CN101095708A - 柴胡总多糖在制备防治系统性红斑狼疮药物中的用途 - Google Patents
柴胡总多糖在制备防治系统性红斑狼疮药物中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属中药领域，具体涉及柴胡总多糖在制备防治系统性药物中的用途。本发明从中药柴胡中分离提取得到总多糖提取物，平均产物收率3.32％，多糖含量超过65％。所述总多糖经整体动物模型试验，结果显示，对系统性红斑狼疮样综合征小鼠的自身免疫反应亢进和肾损伤有明显的保护作用，证实对系统性红斑狼疮样综合征有防治作用。可制备防治系统性红斑狼疮药物和防治自身免疫性疾病等药物。
Description
技术领域
本发明属中药领域，涉及中药柴胡总多糖新的药用用途。具体涉及柴胡总多糖在制备防治系统性红斑狼疮药物中的用途。
背景技术：
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种病因不甚明确的炎性结缔组织病，主要发病在女性，也可累及儿童。一项多国多中心研究表明，目前系统性红斑狼疮的发病率为12.5/10万～39/10万。SLE通常被视为代表性的自身免疫病，是一种难治的、反复发作、致死率高的严重自身免疫病。SLE自身免疫异常的表型具有高度多样性，几乎涉及整个免疫系统，包括免疫耐受缺损、淋巴细胞凋亡障碍、T或B细胞功能调节障碍、NK细胞功能缺损、补体缺陷、自身抗原抗体形成的免疫复合物清除障碍、细胞因子分泌调节障碍等。除皮肤、粘膜外，常累及肾脏、心脏、肝脏、肺以及神经系统等内脏器官，常伴有发热、乏力、关节痛等全身症状，并在血液中存在多种抗自身抗体，是一种累及多系统、临床表现复杂、病程迁延反复的自身免疫性疾病。
补体系统在自身免疫性疾病的预防及疾病损伤中，起着所谓″双刃剑″的作用。一方面，补体系统功能的正常，可以有效地促进循环免疫复合物的运送及清除：另一方面，补体系统功能的缺陷，包括组分的缺失或功能的失常，又会参与对组织的损伤。SLE活动期患者体内B淋巴细胞活性增强，产生大量抗自身尤其是抗ds-DNA抗体，与自身抗原在体内形成大量免疫复合物，活化补体，消耗大量补体C3和C4成分，使C3，C4降低。而非活动期SLE患者B淋巴细胞活性基本正常，体内自身抗体水平也基本正常，补体消耗减少，使补体正常或轻度偏高。因此，血清中高Ig，低补体C3，C4是SLE活动性的重要指标。补体活化造成的III型变态反应的直接作用和对免疫细胞功能的影响可加重SLE的病理损害，影响SLE病程的发展和临床表现。
由于SLE患者体内产生大量的循环免疫复合物沉积于组织、器官等，尤其是肾脏，常可引起肾小球肾炎(即狼疮性肾炎)。一旦免疫复合物沉积于肾组织内即激活补体系统，引起一系列的免疫损伤反应(III型变态反应)：血管内凝血因子的激活，毛细血管通透性增加，中性粒细胞、单核细胞等炎症细胞的浸润，局部组织细胞的坏死，蛋白溶解或裂解酶的大量释放，以及一系列调节肾小球细胞增殖、基质增生的细胞因子的释放等等，从而产生肾脏的各种病理变化。系统性红斑狼疮(SLE)的肾脏病变称为狼疮性肾炎(Lupus Nephritis，LN)。LN是SLE的重要临床组成部分。SLE患者约35％～90％有肾脏累及的临床表现，如蛋白尿、红、白细胞尿，管型尿及肾小管和小球滤过功能的变化。肾脏病理检查发现：90％患者在光镜下可出现异常；采用免疫荧光或电镜等复杂技术，几乎所有SLE患者均有不同程度的肾脏累及。肾脏损害的严重程度与SLE的预后密切相关。多数SLE患者最终出现肾功能不全，严重影响着患者的生命(毕志刚，刘晓华.红斑狼疮现代诊疗.第1版[M].江苏：江苏科学技术出版社，2000.98-100)。SLE的治疗主要以对症的长期监控治疗为主，治疗药物主要为非甾体类抗炎药、免疫抑制剂、静脉注射免疫球蛋白、性激素等治疗药物。尽管糖皮质激素及免疫抑制剂能控制病情，但其长期应用产生的不良反应也是患者致死原因之一。
