CN115677874A - 一种具有益生元活性的银柴胡粗多糖及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有益生元活性的银柴胡粗多糖，该具有益生元活性的银柴胡粗多糖的制备方法包括以下步骤：S1：取银柴胡，粉碎后过筛、脱脂，残渣加水进行超声提取，将提取液浓缩，制得浓缩液；S2：在浓缩液中加入30％‑50％乙醇分级沉淀，过滤后取上清液，加无水乙醇至85％，取下层沉淀用无水乙醇冲洗1‑2次，制得银柴胡多糖粗提物；S3：将银柴胡多糖粗提物除蛋白后冷冻干燥，制得具有益生元活性的银柴胡粗多糖。本发明提供的银柴胡粗多糖具有益生元活性，对典型益生菌嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌的生长具有显著增值作用(或促生长作用)，可以作为益生元用于食品、保健品、饲料等领域开发。
Description
技术领域
本发明属于具有益生元的植物多糖技术领域，具体涉及一种具有益生元活性的银柴胡粗多糖及其制备方法。
背景技术
中药银柴胡为石竹科繁缕属植物银柴胡(Stellaria dichotomaL.var.lanceolata Bge.)的干燥根，主要分布于宁夏、内蒙古、陕西、甘肃等干旱半干旱地区，其性寒味甘，具有祛除小儿疳热，治疗骨蒸痨热等功效。宁夏作为银柴胡的道地产区，近几年已经建立了全国最大规模的银柴胡种植基地，形成了完善的银柴胡规范化种植技术体系，成为带动区域经济发展和农民脱贫的重要途径之一。近年来，对银柴胡药材的化学成分及其作用的研究报道很多，其化学成分主要为甾醇类、黄酮类、生物碱类、挥发油等等，但关于银柴胡多糖的系统研究几乎没有报道。
植物多糖作为一种天然产物，具有抗氧化、调节免疫、降血糖、血脂、抗肿瘤等生物活性，被广泛应用于食品、保健品和化妆品中，因其来源广泛，价格低廉，具有重要的生物学活性，无毒副作用，逐渐受到人们的重视，特别是近年来从传统中药中也发现大量具有药理活性和不同特征的植物多糖，为功能性药品或食品开发及传统中药药效物质基础的研究奠定了基础，然而，银柴胡粗多糖的其他应用却鲜有报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种具有益生元活性的银柴胡粗多糖及其制备方法，具体方案如下：
本发明一方面提供了一种具有益生元活性的银柴胡粗多糖，该具有益生元活性的银柴胡粗多糖的制备方法包括以下步骤：
S1：取银柴胡，粉碎后过筛、脱脂，残渣加水进行超声提取，将提取液浓缩，制得浓缩液；
S2：在浓缩液中加入30％-50％乙醇分级沉淀，过滤后取上清液，加无水乙醇至85％，取下层沉淀用无水乙醇冲洗1-2次，制得银柴胡多糖粗提物；
S3：将银柴胡多糖粗提物除蛋白后冷冻干燥，制得具有益生元活性的银柴胡粗多糖。
进一步地，步骤S1具体是将银柴胡药材粉碎至40-60目，通过超临界CO2萃取进行脱脂，制得银柴胡粉末，将所述银柴胡粉末按1:20(W/V)加入水进行超声提取，超声提取的温度为45-50℃、提取时间为2h-4h，提取次数为2次，将滤液合并后过滤，浓缩，制得银柴胡多糖粗提物。
进一步地，超声提取温度为45℃，提取时间为3h。
本研究考察了超声提取温度、提取时间、提取次数分别与银柴胡粗多糖粗提物得率的变化关系，并明确了因素之间存在交互作用及其对多糖粗多糖得率的影响，即提取时间和提取次数的交互作用对多糖粗提物得率的影响极显著(p<0.01)；提取时间和提取温度的交互作用对多糖粗提物得率有显著的影响(p<0.05)，而提取温度和提取次数交互作用对多糖粗提物得率影响较小(P>0.05)。采用响应面法(Box-Behnken)对上述提取条件进行了优化，制得银柴胡多糖粗提物提取条件的优化模型，即
