CN107129956B - 一种纳豆菌培养基及其优化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳豆食品开发领域，特别是涉及一种纳豆菌培养基及其优化方法。本发明提供了一种纳豆菌培养基的配方，由以下成分组成：4％蔗糖、3％酵母浸粉、5％菠萝皮汁、0.2％MgSO4、0.1％K2HPO4、0.2％KH2PO4。本发明对目前培养效果较好的培养基进行优化，选择更为高效的常见碳源和氮源作为基础培养基中的碳源和氮源的替代物，添加常见的水果蔬菜汁作为纳豆菌的生长因子，采用单因素试验筛选出最适宜浓度的碳源、氮源、生长因子，利用正交试验进行进一步筛选，最终选出最适合纳豆菌生长、增菌效果最好的培养基。

Description

一种纳豆菌培养基及其优化方法
技术领域
本发明属于纳豆食品开发领域，特别是涉及一种纳豆菌培养基及其优化方法。
背景技术
纳豆可以防治食物中毒和肠道疾病，并发现常吃纳豆有助消化、预防疾病、延缓衰老、提高肝解毒能力、防治高血压、解除病痛等好处，最重要的是纳豆在溶解血栓方面具有巨大潜力。
培养基是培养微生物的关键因素之一。在《发酵工艺原理和技术》中记载葡萄糖和蔗糖等被分解利用的速度快，它们是速效碳源。乳糖、淀粉被利用的速度相对较为缓慢，它们是迟效碳源。甘油能在溶解氧的参与作用下，被氧化成CO2和H2O，释放出比糖类更多的能量。现有的纳豆菌发酵条件的优化试验研究中，采用4种不同的碳源：可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及4种不同的氮源：大豆蛋白胨、胰蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵对纳豆菌进行了培养，纳豆菌以大豆蛋白胨和葡萄糖为最佳碳氮源在35℃时发酵最好。
发明内容
本发明对目前培养效果较好的培养基进行优化，选择更为高效的常见碳源和氮源作为基础培养基中的碳源和氮源的替代物，添加常见的水果蔬菜汁作为纳豆菌的生长因子，采用单因素试验筛选出最适宜浓度的碳源、氮源、生长因子，利用正交试验进行进一步筛选，最终选出最适合纳豆菌生长、增菌效果最好的培养基。本发明采用新鲜水果蔬菜汁作为纳豆菌的生长因子，较传统的只添加某种单一维生素作为微生物的生长因子的方法来说营养更为丰富，而且有利于果蔬深加工生产中的废料利用。
技术方案：
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种纳豆菌培养基成分由如下组成：碳源、氮源、生长因子、0.2％MgSO4、0.1％K2HPO4、0.2％KH2PO4。
进一步地，所述碳源为2％-4％蔗糖、2％-4％麦芽糖、2％-4％甘油中的一种。
进一步地，所述氮源为1％-3％(NH4)2SO4、1％-3％酵母浸粉、1％-3％酸水解酪蛋白、1％-3％NH4Cl中的一种。
进一步地，所述生长因子为5％-15％胡萝卜汁、5％-15％西红柿汁、5％-15％菠萝皮汁中的一种。
进一步地，所述培养基成分为：4％蔗糖、3％酵母浸粉、5％菠萝皮汁、0.2％MgSO4、0.1％K2HPO4、0.2％KH2PO4。
进一步地，所述胡萝卜汁、西红柿汁、菠萝皮汁的制作方法为：分别取200g鲜胡萝卜、鲜西红柿、鲜菠萝皮，切碎后加入等量的水，打浆并煮沸20min后，进行冷却、过滤，取滤液并定容到200mL。
本发明纳豆培养基的优化方法，包括如下步骤：
1)制备基础培养基：采用葡萄糖3％、蛋白胨2％、MgSO4 0.2％、K2HPO4 0.1％、KH2PO4 0.2％作为活化和传代培养基；
2)制备纳豆菌的液体种子培养基：在锥形瓶中装入150mL上述基础培养基，灭菌后取纳豆菌0.3g接种于锥形瓶中，在40℃、150r/min的恒温震荡培养箱中培养18h后进行3次传代培养；
3)纳豆菌生长培养：将在基础培养基中培养的纳豆菌置于40℃、150r/min的恒温震荡培养箱中培养12～24h；
