CN112391318B - 一种长双歧杆菌、富硒微生物的制备方法及其冻干制剂的制备方法 - Google Patents

一种长双歧杆菌、富硒微生物的制备方法及其冻干制剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于长双歧杆菌培养领域，具体涉及一种长双歧杆菌、富硒微生物的制备方法及其冻干制剂的制备方法。本发明利用纳米硒培养长双歧杆菌，获得了具有富硒效率高，转化率高，总硒含量高，可利用的高价值的硒代胱氨酸的含量高的富硒长双歧杆菌。富硒长双歧杆菌制得的菌剂能显著抑制肠杆菌、肠球菌以及葡萄球菌的数量，并促进有益乳酸菌的生成。本发明还提供了上述富硒长双歧杆菌和冻干制剂的制备方法，该制备方法简单易行，转化效率高，易于工业化生产制备，具有很高的推广价值。

Description

一种长双歧杆菌、富硒微生物的制备方法及其冻干制剂的制 备方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种长双歧杆菌、富硒微生物的制备方法及其冻干制剂的制备方法。
背景技术
硒是人体必需的微量元素之一，参与合成各种硒代氨基酸以及多种硒代蛋白(酶)。大量临床实验明，人体缺硒可引起某些重要器官的功能失调，导致许多严重疾病发生。硒元素本身以及由其合成的硒蛋白具有很多生物学活性，如抗氧化、抗肿瘤、增强人体免疫等。世界卫生组织提出，硒是促进人类生命健康必不可少的一种微量元素，在日常生活中合理摄取硒元素，可以有效预防多种疾病的发生。
传统的补硒方法主要以无机硒作为硒源，主要包括硒酸盐和亚硒酸盐等，但是无机硒毒性较大，安全治疗窗较窄，作为直接的硒源存在一定的安全隐患。目前，以食品、药品或保健用品等形式出现地补硒品，主要有硒蘑菇，硒酵母、硒酸脂多糖等，其含硒的形态多为无机硒和硒代蛋氨酸，难以为人体利用。
富硒酵母是目前市场上应用较为广泛的补硒产品，酵母作为转化载体可以将外界的无机硒转化为有机硒，从而更有利于人体的吸收。但富硒酵母中的硒以硒代蛋氨酸为主，但是硒代蛋氨酸被人体吸收后活性较差。除此之外，双歧杆菌、乳酸菌一类的益生菌也可用于硒的培养与转化。与富硒酵母相比，由于益生菌本身的益生作用，因此富硒益生菌可能会具有更优的生物活性，但存在着富硒效率低下，转化率低等问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长双歧杆菌、富硒微生物的制备方法及其冻干制剂的制备方法以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
一种长双歧杆菌，长双歧杆菌Bifidobacterium longum保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61113。保藏时间为2020年7月31日。保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
发明人从健康人群肠道的微生物中分离得到一种长双歧杆菌。
一种富硒微生物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将上述长双歧杆菌进行种子制备；(2)将步骤(1)得到的种子接种至富硒发酵液中富硒发酵。
步骤(2)中的富硒发酵液包括组分A、组分B和组分C，组分A、组分B和组分C的体积比为4000-5000：40-50:0.2-0.25；
其中，组分A包括如下浓度的成分10-40g/L蛋白胨、20-40g/L酵母抽提物、葡萄糖30-60g/L、0.5-4g/L磷酸盐、半胱氨酸盐酸盐0.5-2g/L、乙酸盐1-2g/L、0.5-1.5g/L吐温-80；
按照重量份数计，组分B包括0.25-0.5份氯化钙、0.5-1份硫酸镁、1-2份磷酸盐、10-12份钠盐和500-1000份水；优选地，钠盐为碳酸氢钠和氯化钠；
组分C包括维生素和95％的乙醇；
优选地，维生素为维生素K1，按照重量份数计，组分C包括如下体积分数的原料：0.1-0.5份的维生素和20-30份95％的乙醇。
富硒发酵还包括在富硒发酵液中添加纳米硒，富硒发酵液中纳米硒的添加量为0.5-2g/L，优选地，在其他实施方式中上述硒的添加也可以是通过亚硒酸盐。纳米硒的添加量是指的是单位体积发酵液中的添加量。