Y＝28.22-0.71A+1.43B-0.82C+1.36AB+0.39AC+2.24BC-0.67A2-3.30B2-3.31C2。
根据该模型，通过Design-Expert10.0.7软件对提取参数进行分析，获得最佳提取条件的理论值，考虑到实际操作简便性，对数值取整数，即提取时间3h、提取次数2次、提取温度45℃、提取得率为27.39％。进一步按此工艺条件进行实际操作验证，银柴胡多糖粗提物平均得率为28.16％，模型预测理论与实际值误差为2.73％，符合要求。
进一步地，步骤S3是将银柴胡多糖粗提物溶于蒸馏水后，加入Sevag试剂脱蛋白4-5次至蛋白含量为0.015-0.025ug/ml，制得银柴胡粗多糖，所述银柴胡粗多糖纯度达到69.62％-76.18％。
本发明另一方面提供了一种从银柴胡中提取具有益生元活性的银柴胡粗多糖的方法，该方法包括以下步骤：
S1：取银柴胡，粉碎后过筛、脱脂，残渣加水进行超声提取，将提取液浓缩，制得浓缩液；
S2：在浓缩液中加入30％-50％乙醇分级沉淀，过滤后取上清液，加无水乙醇至85％，取下层沉淀用无水乙醇冲洗1-2次，制得银柴胡多糖粗提物；
S3：将银柴胡多糖粗提物除蛋白后冷冻干燥，制得具有益生元活性的银柴胡粗多糖。
进一步地，步骤S1具体是将银柴胡药材粉碎至40-60目，通过超临界CO2萃取进行脱脂，制得银柴胡粉末，将所述银柴胡粉末按1:20(W/V)加入水进行超声提取，超声提取的温度为45-50℃、提取时间为2h-4h，提取次数为2次，将滤液合并后过滤，浓缩，制得银柴胡多糖粗提物。
进一步地，超声提取温度为45℃，提取时间为3h。
进一步地，步骤S3是将银柴胡粗多糖粗提物溶于蒸馏水后，加入Sevag试剂脱蛋白4-5次至蛋白含量为0.015-0.025ug/ml，制得银柴胡粗多糖，所述银柴胡粗多糖纯度达到69.62％-76.18％。
本发明的有益效果在于：本发明提供的银柴胡粗多糖具有益生元活性，对典型的益生菌嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌的生长具有显著增值作用(或促生长作用)，可以作为益生元用于食品、保健品、饲料等领域开发。
附图说明
图1a.提取温度、时间、次数对银柴胡多糖粗提物得率影响的折线图；
图1b.提取时间对银柴胡多糖粗提物得率影响的折线图；
图1c.提取次数对银柴胡多糖粗提物得率影响的折线图；
图2.两因素交互作用的三维响应面图和等高线图；
图3.两种益生菌株生长拟合曲线，其中，A：嗜酸乳杆菌B:长双歧杆菌；
图4.不同浓度银柴胡粗多糖对两种益生菌耗糖量的影响折线图，其中，A：嗜酸乳杆菌B:长双歧杆菌；
图5.不同浓度银柴胡粗多糖对两种益生菌株产酸的影响柱状图，其中，A：嗜酸乳杆菌B:长双歧杆菌(***P<0.001)；
图6.不同浓度银柴胡多糖粗多糖对两种益生菌株生长密度的影响，其中，A：嗜酸乳杆菌B:长双歧杆菌(**P<0.01，***P<0.001)。
具体实施方式
1.材料
1.1试剂与仪器
