CN101588810B - 用于治疗和预防炎性疾病的包括络石藤和日本鹿蹄草提取物的组合物 - Google Patents

用于治疗和预防炎性疾病的包括络石藤和日本鹿蹄草提取物的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于预防和治疗炎性疾病的药物组合物，其以包括络石藤和日本鹿蹄草的草药提取物混合物作为活性成分。更具体地，本发明的药物包括络石藤和日本鹿蹄草的预定范围的草药提取物混合物，从而与由单独的草药药物制备的药物相比，表现出对疼痛、急性炎症、与诱导炎症的因子有关的酶的分泌、以及对NO及iNOS的产生等的更优异的治疗作用，因此可用于预防和治疗炎性疾病，例如关节炎。

Description

用于治疗和预防炎性疾病的包括络石藤和日本鹿蹄草提取物的组合物
技术领域
本发明涉及用于预防和治疗炎性疾病的药物组合物，其以包括络石藤(Trachelospermi caulis)和日本鹿蹄草(Pyrola japonica)的草药提取物混合物作为活性成分。更具体地，本发明的药物组合物包括以预定比例混合的络石藤和日本鹿蹄草的草药提取物混合物，从而与由单独的草药制备的那些药物相比，对疼痛、急性炎症、与诱导炎症的因子有关的酶的分泌、以及对NO及iNOS等的产生表现出更优异的抑制作用，因此可用于预防和治疗炎性疾病，例如关节炎。
背景技术
关节炎是与由于细菌感染或外部损伤引起的在关节区域内发生的炎性变化有关的疾病的总称。关节炎主要分为两类：急性关节炎和慢性关节炎。
急性关节炎进一步如下区分。(1)重症关节炎-通常由外部损伤引起，但是可以由于未知的原因发生。其通常发生在一个关节中。(2)浆液纤维性关节炎-其伴随急性类风湿性关节炎发生，并且在关节腔中聚集有混浊的渗出液。它可以、甚至是在炎症由于假膜的生成而恶化之后引起运动障碍。(3)化脓性关节炎-在关节的开放性伤口中或感染性疾病例如淋病、伤寒、猩红热、和败血病中发生的多发性关节炎。1-2月大的新生婴儿可以由于骨头的不可愈合的严重损伤引起关节脱位。成年人经常发展成骨膜骨髓炎，其引起破裂并使得脓流入关节，即所谓的继发性化脓性关节炎。
慢性关节炎可以如下进一步区分。
(1)炎症的具体类型-泛指由结核性关节炎或梅毒性关节炎或尿酸代谢紊乱引起的痛风性关节炎，通常在中年人中发生。
(2)多发性关节炎-慢性类风湿性关节炎是最常见的。它可以从急性重症关节炎转变而来，可以作为肺炎、梅毒、和淋病的过程中的多关节炎存在，或者可以是一种败血病。另外，斯蒂尔病也属于这个类别。
(3)变形性关节炎-通常由退行性老化过程或外部损伤引起。
(4)血友病关节炎-由血友病患者的关节中出血所引起。
退行性关节炎也称为“骨关节炎”。它是由关节软骨的退行性变化引起的局部关节炎，并且主要发生在中年或老年人中。局部关节炎的主要原因似乎是老化，因为它发生在大约85％的55-65岁的人中。据报导，其在女性中发生比在男性中更常见，并且在女性中还比在男性中更严重。另外，其发生在肥胖人中的概率比发生在正常健康人中的概率大两倍，特别是发生在负载体重的腿软骨中，例如，髋关节、膝关节、踝关节等。它还发生在手的末端关节。关节炎疼痛通常出现在关节的过度活动之后或在夜里，并且在休息之后症状会有所改善。
受试者在早晨感觉到的最初的僵硬可以在身体活动约5-10分钟之后容易地消除。在症状严重或者进展到一定程度时，导致关节在运动过程中产生裂开的声响，以及在更严重的情况中，关节活动受到很大程度的限制。有时，承受体重的关节，特别是膝关节，根本不听使唤，但是在不久之后，症状经常不经任何特殊治疗而自然地痊愈。通常，在年龄为60以上的约35％女性和15％男性中观察到与退行性关节炎有关的症状。用于改善症状的最好的治疗法是在适合个人的程度有规律地进行锻炼或游泳，并且可以使用辅助训练设备来帮助锻炼。用于治疗所述症状的药物的实例是抗炎药和止痛药、肾上腺皮质激素药、软骨保护药、用于在关节内注入润滑剂的手术等。已经开发了许多药物用于以关节炎为代表的上述各类炎性疾病的治疗。
