그 증감여부에 따라 골다공증이나 골다공증 유발 억제효과를 판단할 수 있다(Faugere MC. et al., American Physiological Society, E35-E38, 1986).
구체적으로 괴각 물 추출물(R-G군)과 이의 효소분해물(R-A군)이 뼈의 골밀도에 미치는 영향을 조사하고자, 각 실험군 동물을 희생한 다음 경골 및 요추골을 취하여 10% 포르말린 용액에 고정하였다. 포름산(formic acid)내에서 탈회를 수행하고 골조직 중 관찰할 부위를 수술칼로 절단하였다. 70% 알코올에서 100% 알코올과 아세톤에 이르는 단계별 탈수과정 후 자일렌으로 청명하고 파라핀 포매 실시하였다. 포매된 골조직을 마이크로톰으로 5마이크론으로 절단한 후 헤마토자일린 에오신(Hematoxyline eosin, H&E) 염색을 실시하여 광학 현미경(Olympus BH-2)으로 관찰하였으며 요추골과 경골의 골단부를 정량적 및 형태계측학적으로 측정하였다.
계측방법은 폴라로이드 디지털 카메라(Polaroid digital camera)로 광학 현미경(Olympus BH-2)의 1X 대물렌즈를 통해 영상을 얻은 후 컴퓨터 상에서 각 소주골의 윤곽선을 그리면 자동적으로 계산되는 프로그램을 사용하였으며, 골의 골단부 중 성장판의 직하부 이차골화부위 내에 있는 소주골을 모두 측정하였다. 면적은 컴퓨터에서 산출된 면적을 자동적으로 계산하였으며 영상분석시스템(Optimas ver 6.2, Media Cybernetics. Inc.)을 사용하여 분석하였다. 이들 수치의 평균을 통계처리하여 측정부위의 전체 면적에서 소주골이 차지하는 면적을 %로 정량화하여 분석하였다.
실험 결과, 경골의 경우 식수를 투여한 대조군 2(난소적출군)에 비해 괴각 물 추출물 투여군(R-G군) 및 괴각 효소분해 추출물 투여군(R-A군)에서 소주골 면적의 감소정도가 현저히 개선된 것으로 나타났으며, 에스트라디올 투여군(E 군)과 비슷하거나 보다 높은 골밀도를 유지하는 것으로 나타났다(도 6 참조). 또한, 요추골의 경우에도 대조군에 비해 괴각 물 추출물 투여군(R-G군) 및 괴각 효소분해 추출물 투여군(R-A군)에서 소주골 면적의 감소 정도가 작게 나타났다.
종합적 측면에서, 괴각 물 추출물과 괴각 효소분해 추출물 투여군(R-A군)이 골다공증과 같은 갱년기 골질환에 대하여 가지는 효과는 유사한 것으로 확인되었다.
실시예 5 : 괴각 물 추출물과 괴각 주정 추출물의 항염증 효능 비교
염증반응 유도물질인 lipopolysaccharide(LPS)와 각 시험 물질을 함께 대식세포수인 RAW264.7 세포에 처리 후 24시간 내 파골세포 연관 유전자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)) 및 갱년기 심혈관 연관 유전자(endothelial nitric oxide synthase) 발현을 비교분석하여 시험 물질(표 3 참조)의 갱년기 증상 개선(심혈관)에 도움을 줄 수 있는 지를 관찰하였다.