经过富硒效果检测，本申请提供的富硒长双歧杆菌的制备方法可以生产活菌数达1011cfu/g的菌粉或菌液，总硒含量达45μg/g以上，硒代胱氨酸的含量高，该制备方法无需昂贵的仪器设备，生产成本低，更适合于规模化生产。
能达到上述活菌数和总硒含量的关键在于本申请筛选出的富硒长双歧杆菌和发酵方法。
发明人创造性的提供了上述富硒发酵培养基，通过组分A以提供发酵培养所需的氮源、碳源、磷酸盐、半胱氨酸和无机硒。
通过组分B提供发酵培养所需的无机盐，通过组分C以提供富硒发酵所需的维生素。
组分A、B和C协同配合以保证接种至培养基中的长双歧杆菌菌液能高效发酵。
蛋白胨可以是大米蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨中的至少一种。
在其他实施方式中，碳源也可以由其他的单糖或多糖替代，例如乳糖，蔗糖或麦芽糖。
半胱氨酸盐酸盐具有还原性，有抗氧化和防止非酶褐变的作用。
发明人经过长期的实验筛选和验证，采用上述范围内的组分发酵获得的菌体中的活菌数和总硒含量更高，微生物的转化效率更高。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述维生素为维生素K1，按照重量份数计，组分C包括0.1-0.5份的维生素和20-30份95％的乙醇。
维生素K1、半胱氨酸-盐酸盐、硫酸镁、氯化钙、钠盐为培养各种双歧杆菌提供生长因子；磷酸盐为缓冲剂。磷酸盐可以是磷酸二氢钾或磷酸氢二钾。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述富硒发酵包括如下步骤：用碱液调节发酵液的pH不低于6.0；
优选地，在富硒发酵液中的培养时间为12-24h，转速为80-350rpm，用碱液调节发酵液的pH不低于6.5，优选地，培养温度为36-42℃；
优选地，先以80-120rpm的转速在36-38℃下培养12-24h，用碱液调节发酵液的pH不低于6.5；然后以200-350rpm的转速在40-42℃下培养4-12h，用碱液调节发酵液的pH不低于6.0。
在上述发酵培养温度、时间、pH和转速范围内，可以获得高浓度的活菌数，从而获得更高的总硒含量。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法包括在接种至发酵培养基前进行种子的制备，种子的制备包括先将长双歧杆菌以5-10％的接种量接种至YM培养基上，在36-38℃下厌氧培养6-10h得到一级种子；然后将一级种子接种于新的YM培养基上，在36-38℃下厌氧培养16-20h得到二级种子；最后将二级种子接种于新的YM培养基上，在36-38℃下厌氧培养8-10h得到三级种子以用于接种后续的发酵培养基。
通过三级种子制备以保证长双歧杆菌进入发酵培养基后能高效的扩大培养。
一种长双歧杆菌的培养方法，其包括以下步骤：
将长双歧杆菌接种至培养基中进行培养。
培养基选自市面上常见的厌氧培养基。
一种冻干制剂，其包括冻干保护剂和菌体，菌体为上述的长双歧杆菌或富硒微生物。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述冻干保护剂包括糖类保护剂和甘油。
按重量份数计，冻干保护剂包括30-48份糖类保护剂和1-5份甘油。
在一种实施方式中，上述糖类保护剂包括蔗糖、麦芽糖糊精和玉米淀粉。
在一种实施方式中，按重量份数计，糖类保护剂包括4-8份蔗糖、13-20份麦芽糖糊精和13-20份玉米淀粉。
在其他实施方式中，糖类保护剂也可以是海藻糖、水苏糖、乳糖或乳果糖。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述冻干保护剂和菌体的添加质量比为1-2:15-20。
需要说明的是，冻干保护剂和菌体添加质量的比例并不限于上述的范围，也可以根据实际需要进行自适应调整。
一种冻干制剂的制备方法，制备方法包括如下步骤：将菌体与冻干保护剂混合，在冻干机中进行冻干。
在进入冻干机中冻干前，先在-20～-35℃下冷冻2-5h，然后在冻干机中冷冻至菌体水分低于3％。
在其他实施方式中，冻干制剂的制备方法还包括取出冻干后的菌体，机械粉碎，过80目筛后分装，-20℃保存。