4)基础培养基中碳源的优化：分别采用2％蔗糖、3％蔗糖、4％蔗糖、2％麦芽糖、3％麦芽糖、4％麦芽糖、2％乳糖、3％乳糖、4％乳糖、2％甘油、3％甘油、4％甘油替代上述基础培养基中的葡萄糖，基础培养基其余成分及含量不变，对纳豆菌的生长进行培养并观察记录结果；
5)基础培养基中氮源的优化：分别采用1％(NH4)2SO4、2％(NH4)2SO4、3％(NH4)2SO4、1％酵母浸粉、2％酵母浸粉、3％酵母浸粉、1％酸水解酪蛋白、2％酸水解酪蛋白、3％酸水解酪蛋白、1％NH4Cl、2％NH4Cl、3％NH4Cl替代上述基础培养基中的蛋白胨，基础培养基其余成分及含量不变，对纳豆菌的生长进行培养并观察记录结果；
6)基础培养基中生长因子的优化：将果蔬汁作为生长因子添加到基础培养基中，分别添加10％胡萝卜汁、10％西红柿汁、10％菠萝皮汁、5％胡萝卜汁、5％西红柿汁、5％菠萝皮汁、15％胡萝卜汁、15％西红柿汁、15％菠萝皮汁，基础培养基其余成分及含量不变，对纳豆菌的生长进行培养并观察记录结果；
7)分别将上述优化培养基测量培养基的OD600nm值，筛选出纳豆菌增菌效果较好的三种碳源，通过对单因素试验的结果进行分析并利用正交试验进一步优化培养基配方。
8)将上述正交试验做出的最优方案、理论上的最优方案及基础培养基进行重新培养，测定它们的OD600nm值进行比较，并采用稀释平板计数法在40℃下分别培养24h后进行计数，以最终的菌落数作为最主要的指标得到培养基的最佳配方。
进一步地，所述步骤4)、5)、6)中的纳豆菌的生长培养条件为：在无菌条件下将液体种子培养基接种到各个优化培养基中，调节pH值为7.2，分装高压灭菌，冷却，在无菌操作台中进行接种，接种量为5％，在40℃的恒温振荡培养箱中培养14h、17h、20h。
进一步地，所述步骤8)中的重新培养条件为：分别在三种培养基中接种5％的纳豆菌，在40℃的恒温振荡培养箱中培养17h。
进一步地，所述步骤7)、8)中培养基的OD600nm值的测定方法为：培养完成后利用未接种的培养基作为空白样，经紫外分光光度计测定并进行比较。
附图说明
图1纳豆菌的生长曲线图
图2不同比例的蔗糖作为碳源纳豆菌的OD600nm值曲线
图3不同比例的麦芽糖作为碳源纳豆菌的OD600nm值曲线
图4不同比例的乳糖作为碳源纳豆菌的OD600nm值曲线图
图5不同比例的甘油作为碳源纳豆菌的OD600nm值曲线
图6不同比例的硫酸铵作为氮源纳豆菌的OD600nm值曲线
图7不同比例的氯化铵作为氮源纳豆菌的OD600nm值曲线
图8不同比例的酵母浸粉作为氮源纳豆菌的OD600nm值曲线图
图9不同比例的酸水解酪蛋白作为氮源纳豆菌的OD600nm值曲线图
图10 10％胡萝卜汁、西红柿汁、菠萝皮汁作为生长因子纳豆菌的OD600nm值曲线图
图11 5％胡萝卜汁、西红柿汁、菠萝皮汁作为生长因子纳豆菌的OD600nm值曲线图
图12 15％胡萝卜汁、西红柿汁、菠萝皮汁作为生长因子纳豆菌的OD600nm值曲线图
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例1
1、纳豆菌培养基优化过程研究
1.1材料与试剂
纳豆菌由北京川秀科技有限公司提供；胡萝卜、西红柿、菠萝于市场上购买。
1.2仪器与设备
JYL-350A九阳料理机九阳股份有限公司；BCM-1000生物洁净工作台苏州苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；LDZH-100KBS立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；i2可见分光光度计济南海能仪器股份有限公司；FE20实验室pH计梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司生产；VORTEX-BE1涡旋振荡器海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