本发明涉及包括草药提取物的药物组合物，因此消除了在合成药物中经常产生的不良效果的危险。事实上，包含在本发明草药组合物中的草药药物的单独给药的毒性试验已证实了其安全性。
本发明的草药组合物包括络石藤和日本鹿蹄草的提取物。络石藤(Trachelospermi caulis)也被称为亚洲络石(Trachelospermumasiaticum var.intermedium Nakai)以及Trachelospermum sdisyivumvar.intermedium nakai或夹竹桃(Apocyanaceae)的攀缘茎和枝条。其生长高达5m。其花瓣支化到内部深处，分为五瓣。纸风车形的白色花在5-6月开花并且散发出芬芳的香味。其在大约9-11月结果实，其中两个长的果实呈现人字形，并且经常形成圆圈，表现为手镯的形状。事实上，络石藤生长在海岸、山坡或韩国南方的贫瘠区域，更具体地，生长在岩石上、墙壁上，或者在其它树木或植物上爬藤生长。在有大量络石藤的区域中，可能是其它种类的草不能生长，而只是由络石藤覆盖该位置。根据北朝鲜出版的“Dictionary of Oriental Medicine”，络石藤是亚洲络石(Trachelospermum asiaticum var.intermediumNakai)的干燥的茎叶。其具有苦的味道并且从东方医学的观点属于性寒。其作用于心经、肝经、和肾经的痉挛。它还消除作为致病因素的风湿，并且促进经络系统的平滑连接。此外，它可用于治疗麻痹综合征、四肢抽搐、腰痛、关节炎疼痛、扁桃体炎、和皮疹。
络石藤的活性成分是牛蒡子苷、牛蒡子苷配基、络石苷、罗汉松树脂酚苷、磁麻糖等。已知它们具有舒张血管和降血压的活性(HerbMedicinal Phamacology，LIM，Jongpil，p.155-156(2003))。
日本鹿蹄草是属于鹿蹄草属(Pyrola Klenze ex Alefeld)的常绿的多年生草本植物。在6月和七月之间在作为总状花序的花茎端部开出带黄色的白花或白色的花，其果实在8月成熟为蒴果。其叶和茎被用作止血剂和解毒剂。其包含大约1％量的熊果苷和甲基熊果苷作为活性成分，并且还包括高熊果苷、槲皮素、熊果酸(ursollic acid)、齐墩果酸(oleanoic acid)等。其通常已知可用于治疗高血压和关节炎疼痛[The Encyclopedia of Chinese Crude Drug，J.H.Park，p.139-140(2002)]。
然而，一直没有研究致力于阐明包括混合草药提取物的药物的效力。另外，以前的草药百科全书例如Donguibogam、Hyangyakjipsungbang、Gwangjebigeup或其它相关参考文献只是从东方医学的观点简短地提及这些草药药物的效力以及制备煎剂的方法。另外，一直没有关于从混合草药药物制造煎剂的处方的报告。事实上，一直没有关于使用上述方法提取的上述活性成分的效力的报告。另外，一直没有关于使用动物模型进行的临床前试验或者药物效力(例如，抗炎作用和疼痛解除作用和镇痛作用)的教导。
在背景技术部分中公开的信息只是用于增进对本发明背景的理解，而不应该看作是关于这种信息形成本领域技术人员已知的现有技术的承认或任何形式的暗示。
发明内容
作为致力于通过提供更科学的和客观的数据来解决上述问题以及优化提取效率的深入研究的结果，本发明的发明人发现了包括以合适的重量比混合的络石藤和日本鹿蹄草的两种草药提取物的药物组合物表现出用于治疗疼痛和急性炎症的优异的作用。
因此，本发明的目的是提供用于预防和治疗炎性疾病的以包括络石藤和日本鹿蹄草的草药提取物混合物作为活性成分的药物组合物。
附图说明
参考举例说明附图的某些示例性实施方案描述本发明的上述的和其它的特征，其中：
图1是根据本发明的实施方案制备的混合草药提取物的HPLC色谱图；
图2是表示由本发明的角叉菜胶诱导的爪水肿的增长速率的比较数据的曲线图；
图3是表示由本发明的FCA诱导的慢性炎症的增长速率的比较数据的曲线图；