RT-PCR은 각 군의 세포로부터 트리졸시약 (Invitrogen, USA)를 이용하여 total RNA를 추출 하였다. 즉 트리졸시약 1 mL를 첨가하여 세포를 용해시키고 실온에서 5분 동안 방치 후 클로로포름 200 μL를 첨가하여 13500 rpm에서 15분 동안 원심분리 하였다. 투명한 상층액 (500 μL)을 취하여 새로운 튜브로 옮기고 동량의 이소프로필 알콜을 첨가한 후 13500 rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 RNA를 침강 시켰다. 침전된 RNA 펠렛을 Di ethyl pyrocarbonate (DEPC)로 처리한 증류수로 희석한 75 % 에탄올 0.75 mL로 세척한 후 공기 중에서 건조시켜 역전사 샘플로 사용하였다. cDNA 합성은 1 μg의 총 RNA와 Improm-II 역전사 시스템(Promega, USA)과 올리고 dT 프라이머를 사용하여 총량이 20 μL 되도록 조성한 뒤 역전사 반응을 수행하였으며, 표 6에 제시된 프라이머(Bioneer, Korea)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
프라이머 염기서열 서열 번호 접근 번호
iNOS 포워드 5'-TGCCCCTGGAAGTTTCTCTT-3' 1 NM_010927
리버스 5'-ACTGCCCCAGTTTTTGATCC-3' 2
IL-1β 포워드 5'-GTGTCTTTCCCGTGGACCTT-3' 3 XM_006498795
리버스 5'-ATGGGAACGTCACACACCAG-3' 4
IL-6 포워드 5'-TCCATCCAGTTGCCTTCTTG-3' 5 NM_031168
리버스 5'-CCACGATTTCCCAGAGAACA-3' 6
GM-CSF 포워드 5'-ACATGACAGCCAGCTACTAC-3 7 NM_009969
리버스 5'-CTTCCTCATTTTTGGCCTGG-3 8
β-actin 포워드 5'-TACAGCTTCACCACCACAGC-3' 9 NM_007393
리버스 5'-AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC-3' 10
이에, 염증유발 대식세포주인 Raw264.7세포주에 각 시험 물질을 처치 하고 24시간 반응 후 골 흡수를 증가시키는 염증성 사이토카인 유전자(GM-CSF, iNOS) 발현 수준을 분석한 결과, #1(물 추출물)은 GM-CSF 및 iNOS 유전자 발현 억제 효과를 나타내지 않았으나, 주정 추출물의 경우 유의한 수준의 유전자 발현 억제 효능이 관찰되어 에스트로겐 결핍 시 이를 보완할 수 있는 기능성 대체물질로 개발이 가능한 것으로 평가하였다. (도 7 및 도 8 참조)
따라서, 괴각 물 추출물보다는 주정 추출물이 여성 갱년기 질환 치료제로서 유용한 소재로 확인되었는 바, 괴각 주정 추출물 중심으로 항산화 효능 및 항염증 효능을 평가하였다.
실시예 6 : 주정 농도별 항산화 효능 및 항염증 효능 비교
괴각 주정 추출물의 주정 농도별 효능을 비교하기 위하여(표 7 참조) 항산화 효능 및 항염증 효능을 비교하였다. 실험방법은 실시예 3 및 4의 항산화 효능 및 항염증 효능 검사 방법과 동일한 방법을 사용하였다.
번호(#) 추출용매
1 주정-95%
2 주정-65%
3 주정-25%
실시예 6-1 : 주정 농도별 Hydroxyl radical scavenging assay
도 9에 나타나듯이, 생성된 하이드록시 라디칼에 대한 각 샘플의 단백질 보호 효능 분석 결과, 각 시험물질 10 μg/mL과 반응시켰을 때 #2(65% 주정추출물) 샘플에서 우수한 단백질 보호 효능이 관찰되어 항산화력이 우수한 유용한 소재로 확인되었다. 반면, 25% 주정 추추물의 경우 단백질 보호 효능이 미약하여 항산화력이 우수한 소재로 보기 어려웠다.
실시예 6-2 : 주정 농도별 항염증 효능 평가
각 주정 농도별 괴각 추출물의 염증반응 유도물질인 lipopolysaccharide(LPS)와 각 시험 물질을 함께 대식세포수인 RAW264.7 세포에 처리 후 24시간 내 다양한 파골세포 연관 유전자(interleukin-6 (IL-6), 및 갱년기 심혈관 연관 유전자(nitric oxide synthase) 발현과 일산화 질소의 생성 양을 비교분석하여 시험 물질의 갱년기 증상 개선(심혈관)에 도움을 줄 수 있는지를 관찰하였다. 프라이머에 대한 정보는 표 6에 기재되어 있다.
일산화질소는 Griess reagent(Sigma-Aldrich, USA)를 이용하여 측정하였다. 즉 lipopolysaccharide(LPS)와 각 시험 물질을 함께 대식세포주인 RAW264.7 세포에 처리 24시간 후 세포배양액을 취하여 동량의 Griess reagent와 반응하여 10분 내 540 nm의 파장에서 흡광도를 특정하였다. 일산화질소의 생성량은 표준검량곡선을 통해 비교분석 하였다.
