CN105924537A - 一种柴胡多糖的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柴胡多糖的提取方法，它包括如下步骤：a、预处理：取柴胡，粉碎，脱脂；b、水提：向脱脂柴胡粗粉中加入30～50倍体积量的水提取，提取温度为80～100℃，提取时间3～5h，提取两次，合并提取液；c、醇沉：浓缩提取液，加入乙醇，静置，收集沉淀，即得柴胡多糖提取物。实验结果表明，采用该方法可显著提高柴胡多糖的提取率及提取物中多糖含量，并且可以减少提取过程中杂质的溶出、减少了提取物中的结合蛋白，有利于提高后续纯化过程的效率。

Description

一种柴胡多糖的提取方法

技术领域

本发明涉及一种柴胡多糖的提取方法，属于医药领域。

背景技术

柴胡为伞形科植物北柴胡(Bupleurum chinese DC.)或狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根，系常用中药。目前已有大量关于柴胡药理作用和化学成分的文献报道，现代研究表明，柴胡多糖是其重要的生物活性成分之一，具有抗辐射、降血脂、增强免疫功能和抗病毒等作用，还有较强的抗溃疡作用，对肝炎和系统性红斑狼疮、肾炎、类风湿关节炎等自身免疫性疾病具有重要的临床价值。然而，已有研究证实，柴胡多糖的相对分子量在1×10⁴～1.2×10⁵之间，分子量大且黏度较高，导致其难以穿透细胞生物膜、难以扩散出细胞外，成为限制其提取转移率的主要原因(周泽琴等.中药水提取有效成分转移率低的问题分析[J].中草药，2014，45(23)：3478～3485)。因此，如何有效提高柴胡多糖的提取率和提取物中多糖含量，成为了柴胡多糖资源开发利用中面临的一大难题。

目前已有不少研究者进行了提高柴胡多糖提取率和多糖纯度的努力，然而并未取得令人满意的结果。李岱等采用超声波辅助提取柴胡多糖，在充分优化各个条件参数(比如超声波功率、超声波作用时间、料液比等等)的情况下，也仅仅将柴胡多糖的提取率由传统水提工艺的2.09％提高至2.58％，将多糖纯度由38.14％提高至44.14％(李岱等.超声波处理对柴胡多糖提取率、微观形貌特征及生物活性的影响[J].生物加工过程，2009，7(2)：29～34)。可见，由于柴胡多糖特殊的理化性质，充分提高其提取率及纯度非常困难。

因此，提供一种工艺简单的提取方法，最大限度从柴胡中提取出多糖成分并提高多糖纯度，成为了一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种柴胡多糖的提取方法，以解决现有方法提取率低、多糖纯度不高的问题。

本发明提供了一种柴胡多糖的提取方法，它包括如下步骤：a、预处理：取柴胡，粉碎，脱脂；b、水提：向脱脂柴胡粗粉中加入30～50倍体积量的水提取，提取温度为80～100℃，提取时间3～5h，提取两次，合并提取液；c、醇沉：浓缩提取液，加入乙醇，静置，收集沉淀，即得柴胡多糖提取物。