图4表示使用根据本发明的实施方案制备的iNOS进行的由蛋白质印迹得到的谱带的结果；
图5表示由本发明的LPS引起的巨噬细胞的NO表达水平降低；和
图6表示使用根据本发明的实施方案制备的TNF-α抗体进行的由蛋白质印迹得到的谱带的结果。
具体实施方式
本发明涉及用于预防和治疗炎性疾病的药物，其包括络石藤(Trachelospermi caulis)和日本鹿蹄草(Pyrola japonica)的草药提取物混合物作为活性成分。
如下进一步详述本发明。
本发明涉及药物，其包括络石藤和日本鹿蹄草的草药提取物混合物，从而与由单独的草药药物制备的药物相比，表现出对于疼痛、急性炎症、与诱导炎症的因子有关的酶的分泌、和NO及iNOS的产生等的优异的抑制作用，因此可用于预防和治疗炎性疾病，例如关节炎。
包括络石藤和日本鹿蹄草的提取物的混合草药药物组合物是通过使用如下所示方法用水或醇水溶液提取的。
将络石藤和日本鹿蹄草的草药药物切碎成小块并且将它们以1∶1-1∶15、优选1∶1-1∶5的重量比混合，然后在向混合物添加相对于混合草药药物的总重量为10-15倍重量的水、醇、或醇水溶液之后进行提取。使上述提取得到的滤液经历层分离并将得到的醇层在60-80℃减压浓缩。在浓缩步骤中，使得到的提取物经历共沸浓缩，冷冻干燥，最终产生粉末形式的提取物。
如下更详细地描述本发明的提取方法。
将络石藤和日本鹿蹄草的原始草药药物以1∶1-1∶15、优选1∶1-1∶5的重量比混合，添加水、醇、或醇水溶液，经历2-3小时单位提取时间的2-5次提取。使产物慢慢地在室温下冷却下来，并且通过离心过滤与残余物分离。然后向得到的残余物添加相对于混合草药药物总重量为10-15倍重量的水、醇或醇水溶液，加热，再提取，过滤，与先前的滤液合并，然后再过滤。通过向残余物添加水、醇或醇水溶液进行的再提取并且随后进行过滤可以增加提取效率。在此，如果水、醇或醇水溶液的量低于混合草药药物总重量的10倍，会降低所得提取物的溶解性，从而降低提取效率。然而，如果水、醇或醇水溶液的量超过混合草药药物总重量的15倍，会需要增加要使用的醇的量并且减压浓缩会需要更长的时间，因此是不经济的并且产生操作上的问题。
对于本发明的醇而言，可以使用脂醇类和芳醇类，优选脂醇类，更优选为C1-C6低级醇。
另外，对每个步骤的提取效率的分析表明，通过除第一次提取之外进行的再提取所得的收率为总提取物的约80-90％，尽管进行超过两次再提取之后的另外的提取不增加收率，并且是浪费的。
如上所述，将通过水、醇或水溶液提取得到的提取物过滤，浓缩，然后纯化滤液中所含的作为杂质的不需要的蛋白质、多糖、和脂肪酸。在本发明中，如下除去杂质，使用相同量的醇水溶液作为溶剂并且由其得到溶剂级分来对滤液进行分层2-5次。
优选上述的醇是C1-C6醇，更优选为30％乙醇。如果低级醇水溶液的量低于滤液的量，则会由于无用的组分例如脂肪酸形成颗粒而阻止顺利地分层，并且是不经济的，因为提取的活性成分的含量较低。
将在分层之后得到的提取液体在60-80℃减压浓缩，以除去剩余的溶剂。然后向得到的浓缩物添加在减压浓缩过程中收集的醇，添加在500-1000rpm离心之后得到的滤液并且再次减压浓缩。在这里，如果减压浓缩的温度低于60℃，则不能完全除去溶剂。同时，如果温度超过80℃，则产生浓缩物稳定性的问题。如果浓缩物在低于500rpm离心，则难以将浓缩物与醇分离。
相反，如果在超过1,000rpm离心，则产生浓缩物稳定性的问题。
将如此得到的浓缩物在60-80℃在0.08-0.3pa干燥，并且通过30-80目筛灭菌，最后得到粉末形式的络石藤提取物和日本鹿蹄草提取物的混合物。与来自单独的草药药物的治疗效果相比，如此得到的混合提取物对于治疗关节炎和疼痛具有优异的治疗效果，因此，包括络石藤提取物和日本鹿蹄草提取物的混合草药药物可用于预防和治疗炎性疾病。
本发明中使用的上述草药药物是在中国的河南省长沙市收集的。所述混合草药药物包含0.5-4.3重量％的牛蒡子苷(为络石藤的主要成分)，因此将牛蒡子苷用作生物标志物。牛蒡子苷的分子式是C27H34O11。