研究表明，高水平抗自身抗体和补体系统的过度激活所引发的免疫性组织损伤是SLE患者发病的重要机制，而且与SLE的发生与预后有显著联系。通过特异性抑制补体组成成分激活，降低抗ds-DNA抗体水平，有望提高治疗SLE的临床疗效，减少不良反应。临床急需高效低毒的药物来防治系统性红斑狼疮。
柴胡为常用中药，为伞形科柴胡属(Bupleurum)多种植物的根，具有疏散退热、舒肝、升阳的功效，主治感冒发热、寒热往来、疟疾、胸肋胀痛、月经不调及子宫脱垂等症。柴胡的化学成分相当复杂，迄今为止，已报道含有皂甙、挥发油、黄酮、甾醇、香豆素、糖类、木质素、有机酸、多炔及生物碱等。现代药理研究证明柴胡具有解热、镇痛、镇静、抗炎、免疫调节、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等作用。
文献(张兴权，陈鸿珊.中国药理学与毒理学杂志，1989，3(1)：31.)报道柴胡(Bupleurum chinense DC)多糖能显著增加脾系数；提高巨噬细胞和天然杀伤细胞功能；能提高病毒特异抗体滴度；能明显增加淋巴细胞转化率和皮肤迟发超敏反应，显示免疫促进作用。从狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd)中分离出的黄酮和皂苷显示良好的免疫抑制活性(Wen JC，Li WC，Jenn HL，et al.Phytochmistry，2003，64：1375.)。从其他柴胡(Bupleurum falcatum L)中分出的柴胡多糖IIb能抑制补体系统经典途径激活所致的溶血反应，显示免疫抑制作用(Yamada H，Ra KS，Kiyohara H，et al.Carbohydr Res，1989，189：209.)。但未涉及对系统性红斑狼疮的作用。
综观国内外的研究，均未见报道柴胡总多糖的防治系统性红斑狼疮的药效及其药物。
发明内容
本发明的目的是提供中药柴胡总多糖新的药用用途，具体涉及柴胡总多糖在制备防治系统性红斑狼疮药物中的用途。
本发明从中药柴胡中分离提取得到总多糖提取物。所述总多糖提取物经体外实验证实有较强抗补体活性，整体动物模型试验证实其具有很强的防治系统性红斑狼疮作用。
本发明所述的中药柴胡包括柴胡(Bupleurum chinense DC)，狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd)和小叶黑柴胡(Bupleurum smithiiWolff)。
本发明的目的通过下述方法实现：
1、制备柴胡总多糖：
柴胡药材以95％乙醇冷浸提取，滤过，药渣于室温下置通风处晾干，然后用热水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩，离心，上清液以三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液用水透析3天，透析液浓缩至小体积后加乙醇至含醇量80％，离心，沉淀冷冻干燥即得总多糖提取物，收率达3％以上，多糖含量超过65％。
2、柴胡总多糖用于防治系统性红斑狼疮样综合征试验：
按常规方法，选用昆明种和BALB/c小鼠，以空肠弯曲菌灭活菌株免疫，建立系统性红斑狼疮综合征模型。柴胡总多糖灌胃给药。将试验小鼠在实验结束处理后，观察动物的血清中抗体水平及尿蛋白水平。取肾，石蜡固定，切片，显微镜下观察病理改变，取脾和胸腺测定器官指数。
结果证实，柴胡总多糖对小鼠狼疮样综合征引起的肾损伤有明显的保护作用。整体试验证实柴胡总多糖对小鼠系统性红斑狼疮有防治作用。
附图说明
图1是SLE模型小鼠(昆明种)尿蛋白水平。
图2是SLE模型小鼠(昆明种)抗ds-DNA抗体水平。
图3是空白对照组小鼠(昆明种)肾病理切片图。
图4是模型对照组小鼠(昆明种)肾病理切片图。
图5是SLE模型组小鼠(昆明种)肾病理切片图。
图6是柴胡多糖给药组小鼠(昆明种)肾病理切片图。
图7是阳性对照(泼尼松)组小鼠(昆明种)肾病理切片图。
图8是SLE模型小鼠(BALB/c)尿蛋白水平。
图9是SLE模型小鼠(BALB/c)抗ds-DNA抗体水平。
图10是SLE模型小鼠(BALB/c)抗组蛋白抗体水平。
图11是空白对照组小鼠(BALB/c)肾病理切片图。
图12是模型对照组小鼠(BALB/c)肾病理切片图。
图13是SLE模型组小鼠(BALB/c)肾病理切片图。
图14是柴胡多糖(30mg/kg)组小鼠(BALB/c)肾病理切片图。
图15是柴胡多糖(15mg/kg)组小鼠(BALB/c)肾病理切片图。
图16是阳性对照(泼尼松)组小鼠(BALB/c)肾病理切片图。
具体实施方式
实施例1
取柴胡药材100g，以95％乙醇冷浸提取，药渣于室温下置通风处晾干，然后用热水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩，离心，上清液以S三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液用水透析3天，透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量80％，离心，沉淀冷冻干燥即得总多糖，产物收率达3％以上，多糖含量超过65％。
所述的柴胡药材可选自柴胡(Bupleurum chinense DC)，狭叶柴胡(Bupleurumscorzonerifolium Willd)或小叶黑柴胡(Bupleurum smithii Wolff)。
表1是柴胡总多糖收率及含量。
表1
| 批号 | 1 | 2 | 3 | 平均 |
| 产物产量(克)总多糖量(克)产物收率％多糖含量％ | 3.202.183.2068.2 | 3.152.443.1577.6 | 3.612.843.6178.6 | 3.322.493.3274.8 |
实施例2
昆明种小鼠30只(16-20g)，随机分为5组(A、B、C、D、E组)。A组为正常对照组，B组为模型对照组，C组为SLE模型组，D组为柴胡多糖组，E组为醋酸泼尼松组。初次免疫，A组为正常对照组，尾根部皮下注射生理盐水，B组为模型对照组，尾根部皮下注射弗氏完全佐剂，其余各组以空肠弯曲菌配合弗氏完全佐剂尾根部皮下注射，免疫诱导SLE样综合征，每只小鼠注射量为50μl。初次免疫后第14天加强免疫1次：A组和B组皮下注射生理盐水，其余各组皮下注射空肠弯曲菌菌悬液，每只小鼠注射量为0.2ml。小鼠在免疫当天开始灌胃给药，每天一次至第32天。D组柴胡多糖给药剂量为30mg/kg，E组醋酸泼尼松组给药剂量为5mg/kg，B组和C组均给予配药用空白赋形剂(5％羧甲基纤维素钠，CMC)，A组不灌胃。
小鼠于免疫后d32，摘眼球放血处死，取血测定血清抗自身抗体水平，检测免疫功能。取肾，石蜡固定，切片，显微镜下观察病理改变。病理损伤评级，按损伤的严重程度分为轻、中、重度，分别给1、2、3分，无病理损伤给0分。
结果显示，与正常对照组和模型对照组相比，SLE模型鼠的尿蛋白明显升高，柴胡多糖对SLE样综合征小鼠尿蛋白有明显的降低作用(附图1)。
与正常对照组和模型对照组相比，SLE模型鼠的抗ds-DNA抗体水平明显升高，柴胡多糖对SLE样综合征小鼠抗ds-DNA抗体水平有明显的降低作用(附图2)。
肾病理检测显示，正常组小鼠肾脏正常，模型对照小鼠基本正常。模型组小鼠肾脏均有炎性细胞侵润、肾小球增大和肾小球囊腔缩小。柴胡多糖给药组仅有一只小鼠肾脏有肾小球部分增大，肾小球囊腔缩小，无炎性细胞侵润。阳性对照药强地松仅有一只小鼠的肾小球部分增大、囊腔缩小，伴炎性细胞侵润。
结果表明，柴胡总多糖在体内抑制ds-DNA抗体水平，降低尿蛋白水平，明显改善肾小球的增大，抑制炎性细胞侵润，有缓解SLE样小鼠肾损伤作用。
表2是昆明种小鼠肾病理损伤评级(X±SD)(n＝25)。
表2
| 组别 | 数量 | 肾小球炎性细胞浸润 | 肾小球囊腔缩小 |
| 正常模型对照 | 66 | 0±0**0.2±0.4** | 0±0**0.2±0.4** |
| SLE模型柴胡多糖(30mg/kg)泼尼松(5mg/kg) | 666 | 0.8±0.40±0**0.2±0.4** | 1±00.2±0.4**0.2±0.4** |
其中，*与SLE模型组比较P＜0.05；**与SLE模型组比较P＜0.01。
实施例3
BALB/c小鼠48只(16-20g)，随机分为5组(A、B、C、D、E、F组)。A组为正常对照组(n＝8)，B组为模型对照组(n＝8)，C组为SLE模型组(n＝10)，D组为柴胡多糖30mg/kg组(n＝8)，E组为柴胡多糖15mg/kg组(n＝8)，F组为醋酸泼尼松组(n＝8)。初次免疫，A组为正常对照组，足跖部皮下注射生理盐水，B组为模型对照组，足跖部皮下注射弗氏完全佐剂，其余各组以空肠弯曲菌配合弗氏完全佐剂足跖部皮下注射，免疫诱导SLE样综合征，每只小鼠注射量为50μl。初次免疫后第14天加强免疫1次：A组和B组尾静脉注射生理盐水，其余各组注射空肠弯曲菌菌悬液，每只小鼠注射量为0.2ml。在免疫当天开始给小鼠灌胃给药，每天一次至第34天。D组柴胡多糖给药剂量为30mg/kg，E组柴胡多糖给药剂量为15mg/kg，F组醋酸泼尼松组给药剂量为5mg/kg，B组和C组均给予配药用空白赋形剂(5％羧甲基纤维素钠，CMC)，A组不灌胃。
免疫后第35天，取BALB/c小鼠血测定血清抗自身抗体水平。取小鼠胸腺、脾称重，求器官指数。器官指数＝脏器重(mg)/10g体重。取双侧肾，石蜡固定，切片，显微镜下观察病理改变。病理损伤评级，按损伤的严重程度分为轻、中、重度，分别给1、2、3分，无病理损伤给0分。
结果显示，与正常对照组和模型对照组相比，SLE模型鼠的尿蛋白明显升高，柴胡多糖30mg/kg对SLE样综合征小鼠的尿蛋白有明显的降低作用，柴胡多糖15mg/kg对SLE样综合征小鼠的尿蛋白也有一定的降低作用(附图8)。
与正常对照组和模型对照组相比，SLE模型鼠的抗ds-DNA抗体和抗组蛋白抗体水平明显升高，柴胡总多糖30mg/kg对SLE样综合征小鼠升高的抗ds-DNA抗体和抗组蛋白抗体水平有明显的降低作用；柴胡总多糖15mg/kg对SLE样综合征小鼠的高抗ds-DNA抗体水平有一定的降低作用，但是与模型组相比没有显著性差异，但柴胡总多糖15mg/kg对SLE样综合征小鼠的高抗组蛋白抗体水平有明显的降低作用(附图9，10)。
与正常小鼠和模型对照组相比，免疫使模型组小鼠的脾指数升高。与模型组相比，柴胡总多糖30mg/kg和阳性对照药泼尼松均显著性抑制小鼠免疫后脾指数升高，但泼尼松对脾指数有过度抑制作用，脾指数低于正常小鼠(p＜0.001)，柴胡总多糖15mg/kg对小鼠脾指数无影响。
与正常小鼠和模型对照组相比，免疫使模型组小鼠的胸腺指数升高。与模型组相比，阳性对照药泼尼松能显著性降低胸腺指数，柴胡总多糖30mg/kg和柴胡总多糖15mg/kg对胸腺指数无影响。