其中，所述的脱脂条件为：向柴胡粗粉中加入5倍体积量的95％v/v乙醇水溶液，于80℃回流，每次2小时，直至溶剂无色，弃去溶剂，得脱脂柴胡粗粉。

其中，所述的醇沉条件为：醇沉时乙醇体积百分数为75％，醇沉时间为22h。

进一步的，所述的水提条件为：向脱脂柴胡粗粉中加入30～50倍体积量的水提取，提取温度为84～100℃，提取时间4～5h。

更进一步的，所述的水提条件为：向脱脂柴胡粗粉中加入34～46倍体积量的水提取，提取温度为95～100℃，提取时间4～5h。

更进一步的，所述的水提条件为：向脱脂柴胡粗粉中加入38～40倍体积量的水提取，提取温度为98～100℃，提取时间4～5h。

优选的，所述的水提条件为：向脱脂柴胡粗粉中加入38倍体积量的水提取，提取温度为98℃，提取时间4h。

进一步优选的，所述的提取方法还包括Sevage除蛋白步骤。

其中，所述的Sevage除蛋白条件为：加入柴胡多糖提取物1/5体积量的sevag试剂，震荡20min，4000r/min离心15min，分离得到上清液；采用相同方法处理4次，收集最终得到的上清液，加入95％v/v乙醇至乙醇浓度达80％v/v，于4℃静置22h后取出，4000r/min离心10min，收集沉淀，用无水乙醇、丙酮和乙醚依次各洗涤2次，得精制柴胡多糖提取物。

本发明提供了一种根据所述提取方法制备得到的柴胡多糖提取物。

本发明提供了一种柴胡多糖的提取方法。实验结果表明，采用该方法可显著提高柴胡多糖的提取率及提取物中多糖含量，并且可以减少提取过程中杂质的溶出、减少了提取物中的结合蛋白，有利于提高后续纯化过程的效率。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为醇沉时间对柴胡多糖得率(左)和多糖含量(右)的影响图；

图2为醇沉浓度对柴胡多糖得率(左)和多糖含量(右)的影响图；

图3为料液比对柴胡多糖得率(左)和粗多糖含量(右)的影响图；

图4为提取温度对柴胡多糖得率(左)和粗多糖含量(右)的影响图；

图5为提取时间对柴胡多糖得率(左)和粗多糖含量(右)的影响图；

图6为提取次数对柴胡多糖得率(左)和粗多糖含量(右)的影响图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

柴胡多糖测定方法

以D(+)-无水葡萄糖为对照品，采用苯酚-浓硫酸法测定多糖含量

1、对照品溶液制备

精密称取105℃下干燥恒重的D(+)-无水葡萄糖对照品20mg，置100mL容量瓶中加水溶解定容摇匀,得0.2mg·mL-1对照品溶液备用。

2、供试品溶液制备

精密称取干燥置恒重的柴胡粗多糖20mg，置100mL容量瓶中加水溶解定容，摇匀即得0.2mg·mL-1供试品溶液，备用。

3、线性关系考察

分别精密量取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置10mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀即得不同浓度葡萄糖对照品溶液。再分别吸取上述配制的各浓度葡萄糖对照品溶液2.0mL置10mL干燥具塞刻度试管中，分别加入新配置的5％苯酚溶液1.0mL，再迅速加入浓硫酸5.0mL，摇匀，沸水浴中加热15min，再置冰水浴中冷却，室温放置10min，于490.5nm处测定吸光度(A)，以葡萄糖质量浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，进行线性回归，建立回归方程A＝0.06167C+0.05393，r＝0.9996，结果表明葡萄糖在2.49μg·mL-1～12.34μg·mL-1范围内线性关系良好。

4、柴胡多糖得率及含量的计算

柴胡多糖得率(％)＝[(样品液浓度*稀释倍数*样品液体积)/柴胡试样质量]*100％

柴胡多糖含量(％)＝[(样品液浓度*稀释倍数*样品液体积)/粗多糖质量]*100％

实施例1 本发明柴胡多糖提取方法

预处理：将柴胡饮片进行粉碎，过40目筛，向柴胡粗粉中加入5倍体积量的95％v/v乙醇水溶液，于80℃回流，每次2小时，直至溶剂无色，弃去溶剂，得脱脂柴胡粗粉，过5号筛。

水提：取脱脂柴胡粗粉2g，加入38倍体积量的水提取，提取温度为98℃，提取时间4h，提取两次，合并提取液。

醇沉：浓缩提取液至原液体积1/5，加入95％v/v乙醇使醇沉浓度达75％v/v，静置22h，收集沉淀，即得柴胡多糖提取物0.2352g，多糖提取率为6.29％，多糖含量为53.57％。