本发明还涉及使用包括上述粉末提取物作为活性成分的药物作为治疗剂用于治疗退行性关节炎和疼痛/炎症的方法。使用HPLC分析从包括络石藤和日本鹿蹄草提取物的药物提取得到的有效的生理学活性材料。结果显示，在所述药物中包含牛蒡子苷和牛蒡子苷配基，并且牛蒡子苷和牛蒡子苷配基具有TNF-α抑制活性[IntImmunopharmacol.2004 Oct；4(10-11)：1419-29，Arctigenin，aphenylpropanoid dibenzylbutyrolactone lignan，inhibits MAPkinases and AP-1 activation via potent MKK inhibition：the rolein TNF-αinhibition]。
作为日本鹿蹄草的主要成分的熊果苷已知抑制一种炎症诱导因子NF-κB的活性[J Dermatol Sci.2003 May；31(3)：193-201，Downregulation of NF-κB activation in human keratinocytes bymelanogenic inhibitors]。
对于本发明的用于治疗炎性疾病的治疗剂而言，可以在作为生物标志物的牛蒡子苷含量为0.5-1.1重量％时实现想要的治疗效果。例如，如果牛蒡子苷含量低于0.5重量％，则例如治疗关节炎的治疗效果大大地退化。对于牛蒡子苷的含量没有具体的上限要求。然而，超过上述范围的牛蒡子苷含量不会提高想要的治疗效果，并且在技术方面和经济方面也是不希望的。因此，优选牛蒡子苷含量为约0.8-1.0重量％。
作为本发明的生物标志物的牛蒡子苷是用于治疗炎性疾病的治疗剂的主要成分，并且其可以以一定量存在时通过发挥协同效应来帮助已知的治疗药物表现出优异的药物效力。另外，不仅上述的活性成分，而且所述治疗剂的其它成分也可能涉及发挥治疗炎性疾病的优异的治疗作用。
以下描述可用于治疗炎性疾病的本发明的络石藤提取物的制备方法。
包括络石藤和日本鹿蹄草提取物的本发明的复合物药物可以使用常规方法配制为片剂、胶囊、注射剂等。如果用作用于生产片剂的基体材料的乳糖、微晶纤维素、硬脂酸镁等的合并用量与络石藤和日本鹿蹄草提取物的合并用量的重量比为1∶1-1∶15，则由其生产的片剂对于治疗炎性疾病例如关节炎有良好的治疗效果。
草药提取物本身可用作治疗剂，但是通常是将它们与载体、赋型剂、稀释剂等合并，并且制备为粉末、颗粒、胶囊、或注射剂。本发明的络石藤提取物长久以来被用作食物以及药物。对于其剂量没有特殊的限制，但是剂量可以取决于患者的身体吸收的速率、体重、年龄、性别、健康状况、患者的饮食、以及给药时间、给药方法、排泄速率、疾病的严重程度等而变化。通常，优选每1kg体重给予约10-1000mg的混合草药提取物，更优选为50-500mg。
因此，应该在考虑到其有效范围的情况下生产包括本发明的活性成分的组合物，并且如有必要可以监控由其配制的单位剂量制备物的给药。另外，可以根据患者的决定和要求来使用专用给药方法，或者可以将其每隔一定间隔给药几次。
实施例
下面具体地参考本发明的优选实施方案，在随后的附图中举例说明其实施例，其中在全文中同样的参考数字是指同样的元素。所述实施方案描述如下，以便通过参考附图说明本发明。
参考例1：络石藤提取物的制备
将络石藤用无菌水洗涤，干燥，然后在添加相对于草药药物的重量为5-8倍量的30％乙醇之后进行搅拌，以2小时为单位热提取两次。将得到的提取物冷却到室温并且进行离心过滤，以除去杂质。将滤液合并并且在60-80℃减压浓缩。将浓缩物混悬在从乙醇级分回收的乙醇中，以1000rpm离心过滤，在60℃减压浓缩，在0.08pa压力下干燥，通过80目筛灭菌。通过HPLC分析得到的络石藤提取物，表明其包含3.0-6.0重量％的牛蒡子苷。
参考例2：日本鹿蹄草提取物的制备