本发明提供的上述冻干制剂、长双歧杆菌、富硒长双歧杆菌可以用于制备预防或治疗肠胃道疾病产品。在一项动物实验中，灌胃给予该菌剂的结果显示，本发明提供的菌剂能显著抑制肠杆菌、肠球菌以及葡萄球菌的数量，并促进有益的乳酸杆菌的生成。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种长双歧杆菌，可用于富硒培养。富硒培养获得的富硒长双歧杆菌富硒效率高，转化率高，总硒含量高，可利用的高价值的硒代胱氨酸的含量高。
(2)采用的硒源为纳米硒，纳米硒的安全性好，并且有利用长双歧杆菌对纳米硒的吸收。
(3)所得到的富硒长双歧杆菌剂能显著抑制肠杆菌、肠球菌以及葡萄球菌的数量，并促进有益的乳酸杆菌的生成。
(4)所得到的富硒长双歧杆菌为冻干制剂，制备方法简单易行，转化效率高，易于工业化生产制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为不同菌种的富硒总量统计图；
图2为单位菌体富硒量统计图；
图3为硒的生物利用度统计图；
图4为实验例2富硒能力较好的长双歧杆菌富硒总量对比图；
图5为实验例2富硒能力较好的长双歧杆菌单位菌体富硒量对比图；
图6为实验例2富硒能力较好的长双歧杆菌硒的生物利用度对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种冻干制剂的制备方法。其包括如下依次进行的步骤：
(1)种子的制备。长双歧杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61113。
将长双歧杆菌菌液2mL从-80℃冰箱中取出化冻，接种于80mL YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养8h，为一级种子；取2mL一级种子接种于另一瓶80mL YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养16h，为二级种子；取2mL二级种子接种于80mL的新的YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养8h，为三级种子。
YM培养基由如下成分(g/100mL)组成：酵母膏0.3、胰蛋白胨0.5、麦芽糖0.5及水。
(2)发酵培养基的配制。
发酵培养基的组分A由如下浓度的成分组成(g/L)：大米蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母抽提物20g/L，葡萄糖·H2O 60g/L，K2HPO4 2g/L，吐温-80 1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，乙酸钠2g/L。
组分B包括如下质量(g)的组分：CaCl2·2H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.50g，K2HPO4 1.00g，KH2PO4 1.00g，NaHCO3 10.00g，NaCl 2.00g，ddH2O 1000.00。
组分C包括如下体积(mL)的组分：维生素K1 0.1mL，95％乙醇20mL。
组分A取4L，组分B取40mL，组分C取0.2mL，纳米硒的添加量为1g/L，混合均匀，用5MHCl和5M NaOH调节pH至7.2，121℃灭菌20min。
(3)富硒发酵。
将步骤(1)制得的三级种子转接至步骤(2)配制的发酵培养基中，于5L生化反应器上进行培养16h，转速100rpm，温度37℃，用5M NaOH控制pH，使其不低于6.5；
调节转速至300rpm，调节温度至42℃，控制pH，使其不低于6.0，继续反应8h。
(4)冻干保存。
按如下浓度(g/L)配置冻干保护剂：蔗糖6g/L，麦芽糖糊精15g/L，玉米淀粉15g/L，甘油2g/L，ddH2O 25g/L。
将富硒发酵获得的培养液离心浓缩，收集菌体，与冻干保护剂按照菌体和冻干保护剂为15:1的质量比混合均匀，-20℃下冷冻4h，放置冻干机中进行冷冻至菌体水分3％以下时结束冻干步骤。
取出冻干后的菌体，机械粉碎，过80目筛后分装，-20℃保存。
(5)富硒效果检测。
检测菌粉中活菌数达到1.40×1011cfu/g，通过HPLC-ICP-MS联用对菌粉中的硒含量进行检测，总硒含量为57.93μg/g，其中硒代胱氨酸占总硒31.60％。
实施例2
