KR101914866B1 - 가야보리수(Elaeagnus umbellata) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 콜라게네이즈 또는 MMP-1 발현 억제용 시약 조성물 및 이의 억제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가야보리수(Elaeagnus umbellata) 잎의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 콜라게네이즈(collagenase) 또는 금속단백분해효소-1(MMP-1)의 발현을 억제하는 시약 조성물 및 콜라게네이즈 또는 금속단백분해효소-1의 발현을 억제하는 방법에 관한 것으로, 상기 가야보리수 잎의 에탄올 추출물 또는 열수 추출물은 콜라게네이즈의 활성 및 UVB에 의해 발현이 증가한 금속단백분해효소-1를 효과적으로 억제할 수 있다.

Description

가야보리수(Elaeagnus umbellata) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 콜라게네이즈 또는 MMP-1 발현 억제용 시약 조성물 및 이의 억제 방법{Reagent Composition for Inhibiting Expression of Collagenase or MMP-1, and Method for Inhibiting Expression of Collagenase or MMP-1}

본 발명은 가야보리수(Elaeagnus umbellata) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 콜라게네이즈 또는 MMP-1 발현 억제용 시약 조성물, 또는 콜라게네이즈 또는 MMP-1 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다.

보리수나무(Elaeagnus umbellata Thunb. Autumn olive)는 보리수나무과(Elaeagnaceae) 보리수나무속(Elaeagnus)에 속하는 낙엽활엽 관목으로서 국내에서는 합천군 가야면에 널리 분포하고 있으며 민간에서 보리똥나무, 뻘똥, 핑크팝보리수로 알려져 있다. 이는 거제, 고성 등의 지역에서 재배되어 6~7월 수확되는 뜰보리수(Elaeagnus multiflora Thunb.) 및 7~8월에 화천, 춘천 등의 지역에서 재배되며 주황색 원형모양의 둥근 열매를 갖는 갈매보리수나무(일명 비타민나무, Hippophae rhamnoides L.)와는 달리 10~11월에 열매가 포도송이처럼 열려 붉은색으로 익는다. 열매는 길이 1cm의 구형으로 다소 떫은맛과 단맛을 가지며, 잎은 어긋나고 타원형으로 윗부분은 짙은 녹색을 띤다. 보리수나무의 열매, 잎과 뿌리를 중국에서 우내자(牛子)라고 하며, 이질, 지혈, 지사제로 사용되고 있다. 한편 우리나라에서는 보리수나무의 열매를 한방에서는 목반하(木半夏)라고 하며 효능으로는 설사, 출혈, 소화불량 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 민간에서는 열매뿐만 아니라 잎, 뿌리 및 가지를 기침, 천식 등의 치료에 많이 사용하고 있다.

보리수나무에 관한 효능 연구는 많지 않은 실정으로 열매, 잎, 꽃 추출물의 항균활성, 열매의 일반성분 및 라이코펜 함량 분석, 열매 추출물의 항산화 및 암세포 증식 억제 효과, 열매와 잎 용매 분획물의 항산화 활성 비교가 보고되어 있으며, 뜰보리수 관련 연구로서 잎의 유용성분 분석, 열매추출물의 항산화 및 항암, 미백효과, 항혈소판 및 항염증 등의 보고가 있다.

보리수나무는 체계적인 연구가 전무한 상태이며, 식용으로 허가되어 있으나 식품 소재로서 활용이 전혀 되지 않고 있다. 이에 본 연구에서는 보리수나무의 잎의 기능성과 고부가가치 바이오 소재로서의 활용도를 제고하고자 하였다.