将日本鹿蹄草用无菌水洗涤，干燥，然后在添加相对于草药药物的重量为5-8倍量的30％乙醇之后进行搅拌，以2小时为单位热提取两次。将得到的提取物冷却到室温并且进行离心过滤，以除去杂质。将滤液合并并且在60-80℃减压浓缩。将浓缩物混悬在从乙醇级分回收的乙醇中，以1000rpm离心过滤，在60℃减压浓缩，在0.08pa压力下干燥，通过80目筛灭菌。通过HPLC分析结果得到的日本鹿蹄草提取物，表明包含0.1-1.0重量％的熊果苷。
参考例3：混合草药提取物的制备
将等量的络石藤和日本鹿蹄草用无菌水洗涤，干燥，然后在添加相对于混合草药药物的重量为5-8倍的30％乙醇之后进行搅拌，并且以2小时单位热提取两次。将得到的提取物冷却到室温并且进行离心过滤，以除去杂质。将滤液合并并且在60-80℃减压浓缩。将浓缩物混悬在从乙醇级分回收的乙醇中，以1,000rpm离心过滤，在60℃减压浓缩，在0.08pa压力下干燥，通过80目筛灭菌。通过HPLC分析得到的混合草药药物组合物，结果如表1中所示。
[表1]
Figure G2007800504336D00101
实施例1：TPA诱导的小鼠耳水肿试验
研究了在上述参考例3中得到的混合草药提取物对TPA诱导的小鼠耳水肿的影响。使用6mm冲孔测量的耳的重量作为耳的重量。结果如以下表2中所示。
[试验方法]
将七周龄的ICR小鼠分配到每个实验组中，口服给予400mg/kg和200mg/kg浓度的(SK Pharma Co.，Ltd.，Korea)、分别为400mg/kg和200mg/kg浓度的络石藤提取物、分别为400mg/kg和200mg/kg浓度的日本鹿蹄草提取物、以及分别为400mg/kg、200mg/kg、20mg/kg和2mg/kg浓度的络石藤和日本鹿蹄草的混合草药提取物。在口服给药一小时之后，将每只小鼠的右耳均匀地用溶解在丙酮中的炎症诱导剂TPA(2.5μg/20μL)处理，从而诱导水肿。在实验过程中，一名研究者从后侧紧紧地固定受试动物，并由第二名研究者使用微量吸液管用水肿诱导材料刺激每只小鼠的耳。四小时后，每个实验组的小鼠都观察到耳水肿。通过颈部脱臼将小鼠处死，以便进行精确的观察，然后使用6mm穿孔测量水肿的重量。
[表2]
Figure G2007800504336D00111
如上述表2所示，本发明的混合草药提取物表现出对抗TPA-诱导的耳水肿的优异的抑制作用。具体地，在所用的混合草药提取物浓度为400mg/kg时，观察到54％的最大水肿抑制率。
实施例2：花生四烯酸诱导的小鼠耳水肿试验
研究了在上述参考例3中得到的混合草药提取物对TPA-诱导的小鼠耳水肿的影响。结果表示在以下表3和4中。
[试验方法]
将七周龄的ICR小鼠分配到每个实验组中，口服给予400mg/kg和200mg/kg浓度的
Figure G2007800504336D00112
(SK Pharma Co.，Ltd.，Korea)、分别为400mg/kg和200mg/kg浓度的络石藤提取物、分别为400mg/kg和200mg/kg浓度的日本鹿蹄草提取物、以及分别为400mg/kg、200mg/kg、20mg/kg和2mg/kg浓度的络石藤和日本鹿蹄草的混合草药提取物。在口服给药一小时之后，将每只小鼠的右耳均匀地用溶解在丙酮中的炎症诱导剂花生四烯酸(2mg/20μL)处理，从而诱导水肿。在实验过程中，一名研究者从后侧紧紧地固定受试动物，并由第二名研究者使用微量吸液管用水肿诱导材料刺激每只小鼠的耳。一个小时后，每个实验组的小鼠都观察到耳水肿。通过颈部脱位将小鼠处死，以便进行精确的观察，使用千分尺测量耳的厚度，然后使用6mm穿孔测量水肿的重量。
[表3]
Figure G2007800504336D00121
[表4]
Figure G2007800504336D00122
如上述表3和4所示，本发明的混合草药提取物表现出对抗花生四烯酸诱导的耳水肿的优异的抑制作用。具体地，在使用的草药提取物浓度为400mg/kg时，观察到64％和56％的最大水肿抑制率。
实施例3：λ角叉菜胶诱导的大鼠耳水肿试验