도 10 및 도 11에 나타나듯이, 주정 25% 추출물(#3)의 경우 IL-6 억제 효과가 거의 나타나지 않았으며, 주정 65% 추출물과 비교하엿을 때에도 iNOS 억제 효과가 거의 나타나지 않는 것으로 확인되었다.
반면, 주정 95% 및 65% 추출물인 #1과 #2는 염증성 사이토카인 억제 효과가 주정 25% 추출물과 비교하여 현저히 우수함을 확인할 수 있었다.
또한, 도 12에 나타나듯이, 주정 25% 추출물의 경우 일산화질소 생성량이 다른 추출물과 비교하여 현저히 높아, 항염증 효과가 거의 없는 것으로 확인되었다. 반면, 주정 95% 및 65% 추출물의 경우 염증반응으로 인해 증가된 일산화질소를 현저히 감소시키는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 항산화 효능 및 항염증 효능을 확인한 실험결과를 바탕으로 25% 주정 추출물의 경우 여성 갱년기 질환의 치료제로 사용하기에 적절하지 않은 것으로 판단하였다.
이에, 본 발명자들은 여성 갱년기 질환의 치료 효과를 나타낸 괴각 주정 추출물의 공통된 특징을 구체적으로 분석한 결과, ①제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5의 중량비로 포함하고, ②제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드의 함량이 200mg/g 이상이며, 추가의 특징으로 ③이소플라본 배당체의 함량이 300mg/g 이상인 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 특정 성분비를 가진 괴각 추출물이 여성 갱년기 질환 치료을 가장 효과적을 치료할 수 있다고 판단하였는 바, 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하면서,
제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 여성 갱년기 질환 치료 기능성 소재로 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7: 본 발명 특유 조성 괴각 추출물의 갱년기 동물 모델에 대한 질환 개선/치료 효과 확인
실험방법
상기 실시예 6-2에서 도출한 본 발명 특유 조성의 괴각 주정 추출물(Rex)과 상기 실시예 4-1에서 제조한 괴각 열수 추출 효소분해물(Rex-AG, 실시예 4에서 R-A로 칭한것과 동일한 물질)에 대한 in vivo 활성을 비교 분석하였다.
OVX rat 모델(난소적출 마우스 모델)을 구축하여 효능 연구를 수행하였으며, OVX 후 에스트로겐 고갈을 확인한 후 총 6주간 각각의 시험물질로 제조된 식이 사료를 섭취하도록 하여 아래와 같은 프로토콜로 실험을 진행하였다. 실험의 정확성과 전문적 결과 도출을 위해 식이 및 6주간 관찰은 강릉원주대학교 생명과학대학 동물실에서 수행하였고, 부검, 골세포 채취, 채혈 등 신속하게 진행 후 조직 염색 및 혈액 검사 등은 각 전문업체에 신속히 의뢰하여 데이터의 오류를 최소화하였다.
본 연구에 사용된 동물은 12주령의 female, Sprague-Dawley(SD) rat (220-240 g)을 ㈜코아텍(KOATECH, Gyeonggi, Korea)으로부터 구입하여 시험에 사용하였다. 사육 조건은 온도 21±2℃, 습도 40~60%를 유지하며 명암은 12L/12D로 조성하였고 일주일간의 순화 기간을 둔 후 각 개체의 무작위 배정을 통해 군을 분리하였다. 본 연구는 강릉원주대학교 동물실험윤리위원회로부터 실험계획승인(GWNU-2018-21)을 받은 후 진행하였으며, 군 분리 후 총 1 주간의 추가 적응 기간을 둔 후 난소 절제술(OVX)을 수행하였다.
즉, rat에 마취 유도 후 난소절제군(n=21), 모조수술군(Sham, n=4)의 수술을 시행하였다. 난소절제군은 등 부위를 제모한 후 등 가운데 부위 피부와 양쪽 근육을 절개하여 양쪽 난소를 제거한 후 절개부를 봉합하였고, Sham군은 난소절제술과 같은 방법으로 진행하되 난소 절제는 하지 않은 상태에서 동일한 스트레스에 노출시킨 후 다시 봉합하는 수술을 시행하였으며, 대조군과 특이 변화가 나타나지 않음을 확인 후 분석 대상 군에 포함 또는 미포함 하였다. 수술 후 수술부위 터짐 및 염증 반응 등을 관찰하여 특이 상황을 주시하면서, 성공적으로 수술이 완료된 개체들을 본 실험에 적용하였다. 먹이는 폐경 실험 모델에 최적화된 AIN-76A 펠렛을 사용하여 실험 목적에 따라 시험물질별 사료 펠렛 제작을 전문업체 위탁 제조 후 사용하였다.