1.3方法与结果
1.3.1纳豆菌的生长曲线
将在基础培养基中培养的纳豆菌置于40℃、150r/min的恒温震荡培养箱中培养12～24h，每2h对纳豆菌的生物量进行一次测定，绘制纳豆菌的生长曲线，具体见附图1。
通过图表可以看出，在16h时纳豆菌的生长达到最大值，但在14～20h范围内差别不大，故可以将纳豆菌的最大生物量区间缩小到14～20h范围内，因此需要对这个区间的生长情况进行进一步的测定观察。16h和18h时的OD600nm值较为相近，17h也有可能是最大值点，选取14h、17h、20h作为单因素试验的三个主要测定时间点。
1.3.2碳源、氮源和生长因子单因素试验
1.3.2.1碳源的筛选结果
本试验选取了4种可能较好的碳源，即蔗糖、麦芽糖、乳糖和甘油，按照基础培养基中碳源的优化中所述的方法，通过试验对14h、17h、20h的纳豆菌生物量进行测定，结果分别见附图2-5。
由图2，蔗糖浓度为2％时，纳豆菌的OD600nm值在17h时达到最大的0.607。从14h的0.591到17h阶段增长较平缓，并在17h之后出现明显的下降。说明17h时纳豆菌的最大生物量点，之后进入衰亡期。蔗糖浓度为3％时，纳豆菌的OD600nm值从14h的0.624到17h的0.635再到20h的0.618并没有明显的上升或者下降，此时纳豆菌的稳定期较2％的蔗糖作为碳源时有所延长。蔗糖浓度为4％时，14h到17h的增长较小并在17h后出现明显下降。综上所述，纳豆菌在17h的OD600nm值为0.701，是三种不同浓度的蔗糖作为碳源时的最大生物量。
由图3，麦芽糖浓度为2％时，纳豆菌在14～17h之间生长迅速并在17h时OD600nm值达到最大值0.659，而后出现下降进入衰亡期。麦芽糖浓度为3％时，OD600nm值从14h～17h就出现了0.003的少量下降，在17～20h之间又下降了0.019，根据纳豆菌的生长曲线可以判断出在这种情况下，纳豆菌的最大生物量点出现在稍早于14h并且最大生物量不会超过2％的麦芽糖作为纳豆菌培养基的碳源时17h的OD600nm值0.659。当麦芽糖浓度为4％时，纳豆菌也已经逐渐进入衰亡期。同样可以根据14～17h的OD600nm值下降量0.012和17～20h的下降量0.025进行推断，此时纳豆菌的最大生物量点出现在稍早于14h并且最大生物量也不会超过2％的麦芽糖作为纳豆菌培养基的碳源时17h的OD600nm值0.659。
如图4，当乳糖浓度为2％时，纳豆菌在20h的OD600nm值达到最大的0.842，虽然最大值点有所推迟，但由于其在14h、17h、20h三点的OD600nm值差别不大，故也可视为17h为最大值点。当乳糖浓度为3％时，纳豆菌在14～20h区间内的生长趋势较为平稳并在17h时达到最大的生物量，OD600nm值为0.831。乳糖浓度为4％时，根据纳豆菌的OD600nm值曲线可以看出纳豆菌在14h时就已经逐渐进入衰退期了，14～17h纳豆菌的OD600nm值下降了0.003，17～20h纳豆菌的OD600nm值下降了0.009，纳豆菌的下降趋势越来越明显，故可以根据纳豆菌的生长曲线图分析出当14h时，纳豆菌OD600nm值刚刚开始下降，证明在14h附近纳豆菌已经达到最大生物量，且最大生物量应该0.810左右，并且不会超过当2％的乳糖作为纳豆菌培养基的碳源时17h的OD600nm值0.839。
如图5，当碳源为甘油时，甘油含量为2％、3％、4％的纳豆菌都是在17h生长情况最好，并在17～20h之间生长较为稳定。此区间内纳豆菌的生物量并没有太显著的差异。其中3％的甘油增菌效果最好。但与其他不同的碳源相比，增菌效果不明显。
通过以上不同的碳源之间的比较可以看出，碳源的浓度并不是越高越好，有时过高的碳源浓度反而会对纳豆菌的生长起到抑制作用。通过比较OD600nm值的大小后选择较好的三种碳源为：2％乳糖、3％乳糖、4％蔗糖。