研究了上述参考例3得到的混合草药提取物对急性关节炎的影响。结果表示在以下表5和图2中。
[试验方法]
对体重约200g的SD大鼠口服给予400mg/kg浓度的
Figure G2007800504336D00131
(SKPharma Co.，Ltd.，Korea)、分别为200mg/kg和400mg/kg浓度的络石藤提取物、分别为20mg/kg和400mg/kg浓度的日本鹿蹄草提取物、以及分别为2mg/kg、20mg/kg、200mg/kg和400mg/kg浓度的络石藤和日本鹿蹄草的混合草药提取物。然后，通过在左爪上注射100μL的1％角叉菜胶生理盐水溶液诱导大鼠的爪水肿。在四小时内通过使用器官充满度测量器Ugo Basile 7140(N＝7)测量爪体积来分析爪水肿。
[表5]
Figure G2007800504336D00132
如上述表5和图2所示，本发明的混合草药提取物表示对急性关节炎的优异的治疗效果。具体地，在所用的混合草药提取物浓度为400mg/kg时，观察到最大的治疗效果。
实施例4：FCA诱导的大鼠关节炎
研究了上述参考例3得到的混合草药提取物对慢性关节炎的影响。结果如以下图3中所示。
[试验方法]
将七周龄的SD大鼠分配在每个实验组中，并且测量它们的体重，以便计算口服给药的剂量。然后，使用29G注射器在后爪的中心给药包含1mg/mL结核分枝杆菌的0.1mL/爪(Sigma Co.，Ltd.)的完全弗氏佐剂。在给予佐剂之后，在相同的时间区域每天一次口服给予试验材料，持续21天的时间，并且使用器官充满度测量器(Ugo Basile，Italy)每三天一次测量爪水肿的水平，然后计算在使用角叉菜胶诱导爪水肿的方法中的水肿增长率，并与对照组的水肿增长率相比较。作为阳性对照物，使用5mg/kg的双氯芬酸。
实施例5：乙酸诱导的小鼠血管渗透性
研究了上述参考例3得到的混合草药提取物对血管渗透性的抑制作用。结果表示在以下表6中。
[试验方法]
将七周龄的ICR小鼠分配在每个实验组中，使用探头口服给予分别为20mg/kg和200mg/kg浓度的络石藤提取物、分别为20mg/kg和200mg/kg浓度的日本鹿蹄草提取物、以及分别为2mg/kg、20mg/kg和200mg/kg浓度的络石藤和日本鹿蹄草的混合草药提取物，在将它们以0.1mL/10g体重的浓度溶解在蒸馏水之后进行给药。
基于在实验当天测量的体重确定剂量体积，对对照组只给予0.1mL/10g体重浓度的制备物溶剂-蒸馏水。另外，以50mg/kg体重的剂量口服给药混悬在0.5％甲基纤维素中的保泰松。
根据Whittle(1964)的方法对在实验之前禁食12小时的ICR雄性小鼠给予试验物质。在口服给药三十分钟之后，将2.5％的伊文思蓝溶液(0.1mL/10g体重)给予到尾静脉中。在给予伊文思蓝溶液二十分钟之后，腹膜内给予0.1mL/10g体重浓度的溶解于0.6％生理盐水中的乙酸，诱导血管渗透性的增强。在给予乙酸二十分钟之后，通过颈部脱位将每只小鼠处死，在腹腔中添加5mL生理盐水溶液并轻轻摇动。从腹腔收集洗涤溶液，然后以2,000rpm离心10分钟，使用分光光度计在630nm测量上层清液的光密度，以便计算流入到腹腔中的伊文思蓝溶液的量。使用保泰松(50mg/kg体重)和吲哚美辛(1mg/kg体重)作为阳性对照组。
[表6]
Figure G2007800504336D00151
如上述表6中所示，与对照组的抑制活性相比，本发明的混合草药提取物表现出优于其它对照组的优异的抑制活性。特别地，在所用的混合草药提取物的浓度为200mg/kg时，观察到以剂量依赖性的方式产生对由乙酸诱导的血管渗透性的最大抑制效果。另外，与阳性对照例如保泰松和吲哚美辛的抑制效果相比，在所用的混合草药提取物的浓度是200mg/kg时，表现出对由乙酸诱导的血管渗透性的优异的抑制效果。
实施例6：乙酸诱导的小鼠扭体反应
研究了上述参考例3得到的混合草药提取物的疼痛减轻效果。结果如以下表7所示。
