CN114869928B - 用于治疗脑血管疾病的中药组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗脑血管疾病的中药组合物及其用途。一方面，提供了一种中药组合物，其是用重量比5～40：1比例的中药材黄芪和红花经提取后制备得到的。另一方面，还提供了该中药组合物的制备方法，以及它们在制药中的用途，例如在制备用于治疗脑血管疾病的药物中的用途；例如，所述中药组合物用于促进脑缺血后的血管新生、改善脑缺血后的神经功能、减小脑缺血后的脑梗死体积、和/或提高脑缺血后的脑微血管密度。本发明中药组合物呈现如本文所述优良技术效果。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，涉及一种用于治疗脑血管疾病的中药组合物，尤其涉及一种以中药红花和黄芪制备的中药组合物，其可有利地用于治疗缺血性脑卒中这种急性脑血管疾病，对脑缺血损伤具有优良的保护作用。本发明还涉及该中药组合物的制备方法，以及它们的制药用途。
背景技术
脑卒中又名脑中风，具有高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率的特点。现如今已成为继心脏病和癌症后的第三大致死性疾病，给许多家庭带来巨大的经济和心理负担。脑卒中可分为脑出血和脑缺血，其中，脑缺血占总数的87％左右。因此研究治疗脑缺血的药物对急性脑血管病的治疗具有重大的现实意义。红花和黄芪的使用常见于治疗气虚血瘀证的方剂中，其中以清代名医王清任创制的补阳还五汤最具有代表性。其中红花是传统的活血化瘀药，黄芪是传统的补气药，完全契合治疗缺血性脑卒中气虚血瘀的病理机制，临床使用也较为广泛。
红花是传统的活血化瘀药，黄芪是传统的补气药，临床常用于治疗缺血性脑卒中。缺血性脑卒中是一种急性脑血管疾病，又称为脑缺血，具有较高的死亡率。脑缺血发生后，大脑会发生一系列的应激发应，导致炎性反应、细胞凋亡和脑水肿等。红花和黄芪治疗缺血性脑卒中的作用机制主要是通过抗氧化清除自由基、抑制细胞凋亡与炎性反应，以及调节一些信号通路等来发挥脑保护的作用。红花和黄芪脑保护作用机制多而复杂，具有多环节、多途径、多靶点的特点。
王凯文献(王凯，等，中药红花和黄芪对脑缺血损伤保护作用的研究进展，中国医药导报，2020，17(3)：22)对涉及红花和黄芪的药理作用进行了概述，认为红花和黄芪的脑保护作用机制具有多环节、多途径、多靶点的特点，与中药多靶点、多通路整体调节来治疗疾病的特点相契合。同时发现红花和黄芪发挥脑保护的机制和途径有许多相似之处，如都是通过抗氧化清除自由基、抑制细胞凋亡与炎性反应，以及通过调节一些信号通路等来发挥脑保护的作用。根据相关的文献，发现红花和黄芪配伍使用的确在脑保护方面具有一定的协同作用，其协同机制与抗炎、抗氧化、促进血管新生密切相关。红花和黄芪还能明显促进神经营养因子-3和BDNF表达，减轻脑组织受损状态，较单独应用红花或黄芪效果明显。从而证明了两药效物质在治疗脑缺血方面存在“相须”和“相使”作用，也阐明了补阳还五汤中红花和黄芪治疗缺血性脑卒中的科学性。脑缺血会导致氧化应激反应的发生，氧化应激主要是由细胞和生物体中的活性氧(ROS)触发的。ROS通常被称为含氧活性物质，包括氧阴离子、自由基和过氧化氢。研究证明氧化应激的发生和ROS的大量堆积与炎性反应和免疫反应有着密切的相关性。ROS的大量产生导致核因子-κB的转录增强，随后TNF-α和IL-6的产生增加，进而参与炎性反应。因此红花和黄芪可能通过抑制ROS，保护线粒体结构和功能，线粒体结构完整可改善脑能量代谢来保护大脑神经元，减少细胞凋亡，以及抑制ROS诱导的炎性因子的释放，进而抑制炎性反应。有研究表明缺氧诱导因子-1(HIF-1)的活性对组织缺血后的恢复有着十分重要的作用。VEGF作为HIF-1的下游产物，HIF-1和VEGF与脑水肿密切相关，而红花和黄芪可增加HIF-1和VEGF的表达，减轻脑缺血后引发的脑水肿，从而起到脑保护的作用。
氧化应激是因为机体内氧自由基生成增多或清除能力下降，从而导致机体内活性氧簇蓄积引起神经元凋亡等一系列损伤的过程，而且氧化应激也是脑缺血时最早出现和最重要的损伤机制。然而，中医药在预防和治疗缺血性脑卒中方面有着丰富的临床经验，再加上中药的治疗具有多途径、多靶点的优势，因此，可以通过抗氧化应激反应为治疗脑缺血的新思路，来开发更多具有预防和治疗脑缺血的中药制剂，为临床上治疗缺血性脑卒中提供新的药物。
然而，本领域技术人员仍然期待有新的方法以治疗脑血管疾病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的方法以治疗脑血管疾病，本发明的另一目的在于为上述治疗脑血管疾病治疗方法提供一种中药组合物，本发明再一目的在于提供制备该种中药组合物的方法，本发明的又一目的在于提供该种中药组合物的制药用途，已经出人意料地发现，使用本发明的各个方面有益地实现了一个或者多个方面的目的。本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了用于治疗脑血管疾病的中药组合物，其是由中药材黄芪和红花经提取制得的。
根据本发明第一方面的中药组合物，其是用重量比5～40：1比例的中药材黄芪和红花制备得到的。
根据本发明第一方面的中药组合物，其是用黄芪和红花经分别提取得到提取物后混合制得的。
根据本发明第一方面的中药组合物，其是照如下工艺制备得到的：
