CN112694543A - 一种多糖及其制法和在制备治疗乙肝的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多糖及其制法和在制备治疗乙肝的药物中的应用，所述多糖以阿拉伯糖为主链、结构如式I所示，R1为(1，4)β‑D‑半乳糖基，R2为(1，3)α‑L‑鼠李糖基，R3为(1，2，6)α‑D‑葡萄糖基、R4为(1，6)α‑D‑葡萄糖基，R5为(1，5)α‑L‑阿拉伯糖基，R6为(1，6)α‑D‑葡萄糖醛酸基，R7为(1，4)β‑D‑半乳糖醛酸基；所述多糖的重均分子量为25～3000KD。细胞试验证明，本发明所述的多糖，可显著抑制HBV DNA、HBsAg、HBeAg的表达和分泌，抑制病毒传染的入胞、cccDNA复制、逆转录等多个环节，发挥抗乙肝病毒的作用，可以用于制备治疗乙肝的药物。

Description

一种多糖及其制法和在制备治疗乙肝的药物中的应用

技术领域

本发明属于天然药物领域，具体涉及一种多糖及其制法和在制备治疗乙型肝炎(以下简称乙肝)的药物中的应用。

背景技术

乙肝是由乙肝病毒(HepatitisB Virus，HBV)引起的一种严重危害人类健康的疾病。HBV持续感染会导致肝硬化和原发性肝细胞癌等肝脏疾病，死亡率很高。尽管乙肝疫苗已广泛使用，在一定范围内对乙肝起到有效的预防，但由于存在无应答、抗体失活和不良反应等问题，仍存在大量无症状乙肝病毒感染者。研究显示，“无症状乙肝病毒携带者”中部分肝活检病理报告为慢性迁延性肝炎或慢性活动性肝炎，长期的乙肝病毒感染可发展为肝硬化、甚至肝癌。

目前乙肝治疗主要采取调节免疫和抗病毒两种治疗方式，其中免疫调节剂主要是干扰素α-2b(IFN-α，1986)，聚乙二醇干扰素α-2b(Pegα-2b，2001)以及聚乙二醇干扰素α-2a(Pegα-2a，2005)；抗病毒治疗主要药物是拉米夫定(LAM，1998)，阿德福韦酯(ADV，2002)，恩替卡韦(ETV，2005)，替比夫定(TBV，2006)，替诺福韦酯(TDF，2008)，替诺福韦艾拉酚氨(TAF，2016)。

干扰素采用注射给药，患者顺应性差，价格昂贵，副作用较多且部分患者存在对干扰素应答低的现象，影响其疗效的发挥；而直接的HBV抗病毒药虽然应用较广泛，疗效较确切，但也存在毒性、致突变性、缺乏选择性、耐药性、生物利用度差以及合成困难等问题。因此，有必要开发安全有效、副作用小、不易产生耐药性的一类药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多糖及其制法和在制备治疗乙肝的药物中的应用。本发明多糖对乙肝病毒表面抗原和核心抗原的表达有显著抑制作用；同时本发明多糖分离自天然产物，原料和成本相对可控。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种多糖，以阿拉伯糖为主链、结构如式I所示：

式I中，主链和侧链中的数字代表连接位点，箭头代表连接方向；

所述多糖的重均分子量为25～3000KD；

式I中，R1为(1，4)β-D-半乳糖基，R2为(1，3)α-L-鼠李糖基，R3为(1，2，6)α-D-葡萄糖基、R4为(1，6)α-D-葡萄糖基，R5为(1，5)α-L-阿拉伯糖基，R6为(1，6)α-D-葡萄糖醛酸基，R7为(1，4)β-D-半乳糖醛酸基；

式I中，n为50～8000，n1为60～6000，n2为5～1000，n3为2～1000，n4为1～500，n5为1～1000，n6为10～1000，n7为10～1500；

特别优选地，所述多糖的重均分子量为2200KD；

式I中，n为3000，n1为4650，n2为500，n3为500，n4为300，n5为1000，n6为400，n7为1125。

所述多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将醋柴胡以水、酸水、碱水、含酶水为提取溶液，在50-100℃下提取；或先将药材以乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇中的一种或两种浸泡脱脂后，再以水、酸水、碱水、含酶水溶液在30～100℃温度下提取；