[试验方法]
将七周龄的ICR小鼠分配到每个实验组，口服给予400mg/kg和200mg/kg浓度的
Figure G2007800504336D00161
(SK Pharma Co.，Ltd.，Korea)、分别为400mg/kg和200mg/kg浓度的络石藤提取物、分别为400mg/kg和200mg/kg浓度的日本鹿蹄草提取物、以及分别为400mg/kg、200mg/kg、20mg/kg和2mg/kg浓度的络石藤和日本鹿蹄草的混合草药提取物。在口服给药一小时之后，对每只小鼠腹膜内给予0.7％乙酸(0.1mL/10g)。在腹膜内给药十分钟之后，通过拉伸(扭体：后背或后腿的完全拉伸)观察每只小鼠，并将该结果用作痛觉指标。
[表7]
Figure G2007800504336D00162
如上述表7中所示，与对照组相比，本发明的混合草药提取物表现出更少的扭体次数。特别地，在所用的混合草药提取物的浓度是400mg/kg时，观察到最大的止痛效果。
实施例7：混合草药药物对NO、iNOS和TNF-α的产生的影响
研究了上述参考例3得到的混合草药提取物对使用炎症相关因子进行治疗的治疗效果的影响。
[试验方法]
将未加工的264.7细胞系(一种得自小鼠的巨噬细胞)用LPS(1μg/mL)处理。在处理24小时之后，收集培养基，通过酶法和自由基色谱法分析，用LPS处理。在4小时之后，将细胞溶解，然后使用iNOS抗体，通过蛋白质印迹法，研究混合的络石藤和日本鹿蹄草的草药提取物对一氧化氮(NO，一种固有的炎症诱导分子)、可诱导的氧化氮合酶(iNOS)和TNF-α的表达水平的影响。
对于NO而言，收集100μL的24小时培养基，然后与100μL的Griess溶液混合，并且在OD540nm测量其光密度。
对于iNOS和TNF-α而言，将未加工的264.7细胞系用LPS(1μg/mL)处理，在处理4小时之后，将得到的细胞溶解并且收集全部的溶解的蛋白质。然后通过电泳分离蛋白质，之后通过蛋白质印迹转移到尼龙膜上，并且使用iNOS和TNF-α抗体分析蛋白质的量。
图4显示了对iNOS的表达水平的抑制作用；图5显示通过LPS引起的对巨噬细胞中产生NO的抑制作用；图6显示对TNF-α表达的抑制作用，由此表明了本发明的混合的草药提取物的优异的抗炎作用。
实施例8：毒性试验
使用16小时禁食的4-5周龄的ICR小鼠(每组5只小鼠)重复给予1g上述参考例3得到的络石藤和日本鹿蹄草的混合草药提取物来研究所述混合草药提取物的毒性。将溶解于0.5％羧甲基纤维素(CMC)中的1g上述草药提取物口服给予5天。结果表明，所有的小鼠都存活，没有观察到器官的异常损害。
制备例1：片剂的生产
通过湿法造粒或干法造粒生产包括本发明的混合草药提取物的具有如下组成的用于口服给药的片剂。
[组成]
络石藤和日本鹿蹄草的混合草药提取物                200mg
轻质硅酸酐                                        10mg
硬脂酸镁                                          2mg
微晶纤维素                                        50mg
淀粉羟乙酸钠                                      25mg
乳糖                                              101mg
聚维酮                                            12mg
无水乙醇                                          适量
制备例2：膏剂的制备
生产包括本发明的混合草药提取物的如下组成的膏剂。
[组成]
络石藤和日本鹿蹄草的混合草药提取物                5g
十六酸鲸蜡醇酯                                    20g