실험군은 모조수술군(non-ovariectomized control, Sham), 난소절제군 (Ovariectomized control, OVX), 난소절제 및 양성대조물질 급여군(Ovariectomy + 100μg/kg 17β-estrogen, PC), 난소절제 및 본 발명 급여군(Ovariectomy + 150 mg/kg Rex), 난소절제 및 효소분해물 급여군(Ovariectomy + 150 mg/kg Rex-AG)과 같이 총 5개군으로 나누었다(하기 표 8 참조). 먹이 섭취량에 따른 시료를 섞은 조제 사료를 제조 의뢰(DAEHAN BIOLINK, Chungbuk, KOREA)하여 식이를 제공(Based AIN-76A diet)하고, Sham과 OVX군은 AIN-76A(Harlan teklad, Madison, WI, USA)를 자율급식으로 제공하였다. 체중은 1주 2회 동일한 시간에 측정하였으며, 펠렛 섭취량과 음수량을 주기별로 측정하였다.
No. Group Diet base Dose (mg/kg)
1 Sham AIN-76A -
2 OVX - -
3 Positive control(PC) 0.1
4 본원 발명(Rex) 150
5 괴각 효소분해 추출물(Rex-AG) 150
실험결과
실시예 7-1: 갱년기 혈관 운동 증상(Vasomotor symptom)
혈관 운동 증상은 폐경 여성의 초기에 나타나는 증상으로, 혈관 운동 증상의 대표적인 증상은 안면홍조로서 얼굴, 목, 가슴 부위의 피부가 갑자기 붉게 변하면서 전신의 불쾌한 열감과 발한이 동반되어 나타나는 것을 특징으로 한다. 이는 여러 가지 원인에 의한 것으로 알려져 있으나 에스트로겐 수준의 감소로 인해 혈관의 탄력성이 감소하여 내부 체온 변화에 대한 피부 혈관 반응이 지연되어 나타나는 가설이 그 중 하나이다. 따라서 본 실험에서 혈관 운동 증상을 관찰하기 위해 부검 2일전 매일 직장 온도를 측정하였다. 직장 온도 측정 15분 동안 15 m/min의 속도로 전동식 러닝 머신(MK-680S, Muromachi Kikai, Tokyo, Japan)에서 강제로 달리기를 실시 직후 직장 온도를 10분 간격으로 120분 동안 측정하고 순 변화량을 각 시점의 원래 온도(강제 달리기 전 20분 동안의 평균 온도)를 나눈 값으로 계산하였다. 직장 온도는 편차를 줄이기 위해 전자식 체온계(MT200, Microlife, Taipei, Taiwan)로 측정하였다.
혈관 운동 변화량은 시작 온도를 기점으로 변화량 수치를 나누어 나타냈으며, 이는 갱년기 증상 중 하나로 사람에게서 나타나는 안면 홍조 및 체온 증가에 대비하여 연관성을 제시할 수 있는 결과이다. 도 13에서 보는 바와 같이 인위적으로 체온을 증가시킨 후 OVX군을 대조군으로 하여 회복 시간 및 변화량을 비교하였을 때, 전체적으로 큰 변화 폭 없이 정상적으로 돌아오는 것으로 확인되었으며, Rex군(본 발명 특유 괴각 추출물)이 Rex-AG군에 비해 직장 온도 변화가 현저히 적은 것으로 나타났으며, 이는 양성대조군과 유사한 패턴을 나타내었다. 이를 통해 여성 갱년기 증상 중 하나로서 혈관 운동 증상 중 대표적인 안면홍조에 Rex 군(본 발명)이 더 현저한 효과를 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 7-2: 갱년기 비뇨기계 상피세포 변화(질 각질화 시험)
질 건조증(vaginal dryness)은 가장 대표적인 갱년기 증상 중 하나이다. 따라서 본 실험에서는 각 군의 비뇨기 상피세포의 변화를 관찰하여 실험 물질이 갱년기 증상완화에 도움을 주는 지 여부를 확인하고자 하였다. 즉, 부검 직전에 각 실험군의 질벽을 면봉으로 문질러 질 상피세포를 슬라이드 글라스에 도포하고 염색하여 유핵세포, 각화 상피세포, 각질의 수를 측정한 후 각화 상피세포의 비율을 나타내었다. 질 점막 세포 중의 각화 상피세포의 비율이 높다는 것은 질 각질화 수준이 감소하고 질 점막이 유연한 것으로 간주한다.