表3是BALB/c小鼠的脾指数和胸腺指数(X±SD)(n＝49)。
表3
| 组别 | 数量 | 脾指数(mg/10g) | 胸腺指数(mg/10g) |
| 正常模型对照SLE模型柴胡多糖(30mg/kg)柴胡多糖(15mg/kg)泼尼松(5mg/kg) | 8810888 | 45.7±12.0**49.1±10.1*59.2±17.344.7±3.9**54.8±6.324.6±8.4*** | 19.6±3.2*19.2±6.4**25.3±4.726.9±4.423.5±4.016.2±6.1*** |
其中，*与SLE模型组比较P＜0.05；**与SLE模型组比较P＜0.01，***与SLE模型组比较P＜0.001。
肾病理检测显示，正常组小鼠肾脏正常，模型对照小鼠基本正常。模型组小鼠肾脏肾小球肿胀、肾小球囊腔缩小、肾小球细胞数的增多；与模型组小鼠相比，正常组小鼠肾小管正常，模型对照小鼠肾小管基本正常，模型组小鼠肾小管肿胀。柴胡总多糖30mg/kg对SLE样模型小鼠的肾脏病变有明显的改善作用，柴胡总多糖15mg/kg对SLE样模型小鼠的肾脏病变有一定的改善作用(附图11，12，13，14，15)。
表4是BALB/c小鼠肾病理损伤评级(X±SD)(n＝49)。
表4
| 组别 | 数量 | 肾小球肿胀 | 肾小球囊腔缩小 | 肾小球细胞数增多 | 肾小管病变 |
| 正常模型对照SLE模型柴胡多糖(30mg/kg)柴胡多糖(15mg/kg)泼尼松(5mg/kg) | 889888 | 0.6±0.5**0.4±0.5**2.9±0.31.9±0.4**2.3±0.5*2±0** | 0.8±0.5**1.1±0.4**2.2±0.41±0**1.7±0.52±0 | 0.8±0.5**1.5±0.5**3±01.9±0.4**2.3±0.5*2±0** | 0.4±0.5**1.6±0.5*2.4±0.51.2±0.5**2.3±0.51.7±0.5* |
其中，*与SLE模型组比较P＜0.05；**与SLE模型组比较P＜0.01。
结果证实，柴胡总多糖在体内能抑制SLE样综合征小鼠的抗自身抗体水平的升高(抗ds-DNA抗体和抗组蛋白抗体)，改善小鼠的体液免疫应答亢进，抑制脾肿大；柴胡总多糖在体内能降低SLE样综合征小鼠的尿蛋白水平，明显改善肾小球和肾小管的病变，有缓解SLE样小鼠的肾损伤作用，可制备防治系统性红斑狼疮药物和防治自身免疫性疾病等药物。
Claims (5)
1、柴胡总多糖在制备防治系统性红斑狼疮药物中的用途。
2、柴胡总多糖在制备防治自身免疫病药物中的用途。
3、柴胡总多糖在制备抗变态反应药物中的用途。
4、权利要求1或2或3的用途，其中所述的柴胡总多糖通过下述方法和步骤制备：
柴胡药材以95％乙醇冷浸提取，滤过，药渣于室温下置通风处晾干，然后用热水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩，离心，上清液以三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液用水透析3天，透析液浓缩至小体积后加乙醇至含醇量80％，离心，沉淀冷冻干燥即得总多糖提取物，收率达3％以上，多糖含量为68.2-78.6％。
5、按权利要求4的用途，其中所述的柴胡药材选自柴胡Bupleurum chinenseDC，狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd或小叶黑柴胡Bupleurum smithii Wolff。
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