1.3.2.2氮源的筛选结果
本次试验通过选取4种较好的氮源，(NH4)2SO4、NH4Cl、酵母浸粉、酸水解酪蛋白，按照基础培养基中氮源的优化中所述的方法，通过试验对14h、17h、20h的纳豆菌生物量进行测定，结果分别见附图6-9。
由图6可知，(NH4)2SO4占1％时，纳豆菌在14～17h内迅速大量生长并在17h达到最大生物量OD600nm值为0.142。(NH4)2SO4浓度为2％时，纳豆菌的生长虽然较为缓慢但也在17h达到最大生物量OD600nm值为0.119。当3％的(NH4)2SO4作为氮源时，纳豆菌的生长最为缓慢，17h达到的最大生物量OD600nm值仅为0.114。
由图7可知当NH4Cl作为氮源时，三种不同浓度的氮源都使纳豆菌在14h或者在其之前就达到最大生物量。通过比较这3种氮源培养的纳豆菌的生长量可以看出，当3％的NH4Cl作为纳豆菌的氮源时，纳豆菌的生长情况最好。
由图8时，当酵母浸粉作为唯一氮源时，三种不同浓度的氮源使得纳豆菌在14h出现较大值。通过数据分析其菌数增长趋势，3％的酵母浸粉作为氮源时菌数最大值不会超过0.9，由于生物量之间的差别不大，在17h时菌数没有出现明显的下降，可以近似的认为其为最大生物量点。酵母浸粉的比例为2％和3％时，纳豆菌的生物量都比较大。
由图9可知，将1％的酸水解酪蛋白作为唯一氮源时，17h纳豆菌出现最大生物量0.726，随后逐渐进入衰亡期。2％的酸水解酪蛋白作为唯一氮源时，纳豆菌的生长速度有了较大提升，在14h时生物量为0.600随后继续迅速增长并在17h达到最大生长量0.788，但之后又快速下降。这种氮源虽然提高了纳豆菌的增长速度但也缩短了纳豆菌的稳定期。酸水解酪蛋白的浓度为3％时，在17h达到最大生物量OD600nm值为0.754。
通过以上氮源的比较，依据OD600nm值评价出最好的三种氮源及其比例为：3％酵母浸粉、2％酸水解酪蛋白和2％酵母浸粉。
1.3.2.3生长因子的筛选结果
参考乳酸菌的新型培养基配方，利用胡萝卜汁、西红柿汁、菠萝皮汁作为纳豆菌的生长因子，按照基础培养基中生长因子的优化中所述的方法，用5％、10％、15％三种不同的添加量进行添加，各种生长因子及其不同浓度对纳豆菌OD600nm值的影响见附图10-12。
由图10可知，采用10％胡萝卜汁作为纳豆菌的生长因子时，纳豆菌的长势良好并在17h达到0.734，随后仍然在快速增加并在20h达到最大值，之后的生长趋势无法预测。同浓度的西红柿汁作为纳豆菌的生长因子时出现了几乎相同的生长趋势，同样没有在观察测定的预测时间内出现最大生长量。但考虑到本试验选取的不同的氮源和碳源都能够在17h使得纳豆菌达到最大生长量，而且发酵时间较短能够节约成本，故选用10％胡萝卜汁作为生长因子培养纳豆菌17h的OD600nm值0.749作为这种浓度下的最大生长量，选用17h的OD600nm值0.734作为10％西红柿汁作为生长因子培养纳豆菌的最大生长量。同浓度的菠萝皮汁作为纳豆菌的生长因子时，纳豆菌在14～17h和17～20h的生长量为0.256和0.069，生长速度明显放缓，可以预测其最终的最大生长量会超过1，为了统一培养时间，也视17h为纳豆菌的最大生长量点。
由图11可知，控制胡萝卜汁、西红柿汁、菠萝皮汁的添加量都为5％时，可以看到纳豆菌的生长规律基本相同，都在17h出现最大生长量，并在17～20h增长速度接近于0。其中以5％菠萝皮汁作为纳豆菌的生长因子时生长情况最好。
如图12，控制胡萝卜汁、西红柿汁、菠萝皮汁的添加量都为15％时，纳豆菌在14～17h快速增加，并在17h达到最大生长量，并进入稳定期，这三种不同的生长因子都使得纳豆菌的生长有较长的稳定期。