供试菌株为嗜酸乳杆菌(CGMCC1.3013)和长双歧杆菌(CGMCC1.1878)，购于中国通用微生物培养物保藏中心；MRS肉汤(不含葡萄糖)、MRS琼脂，菊糖、L-半胱氨酸(Solarbio)，葡萄糖(天津市大茂化学试剂厂)，以上均为分析纯；无水乙醇、硫酸(天津市北方天医化学试剂厂)；过硫酸钾(上海广诺化学科技有限公司)；硫酸亚铁(徐州天鹅化工有限公司)；三氯甲烷、正丁醇、苯酚(上海广诺化学科技有限公司)；甲醇(ANPEL)，醋酸钠(Sigma)；硝酸钠(国药集团)；以上均为分析纯；三氟乙酸(ANPEL)；氢氧化钠(Sigma)为色谱纯，葡萄糖对照品(HPLC≥98％，上海源叶生物科技有限公司)；L-抗环血酸(天津市凯通化学试剂有限公司)；以上均为分析纯；
2.5L圆底立式厌氧培养袋、2.5L厌氧产气包(青岛海博生物技术有限公司)；KQ-500DE型数控超声机(昆山市超声仪器有限公司)；TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；恒温振荡器THZ-98A上海一恒科学仪器有限公司；无菌操作台SW-CJ-1FD苏州安泰空气技术有限公司；立式高压蒸汽灭菌器LDZM-60L上海市申安医疗器械厂。
1.2药材
供试材料选自银柴胡道地产区宁夏同心县，栽培3年以上干燥药材。经专家鉴定为石竹科繁缕属植物银柴胡(Stellaria dichotoma L.var.lanceolata Bge.)的干燥根，为正品银柴胡药材。
2.方法
2.1银柴胡粗多糖的制备流程
取银柴胡→粉碎→过筛(40目)→脱脂→残渣加水提取(提取时间3h、提取温度45℃、提取次数2次)→合并提取液→减压浓缩→加入30-50％乙醇分级沉淀→过滤、取上清液→加无水乙醇至85％→取下层沉淀用无水乙醇冲洗1-2次→得到银柴胡多糖粗提物→加水溶解→采用Sevag法除蛋白→冷冻干燥→得到银柴胡粗多糖。
2.2银柴胡粗多糖提取工艺关键参数单因素筛选试验设计
称取脱脂后的银柴胡粉末800g，分为3个处理组，分别考察超声提取温度、提取时间、提取次数，每个处理组设计5个水平，详见表1。考察不同提取温度时，提取时间设为3h，提取次数为2次；考察不同提取时间时，提取温度设为40℃，提取次数为2次；考察提取次数时，提取温度设为40℃，提取时间设为3h。各处理组提取结束后，采用硫酸-苯酚法测定多糖含量，分别根据公式计算多糖含量(1)和(2)计算粗多糖得率。
表1单因素筛选实验设计
(1)式中：C为样品溶液多糖浓度(mg/mL)；D为样品溶液稀释倍数；W为样品质量(g)；f为换算因数，W：提取用银柴胡粉末质量(g)。
(2)式中，M:干燥后的银柴胡多糖粗提物质量(g)，M0：银柴胡粉末质量(g)。
单因素筛选试验结果如下：
根据单因素试验设计，超声提取的温度、时间和次数对银柴胡多糖粗提物得率均有影响。结果见图1。由图1a可见，当提取时间3h、提取次数为2次时，多糖粗提物得率随着温度增加呈先上升后下降趋势，在50℃时得率达到最大值，为27.89％。而后随温度上升，得率逐渐降低；由图1b可见，当提取温度为40℃、提取次数2次时，多糖粗提物得率随着提取时间延长呈现快速提高，在3h时达到最高大值，为27.51％，继续延长提取时间，得率呈下降趋势。同样的，由图1c可以看出，当提取温度为40℃、提取时间为3h时，多糖粗提物得率随提取次数的增多呈现先增加后降低的趋势，当提取次数2次时，得率达到最高值，为27.91％，之后增加提取次数，但多糖粗提物得率分别为24.57％、22.44％、19.43％，降低了11.97％、19.6％、30.38％。通过单因素不同水平考察结果可见，提取温度为50℃、提取时间为3h、且提取次数为2次可以获得最高得率。并以此作为Box-Behnken法优化设计的依据。
