KR101702775B1

KR101702775B1 - 가야보리수 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101702775B1
Application number: KR1020150141580A
Authority: KR
Inventors: 노태길; 이연대; 이석훈; 김민주; 임종순
Original assignee: 보사모영농조합법인
Priority date: 2015-10-08
Filing date: 2015-10-08
Publication date: 2017-02-06

Abstract

본 발명은 가야보리수 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 가야보리수 추출물 또는 가야보리수 열매 발효물은 정상세포에 세포독성을 나타내지 않으면서 암 세포 성장을 효과적으로 억제하였으며 특히, 가야보리수 열매 발효물은 면역세포의 활성을 증진시키는 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 가야보리수 추출물 또는 가야보리수 열매 발효물을 암 예방 또는 치료용 조성물 또는 면역증진용 조성물로 사용할 수 있다.

Description

가야보리수 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cancer comprising gayaborisoo}

본 발명은 가야보리수 추출물 또는 가야보리수 열매 발효액을 유효성분으로 함유하여 암 예방하거나 치료하기 위한 조성물 또는 면역증진제로 사용하는 기술이다.

암 발생률은 산업의 급격한 발달, 지구 생태계 및 식생활의 변화 등으로 과거에 비해 급격히 증가하고 있으나, 아직도 암의 발생기전이 불명확하여 난치성 질병으로 알려져 있다. 현재 사용되고 있는 항암제들은 효소 제제나 백신 등의 생물학적 제제, 순수 합성 의약품, 및 천연물 유래의 의약품 등으로 크게 구분할 수 있는데, 항암제는 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고, 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에 암 치료시 문제가 되고 있다. 또한, 항암제는 암세포의 성장을 효과적으로 억제하기도 하지만, 때로는 정상 세포에 대해서 독성을 나타내기도 한다. 따라서, 많은 학자들은 보다 효과적이면서 정상세포에 대한 독성을 최대화할 수 있는 항암제의 개발을 위해 노력해 오고 있다.

지금까지 보리수에 관한 연구로는 뜰보리수 잎의 유용성분(Yoon et al., 2007), 성숙에 따른 뜰보리수 과실의 성분 변화(Hong et al., 2006a), 뜰보리수 열매 추출물의 항산화 효과(Hong et al., 2006b), 성숙에 따른 뜰보리수 과실 에탄올 추출물의 항산화 효과(Hong et al., 2006c), 뜰보리수 열매의 용매 분획별 항산화 및 암세포 증식 억제 효과(Kim et al., 2007) 등에 대하여 보고되어 있다.

그러나 본 발명의 가야보리수는 뜰보리수와 다르게 열매가 포도송이처럼 열리는 핑크팝 보리수종의 과수로서 현재 대한민국 경상남도 합천군 일대에서 재배되고 있지만 아직 미개발 자원으로 그 효용 가치를 제대로 평가한 연구 결과가 없었다.

한국공개특허 제10-2011-0048236호(2011.05.11)

본 발명은 가야보리수 추출물 또는 가야보리수 열매 발효액을 유효성분으로 함유하는 조성물을 암 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 기능성 건강식품으로 제공하고자 한다.

또한, 가야보리수 열매 발효액을 면역증진용 조성물로 제공하고자 한다.

본 발명은 가야보리수 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 건강식품을 제공한다.

본 발명은 가야보리수 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 가야보리수 열매 발효액을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 건강식품을 제공한다.

본 발명에 따르면, 가야보리수 추출물 또는 가야보리수 열매 발효물은 정상세포에 세포독성을 나타내지 않으면서 암 세포 성장을 효과적으로 억제하였으며 특히, 가야보리수 열매 발효물은 면역세포의 활성을 증진시키는 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 가야보리수 추출물 또는 가야보리수 열매 발효물을 암 예방 또는 치료용 조성물 또는 면역증진용 조성물로 사용할 수 있다.