对以上的各种不同的生长因子进行分析，结果表明不同的果蔬汁中含有的不同维生素及含量对纳豆菌的作用也不相同，纳豆菌对这些物质的利用程度不同导致了纳豆菌的生长情况也不尽相同，使得纳豆菌的各个时期出现的时间长短和持续的时间都有所不同，本试验中在17h基本都达到了最大生物量，选取17h作为最大生长量点，此时，最好的三种生长因子为10％胡萝卜汁、10％菠萝皮汁、5％菠萝皮汁。
1.3.3增菌培养基正交实验结果
依据正交试验设计，在选定的最大生物量点17h，对各组试验结果进行测定和数据分析，结果如下：
表1正交试验结果一览表
Figure BDA0001353644520000081
根据极差分析的结果可以看出，碳源、氮源、生长因子对纳豆菌的影响为碳源＞生长因子＞氮源，在4号试样在17h时OD600nm值最大，即A2C2B1组合。空列D的极差最小，说明碳源、氮源、生长因子之间不存在协同作用。但是根据正交试验的分析，理论最佳组合应该为A2C1B1，为了找出纳豆菌在17h的最佳培养基配方，采用验证试验进行验证，并与基础培养基进行比较。
1.3.4验证试验
用正交试验中的最佳组合A2C2B1和理论最佳组合A2C1B1及基础培养基进行重新培养进行验证。结果如下表：
表2验证试验结果
Figure BDA0001353644520000091
由表2可知：经显著性分析，所选出的最佳培养基组合A2C2B1与理论最佳培养基组合A2C1B1及基础培养基比较,在5％水平上差异显著。即最佳培养基为A2C2B1，即4％蔗糖、3％酵母浸粉、5％菠萝皮汁、0.2％MgSO4、0.1％K2HPO4、0.2％KH2PO4配制成的培养基增菌效果最佳。优化后的培养基使得纳豆菌的生物量在17h较优化前提高了0.607，纳豆菌的菌落总数达到了2.8×109CFU/mL，比优化前提高了一个数量级。
制备例1
一种纳豆培养基成分为：4％蔗糖、3％酵母浸粉、5％菠萝皮汁、0.2％MgSO4、0.1％K2HPO4、0.2％KH2PO4。
培养基的优化方法，包括如下步骤：
1)制备基础培养基：采用葡萄糖3％、蛋白胨2％、MgSO4 0.2％、K2HPO40.1％、KH2PO4 0.2％作为活化和传代培养基；
2)制备纳豆菌的液体种子培养基：在锥形瓶中装入150mL上述基础培养基，灭菌后取纳豆菌0.3g接种于锥形瓶中，在40℃、150r/min的恒温震荡培养箱中培养18h后进行3次传代培养；
3)纳豆菌生长培养：将在基础培养基中培养的纳豆菌置于40℃、150r/min的恒温震荡培养箱中培养12～24h；
4)基础培养基中碳源的优化：分别采用2％蔗糖、3％蔗糖、4％蔗糖、2％麦芽糖、3％麦芽糖、4％麦芽糖、2％乳糖、3％乳糖、4％乳糖、2％甘油、3％甘油、4％甘油替代上述基础培养基中的葡萄糖，基础培养基其余成分及含量不变，对纳豆菌的生长进行培养并观察记录结果；
5)基础培养基中氮源的优化：分别采用1％(NH4)2SO4、2％(NH4)2SO4、3％(NH4)2SO4、1％酵母浸粉、2％酵母浸粉、3％酵母浸粉、1％酸水解酪蛋白、2％酸水解酪蛋白、3％酸水解酪蛋白、1％NH4Cl、2％NH4Cl、3％NH4Cl替代上述基础培养基中的蛋白胨，基础培养基其余成分及含量不变，对纳豆菌的生长进行培养并观察记录结果；
6)基础培养基中生长因子的优化：将果蔬汁作为生长因子添加到基础培养基中，胡萝卜汁、西红柿汁、菠萝皮汁的制作方法为：分别取200g鲜胡萝卜、鲜西红柿、鲜菠萝皮，切碎后加入等量的水，打浆并煮沸20min后，进行冷却、过滤，取滤液并定容到200mL；分别添加10％胡萝卜汁、10％西红柿汁、10％菠萝皮汁、5％胡萝卜汁、5％西红柿汁、5％菠萝皮汁、15％胡萝卜汁、15％西红柿汁、15％菠萝皮汁，基础培养基其余成分及含量不变，对纳豆菌的生长进行培养并观察记录结果；
步骤4)、5)、6)中的纳豆菌的生长培养条件为：在无菌条件下将液体种子培养基接种到各个优化培养基中，调节pH值为7.2，分装高压灭菌，冷却，在无菌操作台中进行接种，接种量为5％，在40℃的恒温振荡培养箱中培养14h、17h、20h。