优选地，步骤(1)将醋柴胡加水回流提取4h；

(2)提取液浓缩，加入乙醇，放置过夜，过滤取沉淀，将沉淀洗涤、加水溶解后除蛋白，上层析柱，先以0％浓度的NaCl溶液洗脱至流份中无糖检出，然后依次以0.05M、0.1M、0.2M、0.4M、1M NaCl溶液洗脱至少3倍柱体积，最后以0.5M氢氧化钠洗脱，收集0.1M NaCl溶液的洗脱液，减压浓缩，透析除盐，冷冻干燥，得到重均分子量2200KD的多糖；将重均分子量2200KD的多糖水解、分段透析、层析和纯化，得到重均分子量为200～1000KD的多糖；

优选地，步骤(2)中加入乙醇至含醇量为80％；

步骤(2)所述的层析柱为凝胶柱或纤维素柱；

优选地，步骤(2)所述的水解是加入0.1M HCL溶解，于37℃水解4h；

步骤(2)所述分段透析的分段是100-750KD、10-100KD和3-10KD。

细胞试验证明，本发明所述的多糖，可显著抑制HBV DNA、HBsAg、HBeAg的表达和分泌，抑制病毒传染的入胞、cccDNA复制、逆转录等多个环节，发挥抗乙肝病毒的作用，可以用于制备治疗乙肝的药物；

所述的治疗乙肝的药物，包括治疗有效量的所述多糖和药学上可接受的载体，所述的载体如水、淀粉、乳糖、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等药学上常用赋形剂，如苯甲酸钠、尼泊金乙酯等防腐剂，助流剂如硬脂酸镁，崩解剂如羧甲基纤维素钠等。

所述的多糖可以以药物组合物的形式给予需要的患者，其不仅可以制备成口服液等液体制剂，还可以制备成为片剂、胶囊、冲剂、丸剂等固体制剂。给药途径可为口服，或局部给药，例如经皮等。剂量为0.1～5g/天，具体可由医师根据患者的具体情况决定。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明的多糖可以抑制乙肝病毒抗原表达，抑制乙肝病毒DNA复制，从而发挥抗乙肝作用，有望作为乙肝辅助治疗药物。

附图说明

图1为醋柴胡总多糖的洗脱曲线。

图2为本发明多糖的分子量测定图谱。

图3为本发明多糖的红外光谱。

图4为本发明多糖的¹H-NMR图谱。

图5为本发明多糖的¹³C-NMR图谱。

图6为本发明多糖的HMBC-NMR图谱。

图7为本发明多糖的HSQC-NMR图谱。

图8为本发明多糖的DEPT-NMR图谱。

图9为本发明多糖的COSY-NMR图谱。

图10为本发明多糖对乙肝表面抗原和乙肝核心抗原表达的影响(n＝3)。

图11为本发明多糖对乙肝病毒基因片段抑制作用。

图12为100-750KD分段所得透析液的洗脱曲线。

图13为10-100KD分段所得透析液的洗脱曲线。

图14为3-10KD分段所得透析液的洗脱曲线。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中，多糖的红外光谱采用文献(Zhao Ya，Wan Peng et al,CarbohydratePolymers，2020，229:115473)报道的方法进行检测，多糖的磁共振1H、13C、HMBC、HSQC、DEPT、COSY图谱采用文献(万鹏，广东药科大学硕士研究生论文)报道的方法进行检测。

实施例1

本发明多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)醋柴胡药材加20重量倍量的水浸泡0.5h，回流提取，提取时间4h，过滤，收集提取液，残渣加水重复提取两次，合并提取液，减压浓缩至含药材量为0.5g/mL，加入无水乙醇使醇的体积含量为80％，搅拌，冷藏过夜，过滤，滤渣以体积浓度80％乙醇反复洗涤，收集滤渣，干燥，得粗多糖。

(2)粗多糖加水溶解，与sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)按照5:1的比例混合剧烈震摇，离心20min，3000r/min，除去变性蛋白层和溶剂层。把得到的多糖溶液浓缩去除溶液中残留的氯仿和正丁醇，用蒸馏水溶解，以4倍乙醇醇沉，离心取上清，放入-80℃冰箱并冻干，得醋柴胡总多糖。

(3)总多糖加20重量倍水溶解，上样到装载着DEAE琼脂糖凝胶Fast Flow离子交换层析柱上，洗脱条件：平衡流速为5mL/min，依次以水、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、1mol/L的氯化钠以及0.5mol/L的氢氧化钠进行洗脱。利用全自动收集器分梯度收集，每个溶液梯度洗脱3倍柱体积，收集100管，每管10mL，各管组分用苯酚-硫酸法进行隔管测定，并作出洗脱曲线。洗脱曲线如图1所示(VBCP-1对应0.05mol/L氯化钠的洗脱液，以此类推)。