2.3响应面法(Box-Behnken)对提取工艺参数优化试验设计
根据单因素试验结果，选择提取温度、提取时间和提取次数的变化范围为40-60℃、2-4h和1-3次。运用Design-Expert 10.0.7软件，以银柴胡粗多糖粗提物得率(Y)为响应值，考察提取温度(A)、提取时间(B)和提取次数(C)对Y的影响，进行3因素3水平的Box-Behnken试验设计(表2)。
表2 Box-Behnken试验因素与水平设计
试验设计和数据如表3所示。通过对数据进行线性拟合，得到因柴胡多糖粗提物的二次多元回归模型方程。
Y＝28.22-0.71A+1.43B-0.82C+1.36AB+0.39AC+2.24BC-0.67A2-3.30B2-3.31C2。
银柴胡多糖粗提物回归方程进行了方差分析结果见表4。用F值和P值评价模型的显著性。F值越大，P值越小，模型越显著。如表4所示，该模型的F值为27.47，P＝0.0001，表明该模型具有极显著意义。利用失拟项评价模型的拟合度。该模型失拟项为P＝0.3108>0.05，表示拟合程度较高，表明实验值是准确可靠的。总体而言，银柴胡多糖粗提物的回归模型良好。
表3 Box-Behnken优化试验设计与结果
表4回归方程的方差分析
注：*P＜0.05，差异显著；**P＜0.01，差异极显著。
根据上述结果，进一步对3个关键工艺参数超声提取温度，提取时间，提取次数的交互作用进行分析，结果见图2所示三维效应面曲面图和等高线图，曲面图越陡峭，等高线图越接近椭圆，说明交互作用越显著。由图2a可见，在提取温度处于0水平时，提取时间和提取次数的交互作用对多糖粗提物得率的影响极显著(p<0.01，见表4)，表现为三维响应面图中曲面陡峭，其中提取时间(B)比次数(C)对提取得率影响大，而且二维图中等高线也呈明显的椭圆形；由图2b可以看出，在提取次数处于0水平时，提取时间和提取温度的交互作用对多糖粗提物得率具有显著的影响(p<0.05，见表4)，表现为三维响应面图中曲面较陡峭，其中提取时间的影响比提取温度影响大，而且在二维图中等高线呈椭圆形；由图2c可以看出，在提取时间处于0水平时，提取温度和提取次数交互作用对得率影响较小(P>0.05，见表4)，三维响应面图中曲面较为平缓，但提取次数比提取时间影响略大，而且二维等高线图趋近圆形，说明二者之间的交互作用较小。综上所述，以上结果均符合银柴胡粗多糖粗提物得率回归模型的方差分析。
Box-Behnken优化工艺的验证结果如下：
根据所得模型，根据该模型，通过Design-Expert10.0.7软件对提取参数进行分析，获得最佳提取条件的理论值，考虑到实际操作简便性，对数值取整数，即提取时间3h、提取次数2次、提取温度45℃、提取得率为27.39％。进一步按此工艺条件进行实际操作验证，结果见表5。由表中结果可见，银柴胡多糖粗提物平均得率为28.16％(SD值＝0.10％，n＝3)，实际值与模型预测值基本相符，误差为2.73％说明模型对银柴胡多糖粗提物工艺参数的优化结果可靠，具有一定的实用价值。获得的银柴胡多糖粗提物中多糖纯度51.98％。
表5最佳提取工艺验证结果
2.4银柴胡多糖粗提物除蛋白
采用Sevag法对多糖粗提物除蛋白，经过比较筛选后，确定使用Sevag试剂除蛋白4-5次，处理后的多糖测定蛋白含量平均为0.021ug/ml，粗多糖得率为14.45％。
2.5银柴胡多糖粗提物总糖含量分析
多糖含量测定:采用苯酚-硫酸法测定