하기 도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, 각질화 세포 수 비교를 통해 Rex 군(본 발명 특유 괴각 추출물)이 Rex-AG 군보다 각화 상피세포의 비율이 더 높은 것이 확인되었다. 이를 통해 질 각질화 수준이 감소하고 질 점막이 유연해져 질 건조증에 Rex군(본 발명)이 더 효과적이라 할 수 있다.
실시예 7-3 : 갱년기 혈액 인자 변화 분석
폐경으로 인한 갱년기 증상의 혈중 관련인자로서 간 기능 검사인 ALT, 심혈관질환 평가를 위한 지질 검사인 총 지질(콜레스테롤, HDL, LDL) 농도의 변화 비교 분석이 요구된다. 특히, ALT(Alanine Aminotransferase)는 간 기능 검사로 수치가 높다면 간염이나 지방 간염을 나타내며, 자가면역성 간염, 만성 바이러스성 간염, 혈색소증 등의 의미 부여가 될 수 있으며, 기초대사량이 떨어지는 폐경기의 환경에서 혈액 순환을 방해하는 LDL(low density lipids)이 증가하면 동맥경화와 심 질환의 위험도가 증가한다.
6주간 OVX 수술 후 각 시험군의 혈액학적 마커 분석 결과, 도 16 및 도 17에서 보는 바와 같이, Rex 군(본 발명 특유 괴각 추출물)에서 간염이나 지방 간염을 나타내는 ALT 수치와 혈액 순환을 방해하는 LDL 수치가 Rex-AG군 보다 유의적으로 낮음을 확인하였다. 이는 Rex 군(본 발명)이 폐경기 여성의 간기능 및 심혈관질환에 대하여 더욱 유익한 효과를 나타냄을 보여준다.
실시예 7-4: 갱년기 골질환 관련 골세포 주요 유전자(골 표지자 유전자) 발현 분석
뼈는 척삭동물문에 속하는 동물들의 몸체를 지지하는 단단한 결합조직으로서, 뼈대를 구축해 몸의 구조물을 지지하고 다른 신체 기관들의 손상을 방지하는 역할을 한다. 건강한 뼈는 뼈를 생성하는 조골세포와 뼈를 파괴하는 파골세포의 균형적인 조절이 주요하다. 골다공증은 골강도가 감소하여 뼈가 쉽게 부러지는 질병으로서 조골세포가 감소하고 파골세포의 영향이 증가하여 파괴되는 뼈의 빈도가 높아지게 되면서 나타나는 질병이다. 따라서 뼈에 존재하는 조골세포와 파골세포의 비중을 유전자 발현으로 확인함으로써 뼈의 건강 상태를 확인할 수 있다.
폐경 후 에스트로겐이 결핍되면 골흡수 촉진인자인 IL-6와 TNF-α의 발현이 증가하여 혈중 칼슘 농도가 증가한다. 이에 따라서 골형성 촉진인자인 IGF-1, TGF-β의 발현이 감소하고 골형성이 부족하게 되어 골다공증이 유발된다. 에스트로겐은 파골세포의 세포사멸을 유도하여 결핍되면 파골세포가 증가하게 된다. 이 때 파골세포를 활성화하는 사이토카인은 RANKL로 RANK 수용체에 결합하여 파골세포 형성과 활성을 조절한다.
6주간 시험물질을 투여한 랫드를 ether 흡입마취로 안락사 시킨 후 대퇴골을 적출하여 골수세포를 분리하였다. 적출한 대퇴골은 즉시 멸균된 phosphate bufferd saline(PBS)으로 2회, 70% 에탄올에 1회, 다시 PBS로 2회 세척하였으며, 대퇴골의 정강이 부분을 bone cutter를 이용하여 절단한 후 microcentrifuge tube에 담아 원심분리(5000 × g, 5분)하여 골수세포(rat bone marrow-derived cells, rBMs)를 분리하였다. 분리한 골수세포에 5 mL의 red blood cell lysis buffer(Invitrogen, CA, USA)을 가하여 적혈구를 제거하였으며, 기타 비골수 유래 세포를 제거하기 위해 100 μm nylon mesh를 이용한 세포 여과를 실시하였다.