取药材黄芪，第一次加8倍水煎煮提取2小时，第二加7倍水煎煮提取1小时，合并两次煎液，过滤，70-80℃减压浓缩到相对密度1.25，喷雾干燥，即得黄芪颗粒；
另取药材红花，第一次加8倍水煎煮提取2小时，第二加7倍水煎煮提取1小时，合并两次煎液，过滤，70-80℃减压浓缩到相对密度1.25，喷雾干燥，即得红花颗粒；
按两种药材重量比将黄芪颗粒和红花颗粒混合，即得。
根据本发明第一方面的中药组合物，其中所述喷雾干燥的进风温度是170℃-185℃，出风温度是85℃-90℃。
根据本发明第一方面的中药组合物，所述中药材黄芪和红花的重量比为5：1。
根据本发明第一方面的中药组合物，其中还添加天冬氨酸和泛酸钙。例如，其中在将黄芪颗粒和红花颗粒混合时还另外添加天冬氨酸和泛酸钙。例如，在按两种药材黄芪：红花重量比5：1的比例将黄芪颗粒和红花颗粒混合时，以每1重量份红花药材计，天冬氨酸和泛酸钙的量分别为0.02重量份和0.005重量份，得到药物组合物。
根据本发明第一方面的中药组合物，其中还任选包含制成药物制剂形式的药用辅料。
根据本发明第一方面的中药组合物，其是呈选自下列的制剂形式：颗粒剂、胶囊剂、片剂、溶液剂、丸剂等。众所周知，不同制剂形式所需要的药用辅料通常是不同的，例如溶液剂的主要辅料是水，而片剂的辅料通常包含润滑剂、助流剂等有助于压片的辅料，颗粒剂通常还考虑添加矫味剂，辅料的选择以及制剂的制备是本领域普通技术人员根据本发明提供的药物组合物容易实现的。
根据本发明第一方面的中药组合物，其用于促进脑缺血后的血管新生、改善脑缺血后的神经功能、减小脑缺血后的脑梗死体积、和/或提高脑缺血后的脑微血管密度。
进一步的，本发明第二方面提供了制备用于治疗脑血管疾病的中药组合物的方法，其包括用黄芪和红花经分别提取得到提取物后混合的操作。
根据本发明第二方面的方法，其中中药材黄芪和红花的重量比为5～40：1。
根据本发明第二方面的方法，其包括如下步骤：
取药材黄芪，第一次加8倍水煎煮提取2小时，第二加7倍水煎煮提取1小时，合并两次煎液，过滤，70-80℃减压浓缩到相对密度1.25，喷雾干燥，即得黄芪颗粒；
另取药材红花，第一次加8倍水煎煮提取2小时，第二加7倍水煎煮提取1小时，合并两次煎液，过滤，70-80℃减压浓缩到相对密度1.25，喷雾干燥，即得红花颗粒；
按两种药材重量比将黄芪颗粒和红花颗粒混合，即得。
根据本发明第二方面的方法，其中所述喷雾干燥的进风温度是170℃-185℃，出风温度是85℃-90℃。
根据本发明第二方面的方法，所述中药材黄芪和红花的重量比为5：1。
根据本发明第二方面的方法，其中还向所述中药组合物中添加天冬氨酸和泛酸钙。例如，其中在将黄芪颗粒和红花颗粒混合时还另外添加天冬氨酸和泛酸钙。例如，在按两种药材黄芪：红花重量比5：1的比例将黄芪颗粒和红花颗粒混合时，以每1重量份红花药材计，天冬氨酸和泛酸钙的量分别为0.02重量份和0.005重量份，得到药物组合物。
根据本发明第二方面的方法，其中还任选向所述中药组合物中添加药用辅料以制成药物制剂的形式。
根据本发明第二方面的方法，其中所述中药组合物是呈选自下列的制剂形式：颗粒剂、胶囊剂、片剂、溶液剂、丸剂等。众所周知，不同制剂形式所需要的药用辅料通常是不同的，例如溶液剂的主要辅料是水，而片剂的辅料通常包含润滑剂、助流剂等有助于压片的辅料，颗粒剂通常还考虑添加矫味剂，辅料的选择以及制剂的制备是本领域普通技术人员根据本发明提供的药物组合物容易实现的。
根据本发明第二方面的方法，其中所述中药组合物用于促进脑缺血后的血管新生、改善脑缺血后的神经功能、减小脑缺血后的脑梗死体积、和/或提高脑缺血后的脑微血管密度。
进一步的，本发明第三方面提供了中药组合物在制备用于治疗脑血管疾病的药物中的用途，其中所述中药组合物是由中药材黄芪和红花经提取制得的。
根据本发明第三方面的用途，所述中药组合物用于促进脑缺血后的血管新生、改善脑缺血后的神经功能、减小脑缺血后的脑梗死体积、和/或提高脑缺血后的脑微血管密度。
根据本发明第三方面的用途，所述中药组合物是用重量比5～40：1比例的中药材黄芪和红花制备得到的。
根据本发明第三方面的用途，所述中药组合物是用黄芪和红花经分别提取得到提取物后混合制得的。
根据本发明第三方面的用途，所述中药组合物是照如下工艺制备得到的：
取药材黄芪，第一次加8倍水煎煮提取2小时，第二加7倍水煎煮提取1小时，合并两次煎液，过滤，70-80℃减压浓缩到相对密度1.25，喷雾干燥，即得黄芪颗粒；
另取药材红花，第一次加8倍水煎煮提取2小时，第二加7倍水煎煮提取1小时，合并两次煎液，过滤，70-80℃减压浓缩到相对密度1.25，喷雾干燥，即得红花颗粒；
按两种药材重量比将黄芪颗粒和红花颗粒混合，即得。
根据本发明第三方面的用途，其中所述喷雾干燥的进风温度是170℃-185℃，出风温度是85℃-90℃。
根据本发明第三方面的用途，所述中药材黄芪和红花的重量比为5：1。
根据本发明第三方面的用途，所述中药组合物中还添加天冬氨酸和泛酸钙。例如，其中在将黄芪颗粒和红花颗粒混合时还另外添加天冬氨酸和泛酸钙。例如，在按两种药材黄芪：红花重量比5：1的比例将黄芪颗粒和红花颗粒混合时，以每1重量份红花药材计，天冬氨酸和泛酸钙的量分别为0.02重量份和0.005重量份，得到药物组合物。
根据本发明第三方面的用途，所述中药组合物中还任选包含制成药物制剂形式的药用辅料。
根据本发明第三方面的用途，所述中药组合物是呈选自下列的制剂形式：颗粒剂、胶囊剂、片剂、溶液剂、丸剂等。众所周知，不同制剂形式所需要的药用辅料通常是不同的，例如溶液剂的主要辅料是水，而片剂的辅料通常包含润滑剂、助流剂等有助于压片的辅料，颗粒剂通常还考虑添加矫味剂，辅料的选择以及制剂的制备是本领域普通技术人员根据本发明提供的药物组合物容易实现的。