도 1은 1, 10, 100, 250 및 500 μg/ml 농도의 가야보리수 추출물이 처리된 간암세포의 세포생존율을 확인한 결과이다.
도 2는 1, 10, 100, 250 및 500 μg/ml 농도의 가야보리수 추출물이 처리된 정상 간세포의 세포생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 0.1, 1, 10, 100 및 1000 μg/ml 농도의 가야보리수 추출물이 처리된 간암세포에서 분비된 LDH의 함량을 확인한 결과이다.
도 4는 1, 10, 100, 250 및 500 μg/ml 농도의 가야보리수 복합추출물이 처리된 간암세포의 세포생존율을 확인한 결과이다.
도 5는 1, 10, 100, 250 및 500 μg/ml 농도의 가야보리수 복합추출물이 처리된 정상 간세포의 세포생존율을 확인한 결과이다.
도 6은 30, 40, 60, 80 및 100배로 희석된 가야보리수 열매 발효액이 처리된 대식세포(Raw 264.7)의 세포 생존율 및 NO 생성 정도를 확인한 결과이다.
도 7은 30, 40, 60, 80 및 100배로 희석된 가야보리수 열매 발효액이 처리된 대식세포(Raw 264.7)의 TNF-α 생성 정도를 확인한 결과이다.
도 8은 10, 20, 40 및 80배로 희석된 가야보리수 열매 발효액이 처리된 간암세포의 세포생존율을 확인한 결과이다.

본 발명자들은 항암 활성이 뛰어난 천연 식물 추출물을 연구하던 중, 가야보리수에서 추출된 추출물이 암세포의 성장을 억제하고 면역세포의 활성을 증가시키는 것을 확인하여 암 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 가야보리수 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 가야보리수 추출물은 가야보리수의 잎, 줄기 또는 열매로부터 추출될 수 있다.

상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출될 수 있으며, 보다 상세하게는 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

추출 방법은 상기 용매를 사용하여 냉침, 온침, 가열 등 통상의 추출방법으로 가능하며, 이때, 증류수 추출은 고온에서 열탕추출과정을 거치는 것이 바람직하며 알코올 및 에틸 아세테이트 추출은 상온에서 추출작업을 거치는 것이 바람직하며, 추출액을 진공회전증발기를 이용하여 감압농축하고 동결건조하여 분말상태의 식물 추출물을 제조할 수 있다.

상기 암은 폐암, 간암, 위암, 대장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 흑색종 및 혈액암으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 간암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 가야보리수 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 건강식품을 제공할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 도 1 및 도 2와 같이 가야보리수의 열매 추출물은 250 및 500 μg/ml에서 각각 10 및 40% 정도의 간암세포 성장 억제효과를 나타내었으며, 잎 추출물은 약 85, 92%의 억제 효과를, 줄기 추출물은 75, 75%의 억제율을 나타낸 반면, 정상세포의 손상이 현저하게 낮은 것을 확인하였다.

상기 결과로부터 가야보리수 추출물은 암세포의 성장을 특이적으로 억제하는 효과가 있음이 확인되었다.

본 발명은 가야보리수 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 복합추출물은 가야보리수 잎 추출물 및 열매 추출물을 1:1의 비율로 혼합될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 상세하세는 상기 잎 추출물 및 열매 추출물은 물, C1 내지 C4의 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출될 수 있으며, 보다 바람직하게는 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 암은 폐암, 간암, 위암, 대장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 흑색종 및 혈액암으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 간암일 수 있으나, 이에 한정되는 것을 아니다.

상기 가야보리수 복합추출물은 암 예방 또는 개선용 건강식품으로 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 잎과 열매 추출물을 1:1로 혼합한 복합물을 1, 10, 100, 250 및 500 μg/ml 농도로 간암 세포에 처리하여 세포독성을 확인한 결과, 도 4와 같이 열매 추출물을 단독으로 처리한 경우보다 복합추출물에서 간암세포의 생존이 효율적으로 억제된 반면, 도 5와 같이 정상 간 세포에는 영향을 미치지 않는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 가야보리수 잎 및 열매 복합추출물은 암세포의 성장을 특이적으로 억제하는 효과가 있음이 확인되었다.

본 발명은 가야보리수 열매 발효액을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 열매 발효액은 가야보리수 열매 및 설탕을 1:1 비율(w/w)로 15 내지 25℃에서 6 내지 10개월 동안 발효하여 제조될 수 있다.