(4)将收集到的多糖溶液浓缩至50mL，放入3500Da分子量的透析袋透析3天，每天换双蒸水6次以上，每次隔2个小时，将透析袋内多糖进行冻干，得到不同洗脱液对应的精多糖。

将0.1M NaCL洗脱得到的精多糖溶于1mL纯水中，并上到装载着Sependx G-200葡聚糖凝胶层析柱(16×900mm)，洗脱条件：平衡流速0.3mL/min，用纯水进行洗脱，并用苯酚硫酸法测定并做出洗脱曲线，以洗脱曲线收集，并冻干，即得到本发明所述的多糖(为均一多糖)。

所得多糖的重均分子量为2200KD(分子量测定图谱如图2所示)；所得多糖的红外光谱见图3，多糖的¹H-NMR、¹³C-NMR、HMBC-NMR、HSQC-NMR、DEPT-NMR和COSY-NMR谱图见图4-图9，数据如下:

表1.本发明多糖的¹HNMR和¹³C NMR数据

^aData was recorded at 600MHz for proton and at 150MHz for carbon inD₂O.

推断所得多糖的结构如式I所示，其中：R1为(1，4)β-D-半乳糖基，R2为(1，3)α-L-鼠李糖基，R3为(1，2，6)α-D-葡萄糖基、R4为(1，6)α-D-葡萄糖基，R5为(1，5)α-L-阿拉伯糖基，R6为(1，6)α-D-葡萄糖醛酸基，R7为(1，4)β-D-半乳糖醛酸基；n为6，n1为9.27，n2为1，n3为1，n4为0.29，n5为0.97，n6为0.78，n7为2.25。

实施例2多糖抗乙肝病毒作用考察

采用实施例1最后获得的多糖进行以下实验；

将生长良好的HepG2.2.15细胞以150,000个/mL浓度接种于12孔板，每孔1mL，置于(37℃、5％CO₂)培养箱内24h，待细胞完全贴壁后，换液，每孔加入1mL含药完全培养基(DMEM高糖基础培养基+10％南美胎牛血清+1％链霉素和青霉素，gibco公司)，每个浓度梯度3个复孔，平行三次。加药24h后吸取培养液测定乙型肝炎表面抗原和乙肝核心抗原。如试剂盒(上海科华生物工程有限公司)说明书所述操作，将样本平衡至室温，试剂盒37℃平衡30min。实验孔每孔加入细胞上清75μL，同时设立阴性对照3孔，阳性对照1孔，空白对照1孔，对照孔操作同实孔。用封片纸封住反应板，置于37℃培养箱孵育1h；取出，每孔加入50μL酶结合物，轻微震荡混匀，用封片纸封板，置于37℃培养箱孵育1h；取出后，先弃去孔内液体，然后将配制好的洗涤液注满各孔，每孔200μL，静置30-60s后，弃去孔内洗涤液，每次尽可能将孔内液体甩净，最后一次须将孔板完全拍干。每孔加入显色剂A，显色剂B各50μL，轻微震荡混匀，用封片纸封板，置于37℃培养箱孵育30min；每孔加终止液50μL，轻微震荡混匀，450nm波长处测定吸光度OD值，以空白对照孔校零，计算抑制率，结果见图10。

P1、P2、P3分别为浓度为10μg/mL、2.5μg/mL、0.625μg/mL的多糖，Lam为1μg/mL的阳性对照药拉米夫定。

由图10可以看出，拉米夫定及本发明多糖三个浓度均显著抑制乙肝病毒表面抗原表达；拉米夫定和多糖的高、低浓度均显著抑制乙肝病毒核心抗原的表达，显示出一定的抗乙肝病毒作用。

实施例3本发明多糖对乙肝病毒基因表达的影响

采用实施例1最后获得的多糖进行以下实验；

将生长良好处于对数生长期的HepG2.2.15细胞以150,000个/mL浓度接种于12孔板，每孔1mL，置于(37℃、5％CO₂)培养箱内24h，待细胞完全贴壁后，换液，每孔加入1mL含药完全培养基(DMEM高糖基础培养基+10％南美胎牛血清+1％链霉素和青霉素，gibco公司)。

于固定给药时间后，吸弃上层培养液，孔板底部贴壁细胞用预冷的PBS洗三次，每孔加入1mL trizol裂解液裂解细胞，轻轻吹打，待细胞裂解完全后转移至1.5mL无核酸酶的EP管中。每管加入氯仿200μL，上下剧烈摇晃15s，避光静置10min，12,000rpm/min 4℃离心15min。取上清液不超过400μL，加入500μL预冷的异丙醇，上下颠倒摇晃15s，充分混匀后，静置15min，12,000rpm/min 4℃离心10min。加入用DEPC水配制的75％乙醇溶液1mL，清洗RNA沉淀，7500rpm/min 4℃离心5min，重复两次。弃上清液，视沉淀多少用10-20μL DEPC水复溶RNA，60℃干浴10min，测定RNA浓度。测RNA浓度后按照Roche逆转录试剂盒说明书采用两步逆转录法，将RNA逆转录成cDNA。

引物设计：引物由Gene Bank数据库中检索，Life Technologies(Invitrogen)英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。引物序列见表2：

表2 RT-PCR实验引物模板

PCR反应：反应体系10μL，包括SYBR Green Master 5μL,引物上下游各0.3μL，cDNA模板1μL，DEPC水3.4μL。反应过程如下：95℃预变性10min，进入循环，95℃变性10s，60℃退火、延伸30s，循环40次。以GAPDH作为内参，将所得Ct值按2-^ΔΔct的方法进行处理，结果见图11。

P1、P2、P3分别为浓度10μg/mL、2.5μg/mL、0.625μg/mL的多糖，Lam为1μg/mL的阳性对照药拉米夫定。

HBV DNA基因组包括四个部分重叠的开放阅读框架，编码7种病毒蛋白质。前核心基因(precore)编码非结构性分泌型HBV e抗原(HBeAg)，与之部分重叠的核心基因(core)编码HBV核心抗原(HBcAg)，它是病毒核衣壳的主要成分。聚合酶基因(Polymerase gene)编码病毒聚合酶(HBV polymerase)，它包括逆转录酶(reverse transcriptase)(RT)结构域，核糖核酸酶H(RNase H)结构域和末端蛋白(TP)结构域。HBV表面抗原基因(HBsAg gene)编码三种HBV表面蛋白，即大(L)、中(M)和小(S)表面蛋白，它们是病毒脂质的一部分。这些表面蛋白质由不同的启动子合成，并涉及病毒附着，成熟，分泌和免疫原性。X基因编码小的调节性HBV X蛋白(HBx)，它的功能目前尚不明确，其可能与肝癌(HCC)进展有关。

图11结果显示，本发明多糖对HBV基因组reverse transcriptase、HBsAg gene、precorn及HBx四个不同片段均有显著抑制作用，抑制HBV DNA在HepG2.2.15细胞中的表达，且其作用具有剂量依赖性。此外，本发明也以临床常用抗病毒药物拉米夫定为阳性药，对比其与本发明多糖在对HBV基因组抑制作用的异同。结果表明，1μg/mL拉米夫定只对HBV基因组reverse transcriptase和HBsAg gene片段有显著抑制作用，这与核苷(酸)类药物的抗病毒机制有关，比本发明多糖少两个作用位点，提示本发明多糖的抗乙肝病毒作用效果更好。

实施例4

实施例1多糖(分子量2200KD)与醋柴胡总多糖抗乙肝病毒作用的比较

将生长良好的HepG2.2.15细胞以150,000个/mL浓度接种于12孔板，每孔1mL，置于(37℃、5％CO₂)培养箱内24h，待细胞完全贴壁后，换液，每孔加入1mL含药完全培养基(DMEM高糖基础培养基+10％南美胎牛血清+1％链霉素和青霉素，gibco公司)，每个浓度梯度3个复孔，平行三次。加药24h吸取培养液测定乙型肝炎表面抗原和乙肝核心抗原。如试剂盒(上海科华生物工程有限公司)说明书所述操作，将样本平衡至室温，试剂盒37℃平衡30min。实验孔每孔加入细胞上清75μL，同时设立阴性对照3孔，阳性对照1孔，空白对照1孔，对照孔操作同实孔。用封片纸封住反应板，置于37℃培养箱孵育1h；取出，每孔加入50μL酶结合物，轻微震荡混匀，用封片纸封板，置于37℃培养箱孵育1h；取出后，先弃去孔内液体，然后将配制好的洗涤液注满各孔，每孔200μL，静置30-60s后，弃去孔内洗涤液，每次尽可能将孔内液体甩净，最后一次须将孔板完全拍干。每孔加入显色剂A，显色剂B各50μL，轻微震荡混匀，用封片纸封板，置于37℃培养箱孵育30min；每孔加终止液50μL，轻微震荡混匀，450nm波长处测定吸光度OD值，以空白对照孔校零，计算抑制率，结果见表3。