시험물질에 대한 뼈 관련 세포의 반응을 확인하기 위해 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcriptional polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하였다. 이를 위해 Trizol(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 이용하여 골수세포의 total RNA을 추출하였으며, 2 μg의 total RNA를 대상으로 Oligo dT primer와 TOP scriptTM Reverse Transcriptase(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 사용한 역전사반응을 통해 PCR의 주형으로 사용할 cDNA를 합성하였다. cDNA와 2X DreamTaq PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 표 9에 나타낸 primer로 PCR을 수행하였으며, PCR 산물은 1.0% agarose gel로 전기영동 하여 유전자 발현 정도를 확인하였다. 이후 GelQuant software(MiniBIS Pro, Jerusalem, Israel)을 이용하여 house-keeping gene인 β-actin으로 normalization하여 유전자 발현을 정량 비교하였다. 하기 표 9는 골세포 RT-PCR에 사용한 Primer 목록이다.
Gene Primer Sequence Accession No.
β-actin 5’ primer 5’-CATCAAAGAGAAGCTGTGCT NM_001101.4
3’ primer 5’-GAAGGAAGGCTGGAAAAGAG
RANKL 5’ primer 5’-CAGCATCGCTCTGTTCCTGT NM_011613.3
3’ primer 5’-CCAGAGTCGAGTCCTGCAAA
TGF-β 5’ primer 5’-GGAGACGGAATACAGGGCTT NM_011577.2
3’ primer 5’-GGTCCCAGACAGAAGTTGGC
도 18 및 도 19에서 보는 바와 같이, 골다공증 관련 유전자인 RANKL, 골형성 촉진인자인 TGF-β 유전자의 발현을 살펴본 결과, Rex 군(본 발명 특유 괴각 추출물)은 골다공증 유전자인 RANKL의 발현을 억제하고, 골형성 촉진인자인 TGF-β의 발현을 증가시켜 갱년기 증상 중 하나인 골다공증 증상에 Rex-AG 보다 더 효과적임을 확인하였다.
실시예 7-5: 갱년기 대사질환 관련 지방 조직 및 간 조직의 유전자 발현 분석
폐경 후의 대사적 질환 연구를 통해서 총콜레스테롤과 중성지방의 상승, 고밀도 지단백 콜레스테롤 저하, 내장지방증가, 혈관기능의 저하등과 같은 변화를 초래한다. 폐경으로 인한 호르몬의 변화로 인해 대사적 변화를 초래하고 인슐린 저항성을 증가시켜 대사증후군의 위험인자로 작용한다. 이로 인해 나이의 변화에 따른 남녀의 대사 증후군 유병률을 비교하면, 여성이 폐경상태가 된 55세 이후에는 남성보다 높다. 폐경 후에 체지방 축적으로 인한 체중 증가가 촉진된다. 더 나아가 지방세포에서 염증반응의 표지가 되는 물질의 생산과 분비가 비만환자에서 증가되어 비만을 낮은 단계의 전신성 염증으로 정의한다. 비만과 관련된 염증은 지방내의 대식세포의 숫자를 증가시키고 염증 유발성 사이토카인의 분비를 증가시킨다. 대식세포를 통해 분비된 다양한 염증 유발성 사이토카인은 지방내의 혈관내피세포를 활성화 시키게 되는데, 혈관내피세포의 활성화에 관여하는 염증 유발성 사이토카인으로써는 TNF-α, IL-6등이 있다. Leptin은 지방조직에서 분비되는 167개의 아미노산으로 구성된 호르몬으로 음식 섭취 및 에너지 소비의 조절에 주된 역할을 하는 비만 관련 유전자이다. Leptin 수용체가 시상하부에서 발현되면 음식섭취를 억제시키고, 에너지 소비를 증가시켜 비만 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다.