상기 가야보리수 열매 발효액은 암 예방 또는 개선용 건강식품으로 제공될 수 있다.

또한, 본 발명은 가야보리수 열매 발효액을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 면역증진용 조성물은 약학조성물 및 건강식품으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 도 8과 같이 가야보리수 추출물과 동일하게 가야보리수 열매 발효액이 처리된 간암세포에서도 농도의존적으로 암세포의 성장이 억제되는 것이 확인되었다.

또한, 가야보리수 열매 발효액이 면역세포를 활성화시킬 수 있는지 확인하기 위해, 면역세포의 하나인 대식세포의 활성에 따른 산화질소 및 사이토카인 생성능을 확인한 결과, 도 6과 같이 가야보리수 열매 발효액은 세포 생존율에 영향을 나타내지 않은 반면, 발효액의 농도가 증가할수록 산화질소의 생성량이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 도 7과 같이 세포 활성화에 따른 사이토카인(TNF-α) 분비량이 30배 희석액까지 농도의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들로부터 가야보리수 열매 발효액이 암세포의 성장을 억제하고 면역세포를 활성화시켜 면역을 증진시키는 효과가 있음이 확인되었다.

본 발명의 약학조성물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여, 가야보리수 추출물을 0.01 내지 90 중량부로 포함할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 가야보리수 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 가야보리수 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 가야보리수 추출물의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 가야보리수 추출물은 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 건강식품은 상기 가야보리수 추출물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 가야보리수 추출물 제조

1. 가야보리수 열매, 줄기 및 잎의 주정 추출물 제조

경남 합천 지역의 가야보리수 열매, 줄기 및 잎에 20배에 해당하는 70% 주정을 넣고 상온에서 24시간씩 3회 반복 추출하였다. 추출 후 여과지로 여과 후 진공회전농축기(rotary evaporator)를 이용하여 55℃에서 농축 후 동결 건조하였다.

2. 수분함량 및 추출수율

냉동열매, 잎 및 줄기를 분쇄 후 에탄올로 3회 반복 추출하여 동결건조 후에 측정된 추출 수율은 표 1과 같이 각각 44.6, 7.1 및 2.9 %로 확인되었다.

시료	수분함량( % )	추출수율( % )
잎	71.46	7.12
줄기	40.22	2.92
냉동 열매	80.80	44.58

< 실시예 2> 가야보리수 열매 발효액 제조

가야보리수 천연 발효액은 세척한 항아리에 보리수 열매(경남 합천, 보사모영농조합법인) 및 설탕을 1:1 비율(w/w)로 넣고 8개월간 상온에서 보리수발효액으로 제조한 후, 60 메시(mesh) 채로 여과하여 냉장 보관하여 사용하였다.

< 실시예 3> 가야보리수 추출물의 항산화 활성 확인

1. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 응용하여 확인하였다. 70% 에탄올 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 mL에 2배로 희석한 Folin 시약 2 mL을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치하여 2 mL의 10% Na₂CO₃를 서서히 가하였다. 이 혼합액을 1시간 동안 방치한 후 UV/visible spectrophotometer를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 폴리페놀 함량은 탄닌산(tannic acid)을 정량하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 표준곡선은 탄닌산의 최종농도가 5, 10, 25, 75, 100 μg/mL이 되도록 하여 위와 같은 방법으로 700 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 등의 방법을 이용하여 확인하였다. 각 시료 100 μL를 80% 에탄올 900 μL에 희석한 후 100 μL를 취하여 10% 질산알루미늄(aluminum nitrate) 20 μL와 1 μM 아세트산칼륨(potassium acetate) 20 μL, 80% 에탄올 860 μL를 혼합하여 실온에서 40분간 방치한 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 함량은 퀘세틴(quercetin)을 정량하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.

그 결과, 표 2와 같이 가야보리수 각 부위의 총 폴리페놀 함량에는 큰 차이가 없었으나, 줄기에서 829 mg/g으로 가장 높게 나타났으며, 플라보노이드는 잎, 줄기, 열매의 순으로 각각 23, 15, 2.6 mg/g으로 나타났다.