根据本发明任一方面和/或任一实施方案，其还具有如实施例所述任一技术特征和/或技术方案。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
缺血性脑卒中具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高等特点，是威胁人的重大疾病之一。但是目前对脑卒中患者的治疗，尤其是错过了溶栓期的患者，其临床疗效仍欠佳。在局灶性脑缺血导致的脑损伤的后期是以神经再生、血管新生等脑重构表现为主的，而脑血管新生又可以刺激内源性的恢复机制，是临床中有效的治疗脑缺血的方法。黄芪与红花配伍应用在治疗气虚血瘀证的方剂中较常见，黄芪补气，红花活血，二者配伍使用，完全符合缺血性脑卒中气虚血瘀的发病机制，临床使用广泛。但二者如何配伍，对脑缺血的保护作用最佳，鲜有报道。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种血管生成生长关键因子，在促进血管内皮细胞的增殖、分化、迁移以及增强血管通透性等方面具有重要作用。小凹蛋白1(Caveolin-1，Cav-1)是组成脂膜囊泡caveolae的主要蛋白成分，高度表达于血管内皮细胞中，对血管新生起着重要作用。有研究表明，Cav-1是VEGF介导的血管新生关键因子。本发明建立脑缺血再灌注大鼠模型，基于此研究黄芪红花不同配伍比例对脑缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨血管新生及Cav-1/VEGF信号通路在其中的作用，从而优选出黄芪红花的最佳配伍比例，指导临床用药。
曹金一文献(曹金一，等，黄芪红花配伍对大鼠脑缺血后血管新生及Cav-1/VEGF信号通路的影响，现代生物医学进展，2019，19(6)：1016)验证了黄芪红花配伍能够通过调节小凹蛋白1(Caveolin-1，Cav-1)/血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)信号通路促进脑缺血再灌注损伤大鼠脑内的血管新生，从而保护大鼠脑缺血损伤。在该验证试验中，60只雄性SD大鼠随机分为5个组：对照组(Sham组，n＝12)，模型组(MACO组，n＝12)，黄芪红花40：1组(n＝12)，20：1组(n＝12)，5：1(n＝12)。大鼠脑缺血再灌注损伤模型采用尼龙线栓法制作，连续给药21d后，评价神经功能学评分，计算脑梗死体积，采用免疫组化法测定皮质区的微血管密度，采用RT-PCR法检测皮质区VEGF mRNA和Cav-1mRNA表达，采用Western-blotting法测定皮质区VEGF和Cav-1的蛋白表达。结果显示，在连续给药21d后，各组大鼠的神经功能学评分均有所降低，3个不同比例的黄芪红花组的神经功能学评分降低最为明显(P<0.01)，脑梗死体积较模型组显著减少(P<0.05～P<0.01)，微血管密度、VEGF和Cav-1mRNA和蛋白表达水平均较模型组明显升高(P<0.05～P<0.01)。该文献验证了最佳的配伍比例为黄芪：红花＝5：1。
王凯文献(王凯，等，中药红花和黄芪对脑缺血损伤保护作用的研究进展，中国医药导报，2020，17(3)：22)对红花对脑缺血损伤的保护作用进行了详细阐述。红花为菊科植物，味辛性温，归心、肝经，是传统的活血化瘀、祛瘀止痛中药。红花提取液中主要的是红花黄色素，其中羟基红花黄色素A(HSYA)是红花黄色素中发挥活血化瘀功效的主要有效成分。近些年红花抗脑缺血损伤的作用日益受到关注，但其脑保护作用机制多而复杂，大致包括如下方面。
红花抗氧化清除自由基作用：研究发现，脑缺血再灌注损伤后会产生大量氧自由基等炎性因子，清除氧自由基可以减轻脑缺血再灌注损伤具有一定的脑保护作用。有文献研究发现红花提取液可以提高在脑缺血再灌注损伤中小鼠脑组织的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)、过氧化氢酶(CAT)的活性，降低丙二醛(MDA)含量，减少炎性因子对脑组织的损伤。因为在脑缺血再灌注损伤过程中会发生过氧化反应，出现大量的氧自由基，MDA就是其中的产物，对细胞具有一定的毒害作用，会破坏细胞的结构和功能。然而SOD、GSH-Px、CAT可以清除过量的氧自由基，从而维持体内氧自由基的动态平衡。因此，表明红花可以通过抗氧化清除自由基进而起到脑保护作用。
红花对大脑神经元的保护作用与炎性反应抑制：有文献研究发现HSYA可以减轻脑缺血再灌注时神经元线粒体结构和功能的破坏，因为线粒体膜结构与功能的破坏导致ATP的产生不足，引起脑能量代谢受到抑制。低氧分压则会产生乳酸，而ATP的产生不足会使乳酸转化过程受到阻碍，大量的乳酸堆积，会毒害脑细胞，从而导致脑细胞灶状坏死和凋亡。因此表明HSYA可以通过保护线粒体结构完整改善脑能量代谢来保护大脑神经元。有文献研究发现HSYA可以缓解氧糖剥夺(OGD)法导致的大脑皮质神经元胞体损伤，并且明显地提高细胞活力，抑制乳酸脱氢酶(LDH)与一氧化氮(NO)的释放，使脑组织白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平降低，抑制炎性反应，改善脑水肿。综上表明，HSYA具有对大脑神经元的保护作用与炎性反应抑制作用。