부검시 채취한 조직 중 일부분을 절취한 후 Trizol(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 이용하여 골수세포의 total RNA을 추출하였으며, 2 μg의 total RNA를 대상으로 Oligo dT primer와 TOP scriptTM Reverse Transcriptase(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 사용한 역전사반응을 통해 PCR의 주형으로 사용할 cDNA를 합성하였음. cDNA와 2X DreamTaq PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 하기 표 10에 나타낸 primer로 PCR을 수행하였으며, PCR 산물은 1.0% agarose gel로 전기영동 하여 유전자 발현 정도를 확인하였다. 하기 표 10은 지방세포 RT-PCR에 사용한 Primer 목록이다.
Gene Primer Sequence Accession No.
β-actin 5’ primer 5’-CATCAAAGAGAAGCTGTGCT NM_001101.4
3’ primer 5’-GAAGGAAGGCTGGAAAAGAG
Leptin 5’ primer 5’-AGCTGCAAGGTGCAAGAAGA NM_008493.3
3’ primer 5’-ACCGACTGCGTGTGTGAAAT
IL-6 5’ primer 5’-CCTTCCTACCCCAACTTCCA NM_012589.2
3’ primer 5’-AGCACACTAGGTTTGCCGAG
TNF-α 5’ primer 5’-GATTATGGCTCAGGGTCCAA NM_013693
3’ primer 5’-GAGACAGAGGCAACCTGACC
도 20, 도 21 및 도 22에서 보는 바와 같이, Rex 군(본 발명 특유 괴각 추출물)은 비만관련 유전자인 Leptin 발현 억제 효과가 더욱 좋았고, 염증발현 표지인자인 IL-6, TNF-α의 유전자 발현을 유의적으로 억제하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 대한 것이다.
본 발명에 따른 제니스테인 배당체의 특정 성분비를 가질 뿐만 아니라 특정 함량 이상을 갖는 괴각 추출물은, 세포 독성이 거의 없어 안전하고, 다른 용매 추출물과 비교하여 항산화 및 항염증 효과가 현저하므로, 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있으므로, 산업상 이용가능성이 높다.
<110> NOVAREX Co., Ltd. <120> Composition for the preventing and treating female menopausal disease comprising the extract of Sophora japonica L. fruits <130> NP18-0057P <150> KR 10-2018-0124707 <151> 2018-10-18 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward primer <400> 1 tgcccctgga agtttctctt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse primer <400> 2 actgccccag tttttgatcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta forward primer <400> 3 gtgtctttcc cgtggacctt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta reverse primer <400> 4 atgggaacgt cacacaccag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward primer <400> 5 tccatccagt tgccttcttg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse primer <400> 6 ccacgatttc ccagagaaca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-CSF forward primer <400> 7 acatgacagc cagctactac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-CSF reverse primer <400> 8 cttcctcatt tttggcctgg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 9 tacagcttca ccaccacagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 10 aaggaaggct ggaaaagagc 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta forward primer <400> 11 cgccctgttc gctctgggta t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta reverse primer <400> 12 aggaggtccg catgctcaca g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer(table 9, table 10) <400> 13 catcaaagag aagctgtgct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer(table 9, table 10) <400> 14 gaaggaaggc tggaaaagag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RANKL forward primer(table 9) <400> 15 cagcatcgct ctgttcctgt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RANKL reverse primer(table 9) <400> 16 ccagagtcga gtcctgcaaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta forward primer(table 9) <400> 17 ggagacggaa tacagggctt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta reverse primer(table 9) <400> 18 ggtcccagac agaagttggc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leptin forward primer(table 10) <400> 19 agctgcaagg tgcaagaaga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leptin reverse primer(table 10) <400> 20 accgactgcg tgtgtgaaat 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward primer(table 10) <400> 21 ccttcctacc ccaacttcca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse primer(table 10) <400> 22 agcacactag gtttgccgag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer(table 10) <400> 23 gattatggct cagggtccaa 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse primer(table 10) <400> 24 gagacagagg caacctgacc 20

Claims (10)

  1. 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며,
    제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 괴각 추출물은 물, 주정 및 탄소수 1 내지 4의 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것을 용매로 하여 제조된 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 괴각 추출물은 주정 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 주정은 40%(v/v) 이상의 농도의 주정인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 여성 갱년기 질환은 안면홍조, 발한, 피부건조, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며,
    제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 여성 갱년기 질환은 안면홍조, 발한, 피부건조, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  8. 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며,
    제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물.
  9. 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며,
    제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 식품 조성물.