脱蛋白：sevag试剂[氯仿：正丁醇＝4：1(V/V)]:柴胡多糖提取物＝1：5(V/V)，剧烈震荡20min，高速离心机离心15min(4000r/min)，分离得到上清液，对上清液反复脱蛋白4次，再次分离得到上清液，加入95％乙醇至乙醇浓度达80％，置4℃冰箱内静置22小时后取出离心10min(4000r/min)，取沉淀用无水乙醇、丙酮和乙醚依次各洗涤2次，得精制柴胡多糖0.1709g，多糖含量为67.85％。

实施例2 本发明柴胡多糖提取方法

预处理：将柴胡饮片进行粉碎，过40目筛，向柴胡粗粉中加入5倍体积量的95％v/v乙醇水溶液，于80℃回流，每次2小时，直至溶剂无色，弃去溶剂，得脱脂柴胡粗粉，过5号筛。

水提：取脱脂柴胡粗粉2g，加入40倍体积量的水提取，提取温度为100℃，提取时间5h，提取两次，合并提取液。

醇沉：浓缩提取液至原液体积1/5，加入95％v/v乙醇使醇沉浓度达75％v/v，静置22h，收集沉淀，即得柴胡多糖提取物0.3054g，多糖提取率为6.74％，多糖含量为44.13％。

脱蛋白：sevag试剂[氯仿：正丁醇＝4：1(V/V)]:柴胡多糖提取物＝1：5(V/V)，剧烈震荡20min，高速离心机离心15min(4000r/min)，分离得到上清液，对上清液反复脱蛋白4次，再次分离得到上清液，加入95％乙醇至乙醇浓度达80％，置4℃冰箱内静置22小时后取出离心10min(4000r/min)，取沉淀用无水乙醇、丙酮和乙醚依次各洗涤2次，得精制柴胡多糖0.2358g，多糖含量为55.29％。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1 采用不同提取方法所得柴胡多糖提取率的对比

水浴回流结合水提醇沉提取：取柴胡粗粉2g置圆底烧瓶中加40倍体积量的水，提取温度90℃，提取两次，每次4h，纱布滤过合并滤液，减压浓缩至原液的1/5，加95％v/v乙醇水溶液至乙醇体积百分比为75％，冷藏22h后4000r/min离心10min，所得沉淀用无水乙醇、丙酮和乙醚依次各洗涤2次，多糖得率为3.4％。

超声提取：取柴胡粗粉2g于圆底烧瓶中，超声时间为15min，加40倍体积量的水，温度45℃，多糖得率仅为0.9％。

超声辅助回流提取：取柴胡粗粉2g于圆底烧瓶中，超声15min，加40倍体积量的水，温度45℃，超声完成后，再置90℃水浴锅中，回流提取1h，多糖的得率为1.4％。

以上实验结果表明，本发明水浴回流结合水提醇沉法提取柴胡多糖得率最高，为提取柴胡多糖的最佳方法；采用其它提取方法得率均有明显降低。

实验例2 醇沉条件中各参数对柴胡多糖提取率及多糖含量的影响

将实验例1采用水浴回流结合水提得到的柴胡粗多糖提取液浓缩至原液体积的1/5。

1、醇沉时间

向上述浓缩液中加入95％v/v乙醇水溶液至乙醇含量为80％v/v，调整时间梯度为1小时，考察醇沉时间对多糖得率和含量的影响，结果见图1。

实验结果：醇沉23h时多糖得率达最大值3.37％，之后逐渐下降，表明多糖开始溶解。醇沉22h时多糖含量达最大值73.23％，之后含量随着多糖溶解而降低。

22～23h多糖得率相差0.02％，含量相差1.23％，相差不大，可见22h为多糖醇沉的最佳时间。

2、醇沉浓度

固定22h的醇沉时间，醇沉浓度(即乙醇体积百分比)梯度为5％，考察醇沉浓度对多糖得率和含量的影响，结果见图2。

实验结果：醇沉浓度70％时多糖含量达最大值73.13％，之后逐渐下降，推测原因是乙醇浓度增大导致小分子脂溶性成分析出，相应降低了多糖含量。而得率随醇沉浓度增加而增大，但趋势放缓。