한국등록특허 제10-1710303호(2017.02.20 등록)

본 발명의 목적은 인 비트로(in vitro)에서 콜라게네이즈(collagenase)의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 시약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인 비트로(in vitro)에서 금속단백분해효소-1(metalloproteinase-1)의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 시약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 사람을 제외한 동물에서 효과적으로 콜라게네이즈(collagenase)의 발현을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 사람을 제외한 동물에서 효과적으로 금속단백분해효소-1(metalloproteinase-1)의 발현을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가야보리수(Elaeagnus umbellata ) 잎의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 콜라게네이즈(collagenase)의 발현을 억제하는 시약 조성물을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가야보리수 잎의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 금속단백분해효소-1(Metalloproteinase-1, MMP-1)의 발현을 억제하는 시약 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람을 제외한 동물에서, 가야보리수 잎의 추출물을 처리하는 단계를 포함하는, 콜라게네이즈(collagenase)의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람을 제외한 동물에서, 가야보리수 잎의 추출물을 처리하는 단계를 포함하는, 금속단백분해효소-1(Metalloproteinase-1, MMP-1)의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 가야보리수 잎 추출물의 콜라게네이즈 및 금속단백분해효소-1의 억제 활성을 개시하는 바, 따라서, 본 발명의 가야보리수 잎의 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 인 비트로에서 콜라게네이즈 활성 억제 및 금속단백분해효소-1을 효과적으로 억제하는 데에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 세포외(extracellular)에서 본 발명에 따른 가야보리수 잎의 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 콜라게네이즈의 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 섬유아세포에서 본 발명에 따른 가야보리수 잎의 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 금속단백분해효소-1(metalloproteinase-1; MMP-1)의 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 발명자들은 본 발명의 일 실시예에서, 가야보리수 잎을 에탄올 또는 열수 추출하여 얻은 추출물이 콜라게네이즈의 발현을 억제하는 활성 및 UVB를 조사한 섬유아세포에서 MMP-1의 발현을 억제하는 활성이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 가야보리수(Elaeagnus umbellata ) 잎의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 콜라게네이즈(collagenase)의 발현을 억제하는 시약 조성물을 제공한다.

보다 바람직하게는, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 70% 에탄올 수용액으로 1회 내지 3회 추출된 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 3회 추출된 것일 수 있는 바, 특히 상온에서 추출작업을 거치는 것이 바람직하며, 이러한 과정을 통해 충분한 양의 유효성분을 얻을 수 있어 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또는, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 물을 용매로 하여 70℃ 내지 120℃의 온도에서 2시간 내지 5시간 동안 추출된 것일 수 있고, 바람직하게는 80℃의 온도에서 3시간 동안 추출된 것일 수 있는 바, 이러한 과정을 통해 충분한 양의 유효성분을 얻을 수 있으므로 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다.

상기와 같이 얻은 추출액을 감압농축하고 동결건조하여 분말 상태의 식물 추출물을 제조할 수 있다.

상기 가야보리수 잎의 추출물은 콜라게네이즈의 발현을 농도 의존적으로 억제할 수 있는 바, 적절한 양을 사용하여 효과적으로 콜라게네이즈의 발현을 억제하는 데에 활용될 수 있다.

또한, 본 발명은 가야보리수 잎의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 금속단백분해효소-1(Metalloproteinase-1, MMP-1)의 발현을 억제하는 시약 조성물을 제공한다.

이때, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 70% 에탄올 수용액으로 1회 내지 3회 추출한 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 3회 반복 추출된 것일 수 있는 바, 특히 상온에서 추출작업을 거치는 것이 바람직하며, 이러한 과정을 통해 충분한 양의 유효성분을 얻을 수 있어 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또는, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 물을 용매로 하여 70℃ 내지 120℃의 온도에서 2시간 내지 5시간 동안 추출된 것일 수 있고, 바람직하게는 80℃의 온도에서 3시간 동안 추출된 것일 수 있는 바, 이러한 과정을 통해 충분한 양의 유효성분을 얻을 수 있으므로 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다.

상기와 같이 얻은 추출액을 감압농축하고 동결건조하여 분말 상태의 식물 추출물을 제조할 수 있다.

더욱이, 본 발명은 사람을 제외한 동물에서, 가야보리수 잎의 추출물을 처리하는 단계를 포함하는, 콜라게네이즈(collagenase)의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 에탄올 추출물 또는 열수 추출물일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 70% 에탄올 수용액으로 1회 내지 3회 추출된 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 3회 반복 추출된 것일 수 있는 바, 특히 상온에서 추출작업을 거치는 것이 바람직하며, 이러한 과정을 통해 충분한 양의 유효성분을 얻을 수 있어 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또는, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 물을 용매로 하여 70℃ 내지 120℃의 온도에서 2시간 내지 5시간 동안 추출된 것일 수 있고, 바람직하게는 80℃의 온도에서 3시간 동안 추출된 것일 수 있는 바, 이러한 과정을 통해 충분한 양의 유효성분을 얻을 수 있으므로 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다.