本实施例提供了一种冻干制剂的制备方法。其包括如下依次进行的步骤：
(1)种子的制备。长双歧杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61113。
将长双歧杆菌菌液2mL从-80℃冰箱中取出化冻，接种于80mL YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养8h，为一级种子；取2mL一级种子接种于另一瓶80mL YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养16h，为二级种子；取2mL二级种子接种于80mL的新的YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养8h，为三级种子。
YM培养基由如下成分(g/100mL)组成：酵母膏0.3、胰蛋白胨0.5、麦芽糖0.5及水。
(2)发酵培养基的配制。
发酵培养基的组分A由如下浓度的成分组成(g/L)：大米蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母抽提物20g/L，葡萄糖·H2O 60g/L，K2HPO4 2g/L，吐温-80 1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，乙酸钠2g/L。
组分B包括如下质量(g)的组分：CaCl2·2H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.50g，K2HPO4 1.00g，KH2PO4 1.00g，NaHCO3 10.00g，NaCl 2.00g，ddH2O 1000.00。
组分C包括如下体积(mL)的组分：维生素K1 0.1mL，95％乙醇20mL。
分别取组分A 4L，组分B 40mL和组分C 0.2mL，混匀，纳米硒的添加量为1g/L，用5MHCl和5M NaOH调节pH至7.2，于121℃灭菌20min。
(3)富硒发酵。
将步骤(1)制得的三级种子转接至步骤(2)配制的发酵培养基中，于5L生化反应器上进行培养20h，转速100rpm，温度37℃，用5M NaOH控制pH，使其不低于6.5；
调节转速至300rpm，调节温度至42℃，控制pH，使其不低于6.0，继续反应4h。
(4)冻干保存。
按如下浓度(g/L)配置冻干保护剂：蔗糖6g/L，麦芽糖糊精15g/L，玉米淀粉15g/L，甘油2g/L，ddH2O 25g/L。
将富硒发酵获得的培养液离心浓缩，收集菌体，与冻干保护剂按照菌体和冻干保护剂为15:1的质量比混合均匀，-20℃下冷冻4h，放置冻干机中进行冷冻至菌体水分3％以下时结束冻干步骤。
取出冻干后的菌体，机械粉碎，过80目筛后分装，-20℃保存。
(5)富硒效果检测。
检测菌粉中活菌数达到1.13×1011cfu/g，通过HPLC-ICP-MS联用对菌粉中的硒含量进行检测，总硒含量为51.12μg/g，其中硒代胱氨酸占总硒的29.60％。
实施例3
本实施例提供了一种冻干制剂的制备方法。其包括如下依次进行的步骤：
(1)种子的制备。
将长双歧杆菌菌液2mL从-80℃冰箱中取出化冻，接种于80mL YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养8h，为一级种子；取2mL一级种子接种于另一瓶80mL YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养16h，为二级种子；取2mL二级种子接种于80mL的新的YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养8h，为三级种子。
YM培养基由如下成分(g/100mL)组成：酵母膏0.3、胰蛋白胨0.5、麦芽糖0.5及水。
(2)发酵培养基的配制。
发酵培养基的组分A由如下浓度的成分组成(g/L)：大米蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母抽提物20g/L，葡萄糖·H2O 60g/L，K2HPO4 2g/L，吐温-80 1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，乙酸钠2g/L。
组分B包括如下质量(g)的组分：CaCl2·2H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.50g，K2HPO4 1.00g，KH2PO4 1.00g，NaHCO3 10.00g，NaCl 2.00g，ddH2O 1000.00。
组分C包括如下体积(mL)的组分：维生素K1 0.1mL，95％乙醇20mL。
分别取组分A 4L，组分B 40mL和组分C 0.2mL，混匀，纳米硒的添加量为1g/L，用5MHCl和5M NaOH调节pH至7.2，于121℃灭菌20min。
(3)富硒发酵。
首先将步骤(1)制得的三级种子转接至步骤(2)配制的发酵培养基中，于5L生化反应器上进行培养12h，设置转速100rpm，温度37℃，用5M NaOH控制pH，使其不低于6.5；
然后调节转速至300rpm，调节温度至42℃，控制pH，使其不低于6.0，继续发酵反应12h。
(4)冻干保存。
按如下浓度(g/L)配置冻干保护剂：蔗糖6g/L，麦芽糖糊精15g/L，玉米淀粉15g/L，甘油2g/L，ddH2O 25g/L。
将富硒发酵获得的培养液离心浓缩，收集菌体，与冻干保护剂按照菌体和冻干保护剂为15:1的质量比混合均匀，-20℃下冷冻4h，放置冻干机中进行冷冻至菌体水分3％以下时结束冻干步骤。
取出冻干后的菌体，机械粉碎，过80目筛后分装，-20℃保存。
(5)富硒效果检测。
检测菌粉中活菌数达到1.23×1011cfu/g，通过HPLC-ICP-MS联用对菌粉中的硒含量进行检测，总硒含量为52.41μg/g，其中硒代胱氨酸占总硒的30.93％。
实施例4
本实施例提供了一种冻干制剂的制备方法。其包括如下依次进行的步骤：
(1)种子的制备。
将长双歧杆菌菌液2mL从-80℃冰箱中取出化冻，接种于80mL YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养8h，为一级种子；取2mL一级种子接种于另一瓶80mL YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养16h，为二级种子；取2mL二级种子接种于80mL的新的YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养8h，为三级种子。
YM培养基由如下成分(g/100mL)组成：酵母膏0.3、胰蛋白胨0.5、麦芽糖0.5及水。
(2)发酵培养基的配制。
发酵培养基的组分A由如下浓度的成分组成(g/L)：大米蛋白胨5g/L，大豆蛋白胨5g/L，酵母抽提物40g/L，葡萄糖·H2O 30g/L，K2HPO4 1g/L，吐温-80 1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，乙酸钠2g/L。
组分B包括如下质量(g)的组分：CaCl2·2H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.50g，K2HPO4 1.00g，KH2PO4 1.00g，NaHCO3 10.00g，NaCl 2.00g，ddH2O 1000.00。
组分C包括如下体积(mL)的组分：维生素K1 0.1mL，95％乙醇20mL。
分别取组分A 4L，组分B 40mL和组分C 0.2mL，混匀，纳米硒的添加量为2g/L，用5MHCl和5M NaOH调节pH至7.2，于121℃灭菌20min。
(3)富硒发酵。
首先将步骤(1)制得的三级种子转接至步骤(2)配制的发酵培养基中，于5L生化反应器上进行培养16h，设置转速100rpm，温度37℃，用5M NaOH控制pH，使其不低于6.5；
然后调节转速至300rpm，调节温度至42℃，控制pH，使其不低于6.0，继续发酵反应8h。
(4)冻干保存。
按如下浓度(g/L)配置冻干保护剂：蔗糖6g/L，麦芽糖糊精15g/L，玉米淀粉15g/L，甘油2g/L，ddH2O 25g/L。
将富硒发酵获得的培养液离心浓缩，收集菌体，与冻干保护剂按照菌体和冻干保护剂为15:1的质量比混合均匀，-20℃下冷冻4h，放置冻干机中进行冷冻至菌体水分3％以下时结束冻干步骤。
取出冻干后的菌体，机械粉碎，过80目筛后分装，-20℃保存。
(5)富硒效果检测。
检测菌粉中活菌数达到1.33×1011cfu/g，通过HPLC-ICP-MS联用对菌粉中的硒含量进行检测，总硒含量为53.28μg/g，其中Cys-Se占总硒31.31％。
实施例5
本实施例提供了一种冻干制剂的制备方法。其包括如下依次进行的步骤：
(1)种子的制备。
将长双歧杆菌菌液2mL从-80℃冰箱中取出化冻，接种于80mL YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养8h，为一级种子；取2mL一级种子接种于另一瓶80mL YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养16h，为二级种子；取2mL二级种子接种于80mL的新的YM培养基上，接种量的体积比为5％，37℃厌氧培养8h，为三级种子。
YM培养基由如下成分(g/100mL)组成：酵母膏0.3、胰蛋白胨0.5、麦芽糖0.5及水。
(2)发酵培养基的配制。
发酵培养基的组分A由如下浓度的成分组成(g/L)：大米蛋白胨5g/L，大豆蛋白胨5g/L，酵母抽提物40g/L，葡萄糖·H2O 30g/L，K2HPO4 1g/L，吐温-80 1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，乙酸钠2g/L。
组分B包括如下质量(g)的组分：CaCl2·2H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.50g，K2HPO4 1.00g，KH2PO4 1.00g，NaHCO3 10.00g，NaCl 2.00g，ddH2O 1000.00。
组分C包括如下体积(mL)的组分：维生素K1 0.1mL，95％乙醇20mL。
分别取组分A 4L，组分B 40mL和组分C 0.2mL，混匀，纳米硒的添加量为2g/L，用5MHCl和5M NaOH调节pH至7.2，于121℃灭菌20min。
(3)富硒发酵。
将步骤(1)制得的三级种子转接至步骤(2)配制的发酵培养基中，于5L生化反应器上进行培养24h，设置转速100rpm，温度37℃，用5M NaOH控制pH，使其不低于6.5。
(4)冻干保存。
按如下浓度(g/L)配置冻干保护剂：蔗糖6g/L，麦芽糖糊精15g/L，玉米淀粉15g/L，甘油2g/L，ddH2O 25g/L。
将富硒发酵获得的培养液离心浓缩，收集菌体，与冻干保护剂按照菌体和冻干保护剂为15:1的质量比混合均匀，-20℃下冷冻4h，放置冻干机中进行冷冻至菌体水分3％以下时结束冻干步骤。
取出冻干后的菌体，机械粉碎，过80目筛后分装，-20℃保存。
(5)富硒效果检测。
检测菌粉中活菌数达到1.13×1011cfu/g，通过HPLC-ICP-MS联用对菌粉中的硒含量进行检测，总硒含量为45.28μg/g，其中Cys-Se占总硒28.31％。
实施例6
本实施例提供了一种冻干制剂的制备方法。与实施例5相比，区别仅在于，富硒发酵的步骤不同，其余步骤和配方相同。
将步骤(1)制得的三级种子转接至步骤(2)配制的发酵培养基中，于5L生化反应器上进行培养24h，设置转速200rpm，温度38℃，用5M NaOH控制pH，使其不低于6.5。
实施例7
本实施例提供了一种冻干制剂的制备方法。与实施例1相比，区别仅在于，纳米硒替换为硒酸钠，其余的步骤和配方相同。
实验例1
将7株长双歧杆菌分别在MRS和BHI富硒培养基中厌氧培养29h，培养温度为37℃，MRS和BHI富硒培养基分别设置如下梯度浓度的处理组：纳米硒添加量分别为0.8μg/mL、0.6μg/mL、0.4μg/mL、0.2μg/mL。
将厌氧培养(即富硒发酵)后的菌液从厌氧操作箱中取出。在生物安全柜中，每个处理组吸取1mL培养的菌液于9mL生理盐水中(稀释10倍)，混匀后利用紫外分光光度计测OD600的值，计算培养菌液的浓度。BHI富硒培养基下各处理组OD600的值参照表1所示，MRS富硒培养基下各处理组OD600的值参照表2所示。
表1 BHI富硒培养基下各处理组OD600的值。
Figure BDA0002797012820000161
表2 MRS富硒培养基下各处理组OD600的值。
Figure BDA0002797012820000162
将剩余的29mL菌液在25℃下，以8000rpm的转速离心4min；离心后将上清液转移至另一50mL离心管中，做好标记；
然后在离心获得的菌体沉淀中加入2mL生理盐水，混匀，使菌体悬浮；4℃保存备用。
富硒总量的检测方法包括如下依次进行的步骤：对各处理组分别进行消化，按照GB/T 5009.93食品中硒的测定(第一法氢化物原子荧光光谱法)进行。具体方法为：量取100μL菌液样品置于消化管中(每个样品三个平行)，加入5mL混酸(硝酸：高氯酸＝3：1)，冷消化过夜，次日加热消化，待当溶液变为清亮无色并伴有白烟时，再继续加热至剩余体积2mL左右，切不可蒸干。冷却，再加5.0mL6M盐酸，继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现，将六价硒还原成四价硒。冷却，转移至15mL离心管中定容至8mL，混匀备用。同时做空白试验。再稀释两倍，用原子荧光光谱仪测定总硒的含量。硒的标准样品购自国家标准中心，测定前先将标准液稀释至一定的浓度范围，以浓度为横坐标，以信号的峰面积为纵坐标得到标准曲线。其中一次的标准曲线为：y＝25.212x-8.680,R2＝0.9999，浓度范围为0-20μg/L。需要说明的是，标准曲线每次开机检测都要重新测定。
富硒总量指菌液中所含硒的总量。以所测的硒浓度以2mL换算。富硒总量参照图1所示，由图1可知8095/M(即8095MN)菌株的富硒总量最高。
单位菌体的富硒量是以富硒总量除以OD值。参照图2所示，由图2可知，8095/M(即MN 8095)菌株的单位菌体的富硒量最高。
硒的生物利用度是指富硒总量与所加硒总量之比。参照图3所示，由图3可知，8095/M(即MN8095)菌株对硒的生物利用度最高。
本实验例得出以下结论：富硒总量与培养基中硒浓度成正比；
总体来说两种培养基中的长双歧杆菌的富硒总量相差不大；
OD值统一化之后，单位菌体富硒量OD值低的富硒能力强；
8095/M和31/B(即MN31)的菌体量相对较少，而单位菌体富硒量较高，当发酵液中的硒含量为0.8μg/mL时，菌株的富硒总量最高；
8095/M菌株对0.8μg/mL硒的生物利用度最高达到了71％，而其他的菌株对0.8μg/mL硒的利用度在40％左右；38/B(即MN38)菌株的生物利用度最低。
实验例2
根据实验例1筛选出1株富硒能力较好的长双歧杆菌株8095，和另外两株17和19749(阳性对照)，在两种培养基(MRS培养基和BHI培养基，硒浓度为0.8μg/mL)中进行验证试验：
在40mL富硒培养基中，按照1％的接种量接种种子液(OD＝1)，然后在37℃下，厌氧培养12h和36h后，从厌氧操作箱中取出；
在生物安全柜中，每管吸取10mL富硒培养的菌液，利用紫外分光光度计测OD600的值(参照表3所示)；表3中19749-B表示菌株19749在BHI培养基中。
剩余30mL的菌液在4℃下，以8000rpm的转速，离心4min，弃上清；离心获得的菌体沉淀中加入3mL的生理盐水，混匀，使菌体悬浮；将菌体及上清装入盒中，置于4℃冷库，送样通过HPLC-ICP-MS联用对菌粉中的硒含量进行检测；
检测方法：每管吸取100μL菌液进行硝化(每支管做两个平行组)，硝化完成后，定容至8mL，再稀释两倍进行测定。表4和表5中示出了各菌株分别富硒发酵12h和36h时的硒浓度、富硒总量、硒生物利用度、单位菌体富硒量等数据。
表3 OD600值。
Figure BDA0002797012820000181
Figure BDA0002797012820000191
表4富硒发酵12h的硒浓度数据。
Figure BDA0002797012820000192
表5富硒发酵36h的硒浓度数据
Figure BDA0002797012820000193
不同菌株富硒总量的检测结果参照图4所示，不同菌株单位菌体富硒量的统计结果参照图5所示，硒的生物利用度数据参照图6所示。
需要说明的是，富硒总量是指菌体中所含硒的总量，以所测的硒浓度乘以3(mL)换算。
单位菌体富硒量是以富硒总量除以菌体的OD值(0.8μg/mL)。
硒的生物利用度：富硒总量与所加硒的总量(例如本实验例为0.8μg/mL)之比。
由图4-图6可知，菌株17和8095在MRS培养基中培养12h的富硒总量和生物利用度要比培养36h的高；其中，8095在MRS培养基中的富硒总量和生物利用度最高。
OD值统一之后，三种菌株在MRS和BHI培养基中培养12h后，8095单位菌体富硒量最高；8095富硒快，并且富硒能力强。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (18)

1.一种长双歧杆菌（Bifidobacterium longum），其特征在于，其保藏编号为GDMCCNo.61113。
2.一种富硒微生物的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
（1）将权利要求1所述的长双歧杆菌进行种子制备；（2）将步骤（1）得到的种子接种至富硒发酵液中富硒发酵。
3.根据权利要求2所述的富硒微生物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的富硒发酵液包括组分A、组分B、组分C，所述组分A、组分B和组分C的体积比为4000-5000：40-50:0.2-0.25；其中，组分A包括如下浓度的成分：10-40 g/L蛋白胨、20-40 g/L酵母抽提物、葡萄糖30-60 g/L、0.5-4 g/L磷酸盐、半胱氨酸盐酸盐0.5-2 g/L、乙酸盐1-2 g/L、0.5-1.5g/L吐温-80；
按照重量份数计，组分B包括：0.25-0.5份氯化钙、0.5-1份硫酸镁、1-2份磷酸盐、10-12份钠盐和500-1000份水；
组分C包括维生素和95%的乙醇。
4.根据权利要求3所述的富硒微生物的制备方法，其特征在于，所述钠盐为碳酸氢钠和氯化钠。
5.根据权利要求3所述的富硒微生物的制备方法，其特征在于，所述维生素为维生素K1，按照重量份数计，所述组分C包括如下体积分数的原料：0.1-0.5份的维生素和20-30份95%的乙醇；
所述富硒发酵还包括在所述富硒发酵液中添加纳米硒，所述富硒发酵液中纳米硒的添加量为0.5-2 g/L。
6.根据权利要求3所述的富硒微生物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）还包括如下步骤：用碱液调节富硒发酵液的pH不低于6.0。
7.根据权利要求6所述的富硒微生物的制备方法，其特征在于，在富硒发酵液中的培养时间为12-24 h，转速为80-350 rpm，用碱液调节发酵液的pH不低于6.5。
8.根据权利要求7所述的富硒微生物的制备方法，其特征在于，培养温度为36-42 ℃。
9.根据权利要求8所述的富硒微生物的制备方法，其特征在于，先以80-120 rpm的转速在36-38 ℃下培养12-24 h，用碱液调节发酵液的pH不低于6.5；然后以200-350 rpm的转速在40-42 ℃下培养4-12 h，用碱液调节发酵液的pH不低于6.0。
10.一种如权利要求1所述的长双歧杆菌的培养方法，其特征在于，其包括以下步骤：
将所述长双歧杆菌接种至培养基中进行培养。
11.一种冻干制剂，其特征在于，其包括冻干保护剂和菌体，所述菌体为权利要求1所述的长双歧杆菌或权利要求2-9任一项所述的富硒微生物的制备方法制备的富硒微生物。
12.根据权利要求11所述的冻干制剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括糖类保护剂和甘油。
13.根据权利要求12所述的冻干制剂，其特征在于，按重量份数计，所述冻干保护剂包括30-48份糖类保护剂和1-5份甘油。
14.根据权利要求12-13任一项所述的冻干制剂，其特征在于，所述糖类保护剂包括蔗糖、麦芽糖糊精和玉米淀粉。
15.根据权利要求14所述的冻干制剂，其特征在于，按重量份数计，所述糖类保护剂包括4-8份蔗糖、13-20份麦芽糖糊精和13-20份玉米淀粉。
16.根据权利要求11所述的冻干制剂，其特征在于，所述冻干保护剂和所述菌体的添加质量比为1-2:15-20。
17.一种如权利要求11-16任一项所述的冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将所述菌体与所述冻干保护剂混合，在冻干机中进行冻干。
18.根据权利要求17所述的冻干制剂的制备方法，其特征在于，在进入冻干机中冻干前，先在-20~-35 ℃下冷冻2-5 h，然后在冻干机中冷冻至菌体水分低于3%。
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