鲸蜡醇                                            40g
硬脂醇                                            40g
十四烷酸异丙酯                                    80g
单硬脂酸山梨糖醇酐酯                              20g
聚山梨酯                                          60g
对羟基苯甲酸丙酯                                  1g
对羟基苯甲酸甲酯                                  1g
磷酸盐和净化水                                    适量
制备例3：注射剂的制备
生产包括本发明的混合草药提取物的如下组成的注射剂。
[组成]
络石藤和日本鹿蹄草的混合草药提取物        100mg
甘露醇                                    180mg
磷酸氢二钠                                25mg
注射用无菌水                              2,974mg
制备例4：透皮制剂的制备
生产包括本发明的混合草药提取物的如下组成的透皮药物。
[组成]
络石藤和日本鹿蹄草的混合草药提取物        0.4g
聚丙烯酸酯                                1.3g
甘油                                      3.6g
氢氧化铝                                  0.004g
对羟基苯甲酸甲酯                          0.2g
丙烯酸粘合溶液                            14mL
如上所述，本发明的混合的络石藤和日本鹿蹄草的草药提取物在治疗疼痛、急性炎症、慢性炎症、和急性水肿、血管渗透性和炎症相关因子时表现出优异的抑制效果，因此，通过调节组分及其相应的量来用于预防和治疗炎性疾病，可以实现所述混合的络石藤和日本鹿蹄草的草药提取物的标准化。
另外，在使用牛蒡子苷作为生物标志物的本发明的混合的络石藤和日本鹿蹄草的草药提取物中，有可能通过调节所述生物标志物的量来生产用于预防和治疗炎性疾病的治疗剂。
已经参考优选实施方案详细描述了本发明。然而，本领域技术人员应该理解，可以在这些实施方案中进行改变而不偏离本发明的原则和精神，本发明的范围在权利要求及其等价物中限定。

Claims (5)

1.药物组合物，由络石藤和日本鹿蹄草的混合提取物组成，用于预防和治疗炎性疾病，其中，作为生物标志物的牛蒡子苷的含量为0.5-1.1重量％，且络石藤和日本鹿蹄草的提取物的混合比以重量计是1∶1～1∶5。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述炎性疾病是关节炎和水肿。
3.制备络石藤和日本鹿蹄草的混合提取物的方法，其包括：
(a)将络石藤和日本鹿蹄草以1∶1～1∶5的重量比混合，使用选自C1-C6醇水溶液的溶剂进行提取，再将混合的提取物过滤；和
(b)对滤液进行分层2-5次，使用相同量的C1-C6醇水溶液作为溶剂并且由其得到C1-C6含水醇级分。
4.权利要求3的方法，其中所述提取是使用所述混合提取物的5-8倍重量的C1-C6醇水溶液进行的。
5.权利要求3的方法，其还包括：
(a)减压浓缩分离后得到的提取液，然后向浓缩物中添加减压浓缩过程中收集的C1-C6醇水溶液，然后离心。
(b)将离心后的滤液再次减压浓缩；以及
(c)将浓缩物干燥、粉碎并灭菌。
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