取银柴胡粗多糖用蒸馏水配制成0.04mg/mL的溶液备用，以无水葡萄糖为对照品，绘制标准曲线为Y＝0.0646x-0.0803，R2＝0.997；将配制好的样品液进行测定，重复3次，多糖含量为69.62％-76.18％，即银柴胡粗多糖纯度为69.62％-76.18％。
2.5银柴胡粗多糖的益生元活性评价
2.5.1试剂与仪器
供试菌株为嗜酸乳杆菌(CGMCC1.3013)和长双歧杆菌(CGMCC1.1878)，购于中国通用微生物培养物保藏中心。MRS肉汤(不含葡萄糖)、MRS琼脂，菊糖、L-半胱氨酸(Solarbio)，葡萄糖(天津市大茂化学试剂厂)，以上均为分析纯。2.5L圆底立式厌氧培养袋、2.5L厌氧产气包(青岛海博生物技术有限公司)。
恒温振荡器THZ-98A上海一恒科学仪器有限公司；无菌操作台SW-CJ-1FD苏州安泰空气技术有限公司；立式高压蒸汽灭菌器LDZM-60L上海市申安医疗器械厂。
2.5.2 MRS培养基的配制
分别配制二种益生菌的MRS肉汤培养基和MRS琼脂培养基，配方方法如下所示：
(1)不同碳源的MRS肉汤培养基制备：称取4.62g MRS肉汤(不含葡萄糖)溶于100ml蒸馏水中，分别添加2.5％(w/v)菊粉(对照)和不同浓度(2.5％、5％、10％、15％)的银柴胡粗多糖(处理组)作为碳水化合物来源。其中接种长双歧杆菌的MRS肉汤培养基中另外加入0.5g/L的L-半胱氨酸。此外分别用NaOH调节嗜酸乳杆菌肉汤培养基的PH至6.8，长双歧杆菌肉汤培养基的PH至7.5，高压灭菌(121℃，20min)后分装于25mL无菌试管中。
(2)MRS琼脂培养基制备：称取6.62g MRS琼脂溶于100ml蒸馏水中，其中长双歧杆菌的MRS琼脂培养基中另外加入0.5g/L的L-半胱氨酸，分别调节嗜酸乳杆菌琼脂培养基的PH至6.8，长双歧杆菌琼脂培养基的PH至7.5，高压灭菌(121℃，20min)后分装于无菌培养皿中。
2.5.3菌种活化
菌种活化参照说明书进行。将购置的装有菌种的安瓿开封后，用无菌吸管滴入适宜的MRS肉汤培养基，然后将溶解后的菌液移至装有肉汤培养基的试管中，在厌氧条件下37℃静止培养24h后继续扩培二代，同样的方法加入5％体积分数的菌液扩培至第三代，备用。
2.5.4两种益生菌的生长曲线
将活化后的两种益生菌液，分别按照5％的比例接种于配制好的含有不同碳源的嗜酸乳杆菌MRS肉汤培养基和长双歧杆菌MRS肉汤培养基中，在37℃下恒温厌氧培养48h，期间，每3个小时测定一次培养液的吸光度及pH值，每个样品做3个重复。
采用Origin Pro 2019b软件中的Logistic模型，迭代算法为Levernberg-Marquardt优化算法，算法表达式(3)如下，得到两种菌的拟合生长曲线。
y＝A2+(A1-A2)/(1+(X/X0)^p) (3)
式中A1、A2、X0、p为参数，A1为真实曲线与模型偏差程度，A2为模型所预测的生长最大值；X0为拐点时间，代表在此时生长速率最大；p为生长速率系数，曲线在过点(X0,A2)时拥有最大斜率，即最大的生长速度。
如图3所示的两种益生菌株的生长曲线的拟合图，模型拟合的决定系数R2值均大于0.9，表明拟合效果良好。嗜酸乳杆菌以不同碳源的生长曲线变化情况如图(3-A)，0-3h为迟缓期，3-12h为对数生长期，菌体生长较快，12h之后缓慢生长，15-48h基本平稳，进入平稳期，菌体生长稳定。菌体生长总量按照多少依次为培养基中添加10％银柴胡粗多糖>15％粗多糖物>5％粗多糖>2.5％菊糖>2.5％粗多糖。长双歧杆菌以不同碳源的生长曲线变化情况如图(3-B)，总体而言3-9小时为迟缓期，菌体生长无明显变化，9-18h为对数生长期，菌体生长较快，18h以后缓慢生长，21-48h基本平稳。菌体生长总量依次为培养基中添加10％银柴胡粗多糖>15％粗多糖>5％粗多糖>2.5％粗多糖>2.5％菊糖。
结合图3和表6，两种益生菌株在以不同碳源的培养基中增值迅速，嗜酸乳杆菌在不同碳源的培养基中，添加2.5％粗多糖和5％粗多糖处理组较对照组(2.5％菊糖)提前进入对数生长期(粗多糖组X0<对照组X0)，而添加10％粗多糖和15％粗多糖处理组较对照组晚进入对数生长期(粗多糖组X0>对照组X0)，前者也先进入稳定期。
长双歧杆菌在不同碳源的培养基中添加不同浓度银柴胡粗多糖组均比对照组(2.5％菊糖)先进入对数生长期(粗多糖组X0<对照组X0)，且两种益生菌株进入稳定期后各粗多糖浓度处理组最大生长数量均大于对照组(粗多糖组P值大于对照组)。由此表明各浓度粗多糖组比对照组(2.5％菊糖)能够有效增强两种益菌株的代谢速率，并促进其增值。
表6生长动力学方程非线性拟合相关参数
2.5.5两种益生菌生长数量的计算
将活化后的两种益生菌液，分别按照5％的比例接种于含有不同碳源的嗜酸乳杆菌MRS肉汤培养基和长双歧杆菌MRS肉汤培养基中，在37℃下恒温下厌氧培养24小时。培养结束后，用无菌生理盐水连续稀释(10-1～10-8)倍，之后吸取200uL稀释液于两种益生菌的MRS琼脂培养基上，厌氧条件下静止培养48h。选取最适合观察的梯度培养基进行计数，计算各个琼脂培养基内的菌落数目。以CFU/mL和lgCFU/mL为单位进行比较。
CFU/mL＝X*10*V (4)
式中：X为各培养基内菌落数；V为稀释倍数
不同浓度银柴胡粗多糖对嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌生长的影响结果以总活菌数(log10CFU/mL)表示，由表7可知，嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌的最大生长都出现在培养基中加入10％银柴胡粗多糖处理组，显著高于对照组和其他处理组。
表7银柴胡粗多糖对MRS中嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌生长的影响
数值表示为每毫升MRS的log10数±SD(CFU)的平均值。a、b、c、d、e在同一行内，不同字母的平均值在p<0.05时差异显著，n＝3。
2.5.6不同浓度银柴胡粗多糖对两种益生菌耗糖量的影响
将活化后的两种益生菌液，分别按照5％的比例接种于配制好的含有不同浓度银柴胡粗多糖的嗜酸乳杆菌MRS肉汤培养基和长双歧杆菌MRS肉汤培养基中，37℃、120rpm的摇床上恒温厌氧培养48h，每3个小时吸取0.5mL培养液，采用苯酚硫酸法测定培养液的总糖含量，从而反映菌株耗糖量的变化。
嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌在生长增值过程中变化如图4所示。结果表明：嗜酸乳杆菌(图4-A)在0-24h中，耗糖量随菌的生长增值逐渐增加，其中在9h后，耗糖量变化基本稳定。在不同浓度银柴胡粗多糖培养基中，该菌的耗糖量均在10％粗多糖组中最高，为77.8％，其次是15％粗多糖组，为55.5％，2.5％粗多糖组耗糖量最低，为45.8％，略低于对照2.5％菊糖组的耗糖量(49.9％)。
长双歧杆菌(图4-B)在培养12h后各处理组耗糖量增加基本达到稳定。在不同浓度银柴胡粗多糖培养基中，该菌的耗糖量在10％粗多糖浓度最高，为67.4％，其次是5％粗多糖组，耗糖量为61.7％，而15％粗多糖组耗糖量最低(47.7％)，略低于2.5％菊糖对照组(49.6％)。由此可见，嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌在生长过程之中利用银柴胡粗多糖为碳源进行生长增值，导致培养基中总糖含量降低，虽然两种菌株的耗糖量增加，但两种益生菌在生长过程中对碳源的消耗规律有所不同。
2.5.7不同浓度银柴胡粗多糖对两种益生菌产酸的影响
将活化后的两种益生菌液，分别按照5％的比例接种于配制好的含有不同浓度银柴胡粗多糖的嗜酸乳杆菌MRS肉汤培养基和长双歧杆菌MRS肉汤培养基中，37℃、120rpm的摇床上恒温厌氧培养48h，每3个小时测定一次培养液的pH值。
在添加不同浓度银柴胡粗多糖作为碳源的培养基中，随着菌的生长，会产生短链脂肪酸等物质，导致pH下降。因此可以通过检测pH的变化来评估益生菌的生长情况。
以不同浓度银柴胡粗多糖添加于MRS肉汤培养基中代替葡萄糖，其pH的变化如图5所示。在嗜酸乳杆菌中(图5-A)，添加10％粗多糖组相较于对照组2.5％菊糖的pH呈显著降低；在长双歧杆菌中(图5-B)，添加不同浓度粗多糖组的pH值均显著低于对照组(2.5％菊糖)。
2.5.8不同浓度银柴胡粗多糖对两种益生菌生长密度的影响
将活化后的两种益生菌液，分别按照5％的比例接种于配制好的含有不同浓度银柴胡粗多糖的嗜酸乳杆菌MRS肉汤培养基和长双歧杆菌MRS肉汤培养基中，37℃、120rpm的摇床上恒温厌氧培养48h，每3个小时测定一次培养液的吸光度值，以吸光度值确定益生菌生长密度。
培养基的OD值变化可反映益生菌的生长情况，菌株生长越快，培养液的OD值越高。由图6结果可见，添加不同浓度的银柴胡粗多糖培养基中OD值变化有所不同。在嗜乳酸杆菌培养中(图6-A)，培养基OD值表现为：随着添加粗多糖浓度增加，OD值逐渐升高，添加10％粗多糖组达到最大值，与对照组差异极显著，之后出现降低，与对照组无差异。在长双歧杆菌培养中(图6-B)，添加不同浓度粗多糖处理组的培养基OD值均显著高于对照组，尽管15％粗多糖组OD值出现下降，但也达到极显著水平。由此可见添加10％粗多糖组对菌的生长密度影响最大，对两种益生菌的生长均具有促进作用。
2.5.9不同浓度银柴胡粗多糖对两种益生菌益生指数的测定
将活化后的两种益生菌液，分别按照5％的比例接种于配制好的含有不同浓度银柴胡粗多糖的嗜酸乳杆菌MRS肉汤培养基和长双歧杆菌MRS肉汤培养基中，37℃、120rpm的摇床上恒温厌氧培养48h，分别于0、24、48h测定吸光值和pH值，计算益生指数PI值。
PI＝(APP48-APP0-(APN48-APN0))/(APG48-APG0-(APN48-APN0)) (5)
式中：APP0和APP48分别为益生菌培养0、48h的吸光值(碳源为除菊粉)外其他糖)；APG0和APG48为碳源为菊糖时益生菌培养0、48h的吸光值；APN0和APN48为益生菌在CK培养基上培养0、48h的吸光值。
两种菌株对培养基中不同碳源的利用通过培养液的PI值的大小来衡量。表8说明嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌在添加不同碳源培养基中发酵培养了48小时之后的菌株生长情况，如表8所示：对嗜酸乳杆菌而言，PI指数随着培养基中添加的粗多糖浓度而增加，最大值出现在添加10％和15％粗多糖浓度的处理组，它们比对照组提高85％；对长双歧杆菌而言，PI指数最大值出现在添加10％粗多糖组，而其他各组的PI值均低于该组。综合两种益生菌的结果看，在培养基中添加10％粗多糖组表现出最好的促进益生菌生长的效果。
表8银柴胡粗多糖对益生菌PI值的影响
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
Claims (8)
1.一种具有益生元活性的银柴胡粗多糖，其特征在于，所述银柴胡粗多糖的制备方法包括以下步骤：
S1：取银柴胡，粉碎后过筛、脱脂，残渣加水进行超声提取，将提取液浓缩，制得浓缩液；
S2：在浓缩液中加入30％-50％乙醇分级沉淀，过滤后取上清液，加无水乙醇至85％，取下层沉淀用无水乙醇冲洗1-2次，制得银柴胡多糖粗提物；
S3：将银柴胡多糖粗提物除蛋白后冷冻干燥，制得具有益生元活性的银柴胡粗多糖，所述银柴胡粗多糖纯度达到69.62％-76.18％。
2.根据权利要求1所述的具有益生元活性的银柴胡粗多糖，其特征在于，步骤S1具体是将银柴胡药材粉碎至40-60目，通过超临界CO2萃取进行脱脂，制得银柴胡粉末，将所述银柴胡粉末按1:20(W/V)加入水进行超声提取，超声提取的温度为45-50℃、提取时间为2h-4h，提取次数为2次，将滤液合并后过滤，浓缩，制得银柴胡多糖粗提物。
3.根据权利要求1所述的具有益生元活性的银柴胡粗多糖，其特征在于，超声提取温度为45℃，提取时间为3h。
4.根据权利要求1所述的具有益生元活性的银柴胡粗多糖，其特征在于，步骤S3是将银柴胡粗多糖粗提物溶于蒸馏水后，加入Sevag试剂脱蛋白4-5次至蛋白含量为0.015-0.025ug/ml，制得具有益生元活性的银柴胡粗多糖。
5.一种从银柴胡中提取具有益生元活性的银柴胡粗多糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：取银柴胡，粉碎后过筛、脱脂，残渣加水进行超声提取，将提取液浓缩，制得浓缩液；
S2：在浓缩液中加入30％-50％乙醇分级沉淀，过滤后取上清液，加无水乙醇至85％，取下层沉淀用无水乙醇冲洗1-2次，制得银柴胡多糖粗提物；
S3：将银柴胡多糖粗提物除蛋白后冷冻干燥，制得具有益生元活性的银柴胡粗多糖。
6.根据权利要求5所述的从银柴胡中提取具有益生元活性的银柴胡粗多糖的方法，其特征在于，步骤S1具体是将银柴胡药材粉碎至40-60目，通过超临界CO2萃取进行脱脂，制得银柴胡粉末，将所述银柴胡粉末按1:20(W/V)加入水进行超声提取，超声提取的温度为45-50℃、提取时间为2h-4h，提取次数为2次，将滤液合并后过滤，浓缩，制得银柴胡多糖粗提物。
7.根据权利要求6所述的从银柴胡中提取具有益生元活性的银柴胡粗多糖的方法，其特征在于，超声提取温度为45℃，提取时间为3h。
8.根据权利要求5所述的从银柴胡中提取具有益生元活性的银柴胡粗多糖的方法，其特征在于，步骤S3是将银柴胡多糖粗提物溶于蒸馏水后，加入Sevag试剂脱蛋白4-5次至蛋白含量为0.015-0.025ug/ml，制得具有益生元活性的银柴胡粗多糖，所述银柴胡粗多糖纯度达到69.62％-76.18％。
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