  10. 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 200mg/g 이상 함유하며,
    제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 1 : 2.5~3.5 : 3.5~4.5 의 중량비로 포함하는 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물.
KR1020190066987A 2018-10-18 2019-06-05 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 및 치료용 조성물 KR102127712B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180124707 2018-10-18
KR20180124707 2018-10-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200043886A true KR20200043886A (ko) 2020-04-28
KR102127712B1 KR102127712B1 (ko) 2020-06-29

Family

ID=70455948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190066987A KR102127712B1 (ko) 2018-10-18 2019-06-05 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 및 치료용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102127712B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102408605B1 (ko) * 2021-06-29 2022-06-14 (주) 노바렉스 회화나무, 및 갈근 또는 콩발아배아의 복합추출물을 포함하는 여성 갱년기 질환 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102348874B1 (ko) 2021-03-15 2022-01-11 주식회사 자생바이오 에스트로겐 및 프로게스테론 활성을 갖는 황정 추출물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 조성물
KR102497345B1 (ko) 2022-10-20 2023-02-06 재단법인 자생의료재단 황정 및 연자육 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020044745A (ko) * 2000-12-06 2002-06-19 신민규 골다공증 예방 및 치료에 효과를 갖는 괴화 추출물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020044745A (ko) * 2000-12-06 2002-06-19 신민규 골다공증 예방 및 치료에 효과를 갖는 괴화 추출물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
비특허문헌 1 (식품산업과 영양, 2013)* *
비특허문헌 3 (Arch. Pharm. Res., 2005) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102408605B1 (ko) * 2021-06-29 2022-06-14 (주) 노바렉스 회화나무, 및 갈근 또는 콩발아배아의 복합추출물을 포함하는 여성 갱년기 질환 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR102127712B1 (ko) 2020-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102127712B1 (ko) 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환의 예방 및 치료용 조성물
JP5334448B2 (ja) グルタチオン産生促進剤およびグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤
JP4684556B2 (ja) Ｓｄｇの製法およびその配合飲食物
KR102049440B1 (ko) 호장근과 계심을 함유하는 여성갱년기 증상 예방 및 개선용 조성물
KR100703180B1 (ko) 혼합 생약제 추출물을 포함하는 골다공증 질환의 예방 및치료를 위한 약학조성물
JP2009269889A (ja) グルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤及び飲食品
KR20200102348A (ko) 지골피 추출물을 유효성분으로 함유하는 근 위축 예방 또는 치료용 조성물
KR100510426B1 (ko) 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 대사성 질환의예방 및 개선용 식품 조성물
KR100509682B1 (ko) 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물
JP2007186483A (ja) 更年期症状を軽減する食品
KR20150037208A (ko) 여성 폐경기 증후군 치료용 조성물
JP2002363086A (ja) 骨代謝改善剤及び骨粗鬆症の予防又は治療用飲食物
KR101687271B1 (ko) 손바닥 선인장 추출물 및 부채마 추출물을 포함하는 갱년기 장애 예방 또는 치료용 조성물
KR100832520B1 (ko) 매생이 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용조성물
US20050123633A1 (en) Biological activity-promoting compositions containing soybean germ-origin isoflavone aglycon
KR101693573B1 (ko) 갱년기 증상의 예방 또는 치료 효과가 있는 약제학적 조성물 및 그 제조방법
EP3159003A2 (en) Composition for enhancing bone growth, preventing bone resorption disorders and for joint health
KR102302734B1 (ko) 호장근 및 계심 추출물을 포함하는 골 손실 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR20170140592A (ko) 하니베리 추출물을 유효성분으로 포함하는 여성 폐경기 증후군 치료 또는 예방용 조성물
KR102025470B1 (ko) 한약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 여성 폐경기 증후군 치료 또는 예방용 조성물
KR101966879B1 (ko) 백합 추출물 및 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는 여성 폐경기 증후군 치료 또는 예방용 조성물
KR20090042839A (ko) 아카시아속 나무 껍질 유래물을 함유하는 소양의 예방 및/또는 치료용 조성물
KR100380864B1 (ko) 골다공증 예방 및 치료에 효과를 갖는 고삼 추출물
JP2023032210A (ja) 関節滑膜の抗炎症剤
JP2023129314A (ja) コレステロール吸収阻害剤

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant