CN113244281B - 黄水枝醇提物在制备治疗或保护、调节肝纤维化疾病药物中的应用 - Google Patents

黄水枝醇提物在制备治疗或保护、调节肝纤维化疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药应用技术领域，具体涉及黄水枝醇提物在制备治疗或保护、调节肝纤维化疾病药物中的应用；采用甲醇对黄水枝进行浸提，加热回流后再次加入甲醇回流提取，合并提取液，过滤后减压回收溶剂，冷冻干燥得到；通过建立小鼠肝纤维化模型，采用黄水枝醇提物对小鼠肝纤维化模型进行高、中、低不同剂量的给药，研究发现黄水枝醇提物对CCl4诱导的肝纤维化小鼠具有一定的保护作用，该作用与抑制氧化应激反应、降低炎症因子水平、调节TGF‑β1/Smad信号通路相关蛋白表达进而抑制HSC活化，降低α‑SMA表达，减少胶原合成有关。

Description

黄水枝醇提物在制备治疗或保护、调节肝纤维化疾病药物中 的应用
技术领域
本发明属于中药应用技术领域，具体涉及黄水枝醇提物在制备治疗或保护、调节肝纤维化疾病药物中的应用。
背景技术
肝纤维化(HF)是指由化学毒物性损伤、慢性肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、酗酒等因素引起的肝内结缔组织非正常增生为主要特征的病理生理过程。中药治疗肝纤维化具有疗效高、低毒副反应、费用低等优点，逐渐得到人们的重视。
HF是各种慢性肝病向肝硬化恶性发展必经的病理过程，其实质是肝组织损伤后机体的自我修复。肝纤维化发生的中心环节是肝星状细胞(HSC)的激活，形成肌成纤维细胞，后者分泌大量细胞外基质(ECM)，而同时肝脏对ECM的降解相对或绝对不足，大量的ECM在肝脏沉积，导致肝纤维化。当肝脏受损时，出现大量炎性细胞浸润，并产生TNF-、IL-6、TGF-1等细胞因子。TNF-α、IL-6为强促炎因子，能促使肝组织的炎症反应加剧而增加肝组织的损伤程度，加速肝纤维化的发展。于此同时，TGF-β1刺激静止状态下的肝星状细胞(HSC)使其激活并大量增殖，促使其向肌成纤维细胞转化，增强HSC合成ECM的能力并抑制ECM的分解，导致肝组织内出现大量的ECM沉积。激活的HSC在肝组织各损伤部位之间迁移，使受损部位出现ECM异常沉积，严重时使肝组织结构发生重构形成假小叶。
黄水枝(Tiarella polyphylla D.Don)为虎耳草科植物，具有活血祛瘀，消肿止痛的功效，其主要化学成分为黄酮类、三萜皂苷类、挥发油等，并具有抗肿瘤、抗补体、抗哮喘、保肝等方面的作用。
CCl4在肝脏氧化代谢过程中产生大量的自由基，使细胞膜脂质过氧化而出现损伤或坏死，从而导致纤维化的发生。用CCl4诱导动物肝纤维化，已成为国内外建立动物肝纤维化模型的经典方法。秋水仙碱具有良好的抗炎作用，也有研究表明秋水仙碱可以通过减少细胞因子分泌、调节TGF-β1等蛋白的表达、减少胶原形成、促进胶原分解等途径发挥抗肝纤维化作用，目前也作为阳性药被广泛应用于抗肝纤维化的研究中。故本发明采用CCl4诱导建立肝纤维化小鼠模型，以秋水仙碱为阳性药，对黄水枝醇提物的保肝作用及其机制进行探索。
现有申请号为CN201710915524.7的专利文件公开了一种植物的提取方法及提取物的应用，其是将虎耳草粉碎后用95％乙醇回流提取3次，过滤，滤液减压浓缩后调节pH，石油醚萃取3-5次后水层调节pH，过滤得沉淀，得到虎耳草素。并且公开了所得到的虎耳草素可用于制备预防或治疗肝纤维化的药物中。黄水枝虽为虎耳草科植物，但与虎耳草同科不同属，与虎耳草是不同的中药材。
申请号为CN201310253977.X的专利文件公开了一种治疗肝纤维化的中药，其是由狗脚迹、大沙叶、川谷根、寸节七、蓝花石参、乌金草、臭常山、飞来鹤、雪茶、一匹草、黄水枝、鸡肫草、羽叶三七、吊岩风、刺梨子、蟛蜞菊、岩丸子、石油菜、臭威灵。用于治疗肝纤维化。其是通过多种药材配伍，相辅相成，从而达到相应的技术效果，虽然在配方中含有黄水枝，但并不能体现单独的药材所起到的作用。
申请号为200780053134.8的专利文件公开了一种用于预防和治疗癌症疾病的包括黄水枝提取物或从其分离的化合物的组合物，其中黄水枝提取物是来自黄水枝的粗制提取物(溶剂为水、C1-C4醇和其混合物)或极性溶剂可溶性提取物(溶剂为水、甲醇、乙醇、丁醇)，应用于肿瘤/癌(包括肝癌)。但对于肝纤维化是否能治疗并未提及。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供了一种黄水枝醇提物在肝纤维化保护中的应用。
具体是通过以下技术方案来实现的：
1、黄水枝醇提物(TPME)在制备治疗或保护、调节肝纤维化疾病药物中的应用。
进一步，所述制备治疗或保护、调节肝纤维化疾病药物包括口服制剂或注射制剂。
进一步，所述制备治疗或保护、调节肝纤维化疾病药物是将黄水枝醇提物与药学中可接受的辅料相结合，制成所需制剂。
2、所述的黄水枝醇提物，是采用黄水枝全草，粉碎成粗粉，过筛后，以醇为溶剂进行提取，将提取液合并后过滤，减压回收溶剂，冷冻干燥后得到。
进一步，所述的醇为甲醇
进一步，所述的提取，是在浸提之后采用加热回流的方法进行提取。
进一步，所述的醇提方法为：称取黄水枝粗粉200g，第一次加入甲醇1900-2100mL，浸泡1h后，加热回流提取1h，第二次加入等体积的甲醇加热回流提取1h，合并提取液，过滤，取滤液，减压回收溶剂，冷冻干燥后即得。
对不同溶剂提取的黄水枝提取物(水提、甲醇提、95％乙醇提)采用肝星状细胞模型进行了筛选，结果显示，甲醇提取物对肝星状细胞的增殖抑制作用强于其余两种提取物，故选择甲醇提取物进行了抗小鼠肝纤维化试验。
采用其他非醇溶剂(乙酸乙酯、丙酮、乙醚)对黄水枝进行提取，采用肝星状细胞模型进行了筛选，结果显示，甲醇提取物对肝星状细胞的增殖抑制作用均强于其他非醇溶剂提取物。
综上所述，本发明的有益效果在于：本发明采用甲醇对黄水枝进行浸提，加热回流后再次加入甲醇回流提取，合并提取液，过滤后减压回收溶剂，冷冻干燥得到；通过建立小鼠肝纤维化模型，采用黄水枝醇提物对小鼠肝纤维化模型进行高、中、低不同剂量的给药，研究发现黄水枝醇提物对CCl4诱导的肝纤维化小鼠具有一定的保护作用，该作用与抑制氧化应激反应、降低炎症因子水平、调节TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白表达进而抑制HSC活化，降低α-SMA表达，减少胶原合成有关。
ALT和AST是反映肝细胞损伤的灵敏指标，本研究显示，模型组小鼠血清中ALT和AST含量显著上升，该两项指标升高说明模型组小鼠出现了肝损伤。与模型组相比，TPME可明显降低AST和ALT活性，说明TPME可减轻CCl4所致小鼠的肝损伤程度。LN、PCⅢ、CⅣ是临床上常用于反应肝脏受损程度和肝纤维化水平的指标，LN是非胶原性结构糖蛋白，当肝纤维化发生时，肝窦内LN明显沉积并释放入血，使血清中LN含量升高，PCIII是在基底膜的胶原纤维形成过程中，分泌到细胞外的III型前胶原向III型胶原转化时，氨基端前胶原肽被N-末端酶裂解后进入外周血中，并随着肝纤维合成的活跃而增多，CⅣ为肝血窦基底膜的主要成分，在肝纤维过度增生时,CⅣ的合成和降解均处于较高水平，与LN结合形成连续基底膜,即“肝窦毛细血管化”。由于其合成和沉积更为明显，其血清含量似乎更是反映胶原生成而非降解的指标。TPME给药组LN、PCIII及CⅣ与模型组比较明显降低，提示TPME给药组肝纤维化程度较模型组有所减轻。
氧化应激和炎症反应在肝纤维化发展进程中有着重要作用，检测血清中SOD、MDA水平可反映机体氧化损伤情况，而血清中TNF-α、IL-6含量可反映机体炎症反应情况。本实验结果表明给予TPME治疗后小鼠血清中MDA、TNF-α、IL-6显著升高，SOD的水平显著降低。说明TPME能在不同水平上减轻HF小鼠的氧化应激反应和炎症反应。
α-SMA是HSC激活的特征标志物，其表达水平与肝脏的纤维化程度呈正相关。本实验结果显示，TPME能够显著下调HF模型小鼠肝组织中α-SMA的表达，提示TPME抑制了HSC的活化。TGF-β1/Smad信号通路是介导HSC激活、促进HSC增殖和产生ECM的主要信号通路，调控HSCs活化并促进其增殖，加速肝纤维化的发生和发展，在肝纤维化的发生和发展过程中有重要作用。因此，阻断TGF-β1/Smad信号通路，对肝纤维化的治疗有重要意义。本实验结果表明，TPME能够显著下调TGF-β1和Smad3蛋白的表达水平，且作用强度与药物浓度呈正相关，提示TPME能够一定程度地阻断TGF-β1/Smad信号通路，这可能是TPME抑制HSC活化、减少胶原合成，进而减轻HF小鼠纤维化程度的原因之一。
附图说明
图1为Western blot检测各组TGF-β1、Smad3及α-SMA蛋白表达结果。
图2为TPME对肝纤维化小鼠肝组织病理学改变的影响(×200)，其中，A.HE染色；B.Masson染色；a.正常组；b.模型组；c.秋水仙碱组；d.TPME低剂量组；e.TPME中剂量组；f.TPME高剂量组。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一、制备黄水枝醇提物(TPME)：
称取黄水枝粗粉200g，第一次加入甲醇2000mL，浸泡1h后，加热回流提取1h，第二次加入等体积的甲醇加热回流提取1h，合并提取液，过滤，取滤液，减压回收溶剂，冷冻干燥后即得。
二、建立CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型。
2.1实验动物及药剂
2.1.1动物
SPF级雄性昆明种小鼠，60只，体质量18～22g，由贵州医科大学实验动物中心提供，饲养于通风良好，温度18～25℃，相对湿度40％～70％，12h光照昼夜循环。许可证号SCXK(黔)2018-0001。相关动物实验通过贵州医科大学实验动物伦理委员会审查(编号2000069)。
2.1.2试剂和设备
药物和试剂：黄水枝全草(昆明采智生物技术有限公司，采集地：湖北省恩施市建始县芭蕉乡，批号：202010)，经贵州医科大学龙庆德副教授鉴定为黄水枝(Tiarellapolyphylla D.Don)全草；秋水仙碱(上海源叶生物科技有限公司，批号：S15A8C34051)；天冬氨酸氨基转移酶(AST)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)，超氧化歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为：20201204，20201207，20201230，20201230)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α，深圳欣博盛生物科技有限公司，批号：M2001106-102a)；白介素-6(IL-6，河南九邦生物科技有限公司，批号：Nov 2020)；III型前胶原(PCIII)，IV型胶原(CIV)试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司，批号分别为：L210104920，L210104913)；层粘连蛋白(LN，武汉华美生物工程有限公司，批号：A22011449)；高效RIPA裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，彩虹180广谱蛋白Marker，ECL Plus超敏发光液(北京索莱宝科技有限公司，批号分别为：R0010，PC0020，P1200，PR1910，PE0010)；TGF-β1抗体，α-SMA抗体(美国Abcam公司，批号分别为：ab179695，ab124964)；Smad3抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号：L1602077)；GAPDH抗体(美国Affinity公司，批号：T0004)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)(德国Merck公司，批号：P2938)。
仪器设备：全波段多功能酶标仪，Universal HoodⅡ型成像分析仪(美国Bio-Tek公司)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；CP124C型电子天平(奥豪斯仪器(常州)有限公司)；ECLIPSE E100正置光学显微镜(日本尼康公司)。
2.2造模、给药及处理
按体重随机将60只雄性昆明种小鼠随机分为6组，每组10只。分别为正常组、模型组、秋水仙碱组和TPME低、中、高剂量组。
除正常组外，其余5组小鼠均腹腔注射20％CCl4(橄榄油：CCl4＝4:1，1mL/kg)，正常组给予等体积橄榄油，每周2次，连续8周，建立肝纤维化模型。
于造模的第5周起，秋水仙碱组给予0.1mg/(kg.d)灌胃，TPME低、中、高剂量组分别给予TPME 250，500，1000mg/(kg.d)灌胃，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，每日灌胃1次，连续4周。末次给药后，禁食不禁水12h，腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠，眼眶取血，常温静置2h，3500r/min，离心15min，取血清，保存于-20℃备用。采血后脱颈椎处死小鼠，剖取肝脏，称重，部分肝组织固定于4％多聚甲醛中保存备用，另一部分肝组织保存于-80℃冰箱中备用。
实施例2
TPME对肝纤维化小鼠肝指数的影响
在实施例1的基础上，计算肝指数，公式如下：
Figure BDA0003108001530000071
结果如表1所示。
表1 TPME对肝纤维化小鼠肝指数的影响
Figure BDA0003108001530000072
Figure BDA0003108001530000073
注：与空白组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01
由实验结果可知，模型组与正常组相比，肝指数显著上升，差异具有统计学意义(P<0.01)；秋水仙碱组和TPME各剂量组与模型组比较肝指数均显著下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。
实施例3
TPME对肝纤维化小鼠血清中ALT和AST水平的影响
在实施例1的基础上，用微板法测定血清中ALT、AST的活性。结果如表2所示。
表2 TPME对肝纤维化小鼠血清中ALT和AST的影响
Figure BDA0003108001530000074
Figure BDA0003108001530000075
Figure BDA0003108001530000081
注：与空白组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01
由实验结果可知，与正常组相比，模型组小鼠血清中的ALT和AST水平显著上升，差异具有统计学意义(P<0.01)；秋水仙碱组和TPME各剂量组小鼠血清中ALT和AST的水平较模型组均有显著下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。
实施例4
TPME对肝纤维化小鼠血清中PCⅢ、CⅣ、LN水平的影响
在实施例1的基础上，采用ELISA法检测血清中PCIII、CIV、LN、TNF-α、IL-6的含量。结果如表3、表4所示。
表3 TPME对肝纤维化小鼠血清中PCIII、CIV和LN的影响
Figure BDA0003108001530000082
Figure BDA0003108001530000083
注：与空白组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01
由实验结果可知，与正常组相比，模型组小鼠血清中PCⅢ、CⅣ、LN的水平均显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.01)；秋水仙碱组和TPME各剂量组小鼠血清中PCⅢ、CⅣ、LN的水平较模型组均有显著下降，差异均具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。
表4 TPME对肝纤维化小鼠血清中TNF-α和IL-6的影响
Figure BDA0003108001530000084
Figure BDA0003108001530000085
Figure BDA0003108001530000091
注：与空白组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01
由实验结果可知，与正常组相比较，肝纤维化模型组小鼠血清中的TNF-α和IL-6水平显著上升(P<0.01)；与肝纤维化模型组小鼠相比较，秋水仙碱组和TPME各剂量组小鼠血清中的TNF-α和IL-6水平显著下降(P<0.01,P<0.05)。
实施例5
TPME对肝纤维化小鼠血清中SOD和MDA水平的影响
在实施例1的基础上，采用TBA法检测血清中MDA的含量；WST-1法检测血清中SOD的活性，按试剂盒说明书进行操作。结果如表5所示。
表5 TPME对肝纤维化小鼠血清中MDA和SOD的影响
Figure BDA0003108001530000092
Figure BDA0003108001530000093
注：与空白组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01
由实验结果可知，与正常组相比较，模型组小鼠血清中的SOD水平降低，MDA水平上升(P<0.01),与肝纤维化模型组小鼠相比较；秋水仙碱组和TPME各剂量组小鼠血清中的SOD水平上升(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.01)。
实施例6
TPME对肝纤维化小鼠肝脏TGF-β1/Smad通路相关蛋白表达的影响
在实施例1的基础上，采用Western blot法检测肝组织中α-SMA、TGF-β1、Smad3的蛋白表达。
取-80℃冰箱中肝组织复温，称取每个肝组织样本100mg，加1mL RIPA蛋白裂解液，于冰上用全自动研磨仪匀浆，4℃，12000r/min离心10min，取上清，即得各组肝组织蛋白。采用BCA法测定肝组织样本蛋白浓度。加入5×蛋白上样缓冲液，于100℃加热5min变性，而后进行10％SDS-PAGE电泳，采用湿转法将蛋白转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5％脱脂奶粉将膜封闭1.5h，TBST缓冲液清洗3次，每次10min，分别加入α-SMA(1:1000)、TGF-β1(1:1000)、Smad3(1:1000)抗体，4℃孵育过夜，PVDF膜室温孵育15min后，用TBST缓冲液清洗3次，每次10min，二抗室温孵育1h，TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，用ECL发光试剂盒显影，以Image J 1.8.0软件分析条带的灰度值，以目标蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值评价蛋白的相对表达量。结果如图1、表6所示。
表6 TPME对肝纤维化小鼠肝组织TGF-β1，Smad3及α-SMA表达的影响
Figure BDA0003108001530000101
Figure BDA0003108001530000102
注：与空白组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01
与正常组相比，肝纤维化模型组小鼠肝脏中α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白的表达升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比较，秋水仙碱组和TPME各剂量组小鼠肝脏中α-SMA、TGF-β和Smad3蛋白表达下降，差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。
实施例7
TPME对肝纤维化小鼠肝脏组织病理变化的影响
在实施例1的基础上，采用苏木精-伊红(HE)、马松三色(Masson)染色评估肝组织病理学变化。
取4％多聚甲醛固定的肝组织，乙醇脱水、石蜡包埋、切片，分别经HE、Masson染色后，于光镜下观察肝脏组织病理变化。结果如图2所示。
HE染色结果显示，正常组小鼠的肝小叶结构完整、清晰，肝细胞以汇管区或中央静脉为中心向四周呈放射状排列，肝组织未见明显肝实质细胞病变及炎症细胞浸润；模型组小鼠的肝细胞排列紊乱且有部分肝细胞坏死，肝组织结构被破坏，出现炎症细胞浸润和脂肪空泡；秋水仙碱组和TPME各剂量组能够在不同程度上缓解肝纤维化小鼠的肝组织发生的病理改变。Masson染色显示，正常组小鼠仅在中央静脉和汇管区有少量的胶原沉积，未见增生的纤维组织；模型组小鼠汇管区出现大量胶原沉积，增生的纤维组织形成的纤维条索将相邻的汇管区相互连接形成假小叶；秋水仙碱组和TPME各剂量组均能在不同程度上减少胶原沉积，降低肝脏纤维化程度。
需说明的是，上述实验所有数据均用SPSS 26.0统计软件进行统计与分析，数据均为计量资料，以均值±标准差
Figure BDA0003108001530000111
表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

Claims (1)

1.黄水枝醇提物在制备抗肝纤维化疾病药物中的应用；
所述抗肝纤维化的药物是将黄水枝醇提物与药学中可接受的辅料相结合，制成所需制剂，包括口服制剂或注射制剂；
所述的黄水枝醇提物，是称取黄水枝粗粉200g，第一次加入甲醇1900-2100mL，浸泡1h后，加热回流提取1h，第二次加入等体积的甲醇加热回流提取1h，合并提取液，过滤，取滤液，减压回收溶剂，冷冻干燥后即得。
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