红花调节细胞信号通路，减少细胞凋亡：磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)通路是经典的细胞信号通路，在细胞增殖和分化、细胞凋亡与代谢等方面有着重要的作用。血小板衍化生长因子(PDGF)是机体内一种重要的结缔组织生长因子，当组织细胞缺氧或血管壁受到损伤时，能促进受损的内皮细胞修复和发挥神经保护作用。有文献实验结果显示，HSYA可能是通过升高PDGF水平，进而激活其介导的PI3K/Akt通路来发挥神经保护作用。有文献研究发现，HSYA能有效逆转细胞形态和超微结构的变化，可增加细胞存活，并抑制了OGD/R诱导的细胞凋亡，其中HSYA显着增加了p-Akt和pmTOR蛋白的水平。表明HSYA通过Ⅰ类PI3K/Akt/mTOR信号传导途径抑制自噬来保护脑血管内皮细胞免受OGD/R诱导的损伤。
红花改善血脑屏障，减轻脑水肿：Toll样受体4(TLR4)属于Ⅰ型跨膜蛋白，主要在小胶质细胞上表达，脑缺血发生后TLR4被激活产生一系列免疫应答因子，调节机体免疫功能和机体防御功能。有文献研究发现，HSYA可以抑制Wnt/β-catenin通路进而改善血脑屏障稳定性，使咬合蛋白(Occludin)和紧密连接相关蛋白5(Claudin-5)表达得到提高，其中Claudin和胞内紧密连接蛋白(ZO-1)结合，是组成紧密连接的主要结构蛋白，对血脑屏障的功能有着重要影响作用。然而阻断TLR4蛋白后，Occludin和Claudin-5表达明显减弱，则表明TLR4可以调控Wnt/β-catenin信号通路。则表明HSYA可以通过活化TLR4蛋白来调控Wnt/β-catenin通路，维持血脑屏障稳定性，减轻脑组织水肿。
红花抗血小板凝聚，降低血液黏度：有文献研究发现，HSYA对脑血管舒张有较强的作用，并且能显著降低血小板聚集，血液黏度，通过扩张脑血管和改善脑血管通透性治疗缺血性脑卒中。有文献研究发现，红花黄色素可以明显降低急性脑梗死患者的全血黏度、血小板聚集率等血液流变学指标，红花黄色素治疗后的患者脑血流动力学检测指标和平均血流速度也有明显改善。综上，表明红花可通过降低血液黏度，抗血小板凝聚，改善脑部血液循环从而发挥治疗缺血性脑卒中的作用。
王凯文献还对黄芪对脑缺血损伤的保护作用进行了详细阐述。黄芪属豆科草本植物，性温，味甘，归脾、肺经，具有补气升阳、益卫固表、生血行滞、增强免疫等功效，是我国传统的补气中药材之一。黄芪提取物中主要的成分有黄芪总苷和黄芪多糖，其中黄芪甲苷是黄芪总苷中主要活性成分。近年来一些相关研究表明，黄芪对缺血性脑卒中具有一定的脑保护作用，大致包括如下方面。
黄芪抗氧化和清除氧自由基作用：有文献研究发现，黄芪甲苷可以明显升高脑组织中SOD、GSH-Px、CAT含量，并降低MDA含量。表明黄芪甲苷可减轻脑组织氧化应激反应的发生，清除自由基，减轻缺血脑组织损伤程度。有文献研究发现，黄芪多糖可以降低大鼠脑缺血再灌注脑组织中NO含量、NOS活力以及MDA含量，增强SOD活性。综上表明黄芪可以通过抗氧化清除自由基从而发挥脑保护作用。
黄芪保护神经元和减少细胞凋亡：有文献研究发现，黄芪甲苷预处理的脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损程度减轻，脑梗死体积减小，神经细胞凋亡减少，正常神经细胞数量增加。有文献研究发现，经黄芪注射液治疗后，大鼠脑组织中神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达明显增加，脑组织凋亡细胞数量也明显减少。有文献研究，谷氨酸兴奋毒性损害线粒体己糖激酶-Ⅱ(HK-Ⅱ)并同时诱导细胞凋亡和由线粒体功能障碍引起的部分细胞凋亡。黄芪甲苷可激活Akt促进HK-Ⅱ与线粒体的结合，从而保证线粒体的结构和功能完整性有助于保护神经元免受细胞凋亡。综上表明，黄芪具有抑制细胞凋亡和保护神经元的作用。
黄芪减轻脑水肿、保护血脑屏障：脑缺血发生后脑组织血管内皮细胞肿胀，导致血脑屏障破坏，血脑屏障的通透性增加，引发脑水肿，进而会加重脑部的一系列继发性损伤。有文献研究，黄芪甲苷可以升高内皮细胞中ZO-1的表达显著减弱血脑屏障的通透性，维持血脑屏障稳定性，从而发挥对脑保护作用。有文献研究发现，黄芪治疗组大鼠的脑组织含水量显著减少，Occludin阳性血管数和ZO-1的阳性血管数显著增加。Occludin和ZO-1是组成内皮细胞紧密连接的主要结构蛋白，其表达量的高低与血脑屏障的开放和关闭具有密切的相关性。因此表明黄芪注射液能够改变血脑屏障的通透性，保护血脑屏障，降低脑组织的水肿程度，进而发挥脑保护作用。
黄芪降低脑组织中谷氨酸、Ca2+及升高Mg2+含量的作用：脑缺血后导致血脑屏障被破坏，大量兴奋性氨基酸(EAA)尤其是谷氨酸(Glu)的释放，EAA受体过度激活，会产生一系列病理反应，最终导致细胞死亡。其中Ca2+也能加速EAA释放，进而加重了EAA对组织的损伤作用。然而，Mg2+是目前较为确定的内源性脑保护因子，是天然的Ca2+拮抗剂。有文献研究发现黄芪注射液可降低脑组织中Ca2+、EAA和血浆ET的含量，抑制Mg2+减少，保护脑细胞，减少脑组织损伤，从而起到脑保护作用。
本发明产生了如本文上下文详述的有益效果。
附图说明
图1：神经功能学评分，与对照组比较**P<0.01，与模型组比较##P<0.01。
图2：大鼠脑缺血再灌注后大脑切片，与对照组(sham)比较**P<0.01，与模型组(Model)比较#P<0.05、##P<0.01。