醇沉浓度70％～75％之间多糖得率相差0.35％，含量相差0.47％，可见75％为醇沉的最佳浓度。

实验例3 提取条件中各参数对柴胡多糖提取率及多糖含量的影响

1、料液比

取已脱脂柴胡药材粗粉(过5号筛)2.0g，固定提取次数为2次，提取时间为3h，提取温度为90℃，以纯化水作溶剂考察料液比分别为10、20、30、40、50(mL·g-1)时对柴胡多糖得率和粗多糖含量的影响，结果见图3。

由图可知，随着料液比增加多糖得率逐渐增加，当料液比达到40(mL·g-1)时多糖得率最大为4.32％，之后随着料液比继续增大，多糖得率略有下降。粗多糖含量也随着料液比增大而逐渐增加，但增幅逐渐变缓，当料液比达到40(mL·g-1)时，粗多糖含量为最高值53.88％，之后随着料液比的增大而逐渐降低。

2、提取温度

取已脱脂柴胡药材粗粉(过5号筛)2.0g，固定提取次数为2次，提取时间为3小时，料液比为40(mL·g-1)，考察60℃、70℃、80℃、90℃和100℃回流对柴胡多糖得率和粗多糖含量的影响，结果见图4。

由图可知，随着温度不断升高，多糖得率不断增大且增幅也逐渐增加，但粗多糖含量却随着温度的增加而先升后降。

3、回流提取时间

取已脱脂柴胡药材粗粉(过5号筛)2.0g，固定料液比为40(mL·g-1)，提取温度为100℃，提取2次，考察提取1h、2h、3h、4h、5h时间对柴胡多糖得率和粗多糖含量的影响，结果见图5。

由图可知，随着提取时间的增加，多糖得率不断增加但增幅逐渐减小，时间为5h时，多糖得率已达最大值6.4％，与提取4h的6.13％相比已无明显增大。而粗多糖含量随提取时间增加也不断增大，提取时间为4h时，粗多糖含量达到最大值54.44％，之后随提取时间的增加而逐渐下降。

4、回流提取次数

固定料液比为40(mL·g-1)，提取温度100℃，提取时间4h，考察加热回流提取1次、2次、3次、4次、5次对柴胡多糖提取率的影响，结果见图6。

由图可知，提取第3次时，提取率已低于0.5％，故提取2次较为合适。

实验例4 采用不同提取条件参数所得柴胡多糖提取率及多糖含量的对比

提取次数固定2次，选择不同的料液比、提取温度、提取时间参数条件进行提取，将所得柴胡多糖提取率及多糖含量进行对比，结果见表1。

表1柴胡多糖提取率及多糖含量对比

实验结果：在本发明的提取条件参数范围内，即向脱脂柴胡粗粉中加入30～50倍体积量的水提取，提取温度为80～100℃，提取时间3～5h，提取两次，均能得到3％以上的提取率，优于现有的多数提取方法；在上述范围内进一步优化：向脱脂柴胡粗粉中加入34～46倍体积量的水提取，提取温度为95～100℃，提取时间4～5h，提取两次，可将多糖提取率提高至6％以上，提取率较现有微波辅助提取方法提高了一倍多；其中，双高优化组能同时兼顾多糖纯度，含量高达55.57％，为最优提取条件，即向脱脂柴胡粗粉中加入38倍体积量的水提取，提取温度为98℃，提取时间4h，提取两次。

实验例5 本发明柴胡多糖提取方法的验证试验

表2本发明柴胡多糖提取方法的验证试验结果

以上结果表明，本发明柴胡多糖提取方法重复性高、可行性强。另外，由表2可知双高优化组与普通优化组的柴胡多糖平均得率相差不超过0.5％，但双高优化组的粗多糖平均含量比试验组22高出9.44％，即在试验组22的基础上可使粗多糖含量提高21.39％，可实现提取率、多糖含量“双高”。

实验例6 采用Sevage法纯化粗多糖对多糖含量的影响

通过Sevage法对双高优化组和普通优化组各分出3批粗多糖提取物进行初步纯化，观察经初步纯化后两试验组的精多糖含量变化。本实验例只是初步纯化，纯化工艺不进行工艺筛选，使用Sevage法常用工艺，即sevag试剂[氯仿：正丁醇＝4：1(V/V)]:药液＝1：5(V/V)，剧烈震荡20min，高速离心机离心15min(4000r/min)，分离得到上清液，对上清液反复脱蛋白4次，再次分离得到上清液，加入95％乙醇至乙醇浓度达80％，置4℃冰箱内静置22小时后取出离心10min(4000r/min)，取沉淀用无水乙醇、丙酮和乙醚依次各洗涤2次，得柴胡精多糖，实验结果见表3。

表3 Sevage法初步纯化结果

由表3可知，初步纯化后双高优化组多糖含量提升了14.28％，普通优化组多糖含量提升了11.16％，对比发现两试验组多糖含量差异不仅没有消除或缩小，反而有所增大，由纯化前的9.44％增大至纯化后的12.56％，增大了3.12％。可见，采用双高优化组提取条件可阻止更多杂质的溶出，减少了提取物中的结合蛋白，从而提高了Sevage法的纯化效率。

Claims (10)

1.一种柴胡多糖的提取方法，其特征是：它包括如下步骤：a、预处理：取柴胡，粉碎，脱脂；b、水提：向脱脂柴胡粗粉中加入30～50倍体积量的水提取，提取温度为80～100℃，提取时间3～5h，提取两次，合并提取液；c、醇沉：浓缩提取液，加入乙醇，静置，收集沉淀，即得柴胡多糖提取物。

2.如权利要求1所述的提取方法，其特征是：所述的脱脂条件为：向柴胡粗粉中加入5倍体积量的95％v/v乙醇水溶液，于80℃回流，每次2小时，直至溶剂无色，弃去溶剂，得脱脂柴胡粗粉。

3.如权利要求1所述的提取方法，其特征是：所述的醇沉条件为：醇沉时乙醇体积百分数为75％，醇沉时间为22h。

4.如权利要求1所述的提取方法，其特征是：所述的水提条件为：向脱脂柴胡粗粉中加入30～50倍体积量的水提取，提取温度为84～100℃，提取时间4～5h。

5.如权利要求4所述的提取方法，其特征是：所述的水提条件为：向脱脂柴胡粗粉中加入34～46倍体积量的水提取，提取温度为95～100℃，提取时间4～5h。

6.如权利要求5所述的提取方法，其特征是：所述的水提条件为：向脱脂柴胡粗粉中加入38～40倍体积量的水提取，提取温度为98～100℃，提取时间4～5h。

7.如权利要求6所述的提取方法，其特征是：所述的水提条件为：向脱脂柴胡粗粉中加入38倍体积量的水提取，提取温度为98℃，提取时间4h。

8.如权利要求1～7任意一项所述的提取方法，其特征是：还包括Sevage除蛋白步骤。

9.如权利要求8所述的提取方法，其特征是：所述的Sevage除蛋白条件为：加入柴胡多糖提取物1/5体积量的sevag试剂，震荡20min，4000r/min离心15min，分离得到上清液；采用相同方法处理4次，收集最终得到的上清液，加入95％v/v乙醇至乙醇浓度达80％v/v，于4℃静置22h后取出，4000r/min离心10min，收集沉淀，用无水乙醇、丙酮和乙醚依次各洗涤2次，得精制柴胡多糖提取物。

10.一种根据权利要求1～9任意一项所述提取方法制备得到的柴胡多糖提取物。