더불어, 본 발명은 사람을 제외한 동물에서, 가야보리수 잎의 추출물을 처리하는 단계를 포함하는, 금속단백분해효소-1(Metalloproteinase-1, MMP-1)의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 에탄올 추출물 또는 열수 추출물일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 70% 에탄올 수용액으로 1회 내지 3회 추출된 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 3회 반복 추출된 것일 수 있는 바, 특히 상온에서 추출작업을 거치는 것이 바람직하며, 이러한 과정을 통해 충분한 양의 유효성분을 얻을 수 있어 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또는, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 물을 용매로 하여 70℃ 내지 120℃의 온도에서 2시간 내지 5시간 동안 추출된 것일 수 있고, 바람직하게는 80℃의 온도에서 3시간 동안 추출된 것일 수 있는 바, 이러한 과정을 통해 충분한 양의 유효성분을 얻을 수 있으므로 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 가야보리수 잎의 추출물 제조 및 시약의 명명

경남 합천 지역에서 얻은 건조 상태의 가야보리수 잎을 분쇄기로 분쇄하고 70% 에탄올(Duksan, Ansan, Korea)로 3회 반복 추출하였고, 또한 건조 상태의 가야보리수 잎을 분쇄기로 분쇄하여 멸균수를 첨가하여 열수 추출(80℃, 3시간)하였다. 추출한 추출물은 여과지(Advantec, No. 5A, Tokyo, Japan)로 여과한 후 감압농축기를 이용하여 농축한 다음 동결건조하여 분석용 시료로 사용하였다. 이때, 가야보리수 잎 에탄올 추출물은 24.92 g, 가야보리수 잎 열수 추출물은 9.58 g을 각각 수득하였고, 가야보리수 잎 에탄올 추출물을 'EUL EtOH' 및 가야보리수 잎 열수 추출물을 'EUL H₂O'로, 대조군으로 사용할 시약인 에피칼로카테킨 갈레이트를 'EGCG'로 명명하였다.

< 실시예 2> 가야보리수 잎 추출물의 콜라게네이즈 ( Collagenase ) 발현 억제 활성 효과 확인

상기 실시예 1에서 제조한 가야보리수 잎 에탄올 및 열수 추출물의 콜라게네이즈 발현 억제 효과를 확인하기 위해 아조콜(Azocoll)과 콜라게네이즈 타입 I 효소(collagenase type I enzyme)를 사용하였다. 즉, 콜라겐 효소의 기질인 아조콜(Azo dye-impregnated collagen, A4341, Sigma-Aldrich, USA) 1 mg에 완충용액인 0.1 M Tris-HCl(pH 7.0)을 900 μL 첨가하여 균질화한 후 200 unit/mL의 농도로 제조한 콜라게네이즈 타입 I 효소(C0130, Sigma-Aldrich, USA) 용액 100 μL를 첨가하여 총 반응액이 1 mL가 되도록 하였다.

이후, 상기에서 준비한 반응액에, 가야보리수 잎 에탄올 또는 열수 추출물을 다양한 농도로 500 μL씩 첨가하여 반응시켰다. 43℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 반응이 완료되면 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 분해되지 않은 콜라겐은 침전시키고 분해된 콜라겐을 함유하는 상등액을 취해 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로서 효소용액 대신 반응완충액을 효소용액과 동량 첨가하여 흡광도를 측정하였으며 시료 자체의 값도 측정하여 효소 활성 계산 시 보정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 가야보리수 잎 추출물에 대한 콜라게네이즈 효소 활성 억제능을 측정한 결과, 가야보리수 잎의 에탄올 추출물 및 열수 추출물 모두 농도의존적으로 콜라게네이즈 효소 활성을 억제하였음을 알 수 있었다. 또한, 가야보리수 잎 에탄올 및 열수 추출물의 IC₅₀ 값을 계산한 결과, 각각 1.818 mg/mL, 1.325 mg/mL로 계산되었다.