7)分别将上述优化培养基测量培养基的OD600nm值，筛选出纳豆菌增菌效果较好的三种碳源，通过对单因素试验的结果进行分析并利用正交试验进一步优化培养基配方。
8)将上述正交试验做出的最优方案、理论上的最优方案及基础培养基进行重新培养，培养条件为：分别在三种培养基中接种5％的纳豆菌，在40℃的恒温振荡培养箱中培养17h；培养完成后利用未接种的培养基作为空白样，经紫外分光光度计测定它们的OD600nm值进行比较，并采用稀释平板计数法在40℃下分别培养24h后进行计数，以最终的菌落数作为最主要的指标得到培养基的最佳配方。

Claims (3)

1.一种纳豆菌培养基，其特征在于，所述培养基成分为：4％蔗糖、3％酵母浸粉、5％菠萝皮汁、0.2％MgSO4、0.1％K2HPO4、0.2％KH2PO4；
所述菠萝皮汁的制作方法为：取200g鲜菠萝皮，切碎后加入等量的水，打浆并煮沸20min后，进行冷却、过滤，取滤液并定容到200mL。
2.根据权利要求1所述的纳豆菌培养基的优化方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备基础培养基：采用葡萄糖3％、蛋白胨2％、MgSO4 0.2％、K2HPO4 0.1％、KH2PO40.2％作为活化和传代培养基；
2)制备纳豆菌的液体种子培养基：在锥形瓶中装入150mL上述基础培养基，灭菌后取纳豆菌0.3g接种于锥形瓶中，在40℃、150r/min的恒温震荡培养箱中培养18h后进行3次传代培养；
3)纳豆菌生长培养：将在基础培养基中培养的纳豆菌置于40℃、150r/min的恒温震荡培养箱中培养12～24h；
4)基础培养基中碳源的优化：分别采用2％蔗糖、3％蔗糖、4％蔗糖、2％麦芽糖、3％麦芽糖、4％麦芽糖、2％乳糖、3％乳糖、4％乳糖、2％甘油、3％甘油、4％甘油替代上述基础培养基中的葡萄糖，基础培养基其余成分及含量不变，对纳豆菌的生长进行培养并观察记录结果；
5)基础培养基中氮源的优化：分别采用1％(NH4)2SO4、2％(NH4)2SO4、3％(NH4)2SO4、1％酵母浸粉、2％酵母浸粉、3％酵母浸粉、1％酸水解酪蛋白、2％酸水解酪蛋白、3％酸水解酪蛋白、1％NH4Cl、2％NH4Cl、3％NH4Cl替代上述基础培养基中的蛋白胨，基础培养基其余成分及含量不变，对纳豆菌的生长进行培养并观察记录结果；
6)基础培养基中生长因子的优化：将果蔬汁作为生长因子添加到基础培养基中，分别添加10％胡萝卜汁、10％西红柿汁、10％菠萝皮汁、5％胡萝卜汁、5％西红柿汁、5％菠萝皮汁、15％胡萝卜汁、15％西红柿汁、15％菠萝皮汁，基础培养基其余成分及含量不变，对纳豆菌的生长进行培养并观察记录结果；
7)分别将上述优化培养基测量培养基的OD600nm值，筛选出纳豆菌增菌效果较好的三种碳源，通过对单因素试验的结果进行分析并利用正交试验进一步优化培养基配方；
8)将上述正交试验做出的最优方案、理论上的最优方案及基础培养基进行重新培养，测定它们的OD600nm值进行比较，并采用稀释平板计数法在40℃下分别培养24h后进行计数，以最终的菌落数作为最主要的指标得到培养基的最佳配方；
所述步骤4)、5)、6)中的纳豆菌的生长培养条件为：在无菌条件下将液体种子培养基接种到各个优化培养基中，调节pH值为7.2，分装高压灭菌，冷却，在无菌操作台中进行接种，接种量为5％，在40℃的恒温振荡培养箱中培养14h、17h、20h；
所述步骤8)中的重新培养条件为：分别在三种培养基中接种5％的纳豆菌，在40℃的恒温振荡培养箱中培养17h。
3.根据权利要求2所述的纳豆菌培养基的优化方法，其特征在于，所述步骤7)、8)中培养基的OD600nm值的测定方法为：培养完成后利用未接种的培养基作为空白样，经紫外分光光度计测定并进行比较。
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