本实施例所使用的醋柴胡总多糖为实施例1步骤(2)制得。

表3 本发明多糖与醋柴胡总多糖抗乙肝病毒作用比较

由表3可以看出，在用量几倍、几十倍于本发明多糖的情况下，醋柴胡总多糖对乙肝病毒表面抗原表达和乙肝病毒核心抗原表达的抑制率还远不如本发明多糖。

实施例5

取实施例1步骤(4)得到的0.1M NaCL洗脱得到的均一多糖2g，加入20倍0.1M HCL溶解，于37℃水解4h，水解液用500D分子量透析膜以蒸馏水透析除去多余盐酸，待pH值为6.5-7时，停止透析，分别用分子量为3-10KD、10-100KD、100-750KD的透析膜对前述透析液进行透析分段。

分段后所得各段透析液分别上样到装载着DEAE琼脂糖凝胶Fast Flow离子交换层析柱上，洗脱条件：平衡流速为5mL/min，依次以水、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、1mol/L的氯化钠以及0.5mol/L的氢氧化钠进行洗脱。利用全自动收集器分梯度收集，每个溶液梯度洗脱3倍柱体积，收集100管，每管10mL，各组分用苯酚-硫酸法进行隔管测定，并作出洗脱曲线，洗脱曲线如图12-图14所示。

取量较多的三个多糖溶液。具体地，100-750KD分段所得透析液取水洗部分，10-100KD和3-10KD分段所得透析液取0.4mol/L氯化钠的洗脱部分。同实施例1方法纯化，分别得到分子量分别为1000KD(100-750KD分段所得透析液)、500KD(10-100KD分段所得透析液)和200KD(3-10KD分段所得透析液)的多糖。单糖组成分析结果及红外、核磁图谱与实施例1基本一致。

上述所得多糖采用实施例2中方法，考察其抗乙肝病毒活性，结果见表4：

表4 不同分子量本发明多糖抗乙肝病毒作用

由表4可以看出，在200-1000KD的分子量范围内，本结构多糖均具有一定的抗乙肝病毒作用。

实施例6

一种治疗乙肝的片剂，由实施例1的多糖200g、淀粉300g、硬脂酸镁5g和羧甲基纤维素钠10g，采用本领域公知的方法，制备成为片剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多糖，其特征在于：以阿拉伯糖为主链、结构如式I所示：

式I中，R1为(1，4)β-D-半乳糖基，R2为(1，3)α-L-鼠李糖基，R3为(1，2，6)α-D-葡萄糖基、R4为(1，6)α-D-葡萄糖基，R5为(1，5)α-L-阿拉伯糖基，R6为(1，6)α-D-葡萄糖醛酸基，R7为(1，4)β-D-半乳糖醛酸基；

所述多糖的重均分子量为25～3000KD。

2.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：式I中，n为50～8000，n1为60～6000，n2为5～1000，n3为2～1000，n4为1～500，n5为1～1000，n6为10～1000，n7为10～1500。

3.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：重均分子量为2200KD。

4.根据权利要求3所述的多糖，其特征在于：式I中，n为3000，n1为4650，n2为500，n3为500，n4为300，n5为1000，n6为400，n7为1125。

5.权利要求1-4任一项所述多糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将醋柴胡以水、酸水、碱水、含酶水为提取溶液，在50-100℃下提取；或先将药材以乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇中的一种或两种浸泡脱脂后，再以水、酸水、碱水、含酶水溶液在30～100℃温度下提取；

(2)提取液浓缩，加入乙醇，放置过夜，过滤取沉淀，将沉淀洗涤、加水溶解后除蛋白，上层析柱，先以0％浓度的NaCl溶液洗脱至流份中无糖检出，然后依次以0.05M、0.1M、0.2M、0.4M、1M NaCl溶液洗脱至少3倍柱体积，最后以0.5M氢氧化钠洗脱，收集0.1M NaCl溶液的洗脱液，减压浓缩，透析除盐，冷冻干燥，得到重均分子量2200KD的多糖；将重均分子量2200KD的多糖水解、分段透析、层析和纯化，得到重均分子量为200～1000KD的多糖。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中加入乙醇至含醇量为80％。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的层析柱为凝胶柱或纤维素柱。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的水解是加入0.1M HCL溶解，于37℃水解4h。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述分段透析的分段是100-750KD、10-100KD和3-10KD。

10.权利要求1-4任一项所述的多糖在制备治疗乙肝的药物中的应用。

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