이전에 보고된 바에 따르면, 에탄올로 추출한 Oregano, Sage, Pepper의 폴리페놀 함량이 각각 32.1, 31.4, 16.7μg/mg 이었으며(Cha 등, 2006), 홍화씨, 순 및 꽃의 폴리페놀 함량이 각각 22.6, 7.5, 37.9 μg/mg이라고 보고되었다(Kim 등, 1998). 또한, 강한 항산화능이 알려진 생강의 경우, 헥산 분획에서 229 mg/g을 함유하는 것으로 보고되었다(Lee 등, 2011).

따라서 상기 결과와 비교했을 때 본 발명에 사용된 가야보리수의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 매우 높음 수준임을 확인할 수 있다.

시료	플라보노이드 함량(mg/g)	폴리페놀 함량(mg/g)
잎	28.84±0.35	803.22±10.00
줄기	15.05±0.21	829.62±18.61
냉동 열매	2.64±0.20	761.18±68.29

2. DPPH 라디칼 소거활성 확인

시료의 유리 라디칼(free radical) 소거활성은 stable radical인 2,20-diphenylpicrylhydrazyl(DPPH)에 대한 환원력을 측정한 것으로 99% 메탄올에 각 시료를 녹여 농도별로 희석한 희석액 800 μL와 메탄올에 녹인 0.15 mM DPPH 용액 200 μL를 가하여 30분 방치한 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 유리 라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 IC₅₀값으로 나타내었다. 이때 활성비교를 위하여 BHA를 사용하였다.

그 결과, 표 3과 같이 폴리페놀 함량이 가장 많은 줄기에서 가장 낮은 IC₅₀ 값을 나타내었으며, 이에 따라 줄기 추출물이 50%의 라디컬을 소거하는데 필요한 시료 농도가 낮음을 확인하였다.

상기 결과로부터 줄기, 잎, 열매의 순으로 라디컬을 소거하는 항산화 효과가 높게 나타났다.

시료	소거능 (IC ₅₀ ) ( μg /ml)
잎	93.53±7.11
줄기	54.04±1.84
냉동 열매	539.62±33.29

< 실시예 4> 가야보리수 추출물 및 열매 발효액의 유리 아미노산 확인

가야보리수 추출물 및 열매 발효액 시료를 100mg/ml DMSO로 제조하고 PITC(phenylisothiocyanate)로 유도체화 한 후, 유도체화된 용액을 MeOH: H₂O: TEA: PITC = 7: 1: 1: 1로 섞어 20 μL를 제조하여 상온에서 30분간 반응시킨 후 사용하였다. 시료를 완전히 건조시킨 후 200 ㎕의 A 용액으로 녹여준 뒤 0.45 μm 필터로 여과하여 분석에 이용하였으며 HPLC(Hewlett Packard 1100 Series)의 조건으로는 다음과 같다.

·Column : Waters Nova-Pak C18 4 μm (3.9×300mm).

·Column oven temp. : 46℃

·HPLC pump : HP 1100 Series, Binary Pump

·HPLC injector : HP 1100 Series, Autosampler

·Variable Wavelength Detector : HP 1100 Series, 254 nm.

·Solvent : A) 140 mM NaHAc, 0.1% TEA, 6% CH₃CN, pH 6.1

B) 60% CH₃CN

Time	% B	Flow(ml/min)
0	0	1
12	8	1
13	12	1
15.2	20	1
22.5	46	1
22.72	100	1.5
23.2	100	1.5
25	100	1.5
25.7	100	1.5
26	0	1.5
29	0	1.5
30	0	1

·Elution : Linear gradient of solvent B (0-100%)

·Run time : 30 min.

·Equil. time : 10 min.

·Injection vol. : standard 10 ㎕

sample 10 ㎕

그 결과, 표 5와 같이 가야보리수 잎에서는 아스파라긴(asparagine; 간기능 개선, 숙취해소 기능), GABA(면역증진, 긴장완화, 항우울, 뇌기능개선, 항당뇨, 혈압강하 등), 콜라겐 구성성분인 알라닌(alanine)과 프롤린(proline)이 주요 아미노산으로 확인되었으며, 열매에서는 프롤린과 라이신(lysine; 면역력 증강), GABA가 주요 아미노산으로 확인되었으며, 또한, 가지 포함 줄기에서는 GABA와 프롤린이 주요 구성 아미노산으로 나타났다.

또한, 표 6와 같이 열매 발효액에서는 열매 추출물과 동일하게 프롤린의 함량이 가장 높게 나타났다.

가야보리수 열매, 잎, 줄기 추출물의 유리 아미노산 함량

아미노산	잎(mg/100g)	줄기(mg/100g)	냉동 열매(mg/100g)
Cys	24.04	17.01	0.00
ASP	22.82	0.00	0.00
GLU	156.67	0.00	0.00
ASN	1907.57	160.05	6.11
SER	324.35	35.75	2.92
GLN	87.70	65.49	16.19
GLY	26.26	2.06	0.00
HIS	9.89	3.91	4.77
ARG	0.00	0.00	0.00
THR	92.17	7.29	0.00
ALA	736.43	132.76	11.43
GABA	809.40	300.17	20.22
PRO	609.46	296.55	233.48
TYR	188.05	7.99	10.75
VAL	379.90	40.70	3.67
MET	0.00	7.25	0.00
Cys2	0.00	0.00	0.00
ILE	206.31	22.15	2.56
LEU	186.58	26.60	6.57
PHE	154.54	12.24	16.78
TRP	174.40	19.07	0.00
LYS	82.60	54.65	43.42
총	6179.12	1211.69	378.88

보리수 열매 발효액의 유리 아미노산 함량

AA	발효액 추출물 ( μg /mL)
Cys	0.00
ASP	818.21
GLU	256.19
ASN	10.55
SER	212.02
GLN	227.76
GLY	106.81
HIS	0.00
ARG	43.55
THR	116.78
ALA	317.34
GABA	1036.59
PRO	2961.61
TYR	250.07
VAL	167.97
MET	0.00
Cys2	0.00
ILE	118.52
LEU	130.70
PHE	161.77
TRP	198.78
LYS	196.04
총	7331.25

< 실시예 5> 가야보리수 추출물 및 열매 발효액의 주요 성분 확인

가야보리수 각 부위의 주요성분을 분석하기 위하여 문헌에 알려진 물질을 후보 성분으로 하여 LC-MS/MS 방법으로 정량분석하였다. 후보 활성성분으로는 갈산(gallic acid), 카테킨(catechin), 미리세틴(myricetin), 퀘세틴(quercetin), 캠페롤(kaempferol)을 선정하였다. 또한, 정확한 함량 측정을 위하여 각 시료를 에틸아세테이트 및 부탄올층으로 분획하여 분석을 진행하였다. 보리수 열매와 잎의 성분과 관련하여 보고된 바에 따르면, 갈산와 캠페롤이 주요 성분으로 알려져 있으므로 이를 부위별로 정량분석, 비교하기 위하여 LC-MS/MS 방법으로 5종의 페놀 화합물을 측정하였다.

- 분석 조건

·instrument: Agilent Technologies 6410 Triple Quad (LC-MS/MS)

·column: C18 (2.1 mm ×150 mm, 2.7 ㎛)

·solvent: A; 0.1% Formic acid in Water, B; 0.1% Formic acid in Acetonitrile

·flow rate: 0.2 mL/min

·injection vol.: 1 μL

·gradient

	time(min)	B%
1	0	5
2	5	10
3	10	30
4	15	60
5	20	100
6	25	100
7	27	5
8	30	5

·MS condition:

Ionization Mode	negative scan mode
Gas temp.	350 ℃
Capillary volt.	4000 V
Nebulizer	40 psig
Fragmentor	190 V

그 결과, 표 9와 같이 열매의 경우, 미리세틴과 캠페롤이 미량 검출되었으며 다른 후보 성분들은 검출되지 않았다. 잎 추출물에는 갈산과 캠페롤이 각각 약 99, 82mg/100g 존재하였으며, 가지 및 줄기 추출물에서는 카테킨이 1.58g/100g으로 상당히 높은 함량을 나타내었으며, 모든 시료에서 클로로겐산(chlorogenic acid)은 검출되지 않았다.

또한, 색소성분이 열매추출물 및 열매 발효액의 주요 성분인 것으로 확인되었으며, 특히, 라이코펜(lycopene)이 토마토보다 많이 함유된 것으로 제안될 수 있다.

	gallic acid	(+)-catechin	myricetin	kaempferol
냉동 열매	N.D.	N.D.	<LOQ	<LOQ
잎	98.95	N.D.	<LOQ	81.85
줄기	9.00	1575.99	N.D.	43.99

< 실시예 6> 가야보리수 추출물의 간암세포 생장 억제 효과 확인

1. 세포주

HepG2 세포주는 한국세포주은행에서 분양을 받아 사용하였다. 배양은 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 항생제(penicillin/streptomycin)를 첨가한 DMEM(Dulbecco’Modified Eagle’Medium) 배지를 사용하여 37℃, CO₂ 5% 조건에서 배양하여 사용하였다.

2. 세포독성 확인

MTT assay를 수행하여 세포 생존율을 측정함으로써 세포독성을 확인하였다. MTT 시약은 세포내로 흡수된 후, 미토콘드리아 내 효소인 succinate- dehydeogenase에 의해 포르마잔(formazan)으로 변하여 세포의 성장을 멈추게 하며, 세포가 죽을수록 포르마잔의 생성이 줄어들게 되는 것을 이용한 것이다. 배양된 간암 세포주를 96 well plate에 5×10⁴ cells/well이 되도록 분주하고 5% CO₂ 배양기에서 16-24시간 동안 사전배양한 후 시료를 1, 10, 100, 250 및 500 μg/ml 농도로 처리하고 24시간 배양한 세포에 PBS에 녹인 MTT(5 mg/mL) 용액 10 mL를 각 well에 넣고 인큐베이터에서 4시간 동안 반응시켰다.

배양 종료 후 상등액을 제거하고, 각 well에 100 mL의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 생성된 포르마잔 결정체를 용해시키고 550nm 파장에서 ELISA reader(SPECTRA max 340PC, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 흡광도를 측정하였다. 측정한 포르마잔 생성 정도는 정상적인 세포의 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2와 같이 열매 추출물은 250 및 500 μg/ml에서 각각 10 및 40% 정도의 암세포 성장 억제효과를 나타내었으며, 잎 추출물의 경우는 약 85, 92%의 억제 효과를, 줄기는 75, 75%의 억제율을 나타내었다. 또한, 암세포를 특이적으로 공격하는지를 확인한 결과, 잎과 줄기 추출물에서 약간의 세포 손상을 나타냈으나 암세포와 비교하면 정상세포의 손상이 현저하게 낮은 것을 확인하였다.

또한, 세포 손상에 의해서 세포외로 유출되는 효소인 LDH(lactate dehydrogenase) 양을 확인하기 위해, 각 시료를 0.1, 1, 10, 100 및 1000 μg/ml 처리하고 LDH 양을 확인하였다. 그 결과, 도 3과 같이 가야보리수 추출물 시료의 농도의존적으로 LDH 분비량이 증가하였으며, 특히, 줄기와 잎 추출물에서 낮은 농도에서도 민감하게 검출되어 간암세포의 생장 억제효과가 우수한 것을 확인하였다.

< 실시예 7> 가야보리수 추출물 복합조성물의 활성 확인

잎과 열매 추출물을 1:1로 혼합한 복합물을 1, 10, 100, 250 및 500 μg/ml 농도로 간암 세포에 처리하여 세포독성을 확인하였다. 그 결과, 도 4와 같이 열매 추출물을 단독으로 처리한 경우보다 복합추출물에서 간암세포의 생존이 효율적으로 억제된 반면, 도 5와 같이 정상 간 세포에는 영향을 나타내지 않았다.

< 실시예 8> 가야보리수 열매 발효액의 활성 확인

1. 면역세포 활성화

1-1. RAW264 .7 대식세포 배양

마우스 유래 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양을 받았으며 세포배양을 위해 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 항생제(penicillin)를 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 5% CO₂가 존재하는 37℃ 인큐베이터에서 1주일에 2~3회 계대배양을 실시하였다.

1-2. 세포독성 및 산화질소(Nitric oxide; NO) 생산량 확인

보리수 발효액의 면역세포 활성능을 확인하기 위해, 면역세포의 하나인 대식세포의 활성에 따른 산화질소 및 사이토카인 생성능을 확인하였다.

먼저, 세포독성을 확인하기 위해 상기 실시예 6과 같은 방법으로 MTT assay를 수행한 후, 하기식을 이용하여 세포 생존율을 확인하였다.

Cell viability (%) =(시료 처리군의 흡광도)/(대조군의 흡광도)

또한, NO 생산량은 배양액 내의 아질산염(Nitrite) 농도를 Griess Reagent System의 방법으로 확인하였다. RAW 264.7 세포를 1×10⁵ Cells/mL의 농도로 96 well plate에 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터를 이용하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 시료를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하고 배양 상등액 100 μL를 새로운 96 well palte에 옮기고 여기에 동량의 Griess 시약 (1% Sulfanilamide, 0.1% naphthylethylendiamine in 2.5% phosphoric acid)을 첨가하여 10분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm의 흡광도로 측정하였다. 아질산염의 농도(μM)는 아질산나트륨(NaNO₂)를 사용하여 얻은 표준 직선과 비교하여 산출하였다.

그 결과, 도 6과 같이 가야보리수 열매 발효액은 세포 생존율에 영향을 나타내지 않았으며, 발효액의 농도가 증가할수록(발효 원액의 30배까지 희석) 산화질소의 생성량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

1-3. TNF -α 생성량 측정

면역 세포 활성화에 따른 사이토카인(TNF-α) 분비량 변화를 확인하기 위해, 세포 배양액 내의 사이토카인 양을 ELISA(Enzyme-Liked Immunosorbent Assay)로 확인하였다. 각 시료의 추출물 또는 LPS를 처리한 배양액을 이용하여 TNF-α 측정에 사용하였다. 배양액을 적절한 농도로 희석한 후, 사이토카인으로 코딩된 96 well plate에 50 μL씩 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척한 다음, 100 μL의 스트렙타비딘-HRP 용액을 처리하고 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 다시 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 그 후 TMB[di(2-ethylhexyl)-2,4,5-trimethoxybenzalmalonate] substrate를 100 μL 씩 첨가하여 5-30분간 반응시키고 100 μL의 정지 용액을 처리한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 7과 같이 세포 활성화에 따른 사이토카인(TNF-α) 분비량이 대조구로 사용된 LPS 처리군보다 약하지만 30배 희석액까지 농도의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들로부터 가야보리수 열매 발효액이 면역증진 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

2. 암세포 생장억제 효과 확인

가야보리수 추출물이 간암세포의 성장을 억제하는 효과를 앞선 실험에서 확인한 바와 같이, 가야보리수 열매 발효액도 암세포 성장을 억제할 수 있는지 확인하였다.

상기 실시예 6에서 수행한 간암세포 생장 억제 확인방법으로 열매 발효액을 간암세포에 처리하여 생장 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 8과 같이 가야보리수 추출물과 동일하게 가야보리수 열매 발효액이 처리된 간암세포에서도 농도의존적으로 암세포의 성장이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

가야보리수 잎 또는 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 조성물.
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가야보리수 잎 또는 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 간암 예방 또는 개선용 건강식품.
삭제
삭제
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가야보리수 열매 및 설탕을 1:1 비율(w/w)로 15 내지 25℃에서 6 내지 10개월 동안 발효시킨 가야보리수 열매 발효액을 유효성분으로 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학조성물.
삭제
가야보리수 열매 및 설탕을 1:1 비율(w/w)로 15 내지 25℃에서 6 내지 10개월 동안 발효시킨 가야보리수 열매 발효액을 유효성분으로 함유하는 간암 예방 또는 개선용 건강식품.
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