< 실시예 3> 가야보리수 잎 추출물의 금속단백분해효소-1 ( metalloproteinase -1; MMP-1) 발현 억제 효과 확인

먼저 실험에 사용할 인간 유래 섬유아세포인 CCD-986sk 세포는 Korea Collection Tissue Center(Seoul, Korea)로부터 분양받았으며, 10% FBS와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)를 첨가한 DMEM 배지(Welgene, Korea)를 이용하여 5% CO₂가 존재하는 37℃ 인큐베이터에서 2~3회 계대 배양한 후 사용하였고, 가야보리수 추출물의 MMP-1 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, Human MMP-1 ELISA kit(Abcam, USA)를 사용하였다.

먼저 CCD-986sk 세포를 24-웰 플레이트에 1X10⁵ cells/well이 되게 분주하였고, 5% CO₂ 조건에서 인큐베이터된 인간 유래 섬유아세포 CCD-986sk에 UVB(15 mJ/cm²)를 조사한 뒤 24시간 동안 배양한 후 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 시딩(seeding) 시, 소태아혈청(fetal bovine serum)이 혼합되지 않은 DMEM 배지로 고갈(starvation)시킨 후 상기 추출물들을 처리하였다. 그 후 상등액을 수거하고 원심분리하여 불순물을 제거하였고 세포 상등액을 이용하여 human MMP-1 ELISA 실험방법에 따라 MMP-1 발현을 측정하였다. 음성 대조군으로는 가야보리수 잎 추출물을 처리하지 않은 군에서의 MMP-1의 발현과 UVB에 노출된 섬유아세포의 MMP-1 발현량을 각각 측정하여 비교하였고, 양성 대조군으로 10 μM의 EGCG(Sigma-Aldrich, USA)를 처리하여 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, UVB에 노출된 섬유아세포에서 MMP-1의 발현량이 정상군의 2배 이상 증가하였고, 10 μg/mL 농도의 가야보리수 잎 에탄올 및 열수 추출물 처리 시에는 정상군의 MMP-1 발현량과 동등한 발현량을 나타냈으며, 그 이상의 농도에서는 정상군보다 더 낮은 MMP-1 발현량을 나타내었다. 즉, 피부 세포에서 UVB에 의해 발현되는 콜라게네이즈 효소 인자인 MMP-1이 가야보리수 잎 추출물에 의해 감소됨을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (9)

1. 가야보리수(Elaeagnus umbellata) 잎의 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 물을 용매로 하여 70℃ 내지 120℃의 온도에서 2시간 내지 5시간 동안 추출된 것을 특징으로 하는, 인 비트로(in vitro)에서 콜라게네이즈(collagenase)의 발현을 억제하는 시약 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 콜라게네이즈의 발현을 농도 의존적으로 억제하는 것을 특징으로 하는, 인 비트로에서 콜라게네이즈의 발현을 억제하는 시약 조성물.
5. 가야보리수 잎의 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 물을 용매로 하여 70℃ 내지 120℃의 온도에서 2시간 내지 5시간 동안 추출된 것을 특징으로 하는, 인 비트로(in vitro)에서 금속단백분해효소-1(Metalloproteinase-1, MMP-1)의 발현을 억제하는 시약 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 사람을 제외한 동물에서, 가야보리수 잎의 추출물을 처리하는 단계를 포함하며, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 물을 용매로 하여 70℃ 내지 120℃의 온도에서 2시간 내지 5시간 동안 추출된 것을 특징으로 하는, 콜라게네이즈(collagenase)의 발현을 억제하는 방법.
9. 사람을 제외한 동물에서, 가야보리수 잎의 추출물을 처리하는 단계를 포함하며, 상기 가야보리수 잎의 추출물은 물을 용매로 하여 70℃ 내지 120℃의 온도에서 2시간 내지 5시간 동안 추출된 것을 특징으로 하는, 금속단백분해효소-1(Metalloproteinase-1, MMP-1)의 발현을 억제하는 방법.

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