图3：脑皮层梗死区免疫组化染色CD34表达结果(×200)，A)Sham、B)Model、C)40:1、D)20:1、E)5:1。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。在本发明中，如未特别指明，所用药材均为药材的干燥品，且符合药典规定。在本发明下面的实例中，制备组合物时，各种物料的投料量均以重量份计，并且在实际投料时，若无另外说明，每批次的全部物料总重量不少于5千克。
在本发明中，涉及数据统计时，采用SPSS17.0软件，实验结果中计量数据以(x±s)表示；进行方差齐性检验后通过方差分析比较各组间数据；P<0.05时认为差异有统计学意义。
实施例1：黄芪红花配伍对大鼠脑缺血后血管新生及Cav-1/VEGF信号通路的影响
如曹金一文献所记载的，进行了如下黄芪红花配伍对大鼠脑缺血后血管新生及Cav-1/VEGF信号通路的影响的研究。
1、实验动物及分组
雄性SPF级SD大鼠共60只，体质量为240～260g，购自第四军医大学实验动物中心，合格证编号：SCXK(军)2012-0007。适应性喂养1周后，随机分为对照组、模型组、黄芪/红花5:1组、黄芪/红花20:1组、黄芪/红花40:1组共5个动物组，每组12只。
2、试剂
黄芪-红花配方颗粒(广东一方制药有限公司)，CD34抗体、VEGF、caveolin-1抗体(均购自于CellSignaling TECHNOLOGY，批号分别为3569、2463S、9698、3267)，RT-PCR测定试剂盒(美国MBI公司，批号015234)，RIPA(强)裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，蛋白凝胶成像系统(上海培清科技有限公司，型号JS-786)，电泳仪(北京六一仪器厂，型号DYCZ30D)，倒置显微镜(Olympus，型号CX23)，Image-pro-plus6.0图像分析软件。
上述广东一方制备的黄芪-红花配方颗粒，其是照如下具体方法制备得到的：取药材黄芪，第一次加8倍水煎煮提取2小时，第二加7倍水煎煮提取1小时，合并两次煎液，过滤，70-80℃减压浓缩到相对密度1.25，喷雾干燥(进风温度：170℃-185℃，出风温度：85℃-90℃)，即得黄芪颗粒，根据药材投料量和所得颗粒计算每1g药材相当于提取物颗粒的重量；另取药材红花，第一次加8倍水煎煮提取2小时，第二加7倍水煎煮提取1小时，合并两次煎液，过滤，70-80℃减压浓缩到相对密度1.25，喷雾干燥(进风温度：170℃-185℃，出风温度：85℃-90℃)，即得红花颗粒，根据药材投料量和所得颗粒计算每1g药材相当于提取物颗粒的重量；按两种药材黄芪：红花重量比5：1的比例将黄芪颗粒和红花颗粒混合，得5：1颗粒；或者类似的方法混合得到40：1颗粒、20：1颗粒。
3、大鼠脑缺血再灌注损伤模型制备及给药
采用改良Longa法[Longa E Z,Weinstein P R,Carlson S,et al.Reversiblemiddle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20:84-89]制备脑缺血再灌注损伤大鼠模型，主要步骤：腹腔注射水合氯醛麻醉，仰卧位，固定，颈部备皮，颈正中部位切开皮肤，依次分离各动脉后，结扎颈总动脉和颈外动脉，并插入线栓(直径0.26～0.28mm，长度5cm)，栓塞90min，然后退出线栓进行再灌注24h，作为模型组(Model)。对照组(Sham)大鼠只开胸，不做处理。给药组在模型复制成功后分别灌胃给药黄芪-红花的5:1配方颗粒、20:1配方颗粒和40:1配方颗粒，每日剂量均为每1kg动物体重每天给以相当于12g总药材量的混合配方颗粒，每天1次，连续21d；混合配方颗粒给药前用适量0.9％生理盐水混悬。对照组和模型组灌胃给予纯净水。
4、神经功能学评分
按Bederson方法[Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebralarteryocclusion evaluation of the model and development of aneurologicexamination[J].Stroke,1986,17(3):472-476]进行神经功能学评分：无功能障碍为0级(0分)；无法伸展左侧前肢为1级(1分)；向左侧旋转为2级(2分)；向左侧倾倒为3级(3分)；无自主活动并伴有意识障碍为4级(4分)。于造模后和给药21d后各评估一次。评分较高者神经功能损伤较大。
结果见图1。由图中结果可见，与对照组(Sham)比较，模型组(Model)大鼠的神经功能学评分显著升高，而经过21d的给药治疗，各组的神经功能学评分均有所降低，尤其是黄芪-红花5:1组相较模型组改善最为明显(P<0.01)。在本发明中，对照组或称为Sham组，即假手术组。
5、脑梗死体积测定
采用TTC染色方法[Gu Li-juan,Xiong Xiao-xing,Wei Ding-tai,et al.T cellscontribute to stroke-induced lymphopenia in rats[J].PLOS ONE,2013,8(3):e59602]，步骤如下：10％水合氯酸麻醉，脱颈处死后，快速取出全脑，除去嗅球组织、小脑组织和低位脑干组织，其余脑组织于冰盘上切厚度为2mm的冠状切片。脑片置于37℃的1％TTC磷酸缓冲液中避光孵育15min，然后10％福尔马林中固定，吸干表面水分后，按次序整齐排列，数码相机拍照，分别测定红色和白色区域面积，计算梗死体积比。照片用图像分析系统Image Pro Plus 6.0计算每片脑组织的梗死面积、脑片面积。
结果见图2。如图所示，TTC染色结果显示，对照大鼠组脑组织切片呈现均匀红色，没有发现梗死病灶；而模型组梗死区皮层及纹状体缺血部分呈白色。在给药21d后，给药组梗死体积有明显的减少，尤其以黄芪-红花5:1改善最为明显(P<0.01)。
6、脑微血管密度(Microvascular density，MVD)的测定
取各组大鼠缺血周边脑组织，10％甲醛固定，石蜡包埋后，进行切片，脱蜡，热修复，H2O2封闭后，用CD34抗体(1：800)在4℃孵育过夜。然后，二抗常温孵育30min，DAB显色，苏木素复染，水洗返蓝，梯度酒精脱水后，树胶封片，拍片。右侧皮质区MVD计数采用WEIDNER法[Weidner N J,RSemple W R,Welch,et al.Tumor angiogenesis and metastasis:correlation in invasive breast carcinoma[J].N Engl JMed,1991,324:1-8]。结果见表1和图3。
表1：大鼠再灌注皮质区MVD(n＝8)
注：与Sham组比较**P<0.01，与模型组比较##P<0.01。
结果显示，与对照组比较，模型组皮质区MVD值显著高于对照组(P<0.01)。连续给药21d后，三个给药组皮质区MVD值均明显大于模型组，并高于对照组(P<0.01)，其中，以黄芪-红花5:1组皮质区MVD升高最为显著。
7、VEGF mRNA和Cav-1mRNA的检测
取各组大鼠缺血周边脑组织，采用TRIzol法提取总RNA，应用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，应用Real-time PCR技术检测mRNA的表达，GAPDH作为内参。VEGF引物序列、Cav-1引物序列、GAPDH引物序列参考曹金一文献(曹金一，等，黄芪红花配伍对大鼠脑缺血后血管新生及Cav-1/VEGF信号通路的影响，现代生物医学进展，2019，19(6)：1016)所记载的。结果见表2。
表2：大鼠再灌注皮质区VEGF mRNA和Cav-1mRNA相对表达量(n＝8)
| 组别 | VEGF mRNA | Cav-1mRNA |
| Sham | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 |
| Model | 0.516±0.14** | 0.435±0.05** |
| 40:1组 | 0.581±0.08 | 0.548±0.13## |
| 20:1组 | 0.723±0.06## | 0.666±0.03## |
| 5:1组 | 0.910±0.02## | 0.932±0.03## |
注：与Sham组比较**P<0.01，与模型组比较##P<0.01。
结果表明，与对照组比较，模型组皮质区VEGF mRNA和Cav-1mRNA的表达水平显著降低(P<0.01)，连续给药21d后，皮质区VEGFmRNA和Cav-1mRNA表达水平均有所升高(P<0.01)，尤其是黄芪红花5：1组，升高最为显著。
8、VEGF和Cav-1蛋白的检测
取各组大鼠缺血周边皮层脑组织，匀浆，离心后收集上清液，即为总蛋白提取液，加入到上样缓冲液中水煮变性，将等量蛋白加入到SDS-PAGE胶中，电泳，转膜至PVDF上，封闭2h，Cav-1和VEGF一抗1：500稀释后，在4℃孵育过夜。TBST洗膜后，在常温下孵育二抗60min，加入ECL发光底物。扫描并计算各条带的灰度，以GAPDH作为内参计算相对蛋白含量。
脑缺血再灌注损伤后，模型组皮质区的VEGF和Cav-1蛋白表达均明显低于对照组(P<0.01)，连续给药21d后，给药组脑缺血再灌注区VEGF和Cav-1蛋白表达量均有所升高，尤其是黄芪红花20:1组和5:1均显著高于模型组(P<0.01)。
实施例2：黄芪红花配伍对大鼠脑缺血后血管新生及Cav-1/VEGF信号通路的影响
1、参照实施例1进行试验，具体实验条件若未另外说明，均照实施例1进行。
大鼠购自空军军医大学实验动物中心，合格证编号：SCXK(陕)2019-001。各种试剂来源采购相同。
实施例1之5：1颗粒组的剂量为，每1kg动物体重每天给以相当于12g总药材量的混合配方颗粒，即1kg动物体重每天给以相当于药材10g黄芪和2g红花量的混合配方颗粒。
2、试药
照实施例1方法重新制备黄芪颗粒和红花颗粒；按两种药材黄芪：红花重量比5：1的比例将黄芪颗粒和红花颗粒混合得到5：1颗粒，作为组合物2a；按两种药材黄芪：红花重量比5：1的比例将黄芪颗粒和红花颗粒混合另外还添加天冬氨酸和泛酸钙所得混合颗粒，其中以每1重量份红花药材计，天冬氨酸和泛酸钙的量分别为0.02重量份和0.005重量份，作为组合物2b；按两种药材黄芪：红花重量比5：1的比例将黄芪颗粒和红花颗粒混合另外还添加天冬氨酸所得混合颗粒，其中以每1重量份红花药材计，天冬氨酸的量为0.02重量份，作为组合物2c；按两种药材黄芪：红花重量比5：1的比例将黄芪颗粒和红花颗粒混合另外还添加泛酸钙所得混合颗粒，其中以每1重量份红花药材计，泛酸钙的量为0.005重量份，作为组合物2d。本实施例2设置了对照组、模型组、组合物2a组、组合物2b组、组合物2c组、组合物2d组。根据下文关于组合物2b各方面的效果显著优于其它组别，已发出人意料地发现，当在混合颗粒中增补添加规定量天冬氨酸和泛酸钙时能够显著提高黄芪红花提取物治疗脑缺血的效果。
3、大鼠脑缺血再灌注损伤模型制备及给药
采用改良Longa法[Longa E Z,Weinstein P R,Carlson S,et al.Reversiblemiddle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20:84-89]制备脑缺血再灌注损伤大鼠模型，主要步骤：腹腔注射水合氯醛麻醉，仰卧位，固定，颈部备皮，颈正中部位切开皮肤，依次分离各动脉后，结扎颈总动脉和颈外动脉，并插入线栓(直径0.26～0.28mm，长度5cm)，栓塞90min，然后退出线栓进行再灌注24h，作为模型组(Model)。对照组(Sham)大鼠只开胸，不做处理。给药组在模型复制成功后分别灌胃给予组合物2a、组合物2b、组合物2c、组合物2d四种混合配方颗粒，每日剂量均为每1kg动物体重每天给以相当于12g总药材量的混合配方颗粒，每天1次，连续21d；混合配方颗粒给药前用适量0.9％生理盐水混悬。对照组和模型组灌胃给予纯净水。
4、神经功能学评分
按Bederson方法[Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebralarteryocclusion evaluation of the model and development of a neurologicexamination[J].Stroke,1986,17(3):472-476]进行神经功能学评分：无功能障碍为0级(0分)；无法伸展左侧前肢为1级(1分)；向左侧旋转为2级(2分)；向左侧倾倒为3级(3分)；无自主活动并伴有意识障碍为4级(4分)，在评分过程中还对不同级别的情形作赋分细化，例如0～1分之间根据情形取小数分值。于造模后和给药21d后各评估一次。评分较高者神经功能损伤较大。结果见下表。
| 组别 | 神经功能学评分(21天) |
| 对照组 | 0 |
| 模型组 | 2.93±0.17 |
| 组合物2a | 1.72±0.16** |
| 组合物2b | 1.13±0.17 |
| 组合物2c | 1.80±0.14** |
| 组合物2d | 1.69±0.18** |
四种组合物组的评分与模型组相比均有显著的降低(P<0.01)，**与组合物2a、组合物2c、组合物2d组相比组合物2b组评分显著更低(P<0.05)。
5、脑梗死体积测定
采用TTC染色方法[Gu Li-juan,Xiong Xiao-xing,Wei Ding-tai,et al.T cellscontribute to stroke-induced lymphopenia in rats[J].PLOS ONE,2013,8(3):e59602]，步骤如下：10％水合氯酸麻醉，脱颈处死后，快速取出全脑，除去嗅球组织、小脑组织和低位脑干组织，其余脑组织于冰盘上切厚度为2mm的冠状切片。脑片置于37℃的1％TTC磷酸缓冲液中避光孵育15min，然后10％福尔马林中固定，吸干表面水分后，按次序整齐排列，数码相机拍照，分别测定红色和白色区域面积，计算梗死体积比，结果见下表。
四种组合物组的评分与模型组相比均有显著的降低(P<0.01)，**与组合物2a、组合物2c、组合物2d组相比组合物2b组评分显著更低(P<0.05)。模型组等组别的TTC染色结果与实施例1类似。
6、脑微血管密度(Microvascular density，MVD)的测定
取各组大鼠缺血周边脑组织，10％甲醛固定，石蜡包埋后，进行切片，脱蜡，热修复，H2O2封闭后，用CD34抗体(1：800)在4℃孵育过夜。然后，二抗常温孵育30min，DAB显色，苏木素复染，水洗返蓝，梯度酒精脱水后，树胶封片，拍片。右侧皮质区MVD计数采用WEIDNER法[Weidner N J,RSemple W R,Welch,et al.Tumor angiogenesis and metastasis:correlation in invasive breast carcinoma[J].N Engl JMed,1991,324:1-8]。MVD结果见下表(n＝8)。
| 组别 | MVD |
| Sham | 7.68±0.12 |
| Model | 11.32±0.23 |
| 组合物2a | 18.44±0.17 |
| 组合物2b | 23.15±0.21 |
| 组合物2c | 19.27±0.32 |
| 组合物2d | 17.83±0.14 |
注：四种组合物组与Sham组比较均呈现P<0.005，四种组合物组与模型组比较均呈现P<0.01，组合物2a、组合物2c、组合物2d三者均显著低于组合物2b组(P<0.05)。结果显示组合物2b效果显著优于其它三种组合物的效果。
7、VEGF mRNA和Cav-1mRNA的检测
取各组大鼠缺血周边脑组织，采用TRIzol法提取总RNA，应用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，应用Real-time PCR技术检测mRNA的表达，GAPDH作为内参。VEGF引物序列、Cav-1引物序列、GAPDH引物序列参考曹金一文献(曹金一，等，黄芪红花配伍对大鼠脑缺血后血管新生及Cav-1/VEGF信号通路的影响，现代生物医学进展，2019，19(6)：1016)所记载的。结果见下表(n＝8)。
注：四种组合物组与模型组比较均呈现P<0.01，组合物2b显著高于组合物2a、组合物2c、组合物2d三者(P<0.05)。结果显示组合物2b效果显著优于其它三种组合物的效果。
脑缺血后，持续的缺氧和缺血导致脑神经细胞坏死、变性和凋亡，造成严重的神经功能损伤。美国心脏协会/美国卒中协会为医疗保健专业人员制定的2013年《急性缺血性卒中的早期治疗指南》中指出：“目前，没有哪种具有公认的神经保护作用的药物可有效改善缺血性卒中的结局，所以不建议使用其他神经保护剂”[Edward C Jauch,Jeffrey LSaver,Harold P Adams,et al.Guidelines for the Early Management of PatientsWith Acute Ischemic Stroke:A Guideline for Healthcare Professionals From theAmerican Heart Association/American Stroke Association[J].Stroke,2013,44:870-947]。而在局灶性脑缺血导致的脑损伤的后期是以神经再生、血管新生等脑重构表现为主的，有研究表明，缺血半暗带血管密度越高，卒中患者存活时间越长。因此，有效的保护缺血半暗带的神经元存活和建立丰富的侧支循环就成为脑梗塞研究的突破口，对改善中风的结果和卒中后功能恢复非常关键。
血管新生主要包括血管内皮细胞的激活、增殖、迁移、黏附，并最终新的腔样结构等过程，有多种活性因子参与这些过程。其中，VEGF是迄今为止发现最强的促血管新生活性因子，VEFG与其受体节后后，能够有效的刺激血管内皮前体细胞即内皮祖细胞的成熟和分化，同时促进血管内皮细胞黏附和迁移。有研究表明，Cav-1，是细胞膜主要支架蛋白之一，在介导VEGF的血管新生作用过程中扮演着重要角色。在Cav-1基因敲除鼠体内，由VEGF介导而生成的血管数量显著降低，同时，eNOS蛋白活性显著下降，最终NO生成减少；而给予VEGF刺激也不能有效的刺激血管生成，表现出较弱的血管新生能力。这充分证明了Cav-1和VEGF共同参与了血管新生的过程，并起着重要作用。血管新生与中医机理之益气生血、祛瘀生新等有着密切的关系，如“生脉”、“生肌”等。从中医角度看，“生脉”即采用益气生血类药物使原本闭塞的血管恢复通血或者刺激其他部位生成新的血管以代替原来闭塞的血管。
本发明人团队的前期研究证实黄芪的有效成分黄芪甲苷，红花的有效成分羟基红花黄色素A能够显著减小脑缺血再灌注损伤大鼠的脑梗死面积，促进神经功能的恢复，表明其具有抗脑缺血损伤的作用。本发明人团队的研究还显示，灌胃不同配比(40:1、20:1、5:1)的黄芪红花配方颗粒后大鼠的神经功能评分均显著低于模型组，且脑梗死体积显著低于模型组，表明黄芪红花配伍可有效的保护脑缺血损伤，恢复神经功能；三种不同配比组的大鼠损伤皮质区MVD显著高于模型组，表明黄芪红花配伍可以促进损伤脑区的血管新生；且三个给药组脑缺血再灌注区的VEGF和Cav-1mRNA和蛋白表达水平均明显高于模型组，效果最佳的组别为黄芪红花5：1组。基于前期研究结果，可以推测，黄芪红花配伍确可以通过上调Cav-1，促进VEGF的表达，促进血管新生，从而改善脑缺血损伤，且最优的配伍比例应为黄芪红花5：1。
虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.用于治疗脑血管疾病的中药组合物，其特征在于，由中药材黄芪和红花的提取物并添加天冬氨酸和泛酸钙制得，其中，所述中药材黄芪和红花的重量比为5：1；以每1重量份的中药材红花计，所述天冬氨酸和所述泛酸钙的添加量分别为0.02重量份和0.005重量份。
2.根据权利要求1的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物的制剂形式为颗粒剂、胶囊剂、片剂、溶液剂或丸剂；所述中药组合物还包含制成所述制剂形式的药用辅料。
3.制备权利要求1-2任一项所述中药组合物的方法，其特征在于，包括：用黄芪和红花经分别提取得到提取物后，另外添加天冬氨酸和泛酸钙混合。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述用黄芪和红花经分别提取得到提取物后，另外添加天冬氨酸和泛酸钙混合，包括如下步骤：
取药材黄芪，并加水进行第一次煎煮提取2小时，第一次煎煮的水量为所述黄芪重量的8倍；将所述黄芪加水进行第二次煎煮提取1小时，第二次煎煮的水量为所述黄芪重量的7倍；合并两次煎煮提取的黄芪煎液进行过滤，并在70℃-80℃进行减压浓缩，使所述黄芪煎液的相对密度为1.25；然后进行喷雾干燥，即得黄芪颗粒；
另取药材红花，并加水进行第一次煎煮提取2小时，第一次煎煮的水量为所述红花重量的8倍；将所述红花加水进行第二次煎煮提取1小时，第二次煎煮的水量为所述红花重量的7倍；合并两次煎煮提取的红花煎液进行过滤，并在70℃-80℃进行减压浓缩，使所述红花煎液的相对密度为1.25；然后进行喷雾干燥，即得红花颗粒；
按两种药材重量比将黄芪颗粒和红花颗粒混合，混合时另外添加天冬氨酸和泛酸钙，即得所述中药组合物；
其中，所述喷雾干燥的进风温度是170℃-185℃，出风温度是85℃-90℃。
5.权利要求1-2任一项所述中药组合物在制备用于治疗脑血管疾病的药物中的用途；所述中药组合物用于促进脑缺血后的血管新生、改善脑缺血后的神经功能、减小脑缺血后的脑梗死体积和/或提高脑缺血后的脑微血管密度。
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